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CN119391668A - Udp-葡萄糖基转移酶突变体及其应用和甜菊糖苷莱鲍迪苷d的制备方法 - Google Patents

Udp-葡萄糖基转移酶突变体及其应用和甜菊糖苷莱鲍迪苷d的制备方法 Download PDF

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CN119391668A
CN119391668A CN202510015387.6A CN202510015387A CN119391668A CN 119391668 A CN119391668 A CN 119391668A CN 202510015387 A CN202510015387 A CN 202510015387A CN 119391668 A CN119391668 A CN 119391668A
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Jindawei Biotechnology Jiangsu Co ltd
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Abstract

本发明属于生物技术领域，公开了一种UDP‑葡萄糖基转移酶突变体及其应用和甜菊糖苷莱鲍迪苷D的制备方法。本发明提供的UDP‑葡萄糖基转移酶突变体相较于包括序列如SEQ ID NO:1所示的氨基酸片段的原始的UDP‑葡萄糖基转移酶而言，包括H18P突变和/或R370H突变，上述突变赋予了该UDP‑葡萄糖基转移酶突变体具有更高的特异性催化莱鲍迪苷A转化为莱鲍迪苷D的活性，能够实现莱鲍迪苷A至莱鲍迪苷D高效率以及充分的转化，有利于莱鲍迪苷D大规模以及高效率生产的实现，具有良好的应用前景。

Description

UDP-葡萄糖基转移酶突变体及其应用和甜菊糖苷莱鲍迪苷D 的制备方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种UDP-葡萄糖基转移酶突变体及其应用和甜菊糖苷莱鲍迪苷D的制备方法。
背景技术
甜叶菊中天然存在一种甜味剂——甜菊糖，即甜菊烯二萜苷，通常被称为甜菊糖苷(Steviol glycosides，SGs)。甜菊糖苷是由多成分组成的混合物，具有甜度高、热量低、性质稳定等特点，易溶于水，可溶于甲醇和乙醇。甜菊糖苷主要包括甜菊苷、莱鲍迪苷A~O、杜克苷A、甜茶苷及甜菊双糖苷等成分。其中，甜菊糖苷中含量最高的为甜菊苷和莱鲍迪苷A，是甜菊糖苷味质的主要成分，含量占甜菊糖苷的80%以上，具有缓慢的释放能力以及持续时间长，口感非常接近蔗糖；但是，高浓度的甜菊苷和莱鲍迪苷A具有苦味感，限制了其的应用。近期研究发现，莱鲍迪苷D含量的增加有利于改善甜菊糖苷所存在的苦味感，且也具有与蔗糖接近的口感，被称为“下一代甜菊糖”并得到广泛应用。
目前，莱鲍迪苷D的生产工艺主要包括提取法和生物催化法。其中，提取法指的是从甜叶菊中提取分离、纯化得到莱鲍迪苷D；但莱鲍迪苷D在甜叶菊中的含量极低(＜0.5％)，限制了莱鲍迪苷D的大规模生产。生物催化法指的是利用酶或微生物细胞作为生物催化剂进行催化反应以合成莱鲍迪苷D的技术，其相较于提取法而言具有更高的莱鲍迪苷D产量，因而在莱鲍迪苷D的生产中得到了更加广泛的应用。
但是，生物催化法所使用的UDP-葡萄糖基转移酶往往存在酶活低、转化效率低的缺点，从而导致其应用于工业化大规模生产莱鲍迪苷D的成本较高。
因此，亟需对UDP-葡萄糖基转移酶进行升级改造，以提高莱鲍迪苷D的生物催化合成效率。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种UDP-葡萄糖基转移酶突变体。该UDP-葡萄糖基转移酶突变体相较于原始的UDP-葡萄糖基转移酶而言，具有更高的催化莱鲍迪苷A转化成莱鲍迪苷D的催化活性，将其应用于莱鲍迪苷D制备中，能够很好地实现莱鲍迪苷D的高效率合成，具有良好的应用前景。
本发明的第二目的在于提供一种核酸分子。
本发明的第三目的在于提供一种重组菌株。
本发明的第四目的在于提供一种复合酶制剂。
本发明的第五目的在于提供上述UDP-葡萄糖基转移酶突变体、核酸分子、重组菌株或复合酶制剂在莱鲍迪苷D制备中的应用。
本发明的第六目的在于提供一种莱鲍迪苷D的制备方法。
具体的，本发明提供的UDP-葡萄糖基转移酶突变体相较于UDP-葡萄糖基转移酶，所述UDP-葡萄糖基转移酶突变体包括H18P突变和/或R370H突变；其中，所述UDP-葡萄糖基转移酶包括序列如SEQ ID NO:1所示的氨基酸片段。
进一步地，所述UDP-葡萄糖基转移酶突变体包括序列如SEQ ID NO:10所示的氨基酸片段。
进一步地，所述UDP-葡萄糖基转移酶突变体包括序列如SEQ ID NO:11所示的氨基酸片段。
进一步地，所述UDP-葡萄糖基转移酶突变体包括序列如SEQ ID NO:12所示的氨基酸片段。
本发明提供的核酸分子包括编码上述UDP-葡萄糖基转移酶突变体的核苷酸片段。
本发明提供的重组菌株合成表达上述UDP-葡萄糖基转移酶突变体。
进一步地，所述重组菌株的底盘细胞选自大肠杆菌DH5α、大肠杆菌TOP10、大肠杆菌BL21和大肠杆菌BL21(DE3)中的一种或多种。
本发明提供的复合酶制剂包括上述的UDP-葡萄糖基转移酶突变体。
本发明还提供了上述UDP-葡萄糖基转移酶突变体、核酸分子、重组菌株或复合酶制剂在莱鲍迪苷D制备中的应用。
本发明提供的莱鲍迪苷D的制备方法包括：取上述的UDP-葡萄糖基转移酶突变体或复合酶制剂与原料液混合，进行酶催化反应，得到所述莱鲍迪苷D；其中，所述原料液包括蔗糖合成酶、莱鲍迪苷A和UDP-葡萄糖。
进一步地，所述原料液中，所述蔗糖合成酶的浓度为10~40mM，所述莱鲍迪苷A的浓度为5~20g/L，所述UDP-葡萄糖的浓度为5~20mM。
进一步地，当与所述原料液混合的试剂为复合酶制剂时，以所述复合酶制剂中的蛋白质量计，所述复合酶制剂的添加量为600~800mg/L。
进一步地，所述酶催化反应的温度为30~40℃，时间为24~36h。
有益效果：
本发明提供的UDP-葡萄糖基转移酶突变体相较于包括序列如SEQ ID NO:1所示的氨基酸片段的原始的UDP-葡萄糖基转移酶而言，具有H18P突变和/或R370H突变，上述突变赋予了该UDP-葡萄糖基转移酶突变体更高的特异性催化莱鲍迪苷A转化成莱鲍迪苷D的活性，能够实现莱鲍迪苷A至莱鲍迪苷D高效率以及充分的转化，有利于莱鲍迪苷D大规模以及高效率生产的实现，具有良好的应用前景。
在一些具体的实施方式中还提供了一种复合酶制剂，该复合酶制剂是通过能够合成表达所述UDP-葡萄糖基转移酶突变体的重组菌株进行发酵后细胞破碎处理获得的，该复合酶制剂中不仅包括UDP-葡萄糖基转移酶突变体，还包括有重组菌株细胞中的全套酶系统，UDP-葡萄糖基转移酶突变体以及酶系统协同配合，共同构成酶联级反应，能够有效地发酵处理系统中相关物质的循环，以有效地降低底物浓度降低对UDP-葡萄糖基转移酶突变体催化莱鲍迪苷A转化为莱鲍迪苷D的活性的影响，能够进一步提高莱鲍迪苷A至莱鲍迪苷D的转化效率和转化率。
具体实施方式
本发明所涉及的氨基酸及核苷酸序列具体如表1所示。
表1.
本发明发明人基于对原始的UDP-葡萄糖基转移酶催化莱鲍迪苷A转化为莱鲍迪苷D的催化机制以及底物识别的机制的深刻理解，经过广泛且深入的研究以及大量的实验，创造性地发现——在原始的UDP-葡萄糖基转移酶的结构的基础上，引入特定位点和特定类型的突变，所得突变体中的底物结合区域具有严格的莱鲍迪苷A的识别和结合的能力，且催化活性区域具有催化糖基化反应形成β-1,2糖苷键的催化活性，从而赋予该突变体高特异性和高效率的催化莱鲍迪苷A转化为莱鲍迪苷D的活性。基于此，得到了本发明的技术方案。
在本发明中，所述UDP-葡萄糖基转移酶具有典型的GT-B折叠家族糖基转移酶结构特征，具体包括序列如SEQ ID NO:1所示的氨基酸片段或与SEQ ID NO:1所示序列具有至少90%同源性的变体序列。其中，所述变体序列为如SEQ ID NO:1所示的氨基酸片段经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的，且所发生的取代、缺失或添加并不影响UDP-葡萄糖基转移酶的生物活性。
在本发明中，参照SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列进行氨基酸残基位置的编号，所述UDP-葡萄糖基转移酶突变体相较于原始的UDP-葡萄糖基转移酶包括H18P突变和/或R370H突变。
在本发明中，所述H18P突变定义为原始的UDP-葡萄糖基转移酶的第18位上的氨基酸残基发生了由组氨酸至脯氨酸的突变。
在本发明中，所述R370H突变定义为原始的UDP-葡萄糖基转移酶的第370位上的氨基酸残基发生了由精氨酸至组氨酸的突变。
在一些具体的实施方式中，所述UDP-葡萄糖基转移酶突变体相较于原始的UDP-葡萄糖基转移酶具有H18P突变；此时，该UDP-葡萄糖基转移酶突变体具体包括序列如SEQ IDNO:10所示的氨基酸片段或与SEQ ID NO:10所示序列具有至少90%同源性的变体序列。其中，所述变体序列为如SEQ ID NO:10所示的氨基酸片段经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的，且所发生的取代、缺失或添加并不影响UDP-葡萄糖基转移酶突变体的生物活性。
在一些具体的实施方式中，所述UDP-葡萄糖基转移酶突变体相较于原始的UDP-葡萄糖基转移酶具有R370H突变；此时，该UDP-葡萄糖基转移酶突变体具体包括序列如SEQ IDNO:11所示的氨基酸片段或与SEQ ID NO:11所示序列具有至少90%同源性的变体序列。
在一些具体的实施方式中，所述UDP-葡萄糖基转移酶突变体相较于原始的UDP-葡萄糖基转移酶具有H18P突变和R370H突变；此时，该UDP-葡萄糖基转移酶突变体具体包括序列如SEQ ID NO:12所示的氨基酸片段或与SEQ ID NO:12所示序列具有至少90%同源性的变体序列。
基于获得上述UDP-葡萄糖基转移酶突变体为目的，本发明还提供了一种核酸分子。该核酸分子包括了编码上述UDP-葡萄糖基转移酶突变体的核苷酸片段。
在本发明中，所述核酸分子以能够指导合成相应结构的UDP-葡萄糖基转移酶突变体为限，本领域技术人员可根据以期获得的UDP-葡萄糖基转移酶突变体的结构以及所采用的宿主细胞对所述核酸分子的核苷酸序列进行设计，本发明并不对其加以特别的限定。
在一些具体的实施方式中，当以期获得的UDP-葡萄糖基转移酶突变体包括序列如SEQ ID NO:10所示的氨基酸片段时，且表达UDP-葡萄糖基转移酶突变体的宿主细胞为大肠杆菌时，所述核酸分子优选的包括序列如SEQ ID NO:7所示的核苷酸片段。
在一些具体的实施方式中，当以期获得的UDP-葡萄糖基转移酶突变体包括序列如SEQ ID NO:11所示的氨基酸片段时，且表达UDP-葡萄糖基转移酶突变体的宿主细胞为大肠杆菌时，所述核酸分子优选的包括序列如SEQ ID NO:8所示的核苷酸片段。
在一些具体的实施方式中，当以期获得的UDP-葡萄糖基转移酶突变体包括序列如SEQ ID NO:12所示的氨基酸片段时，且表达UDP-葡萄糖基转移酶突变体的宿主细胞为大肠杆菌时，所述核酸分子优选的包括序列如SEQ ID NO:9所示的核苷酸片段。
在本发明中，所述核酸分子除了包括上述UDP-葡萄糖基转移酶突变体的编码基因外，优选的还包括有实现不同功能的核苷酸序列，其具体可以是但不限制于启动子、增强子、转录终止信号、多腺苷酸化序列、复制起点、核酸限制性位点、同源重组位点、NdeⅠ酶切位点和XhoⅠ酶切位点中的一种或多种。
基于获得上述UDP-葡萄糖基转移酶突变体为目的，本发明还提供了一种重组菌株。该重组菌株能够合成表达上述UDP-葡萄糖基转移酶突变体。
在本发明中，所述重组菌株以能够合成相应结构的UDP-葡萄糖基转移酶突变体为限，本领域技术人员可根据以期获得的UDP-葡萄糖基转移酶突变体的结构，以现有常规使用的基因工程菌株作为底盘细胞，利用基因工程技术导入相应的UDP-葡萄糖基转移酶突变体的编码基因，从而构建得到重组菌株，本发明并不对其加以特别的限定。
在一些具体的实施方式中，所述重组菌株的底盘细胞的具体实例包括但不限制于：大肠杆菌DH5α、大肠杆菌TOP10、大肠杆菌BL21和大肠杆菌BL21(DE3)中的一种或多种。
基于上述UDP-葡萄糖基转移酶突变体所具有的优秀的生物催化合成效率，发明人在对重组菌株所表达的蛋白进行纯化以获得UDP-葡萄糖基转移酶突变体的纯酶制剂的过程中，创造性地发现：直接采用重组菌株的全细胞破碎液与蔗糖合成酶进行对莱鲍迪苷A进行酶催化反应，能够实现更加优秀的莱鲍迪苷D的合成效率和转化率。因此，本发明进一步提供了一种复合酶制剂，该复合酶制剂包括上述UDP-葡萄糖基转移酶突变体。
在本发明中，所述复合酶制剂的制备具体包括：取上述重组菌株发酵后进行细胞破碎处理，即得所述复合酶制剂。
在发明中，所述细胞破碎处理为现有生物领域中常规使用的一项技术手段，以能够实现细胞内酶蛋白的充分释放为限，本发明并不对其加以特别的限定，具体的实例包括但不限制于：机械破碎法、超声破碎法、渗透压突变法和冻融法中的一种或多种。
基于上述UDP-葡萄糖基转移酶突变体所具有的优秀的生物催化合成效率，本发明还提供了上述UDP-葡萄糖基转移酶突变体、重组菌株或复合酶制剂在莱鲍迪苷D制备中的应用。
基于上述UDP-葡萄糖基转移酶突变体在莱鲍迪苷D制备中的应用潜力，本发明还提供了一种莱鲍迪苷D的制备方法。该制备方法具体包括：取上述UDP-葡萄糖基转移酶突变体或复合酶制剂与原料液混合，进行酶催化反应，得到所述莱鲍迪苷D；其中，所述原料液包括蔗糖合成酶、莱鲍迪苷A和UDP-葡萄糖。
在本发明中，所述原料液中，所述蔗糖合成酶的浓度优选为10~40mM，如10mM、15mM、20mM、25mM、30mM、40mM或它们之间的任意值；所述莱鲍迪苷A的浓度优选为5~20g/L，如5g/L、8g/L、10g/L、15g/L、20g/L或它们之间的任意值；所述UDP-葡萄糖的浓度优选为5~20mM，如5mM、7.5mM、15mM、20mM或它们之间的任意值。
在本发明中，当与所述原料液混合的试剂为UDP-葡萄糖基转移酶突变体时，所述UDP-葡萄糖基转移酶突变体的添加量优选为600~800mg/L，如600mg/L、610mg/L、630mg/L、680mg/L、700mg/L、750mg/L、800mg/L或它们之间的任意值。
在本发明中，当与所述原料液混合的试剂为复合酶制剂时，以复合酶制剂中的蛋白质量计，所述复合酶制剂的添加量优选为600~800mg/L，如600mg/L、625mg/L、650mg/L、675mg/L、700mg/L、750mg/L、800mg/L或它们之间的任意值。
在本发明中，所述酶催化反应的条件具体包括温度优选为30~40℃，如30℃、32℃、33℃、35℃、37℃、39℃、40℃或它们之间的任意值；时间优选为4~48h，如4h、8h、12h、16h、36h、40h、48h或它们之间的任意值。
下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1
本实施例用以说明重组菌株的构建方法，该构建方法具体包括：
（1）基于原始的UDP-葡萄糖基转移酶的氨基酸序列（如SEQ ID NO:1所示）进行大肠杆菌密码子优化，并委托生物公司合成得到序列如SEQ ID NO:2所示的UDP-葡萄糖基转移酶的编码基因。
（2）采用表2所示的突变引物对UDP-葡萄糖基转移酶的编码基因进行PCR定点突变，以获得UDP-葡萄糖基转移酶H18P突变体的编码基因（如SEQ ID NO:7所示）、UDP-葡萄糖基转移酶R370H突变体的编码基因（如SEQ ID NO:8所示）和UDP-葡萄糖基转移酶H18P/R370H突变体的编码基因（如SEQ ID NO:9所示）。
表2.
PCR反应体系包括：2μL的DNA模版、0.5μL的正向引物、0.5μL的反向引物、4μL的5×反应缓冲液（近岸生物，货号为NR005）、1μL的NovoRec Plus重组酶（近岸生物，货号为NR005），ddH2O补齐至20μL。
PCR反应程序包括：95℃ 3min；55℃ 42s，70℃ 3min，29cycle；4℃保温。
（3）分别在上述UDP-葡萄糖基转移酶的编码基因、UDP-葡萄糖基转移酶H18P突变体的编码基因、UDP-葡萄糖基转移酶R370H突变体的编码基因、UDP-葡萄糖基转移酶H18P/R370H突变体的编码基因的两端添加BamHⅠ和HindIIⅠ酶切位点后进行合成，并使用BamHⅠ和HindIIⅠ酶切后重组至pET24a载体上，获得相对应的重组质粒。
（4）分别将上述获得的重组质粒转化E.coli TOP10感受态细胞，并涂布至含有100μg/mL氨苄青霉素的LB固体培养基（索莱宝，货号为L1015）上，于37℃下培养过夜，取每个单菌落中的部分细胞进行PCR鉴定及测序，将扩增正确的单菌落接种于含有100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基（索莱宝，货号为L1015）中培养，提取得到大量重组质粒。
（5）分别将上述获得的重组质粒转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞，并涂布至含有100μg/mL氨苄青霉素的LB固体培养基上，于37℃下培养过夜，取每个单菌落中的部分细胞进行PCR鉴定及测序，获得重组菌株WT、UGT-H18P、UGT-R370H和UGT-H18P/R370H。其中，各重组菌株所能合成表达的UDP-葡萄糖基转移酶（突变体）的具体氨基酸序列如表3所示。
表3.
实施例2
本实施例用以说明复合酶制剂的制备方法，该制备方法具体包括：
（1）按照5%的接种量，分别取实施例1提供的重组菌株WT、UGT-H18P、UGT-R370H和UGT-H18P/R370H接种于LB液体培养基中，于37℃、180rpm下培养16h，接着加入终浓度为0.5mM的IPTG，于37℃、180rpm下培养18h，获得相对应的发酵液。
（2）于220rpm下分别对各发酵液进行离心处理，收集得到各菌体；按照质量体积比为1:10取菌体和Tris-HCl缓冲液（pH=7.0）混合，得到菌悬液；取超声破碎仪对菌悬液进行细胞破碎处理，获得相对应的细胞破碎液，也即复合酶制剂1~4。其中，各复合酶制剂中所包括的UDP-葡萄糖基转移酶（突变体）具体如表4所示。
表4.
实施例3
本实施例用以说明以上实施例提供的复合酶制剂在生产莱鲍迪苷D中的应用，具体包括：
按照添加量为750mg/L（以复合酶制剂中的蛋白质量计），取各复合酶制剂与原料液混合，于37℃下进行酶催化反应36h，且每隔4h取样进行HPLC检测莱鲍迪苷D的浓度，并根据下式计算得到莱鲍迪苷D转化率（%），结果如表5所示。
转化率=（产生的莱鲍迪苷摩尔量/总投入的莱鲍迪苷A摩尔量）×100%
其中，原料液包括10g/L的莱鲍迪苷A、10mM的UDP-葡萄糖、20mM的蔗糖合成酶（上海生工，货号为D799786）和10mM的Tris-HCl缓冲液（pH=7.0）。
HPLC检测的条件包括：色谱柱为Agilent Zorbax SB-C18色谱柱(4.6mm×250mm，5μm)；流动相为乙腈-磷酸钠缓冲液(pH＝2.60，27:73v/v)；流速为1.0mL/min；柱温为40℃；进样量为10μL；检测波长为210nm。
表5.
由表5所示的测试结果可知，相较于原始的UDP-葡萄糖基转移酶而言，引入有H18P突变和/或R370H突变的UDP-葡萄糖基转移酶突变体具有更加优秀的生物催化合成效率，以实现莱鲍迪苷D的高效率制备；并且，本发明提供的复合酶剂的制备无需复杂的蛋白纯化操作，具有生产成本低、生产效率高等优点，工业化应用潜力优秀。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims (12)

1. 一种UDP-葡萄糖基转移酶突变体，其特征在于，相较于UDP-葡萄糖基转移酶，所述UDP-葡萄糖基转移酶突变体包括H18P突变和/或R370H突变；所述UDP-葡萄糖基转移酶包括序列如SEQ ID NO:1所示的氨基酸片段。
2. 根据权利要求1所述的UDP-葡萄糖基转移酶突变体，其特征在于，所述UDP-葡萄糖基转移酶突变体包括序列如SEQ ID NO:10所示的氨基酸片段。
3. 根据权利要求1所述的UDP-葡萄糖基转移酶突变体，其特征在于，所述UDP-葡萄糖基转移酶突变体包括序列如SEQ ID NO:11所示的氨基酸片段。
4. 根据权利要求1所述的UDP-葡萄糖基转移酶突变体，其特征在于，所述UDP-葡萄糖基转移酶突变体包括序列如SEQ ID NO:12所示的氨基酸片段。
5.一种核酸分子，其特征在于，所述核酸分子包括编码权利要求1~4中任意一项所述的UDP-葡萄糖基转移酶突变体的核苷酸片段。
6.一种重组菌株，其特征在于，所述重组菌株合成表达权利要求1~4中任意一项所述的UDP-葡萄糖基转移酶突变体。
7.一种复合酶制剂，其特征在于，所述复合酶制剂包括权利要求1~4中任意一项所述的UDP-葡萄糖基转移酶突变体。
8.权利要求1~4中任意一项所述的UDP-葡萄糖基转移酶突变体、权利要求5所述的核酸分子、权利要求6所述的重组菌株或权利要求7所述的复合酶制剂在莱鲍迪苷D制备中的应用。
9.一种莱鲍迪苷D的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：取权利要求1~4中任意一项所述的UDP-葡萄糖基转移酶突变体或权利要求7所述的复合酶制剂与原料液混合，进行酶催化反应，得到所述莱鲍迪苷D；其中，所述原料液包括蔗糖合成酶、莱鲍迪苷A和UDP-葡萄糖。
10.根据权利要求9所述的莱鲍迪苷D的制备方法，其特征在于，所述原料液中，所述蔗糖合成酶的浓度为10~40mM，所述莱鲍迪苷A的浓度为5~20g/L，所述UDP-葡萄糖的浓度为5~20mM。
11.根据权利要求9所述的莱鲍迪苷D的制备方法，其特征在于，当与所述原料液混合的试剂为复合酶制剂时，以所述复合酶制剂中的蛋白质量计，所述复合酶制剂的添加量为600~800mg/L。
12.根据权利要求9所述的莱鲍迪苷D的制备方法，其特征在于，所述酶催化反应的温度为30~40℃，时间为4~48h。
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