CN119371542A - 抗rage抗体及其应用 - Google Patents

Abstract

本申请公开了一种抗RAGE抗体，还公开了一种包含所述抗RAGE抗体的偶联物、双特异性、多特异性抗体、免疫细胞、融合蛋白等。本申请的抗RAGE抗体可靶向人、鼠、猴不同种属的RAGE抗原靶点，在科学研究和临床应用方面都具有很高的应用价值。

Description

抗RAGE抗体及其应用

技术领域

本申请属于生物工程领域，具体涉及一种抗RAGE抗体，一种包含所述抗RAGE抗体的偶联物、双特异性、多特异性抗体、免疫细胞、融合蛋白及其应用。

背景技术

晚期糖基化终产物特异性受体（Receptor for advanced glycationendproducts, RAGE, 或称为AGER），是免疫球蛋白超家族的多配体细胞表面成员。RAGE由胞外结构域、单跨膜结构域和胞质尾部组成。受体的胞外结构域由一个v型免疫球蛋白结构域和两个c型免疫球蛋白结构域组成。RAGE由多种细胞类型表达，如内皮细胞和平滑肌细胞、巨噬细胞和淋巴细胞，在许多不同的组织中，包括肺、心、肾、骨骼肌和脑。RAGE参与许多重要的病理学反应，包括阿尔茨海默病、糖尿病、炎症和癌症。RAGE刺激癌症生长、生存和转移。此外，RAGE表达与胃癌侵袭和转移密切相关。而且，有报道表明阻断RAGE可抑制胃癌细胞侵袭。有报道Ser82通过细胞分裂素(丝裂原)活化蛋白激酶(MAPK)和核因子κB(NF-κB)增强配体亲和力，上调受体信号。RAGE与晚期糖基化终产物(AGEs)、S100蛋白等相作用。配体与受体RAGE的作用激活重要细胞通路，包括MAPK，Cdc42/Rac和NF-κB信号通路。

目前已报道的绝大多数抗RAGE抗体分子仅对单一种属来源的RAGE具有较高的亲和力，但是抗原种属单一限制了抗体的通用性。

发明内容

针对现有技术中的上述问题，本申请提供了一种抗RAGE抗体，其可靶向人、鼠、猴不同种属的RAGE抗原靶点，同时抗RAGE抗体对RAGE抗原蛋白和细胞表面RAGE抗原具有高效结合活性，无论是科学研究还是临床应用都具有很高的应用价值。

本申请的具体技术方案如下：

1. 一种抗RAGE抗体，其中，所述抗体包含三个重链互补决定区和三个轻链互补决定区，所述三个重链互补决定区为CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，所述三个轻链互补决定区为CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其中：

所述CDR-H1包含的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，SEQ ID NO：1为SSYAMH；

所述CDR-H2包含的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，SEQ ID NO：2为VISYDGSNKY；

所述CDR-H3包含的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示，SEQ ID NO：3为DRRWNFFDP；

所述CDR-L1包含的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示，SEQ ID NO：4为HVIGSWLA；

所述CDR-L2包含的氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示，SEQ ID NO：5为IYAASSLQS；以及

所述CDR-L3包含的氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示，SEQ ID NO：6为QGNSFPIT。

2. 根据项1所述的抗RAGE抗体，其包含人类通用框架区。

3. 根据项1所述的抗RAGE抗体，其中，所述抗体包含重链可变区和轻链可变区，其中：

所述重链可变区包含的氨基酸序列如SEQ ID NO：7所示，或为与SEQ ID NO：7具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列，其中SEQ ID NO：7为QVQLVQSGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMHWVRQAPGKGLEWVAVISYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDRRWNFFDPWGQGTLVTVSS；

所述轻链可变区包含的氨基酸序列如SEQ ID NO：8所示，或为与SEQ ID NO：8具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%同一性的氨基酸序列，其中，SEQ ID NO：8为NIQLTQSPSSVSASVGDRVTITCRASHVIGSWLAWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTITNLQPEDFATYYCQQGNSFPITFGQGTRLDIK。

4. 根据项1~3中任一项所述的抗RAGE抗体，其为人抗体、人源化抗体或嵌合抗体。

5. 根据项1~3中任一项所述的抗RAGE抗体，其为IgG全长抗体。

6. 根据项1~3中任一项所述的抗RAGE抗体，其为IgG1全长抗体。

7. 根据项1~3中任一项所述的抗RAGE抗体，其为选自以下任意一种的抗原结合片段：Fv、Fab、F(ab')2、Fab'、Fd、dsFv、scFv、sc(Fv)2、dAb、分离的互补决定区、结构域特异性抗体、单结构域抗体、结构域缺失抗体、CDR嫁接抗体、双抗体、三抗体、四抗体和微抗体。

8. 根据项1~3中任一项所述的抗RAGE抗体，其与人、猴和鼠来源的RAGE抗原结合。

9. 包含根据项1~8中任一项所述的抗RAGE抗体的偶联物。

10. 根据项9所述的偶联物，其包括与所述抗RAGE抗体偶联的治疗剂。

11. 根据项10所述的偶联物，所述治疗剂选自细胞毒性剂、激素制剂、靶向小分子制剂、蛋白酶体抑制剂、免疫调节剂、血管生成抑制剂、细胞增殖抑制剂、促细胞凋亡剂、细胞因子、共刺激分子的激活剂中的一种或多种。

12. 包含根据项1~8中任一项所述的抗RAGE抗体的双特异性或多特异性抗体。

13. 包含项1~8中任一项所述的抗RAGE抗体或其编码核酸的免疫细胞。

14. 根据项13所述的免疫细胞，其为NK细胞、T细胞或树突细胞。

15. 包含项1~8中任一项所述的抗RAGE抗体和一种或多种多肽或蛋白的融合蛋白。

16. 一种编码项1~8中任一项所述的抗RAGE抗体的核酸分子。

17. 一种表达载体，其包含项16所述的核酸分子。

18. 一种细胞，其包含项16所述的核酸分子或项17所述的表达载体。

19. 项1~8中任一项所述的抗RAGE抗体、项9~11中任一项所述的偶联物、项12所述的双特异性或多特异性抗体、项13或14所述的免疫细胞或项15所述的融合蛋白在制备诊断、治疗和/或预防疾病的药物中的用途。

发明的效果

本申请的抗RAGE抗体是人、鼠、猴交叉分子，其可靶向人、鼠、猴不同种属的RAGE抗原靶点，无论是科学研究还是临床应用都具有很高的应用价值。

附图说明

图1A为三种His标签抗原的考马斯亮蓝染色结果图； 图1B为三种Fc标签抗原的考马斯亮蓝染色结果图。

图2A为 h11E6.16抗体的考马斯亮蓝染色结果图；图2B为对照抗体的考马斯亮蓝染色结果图。

图3为h11E6.16抗体的HPLC-SEC图谱。

图4A显示不同抗原与h11E6.16抗体(P38411)的结合活性；图4B~图4C显示不同抗原与Anti-hRAGE(P46085)的结合活性。

图5为RAGE抗原的生物素标记效果检测结果图。

图6A为Biotin标记前后的Fc标签RAGE抗原结合抗体活性分析结果；图6B为Biotin标记前后的His标签RAGE抗原结合抗体活性分析结果。

图7A为质粒p318瞬转至293F细胞构建的高表达RAGE细胞系的细胞流式图；图7B~图7D为质粒p318瞬转至293F细胞构建的高表达RAGE细胞系的WB检测结果；图7E质粒p318瞬转至293F细胞构建的高表达RAGE细胞系的共聚焦显微镜下照片。

图8A为质粒p605瞬转至HepG2细胞构建的高表达RAGE细胞系的细胞流式图；图8B~图8D为质粒p605瞬转至HepG2细胞构建的高表达RAGE细胞系的WB检测结果。

图9A和图9B为显示各候选噬菌体抗体群对human RAGE抗原表达细胞特异性结合能力的流式细胞结果。

图10A~图10L为显示各候选噬菌体抗体群对不同种属RAGE抗原特异性结合能力的Elisa结果图。

图11A和图11B为显示各候选抗体在p318-293F细胞上的结合能力的流式细胞结果。

图12A~图12L为真核表达抗体上清与抗原Human-RAGE-Fc (P38406)、Cyno-RAGE-Fc (P38408)、Mouse-RAGE-Fc (P38410)的结合活性分析结果。

图13A为本申请的antiRAGE-Fc抗体的SDS-PAGE电泳结果图；图13B为显示本申请的antiRAGE-Fc抗体与p605瞬转HepG2细胞特异性结合的流式细胞图。

具体实施方式

下面将参照附图更详细地描述本申请的具体实施方案。虽然附图中显示了本申请的具体实施方案，然而应当理解，可以以各种形式实现本申请而不应被这里阐述的实施方案所限制。相反，提供这些实施方案是为了能够更透彻地理解本申请，并且能够将本申请的范围完整的传达给本领域的技术人员。

需要说明的是，在通篇说明书及权利要求当中所提及的“包含”或“包括”为一开放式用语，故应解释成“包含但不限定于”。说明书后续描述为实施本申请的较佳实施方案，然所述描述乃以说明本申请的一般原则为目的，并非用以限定本申请的范围。本申请的保护范围当视所附权利要求所界定者为准。

定义

除非另有定义，本文使用的所有科技术语具有本领域普通技术人员所理解的相同含义。

在本文中，术语“晚期糖基化终产物特异性受体(Receptor for advancedglycation endproducts, RAGE, 或称为AGER)”，是免疫球蛋白超家族的多配体细胞表面成员。RAGE由胞外结构域、单跨膜结构域和胞质尾部组成。受体的胞外结构域由一个v型免疫球蛋白结构域和两个c型免疫球蛋白结构域组成。RAGE由多种细胞类型表达，如内皮细胞和平滑肌细胞、巨噬细胞和淋巴细胞，在许多不同的组织中，包括肺、心、肾、骨骼肌和脑。

在本文中，术语“抗体”是一类能与抗原特异性结合的免疫球蛋白。此类分子通常包含通过二硫键相互连接的两条重链(H)和两条轻链(L)。每条重链由重链可变区(VH)和重链恒定区组成。重链恒定区由三个结构域CH1、CH2和CH3组成。每条轻链由轻链可变区(VL)和轻链恒定区组成。轻链恒定区由一个结构域CL组成。抗体重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，宿主组织或因子包括免疫系统的各种细胞(如效应细胞)和补体系统的组分如C1q (补体激活经典途径中的第一组分)。

抗体的重链可分为三个功能区：Fd区、铰链区和Fc区(可结晶片段)。Fd区包含VH和CH1结构域，并与轻链结合形成Fab (抗原结合片段)。Fc片段负责免疫球蛋白效应功能，包括例如补体结合和与效应细胞的同源Fc受体结合。在IgG、IgA和IgD免疫球蛋白类别中发现的铰链区充当柔性间隔区，允许Fab部分相对于Fc区在空间中自由移动。铰链结构域在结构上多种多样，在免疫球蛋白类别和亚类之间的序列和长度都不同。

“轻链可变区”(VL)和“重链可变区”(VH)从氨基端至羧基端都包含以下框架区(FR)和CDR区：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。轻链可变区的CDR1、CDR2和CDR3在本文中也分别称为CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3；重链可变区的CDR1、CDR2和CDR3在本文中也分别称为CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3。

CDR可以根据Kabat定义、Chothia定义、Kabat定义和Chothia定义两者的累积、AbM定义、接触定义、IMGT独特编号定义和/或构象定义或本领域熟知的任何CDR确定方法来确定。在本申请中，利用Kabat定义确定CDR序列。

基于抗体重链恒定区的氨基酸序列，免疫球蛋白分子可以分为五类(同种型)：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并可以进一步分为不同的亚型，如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2等。基于轻链的氨基酸序列，抗体的轻链可以分为lambda (λ)链和kappa (κ)链。

在本文中，术语“抗体”应以其最广泛的意义来理解，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、抗原结合片段等。抗体可以含有另外的修饰，如非天然存在的氨基酸、Fc区中的突变、以及糖基化位点的突变。抗体还包括翻译后修饰的抗体、含有抗体的抗原决定簇的融合蛋白、以及含有对抗原识别位点的任何其他修饰的免疫球蛋白分子，只要这些抗体表现出期望的生物活性。

在本文中，术语“抗原结合片段”可以通过重组DNA技术或通过完整抗体的酶促切割或化学切割产生。本文所述的抗原抗体片段实例包括但不限于：(1) 具有抗体单臂的VL和VH结构域的Fv片段；(2) 具有VL、CL、VH和CH1结构域的Fab片段；(3) Fab’片段，即在CH1结构域的C末端具有一个或多个半胱氨酸残基的Fab片段；(4) F(ab’)2片段，包含在铰链区通过二硫键桥接的两个Fab’片段的二价片段；(5) 具有VH和CH1结构域的Fd片段；(6) dsFv片段，即二硫键稳定性Fv抗体；(7) 由一条重链可变区与一条轻链可变区相连而成的scFv片段；(8) sc(Fv)2片段，两个轻链可变区(VL)和两个重链可变区(VH)共四个可变区通过接头结合制成的单链抗体；(9) 由VH结构域组成的dAb片段；(10) 分离的互补决定区；(12)特异性结合结构域的抗体；(13) 仅包含整个抗体的单个可变结构域的抗体片段的单结构域抗体（如纳米抗体，其为只有重链可变区的单结构域抗体）；(14) 结构域缺失抗体；(15)CDR嫁接抗体，指包含来自一个物种的重链可变区和轻链可变区序列的抗体，但其中VH和/或VL的一个或多个CDR区域的序列用另一个物种的CDR序列替换，诸如具有鼠重链可变区和轻链可变区的抗体，其中一个或多个鼠CDRs(例如，CDR3)已用人CDR序列替换；(16) 双抗体，其为当第一scFv的VH结构域与第二scFv的VL结构域组装在一起，并且第一scFv的VL结构域与第二scFv的VH结构域组装在一起时，形成的二聚化scFv，双抗体的两个抗原结合结构域可以针对相同或不同的表位；(17) 三抗体，其为三聚体scFv，以类似于双抗体的方式形成，但是其中在单个复合物中产生三个抗原结合结构域，三个抗原结合结构域可以针对相同或不同的表位；(18) 四抗体，其为四聚体scFv，以与双抗体相似的方式形成，但其中在单个复合物中产生四个抗原结合结构域；四个抗原结合结构域可指向相同或不同的表位；(19) 微抗体，其为融合至CH3结构域的scFv(参见Olafsen等，ProteinEng Des Sel.，第17卷：315-23，2004)。

在本文中，术语“双特异性抗体”是指具有源自两个不同的单克隆抗体的片段并且能够与两个不同的表位结合的人工抗体。所述两个表位可以存在于同一个抗原上，或者其可以存在于两个不同的抗原上。

在本文中，术语“多特异性抗体”是指与至少两个不同的抗原或相同抗原的至少两个不同的表位特异性结合的抗体。多特异性抗体可以与，例如，两个、三个、四个、五个或更多不同的抗原结合，或者可以与相同抗原的两个、三个、四个、五个或更多不同的表位结合。

在本文中，术语“单克隆抗体(Monoclonal Antibody, mAb)” 或“mAb”或“Mab”是指同质抗体群，即除了可能以少量存在的可能的天然出现的突变和/或翻译后修饰(例如异构化、酰胺化)之外，构成群体的各个抗体是相同的。单克隆抗体是高度特异性的，针对单个抗原或表位。“单克隆”表明抗体从基本上同质的抗体群获得的特征，不应解释为限制抗体的结构、来源或制备方式。在一些实施方案中，单克隆抗体通过杂交瘤法、噬菌体展示法、酵母展示法、重组DNA法、单细胞筛选或单细胞测序法制备得到。

在本文中，术语“人抗体”是具有对应于由人产生的抗体的氨基酸序列的氨基酸序列和/或已经使用任何制备人抗体的技术制备的抗体。人抗体的该定义特别排除了包含非人抗原结合残基的人源化抗体。可以使用本领域已知的多种技术来生产人抗体，这些技术包括噬菌体展示文库(Hoogenboom and Winter,1991,J.Mol.Biol.227:381；Marks etal.,1991,J.Mol.Biol.222:581)和酵母展示文库(Chao et al.,2006,NatureProtocols1:755-68)。也可用于制备人单克隆抗体的方法描述于：Cole et al.,Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy 77(1985)；Boerner et al.,1991,J.Immunol.147(1):86-95；以及van Dijk and van de Winkel,2001,Curr.Opin.Pharmacol.5:368-74。人抗体可以通过将抗原施用于转基因动物(例如小鼠)来制备，该转基因动物已被修饰以响应抗原攻击而产生此类抗体但其内源基因座已失能(参见例如，Jakobovits,1995,Curr.Opin.Biotechnol.6(5):561-66；Brüggemann andTaussing,1997,Curr.Opin.Biotechnol.8(4):455-58，以及涉及XENOMOUSE^TM技术的美国专利US6,075,181和6,150,584)。关于通过人B细胞杂交瘤技术产生的人抗体，也参见例如，Liet al.,2006,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 103:3557-62。

在本文中，术语“嵌合抗体”是指组合有来自不同物种的抗体片段的抗体。具体的，例如来自一个物种(例如小鼠)的一种单克隆抗体，其Fc恒定区经由DNA重组技术替换为来自一个物种(例如人)的Fc恒定区。参见例如专利申请PCT/US86/02269；EP/173,494。

在本文中，术语“人源化抗体”是指包含人免疫球蛋白框架区和来自非人(例如小鼠、大鼠、兔或合成)免疫球蛋白的一个或多个CDR的抗体。除CDR以外，人源化抗体中的所有其他部分与天然人免疫球蛋白序列的相应部分基本相同。通过基因工程构建人源化抗体的方法参见例如专利申请US/5,585,089。

在本文中，术语“特异性结合”是指由抗原决定簇和抗体分子可变区空间构象决定的以高亲和力互补结合的特性。这种高亲和力决定了所述抗体分子一旦与所述抗原结合，便可发挥其相应的生理功能，例如，在本申请的一些实施例中，所述抗体结合并帮助清除所述抗原的功能。

在本文中，术语“人类通用框架”为代表在选择人类免疫球蛋白VL或VH框架序列中最常存在的氨基酸残基的框架。一般而言，人类免疫球蛋白VL或VH序列选自于可变域序列的亚组。一般而言，序列亚组为如Kabat等人，Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest，第5版，NIH Publication 91-3242，Bethesda MD(1991)，第1-3卷中的亚组。在一些实施方案中，对于VL而言，所述亚组为如Kabat等人(同上)描述的亚组。在一些实施方案中，对于VH而言，所述亚组为如Kabat等人(同上)描述的亚组III。

在本文中，术语“同源性”或“同一性”指两序列间氨基酸残基或核苷酸残基完全相同的百分数。如果待相互比较的两序列长度有别，则序列“同源性”或“同一性”优选是指较短序列中与较长序列氨基酸残基或核苷酸残基完全相同的核苷酸残基的百分数。序列同一性可以通过使用本领域常用的序列分析软件，诸如Wisconsin序列分析包等常规确定。

在本文中，术语“偶联物”(也简称为“ADC”)，是指通过将治疗剂与抗体直接地或经由一个或多个适当的连接子间接地共价偶联形成的偶联物。ADC通常为抗体-连接子-治疗剂偶联物的形式。抗体-治疗剂偶联物将抗体和治疗剂(细胞毒性分子或具有其他特性的物质)两者的理想性质组合，通过将强力的治疗剂(细胞毒性分子或具有其他特性的物质)靶向表达抗原的肿瘤细胞(或其他细胞/器官)，由此增强它们的抗肿瘤(或其他医药)活性。ADC的设计意图是区分健康细胞和病变组织，例如肿瘤中的肿瘤细胞。

在本文中，术语“治疗剂”是指具有例如抗肿瘤效果、抗感染或抗炎症效果并具有允许连接至连接子结构的至少一个取代基团或部分结构的任何细胞毒性分子。治疗剂可以杀死细胞(例如癌细胞)和/或抑制细胞(例如癌细胞)的生长、增殖或转移，由此减少、缓解或消除疾病或病症(例如癌症)的一个或多个症状。

在本文中，术语“载体”通常是指能够在合适的宿主中自我复制的核酸分子，其将插入的核酸分子转移到宿主细胞中和/或宿主细胞之间。所述载体可包括主要用于将DNA或RNA 插入细胞中的载体、主要用于复制DNA或RNA的载体，以及主要用于DNA或RNA的转录和/或翻译的表达的载体。所述载体还包括具有多种上述功能的载体。所述载体可以是当引入合适的宿主细胞时能够转录并翻译成多肽的多核苷酸。通常，通过培养包含所述载体的合适的宿主细胞，所述载体可以产生期望的表达产物。

在本文中，术语“核酸”或“多核苷酸”或“核酸分子”通常是指脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)及其单链形式或双链形式的聚合物。除非特别限定，否则该术语可以包括含天然核苷酸的类似物的核酸，所述核酸具有与参考核酸(例如示出了序列信息)相似的结合特性并且按照与天然存在核苷酸相似的方式代谢。除非另外说明，核酸的序列可以包括其保守方式修饰的变体，例如简并密码子置换、等位基因、直向同源物、SNP 和互补序列，以及明确指出的序列。

在本文中，术语“治疗”是指导致治疗的任何可观察到的有益效果的干预，或任何在治疗或改善疾病或病况方面具有统计学显著成功的指标，诸如改善疾病或病理状况的体征、症状或进展。例如，有益效果可以通过在受试者中减少疾病、推迟疾病发作或减轻疾病临床症状的严重程度、减少受试者经历疾病症状的频率、减缓疾病的进展、减少疾病复发的次数、改善受试者的整体健康状况，或通过对特定疾病具有特异性的其他参数来证明。

在本文中，术语“预防”是施用于没有表现出疾病体征或只表现出早期体征的受试者的治疗，目的是降低病理发展或早期疾病进一步发展的风险。

抗RAGE抗体

本申请提供了一种抗RAGE抗体，其包含三个重链互补决定区和三个轻链互补决定区，所述三个重链互补决定区为CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，所述三个轻链互补决定区为CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其中：

所述CDR-H1的氨基酸序列如SEQ ID NO：1(SSYAMH)所示；

所述CDR-H2的氨基酸序列如SEQ ID NO：2(VISYDGSNKY)所示；

所述CDR-H3的氨基酸序列如SEQ ID NO：3(DRRWNFFDP)所示；

所述CDR-L1的氨基酸序列如SEQ ID NO：4(HVIGSWLA)所示；

所述CDR-L2的氨基酸序列如SEQ ID NO：5(IYAASSLQS)所示；以及

所述CDR-L3的氨基酸序列如SEQ ID NO：6(QGNSFPIT)所示。

在一些实施方案中，所述抗RAGE抗体包含人类通用框架区。在一些实施方案中，所述VH包含人类亚组III通用框架区(FR)。在一些实施方案中，所述VL包含人类亚组通用框架。在一些实施方案中，包含人类通用框架区(FR)和在人类通用框架区(FR)基础上的一个或多个氨基酸取代。

在一些实施方案中，所述框架区为人类通用框架区，并且包含一个或多个(例如1-20、1-15、1-10、1-5、1-4、1-3个)氨基酸取代、缺失或插入。在一些实施方案中，所述框架区为人类通用框架区或与人类通用框架区具有70%、80%、90%、95%、97%、98%、99%同一性。

在一些实施方案中，所述抗体包含重链可变区和轻链可变区，其中：

所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：7(QVQLVQSGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMHWVRQAPGKGLEWVAVISYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDRRWNFFDPWGQGTLVTVSS)所示，或为与SEQ ID NO：7具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列；

所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：8(NIQLTQSPSSVSASVGDRVTITCRASHVIGSWLAWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTITNLQPEDFATYYCQQGNSFPITFGQGTRLDIK)所示，或为与SEQ ID NO：8具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%同一性的氨基酸序列。

在一些实施方案中，所述抗RAGE抗体为人抗体、人源化抗体或嵌合抗体。

在一些实施方案中，所述抗RAGE抗体为IgG全长抗体，优选为IgG1全长抗体。

在一些实施方案中，所述抗RAGE抗体为选自以下任意一种的抗原结合片段：Fv、Fab、F(ab')2、Fab'、Fd、dsFv、scFv、sc(Fv)2、dAb、VH-CH1-CH2-CH3、VH-CH1、scFv-Fc、分离的互补决定区、结构域特异性抗体、单结构域抗体、结构域缺失抗体、CDR嫁接抗体、双抗体、三抗体、四抗体和微抗体。

在一些实施方案中，所述抗RAGE抗体包括重链和轻链，其中重链构型为VH-CH(IgG1)，轻链构型为VL-CL(Kappa)。

在上述实施方案中，VH序列如SEQ ID NO：7所示，CH(IgG1)序列如SEQ ID NO：9(ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK)所示；CL(Kappa)序列如SEQ ID NO：10 (RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC) 所示，VL序列如SEQ ID NO：8所示。

在一些实施方案中，所述抗RAGE抗体与人、猴或鼠来源的RAGE抗原结合，所述抗RAGE抗体是人、鼠、猴交叉分子，无论从科研还是临床上具有更加广泛的实用性。在一些实施方案中，所述鼠为大鼠或小鼠。在一些实施方案中，所述猴包括但不限于猕猴属动物。

偶联物

本申请还提供一种包含前述任一种抗RAGE抗体的偶联物。

在一些实施方案中，所述偶联物还包括与所述抗RAGE抗体偶联的治疗剂。在一些实施方案中，所述治疗剂选自细胞毒性剂、激素制剂、靶向小分子制剂、蛋白酶体抑制剂、免疫调节剂、血管生成抑制剂、细胞增殖抑制剂、促细胞凋亡剂、细胞因子、共刺激分子的激活剂中的一种或多种。

细胞毒性剂的实例包括但不限于，蒽环霉素、奥里斯他汀、CC-1065、尾海兔素(dolastatin)、多卡米星、烯二炔、格尔德霉素(geldanamycin)、美登素(maytansine)、嘌呤霉素、紫杉烷、长春花生物碱、SN-38、微管溶素(tubulysin)、哈米特林(hemiasterlin)、艾日布林、曲贝替定(trabectedin)、卢比替定(lubinectedin)及其立体异构体、类似物或衍生物。

激素制剂的实例包括但不限于，他莫昔芬(tamoxifen)、奥那普斯通(onapristone)，雷洛昔吩(raloxifene)(Evista)、4-羟基三苯氧胺(4-hydroxytamoxifen)、曲沃西芬(trioxifene)、凯西酚(keoxifene)、LY117018、氟他胺(flutamide)和尼鲁米特(nilutamide)；以及上述物质药学上可接受的盐、酸或衍生物。

细胞因子的实例包括但不限于，生长激素，如人生长激素、N-甲硫酰基人生长激素和牛生长激素；甲状旁腺激素；甲状腺素；胰岛素；胰岛素原；松弛素；松弛素原；糖蛋白激素(如促卵泡激素(FSH)；促甲状腺素(TSH)和促黄体素(LH))；肝细胞生长因子；成纤维细胞生长因子；促乳素；胎盘催乳素；肿瘤坏死因子α和β；米勒抑制物；小鼠促性腺激素相关肽；抑制素；活化素；血管内皮生长因子；整联蛋白；血小板生成素(TPO)；神经生长因子(如NGF-β)；血小板生长因子；转化生长因子(TGF)(如TGF-α和TGF-β)；胰岛素样生长因子I和II；促红细胞生成素(EPO)；骨诱导因子(osteoinductivefactor)；干扰素(如干扰素α；β和γ)；集落刺激因子(CSF)(如巨噬细胞-CSF(M-CSF)；粒细胞-巨噬细胞-CSF(GM-CSF)和粒细胞-CSF(G-CSF))；白细胞介素(IL)(如IL-1；IL-1α；IL-2；IL-3；IL-4；IL-5；IL-6；IL-7；IL-8；IL-9；IL-11；IL-12)；肿瘤坏死因子如TNF-α或TNF-β；以及其它多肽因子(包括LIF和盒配体(KL，kit ligand))。本文所用的术语细胞因子包括来自天然的或重组细胞培养的蛋白以及天然序列细胞因子的生物活性等价物。

靶向小分子制剂的实例包括但不限于，厄洛替尼、吉非替尼、奥希替尼、阿法替尼、埃克替尼、达克替尼、索拉非尼、伊马替尼、舒尼替尼。

蛋白酶体抑制剂的实例包括但不限于，硼替佐米、伊沙佐米、卡非佐米、奥普佐米、地兰佐米、马里佐米、MG132。

免疫调节剂的实例包括但不限于，胸腺素、左旋咪唑、Toll样受体调节剂、STING调节剂。

血管生成抑制剂的实例包括但不限于，贝伐珠单抗、阿帕替尼、安罗替尼、索拉非尼、西妥昔单抗。

细胞增殖抑制剂是指对细胞具有细胞生长抑制效应、由此抑制细胞的特定亚组的生长和/或扩增的药剂。

双特异性或多特异性抗体、亲脂基团修饰的抗体、免疫细胞

本申请还提供包含前述任一种抗RAGE抗体的双特异性或多特异性抗体。

本申请的双特异性抗体包含抗RAGE抗体或其抗原结合片段，和另外的抗体或其片段，或抗体类似物。

在一些实施方案中，所述多特异性抗体为三特异性抗体或四特异性抗体。

本申请的多特异性抗体包含抗RAGE抗体或其抗原结合片段，和另外的两种或三种抗体或其片段，或抗体类似物。

属于双特异性抗体或多特异性抗体的抗体可为基于scFv的抗体、基于Fab的抗体或基于IgG的抗体。双特异性抗体或多特异性抗体可以同时抑制或放大两种或更多种信号，因此比抑制/放大一种信号的单抗体更有效。与用每种信号抑制剂处理每种信号时相比，其可以低剂量给药，并且可以在相同的时间和空间抑制/放大两种或更多种信号。

产生双特异性或多特异性抗体的方法是公知的。传统上，在其中两种或更多种重链具有不同的特异性的条件下，双特异性抗体的重组产生是基于两种或更多种免疫球蛋白重链/轻链对的共表达。

本申请还提供一种包含前述任一种抗RAGE抗体或其编码核酸的免疫细胞。

在一些实施方案中，免疫细胞可以选自T细胞、NK细胞、细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)、激活的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)、巨噬细胞、肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)和树突状细胞中的一种或多种。

融合蛋白

本申请还提供一种包含前述任一种抗RAGE抗体和一种或多种多肽或蛋白的融合蛋白。

在一些实施方案中，所述多肽或蛋白为支架蛋白或其截短体或变体、抗体或细胞因子。

在本文中，“支架蛋白的截短体”指的是支架蛋白原始序列的任一片段。

在本文中，“支架蛋白的变体”指通过至少一个氨基酸残基的添加、删除或取代区别于原始支架蛋白的蛋白。在一些实施方案中，支架蛋白的变体通过可以是保守的或非保守的一个或多个取代与原始支架蛋白区分。在一些实施方案中，支架蛋白的变体包含保守性取代。支架蛋白的变体还包括其中一个或多个氨基酸被添加或删除、或者被另外氨基酸残基取代的支架蛋白。

在一些实施方案中，所述抗体选自Fv、Fab、F(ab')2、Fab'、Fd、dsFv、scFv、sc(Fv)2、dAb、分离的互补决定区、结构域特异性抗体、单结构域抗体、结构域缺失抗体、CDR嫁接抗体、双抗体、三抗体、四抗体和微抗体中任意一种或两种以上。

核酸分子、表达载体、细胞

本申请还提供一种编码前述任一种抗RAGE抗体的核酸分子。

在一些实施方案中，编码所述抗RAGE抗体重链的核酸分子的序列如SEQ ID NO：11所示，或为与SEQ ID NO：11具有至少70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相似性的核苷酸序列；编码所述抗RAGE抗体轻链的核酸分子的序列如SEQ IDNO：12所示，或为与SEQ ID NO：12具有至少70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相似性的核苷酸序列。

其中，SEQ ID NO：11为：

CAAGTGCAGCTGGTTCAGAGCGGCGGAGGCCTGGTGAAACCTGGAGGATCTCTGAGACTGAGCTGTGCTGCTTCTGGCTTTACATTCAGCAGCTATGCCATGCACTGGGTGCGGCAGGCCCCTGGCAAGGGCCTGGAATGGGTCGCCGTGATCAGCTACGACGGCTCCAACAAGTACTACGCCGACAGCGTGAAGGGCAGATTCACCATCTCTAGAGATAATAGCAAGAACACCCTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGCGGGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCAGAGATAGACGGTGGAACTTCTTCGACCCCTGGGGCCAGGGCACACTCGTGACCGTGTCCAGC

SEQ ID NO：12为：

AATATCCAGCTGACACAGAGCCCCAGCAGCGTGTCCGCCAGCGTCGGCGACAGAGTGACCATCACCTGTAGAGCCAGCCACGTGATCGGCAGCTGGCTGGCTTGGTATCAGCAGAAACCTGGCAAGGCCCCTAAGCTGCTGATCTACGCCGCTTCTAGCCTCCAGTCCGGCGTGCCATCTAGATTCAGCGGAAGCGGATCTGGCACAGATTTTACCCTGACCATTACAAACCTGCAGCCTGAGGACTTCGCCACATACTACTGCCAGCAAGGCAACAGCTTCCCCATCACCTTCGGCCAGGGCACCCGGCTGGACATCAAG

本申请还提供一种包含前述任一种核酸分子的表达载体。

在一些实施方案中，所述表达载体可以是任何类型的质粒，其是指其中可以例如通过标准分子克隆技术插入另外的DNA片段的环状双链DNA环。

本申请还提供一种包含前述任一种核酸分子或表达载体的细胞。

本申请的抗体可以展示在任意递送载体上。

在一些实施方案中，本申请的递送载体内负载其他药物分子。

制药用途以及诊断、治疗和/或预防疾病的方法

本申请还提供一种前述任一种抗RAGE抗体、偶联物、双特异性或多特异性抗体、免疫细胞或融合蛋白在制备诊断、治疗和/或预防疾病的药物中的用途。

例如，所述疾病为免疫性疾病或癌症，所述癌症可为肺癌。

实施例

实施例1 RAGE抗原蛋白及抗原细胞构建

1.1 合成人、猴和鼠不同来源的RAGE抗原蛋白，用于抗体筛选。

实验方法：

(1) 表达合成6个不同来源及不同标签的RAGE抗原蛋白胞外域（extracellulardomain, ECD），抗原设计信息及表达合成结果如下表1所示，其中，Human-RAGE-ECD-Fc(IgG1)的氨基酸序列如SEQ ID NO：13(AQNITARIGEPLVLKCKGAPKKPPQRLEWKLNTGRTEAWKVLSPQGGGPWDSVARVLPNGSLFLPAVGIQDEGIFRCQAMNRNGKETKSNYRVRVYQIPGKPEIVDSASELTAGVPNKVGTCVSEGSYPAGTLSWHLDGKPLVPNEKGVSVKEQTRRHPETGLFTLQSELMVTPARGGDPRPTFSCSFSPGLPRHRALRTAPIQPRVWEPVPLEEVQLVVEPEGGAVAPGGTVTLTCEVPAQPSPQIHWMKDGVPLPLPPSPVLILPEIGPQDQGTYSCVATHSSHGPQESRAVSISIIEPGEEGPTAGSVGGSGLGTLAEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK)所示，Cyno-RAGE-ECD-Fc(IgG1)的氨基酸序列如SEQ ID NO：14(AQNITARIGEPLVLKCKGAPKKPPQQLEWKLNTGRTEAWKVLSPQGGPWDSVARVLPNGSLFLPAVGIQDEGIFRCQAMNRNGKETKSNYRVRVYQIPGKPEIIDSASELTAGVPNKVGTCVSEGSYPAGTLSWHLDGKPLVPNEKGVSVKEETRRHPETGLFTLQSELMVTPARGGNPHPTFSCSFSPGLPRRRALHTAPIQPRVWEPVPLEEVQLVVEPEGGAVAPGGTVTLTCEVPAQPSPQIHWMKDGVPLPLSPSPVLILPEIGPQDQGTYRCVATHPSHGPQESRAVSISIIEPGEEGPTAGSVGGSGPGTLAEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK)所示，Mouse-RAGE-ECD-Fc(IgG1)的氨基酸序列如SEQ ID NO：15(GQNITARIGEPLVLSCKGAPKKPPQQLEWKLNTGRTEAWKVLSPQGGPWDSVARILPNGSLLLPATGIVDEGTFRCRATNRRGKEVKSNYRVRVYQIPGKPEIVDPASELTASVPNKVGTCVSEGSYPAGTLSWHLDGKLLIPDGKETLVKEETRRHPETGLFTLRSELTVIPTQGGTHPTFSCSFSLGLPRRRPLNTAPIQLRVREPGPPEGIQLLVEPEGGIVAPGGTVTLTCAISAQPPPQVHWIKDGAPLPLAPSPVLLLPEVGHEDEGTYSCVATHPSHGPQESPPVSIRVTETGDEGPAEGSVGESGLGTLAEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK)所示，Human-RAGE-ECD-His的氨基酸序列如SEQ ID NO：16(AQNITARIGEPLVLKCKGAPKKPPQRLEWKLNTGRTEAWKVLSPQGGGPWDSVARVLPNGSLFLPAVGIQDEGIFRCQAMNRNGKETKSNYRVRVYQIPGKPEIVDSASELTAGVPNKVGTCVSEGSYPAGTLSWHLDGKPLVPNEKGVSVKEQTRRHPETGLFTLQSELMVTPARGGDPRPTFSCSFSPGLPRHRALRTAPIQPRVWEPVPLEEVQLVVEPEGGAVAPGGTVTLTCEVPAQPSPQIHWMKDGVPLPLPPSPVLILPEIGPQDQGTYSCVATHSSHGPQESRAVSISIIEPGEEGPTAGSVGGSGLGTLAGGSGGSHHHHHHHH)所示，Cyno-RAGE-ECD-His的氨基酸序列如SEQ ID NO：17(AQNITARIGEPLVLKCKGAPKKPPQQLEWKLNTGRTEAWKVLSPQGGPWDSVARVLPNGSLFLPAVGIQDEGIFRCQAMNRNGKETKSNYRVRVYQIPGKPEIIDSASELTAGVPNKVGTCVSEGSYPAGTLSWHLDGKPLVPNEKGVSVKEETRRHPETGLFTLQSELMVTPARGGNPHPTFSCSFSPGLPRRRALHTAPIQPRVWEPVPLEEVQLVVEPEGGAVAPGGTVTLTCEVPAQPSPQIHWMKDGVPLPLSPSPVLILPEIGPQDQGTYRCVATHPSHGPQESRAVSISIIEPGEEGPTAGSVGGSGPGTLAGGSGGSHHHHHHHH)所示，Mouse-RAGE-ECD-His的氨基酸序列如SEQ ID NO：18(GQNITARIGEPLVLSCKGAPKKPPQQLEWKLNTGRTEAWKVLSPQGGPWDSVARILPNGSLLLPATGIVDEGTFRCRATNRRGKEVKSNYRVRVYQIPGKPEIVDPASELTASVPNKVGTCVSEGSYPAGTLSWHLDGKLLIPDGKETLVKEETRRHPETGLFTLRSELTVIPTQGGTHPTFSCSFSLGLPRRRPLNTAPIQLRVREPGPPEGIQLLVEPEGGIVAPGGTVTLTCAISAQPPPQVHWIKDGAPLPLAPSPVLLLPEVGHEDEGTYSCVATHPSHGPQESPPVSIRVTETGDEGPAEGSVGESGLGTLAGGSGGSHHHHHHHH)所示。

表1

(2)将6种RAGE抗原进行SDS-PAGE-考马斯亮蓝染色，结果如图1A和1B所示，通过条带灰度估算纯度，结果如表2和表3所示：

表2

表3

实验结果：6种RAGE抗原均成功表达，还原性SDS-PAGE中纯度均大于70%。

1.2 anti-RAGE抗体表达检测，用于评价抗体活性做为筛选抗体的对照。

实验方法：

(1) 表达合成两种对照抗RAGE抗体，相关信息及表达合成结果如下表4所示，其中抗体h11E6.16可参照专利ES2577718T3中的方法合成，抗体h11E6.16的重链的氨基酸序列如SEQ ID NO：19(EIQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNFGMNWVRQAPGQGLEWMGYINTNTGESIYSEEFKGRFTFTLDTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYFCARSRMVTAYGMDYWGQGTSVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK)所示，轻链如SEQ ID NO：20(EIVMTQSPATLSLSPGERATLSCKASQNVGTAVAWYQQKPGQSPRLLIFSASNRYTGVPARFSGSGSGTDFTLTISSLQSEDFAVYFCQQYSSYPLTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC)所示。

表4

(2) 对两种对照抗RAGE抗体进行SDS-PAGE-考马斯亮蓝染色，实验结果如图2A和2B所示，通过条带灰度估算纯度，结果如表5和表6所示：

表5

表6

(3) 对h11E6.16抗体进行HPLC-SEC检测，结果如表7和图3所示。

表7

实验结果：h11E6.16抗体成功表达，单体率为100%。

1.3 检测不同抗原与h11E6.16抗体（P38411）的结合活性。

实验方法：

(1) 不同抗原（实施例1中合成的6个RAGE抗原、Ipilimumab（Sanyou Bio/CHA032）(阴性对照)、1% 脱脂牛奶作为(空白对照)）包被Elisa孔板，PBS稀释抗原至工作浓度2 μg/mL，每孔加30 μL，4℃孵育过夜。

(2) 用PBST（在PBS加入0.05% TWEEN-20）洗涤3次，用5 % 脱脂牛奶（用PBS配制）在室温下封闭2 h。

(3) 用PBST洗涤3次，加入用1 % 脱脂牛奶（用PBS配制）稀释的h11E6.16(P38411)，每孔30 µL, 室温下孵育60 min。

(4) 用PBST洗涤3次，加入用1 % 脱脂牛奶稀释的Goat-Anti-human-κ+λ-HRP(Millipore/ AP502P, AP506P) （稀释比例1:4000），室温下孵育50 min。

(5) 加入四甲基联苯胺（TMB，HRP显色底物），用2M HRP反应中止液停止反应，读出OD450，结果如图4A所示。

实验结果：h11E6.16抗体（P38411）与人、猴的抗原结合能力较好，而与鼠抗原的结合能力较弱。

1.4 检测不同抗原与Anti-hRAGE （P46085）（货号：R&D systems/ MAB11451）的结合活性。

实验方法：

(1) 不同抗原包被Elisa孔板，PBS稀释抗原至工作浓度4 μg/mL，每孔加30μL，4℃孵育过夜。

(2) 用PBST洗涤3次，用5 % 脱脂牛奶（用PBS配制）在室温下封闭2 h。

(3) 用PBST洗涤3次，加入用1 % 脱脂牛奶（用PBS配制）稀释的Anti-hRAGE（P46085），每孔30 µL，室温下孵育60 min。

(4) 用PBST洗涤3次，加入用1 % 脱脂牛奶稀释的Goat-Anti-mouse-IgG (1+2a+2b+3)-HRP (Jackson/ 115-035-164)（稀释比例1:4000），室温下孵育50 min。

(5) 加入TMB，用中止液停止反应，读出OD450，结果如图4B和图4C所示。

实验结果：Anti-hRAGE（P46085）与人抗原结合能力较强，而与猴、鼠的抗原的结合能力很弱。

1.5 构建生物素标记的RAGE抗原。

实验方法：

(1) 使用生物素 N-羟基磺基琥珀酰亚胺 (NHS) 酯（Thermo Scientific/20217）标记抗原蛋白。

(2) 用PBS稀释biotin标记的抗原包被Elisa孔板，每孔加30 μL，4℃孵育过夜。

(3) 用PBST洗涤3次，用5%脱脂牛奶（用PBS配制）在室温下封闭2h。

(4) 用PBST洗涤3次，加入用1%脱脂牛奶稀释的NeutrAvidin-HRP (ThermoFisher/31001)（稀释比例1:2000），在室温下孵育60 min。

(5) 用PBST洗涤12次。

(6) 每孔加入30 μL TMB显色，随后加入中止液停止反应，读出OD450，结果如图5所示。

实验结果：所有抗原蛋白已成功标记生物素。

1.6 验证Biotin标记不影响抗原结合抗体活性。

实验方法：

(1) 上述生物素N-羟基磺基琥珀酰亚胺 (NHS) 酯标记的各抗原包被Elisa孔板，PBS稀释抗原至工作浓度4μg/mL，每孔加30 μL，4℃孵育过夜。

(2) 用PBST洗涤3次，用5 % 脱脂牛奶（用PBS配制）在室温下封闭2 h。

(3) 用PBST洗涤3次，加入用1 % 脱脂牛奶（用PBS配制）稀释的h11E6.16(P38411)，每孔30 µL, 室温下孵育60 min。

(4) 用PBST洗涤3次，加入用1 % 脱脂牛奶稀释的Goat-Anti-human-κ+λ-HRP(Millipore/ AP502P, AP506P)（按1:4000比例稀释），室温下孵育50 min。或者加入用1 %脱脂牛奶稀释的Goat-Anti-human-IgG-Fc-HRP (abcam, ab97225)（按1:8000比例稀释），室温下孵育50 min。

(5) 加入TMB，用中止液停止反应，读出OD450，结果如图6A和6B所示。

实验结果：Biotin标记前后，不同来源的RAGE抗原结合抗体活性相当。

1.7 质粒稳转293F悬浮细胞构建高表达RAGE抗原蛋白的细胞系。

实验方法：

(1) 构建质粒p318（RAGE(1-404)-3xflag-mCherry），序列如SEQ ID NO：21(MAAGTAVGAWVLVLSLWGAVVGAQNITARIGEPLVLKCKGAPKKPPQRLEWKLNTGRTEAWKVLSPQGGGPWDSVARVLPNGSLFLPAVGIQDEGIFRCQAMNRNGKETKSNYRVRVYQIPGKPEIVDSASELTAGVPNKVGTCVSEGSYPAGTLSWHLDGKPLVPNEKGVSVKEQTRRHPETGLFTLQSELMVTPARGGDPRPTFSCSFSPGLPRHRALRTAPIQPRVWEPVPLEEVQLVVEPEGGAVAPGGTVTLTCEVPAQPSPQIHWMKDGVPLPLPPSPVLILPEIGPQDQGTYSCVATHSSHGPQESRAVSISIIEPGEEGPTAGSVGGSGLGTLALALGILGGLGTAALLIGVILWQRRQRRGEERKAPENQEEEEERAELNQSEEPEAGESSTGGPDYKDHDGDYKDHDIDYKDDDDKMVSKGEEDNMAIIKEFMRFKVHMEGSVNGHEFEIEGEGEGRPYEGTQTAKLKVTKGGPLPFAWDILSPQFMYGSKAYVKHPADIPDYLKLSFPEGFKWERVMNFEDGGVVTVTQDSSLQDGEFIYKVKLRGTNFPSDGPVMQKKTMGWEASSERMYPEDGALKGEIKQRLKLKDGGHYDAEVKTTYKAKKPVQLPGAYNVNIKLDITSHNEDYTIVEQYERAEGRHSTGGMDELYK)所示。

(2) 使用化学转染试剂，将质粒瞬转至293F悬浮细胞，收集细胞备用。

(3) 取(2)中收集的细胞，通过Attune™ NxT流式细胞仪（Thermo Fisher，A24860）检测mcherry荧光，实验结果如图7A所示。实验结果表明：p318瞬转293F细胞高表达RAGE-3xflag-mCherry。

(4) 将(2)收集的细胞裂解，通过蛋白质印迹法(Western blotting, WB)检测偶联的mcherry荧光蛋白，实验结果如图7B~7D所示。实验结果表明：p318瞬转293F细胞高表达RAGE-3xflag-mCherry。

(5) 使用0.1 mg/mL的多聚赖氨酸（PDL）加入共聚焦培养皿中，放到培养箱中(37℃ 5%CO2)包被30 min，然后用超纯水反复清洗三次培养皿，加入(2)收集的细胞，放入在培养箱中过夜培养使细胞贴壁，在培养皿中加入4%PFA固定细胞，用PBS清洗，再加入0.5 μg/mL DAPI染色剂室温染色30 min，用PBS清洗，加入70% 甘油（使用PBS配制），将培养皿转移至共聚焦显微镜下观察拍照，照片如图7E所示。实验结果表明：p318瞬转293F细胞高表达RAGE-3xflag-mCherry（比例尺：100 μm）。

1.8 质粒瞬转HepG2贴壁细胞构建高表达RAGE抗原的细胞系。

实验方法：

(1) 构建质粒p605（RAGE(1-404)-3xflag-eBFP），序列如SEQ ID NO：22(MAAGTAVGAWVLVLSLWGAVVGAQNITARIGEPLVLKCKGAPKKPPQRLEWKLNTGRTEAWKVLSPQGGGPWDSVARVLPNGSLFLPAVGIQDEGIFRCQAMNRNGKETKSNYRVRVYQIPGKPEIVDSASELTAGVPNKVGTCVSEGSYPAGTLSWHLDGKPLVPNEKGVSVKEQTRRHPETGLFTLQSELMVTPARGGDPRPTFSCSFSPGLPRHRALRTAPIQPRVWEPVPLEEVQLVVEPEGGAVAPGGTVTLTCEVPAQPSPQIHWMKDGVPLPLPPSPVLILPEIGPQDQGTYSCVATHSSHGPQESRAVSISIIEPGEEGPTAGSVGGSGLGTLALALGILGGLGTAALLIGVILWQRRQRRGEERKAPENQEEEEERAELNQSEEPEAGESSTGGPDYKDHDGDYKDHDIDYKDDDDKMVSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTLSHGVQCFSRYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNFNSHNVYIMADKQKNGIKANFKIRHNIEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDSHYLSTQSALSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITLGMDELYK)所示。

(2) 使用化学转染试剂，将质粒瞬转至HepG2细胞，收集细胞备用。

(3) 取(2)中收集的细胞，通过流式细胞仪检测eBFP荧光，实验结果如图8A所示。实验结果表明：p605瞬转HepG2细胞高表达RAGE-3xflag-eBFP。

(4) 将(2)收集的细胞裂解，通过WB检测偶联的flag标签，实验结果如图8B~8D所示。实验结果表明：p605瞬转HepG2细胞高表达RAGE-3xflag-eBFP。

实施例2 抗体库海选

2.1 噬菌体抗体库筛选

实验方法：

对不同来源不同标签偶联的抗原蛋白与噬菌体抗体库进行三轮次筛选（如下表8和表9所示），筛选出能特异性结合的人鼠猴交叉抗体，同时与抗原表达细胞有较好的结合。

表8

表9

2.2 检测候选噬菌体抗体群（pool）对human RAGE抗原表达细胞特异性结合能力

实验方法：

(1) 根据“2.1噬菌体抗体库筛选”部分的海选策略，使用“1.7 质粒稳转293F悬浮细胞构建高表达RAGE抗原蛋白的细胞系”部分构建的RAGE抗原高表达细胞p318-293F和293F细胞(空白细胞)分别铺板1E5个/孔，用FACS缓冲液洗涤细胞。

(2) 细胞中加入100μL抗体稀释液。4℃孵育60分钟。离心，用FACS缓冲液洗涤细胞两次。

(3) 细胞中加入100μL M13 (Sino Biological 11973-MM05T-P 1:500)或Anti-human Fc (PE) (abcam ab98596 1:300)或anti-Mouse Fc (abcam 98742 1:300)，4℃孵育30min。

(4) 用FACS缓冲液重悬细胞，流式细胞术检测，显示各候选噬菌体抗体群对humanRAGE抗原表达细胞p318-293F特异性结合能力的细胞平均荧光强度结果如图9A和图9B，显示各候选噬菌体抗体群对293F细胞特异性结合能力的细胞平均荧光强度结果如表10和表11所示，其中，PC表示感染噬菌体的阳性菌，NC表示无噬菌体存在的阴性菌。

表10

表11

实验结果分析：

(1) 由图9A和图9B可知，噬菌体库 5(0802-43(2nd)), 6(0802-44(2nd)), 7(0802-45(2nd)), 9(0802-47(2nd)), 10(0802-48(2nd)), 11(0802-49(2nd)), 13(0802-51(2nd)), 14(0802-52(2nd)), 17(0802-55(2nd)), 18(0802-56(2nd)) (0807-43(3rd)), 22(0807-44(3rd)), 23(0807-45(3rd)), 24(0807-46(3rd)), 25(0807-47(3rd)), 26(0807-48(3rd)), 27(0807-49(3rd)), 28(0807-50(3rd)), 29(0807-51(3rd)), 30(0807-52(3rd)), 31(0807-53(3rd)), 33(0807-55(3rd)), 34(0807-56(3rd)), 35(0807-57(3rd)), 36(0807-58(3rd))在p318-293F细胞上有较好的结合。

(2) 由表10和表11可知，所有噬菌体在293F细胞上均没有结合。

2.3检测候选噬菌体抗体群（pool）对不同种属RAGE抗原特异性结合能力，筛选人鼠猴交叉pool。

实验方法(方法参见实施例1的1.3和1.4部分)：

(1) 不同抗原Human-RAGE-ECD-His(P38405)，Cyno-RAGE-ECD-His(P38407)，Mouse-RAGE-ECD-His(P38409)和PBS（空白 对照）分别包被Elisa孔板，PBS稀释抗原至工作浓度4 μg/mL，每孔加30 μL，4℃孵育过夜。

(2) 用PBST洗涤3次，用5 % 脱脂牛奶（用PBS配制）在室温下封闭2 h。

(3) 用PBST洗涤3次，加入噬菌体抗体pool或对照噬菌体抗体（H11E6.16）和空白对照（NC），每孔30 µL, 室温下孵育60 min。

(4) 用PBST洗涤3次，加入用1% 脱脂牛奶稀释的Mouse Anti-M13 (Sinobiological/ 11973-MM05T-H) （按1:8000比例稀释），室温下孵育50 min。

(5) 加入TMB，用中止液停止反应，读出OD450，实验结果如图10A~图10L所示。

实验结果表明：噬菌体抗体Pool 0802-43、0802-44、0802-45、0802-47、0802-48、0802-49、0802-51、0802-52、0802-53、0802-55、0802-56、0802-57、0807-43、0807-44、0807-45、0807-46、0807-47、0807-48、0807-49、0807-50、0807-51、0807-52、0807-53、0807-54、0807-55、0807-56、0807-57、0807-58具有人鼠猴交叉富集，其他Pool无人鼠猴交叉富集。

实施例3 阳性单克隆鉴定

3.1 单克隆鉴定并筛选阳性单克隆测序

实验方法：

(1) 将实施例2的2.3部分筛选得到的噬菌体抗体阳性菌进行测序。

(2) 将(1)中每个单克隆进行Elisa验证（方法参见实施例2的2.3部分）实验结果汇总在下表12中：

表12

实验结果显示：在挑取的744个克隆中，筛选到542个与人结合的阳性克隆，其中263个具有人猴交叉活性，184个具有人鼠猴交叉活性，送测264个阳性克隆，序列分析后得到112个Unique，其中1个只与人结合，46个只具有人猴交叉活性，65个具有人鼠猴交叉活性。

实施例4真核表达抗体及抗体片段活性验证

4.1检测候选抗体在p318细胞上的结合能力

(1) 在实施例3的3.1部分筛选的抗体中，选取31个具有人鼠猴交叉活性的候选单克隆抗体进行真核表达。

(2) 根据实施例2的2.1部分的海选策略，使用实施例1的1.7部分构建的RAGE抗原高表达细胞p318-293F和293F细胞分别铺板1E5个/孔，用FACS缓冲液洗涤细胞。

(3) 细胞中加入100 μL抗体稀释液。4℃孵育60分钟。离心，用FACS缓冲液洗涤细胞两次。

(4) 细胞中加入100 μL Anti-human Fc (PE) (abcam ab98596 1:300)，4℃孵育30min。

(5) 用FACS缓冲液重悬细胞，流式细胞术检测，显示各候选抗体在p318-293F细胞上的结合能力的细胞平均荧光强度结果如图11A和图11B所示；显示各候选抗体在293F细胞上的结合能力的细胞平均荧光强度结果如表13所示。

表13

实验结果表明：除了NL-A69-VH(P57676)，NL-A190-VH(P57694)分子在p318-293F细胞上没有结合，其他样品在细胞上均有结合。

4.2检测真核表达抗体上清与抗原Human-RAGE-Fc (P38406)、Cyno-RAGE-Fc(P38408)、Mouse-RAGE-Fc (P38410)的结合活性

(1) 在实施例3的3.1部分筛选的抗体中，选取31个具有人鼠猴交叉活性的候选单克隆抗体进行真核表达。

(2) 不同抗原Human-RAGE-Fc (P38406)、Cyno-RAGE-Fc (P38408)、Mouse-RAGE-Fc (P38410)分别包被Elisa孔板，PBS稀释抗原至工作浓度2 μg/mL，每孔加30 μL，4℃孵育过夜。

(3) 用PBST洗涤3次，用5 % 脱脂牛奶（用PBS配制）在室温下封闭2 h。

(4) 用PBST洗涤3次，加入噬菌体抗体pool，每孔30 µL, 室温下孵育60 min。

(5) 用PBST洗涤3次，加入用1 % 脱脂牛奶稀释的Goat-Anti-mouse-IgG-Fc-HRP(abcam; ab97265) （按1:8000比例稀释）或Goat-Anti-human-κ+λ-HRP (Millipore/AP502P, AP506P)（按1:4000比例稀释），室温下孵育50 min。

(6) 加入TMB，用中止液停止反应，读出OD450，真核表达抗体上清与Human-RAGE-Fc (P38406)的结合活性分析结果如图12A~12D所示，真核表达抗体上清与Cyno-RAGE-Fc(P38408)的结合活性分析结果如图12E~12H所示，真核表达抗体上清与Mouse-RAGE-Fc(P38410)的结合活性分析结果如图12I~12L所示。

实验结果表明：真核表达筛选的31个的候选抗体均具有人鼠猴交叉活性。

4.3 antiRAGE-Fc抗体(A230)可与p605瞬转HepG2细胞特异性结合

实验方法：

(1) 合成表达：6xHis-antiRAGE(A230VH)-G4S-HA与antiRAGE(A230VL)配对表达，使用镍柱纯化His标签蛋白，得到antiRAGE(A230)-Fc-G4S-HA；本申请实施例中antiRAGE-Fc构型均由重链与轻链配对表达得到antiRAGE-Fc-G4S-HA，其中，antiRAGE(A230VH)的构型为6xHis-VH-CH1-CH2-CH3-G4S-HA，氨基酸序列如SEQ ID NO：23（HHHHHHQVQLVQSGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMHWVRQAPGKGLEWVAVISYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDRRWNFFDPWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGSYPYDVPDYA）所示；antiRAGE(A230VL)的构型为VL-CL(Kappa)，VL的氨基酸序列如SEQ ID NO：8所示，CL(Kappa)序列如SEQ ID NO：10所示。经过SDS-PAGE检测，antiRAGE(A230)-Fc-G4S-HA的纯度>95%，结果如图13A所示。

(2) 使用实施例1的1.8部分构建的p605-HepG2细胞，用PBS清洗重悬细胞。

(3) 使用4 % PFA室温固定细胞20 min，用PBS清洗重悬细胞。

(4) 使用5 % BSA室温封闭细胞30 min。

(5) 在100 μL孵育体系中分别加入antiRAGE(A230)-Fc 1 μg和5 μg，4℃孵育2h，用PBS稀释的0.5 % BSA清洗重悬细胞。

(6) 分别在未加入A230-Fc抗体的细胞和孵育过A230-Fc抗体的细胞中加入FITC偶联antiHA荧光抗体1 μL，室温孵育1 h，用PBS清洗细胞两次，重悬细胞。

(7) 使用流式细胞仪检测，实验结果如图13B所示。

实验结果表明：与不加A230-Fc组相比，A230-Fc对p605细胞有更强的结合力。

以上所述，仅是本申请的较佳实施例而已，并非是对本申请作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本申请技术方案内容，依据本申请的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本申请技术方案的保护范围。

Claims (19)

1.一种抗RAGE抗体，其中，所述抗体包含三个重链互补决定区和三个轻链互补决定区，所述三个重链互补决定区为CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，所述三个轻链互补决定区为CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其中：

所述CDR-H1包含的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，SEQ ID NO：1为SSYAMH；

所述CDR-H2包含的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，SEQ ID NO：2为VISYDGSNKY；

所述CDR-H3包含的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示，SEQ ID NO：3为DRRWNFFDP；

所述CDR-L1包含的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示，SEQ ID NO：4为HVIGSWLA；

所述CDR-L2包含的氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示，SEQ ID NO：5为IYAASSLQS；以及

所述CDR-L3包含的氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示，SEQ ID NO：6为QGNSFPIT。

2.根据权利要求1所述的抗RAGE抗体，其包含人类通用框架区。

3.根据权利要求1所述的抗RAGE抗体，其中，所述抗体包含重链可变区和轻链可变区，其中：

所述重链可变区包含的氨基酸序列如SEQ ID NO：7所示，或为与SEQ ID NO：7具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列，其中SEQ ID NO：7为QVQLVQSGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMHWVRQAPGKGLEWVAVISYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDRRWNFFDPWGQGTLVTVSS；

所述轻链可变区包含的氨基酸序列如SEQ ID NO：8所示，或为与SEQ ID NO：8具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%同一性的氨基酸序列，其中，SEQ ID NO：8为NIQLTQSPSSVSASVGDRVTITCRASHVIGSWLAWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTITNLQPEDFATYYCQQGNSFPITFGQGTRLDIK。

4.根据权利要求1~3中任一项所述的抗RAGE抗体，其为人抗体、人源化抗体或嵌合抗体。

5.根据权利要求1~3中任一项所述的抗RAGE抗体，其为IgG全长抗体。

6.根据权利要求1~3中任一项所述的抗RAGE抗体，其为IgG1全长抗体。

7.根据权利要求1~3中任一项所述的抗RAGE抗体，其为选自以下任意一种的抗原结合片段：Fv、Fab、F(ab')2、Fab'、Fd、dsFv、scFv、sc(Fv)2、dAb、分离的互补决定区、结构域特异性抗体、单结构域抗体、结构域缺失抗体、CDR嫁接抗体、双抗体、三抗体、四抗体和微抗体。

8.根据权利要求1~3中任一项所述的抗RAGE抗体，其与人、猴和鼠来源的RAGE抗原结合。

9.包含根据权利要求1~8中任一项所述的抗RAGE抗体的偶联物。

10.根据权利要求9所述的偶联物，其包括与所述抗RAGE抗体偶联的治疗剂。

11.根据权利要求10所述的偶联物，所述治疗剂选自细胞毒性剂、激素制剂、靶向小分子制剂、蛋白酶体抑制剂、免疫调节剂、血管生成抑制剂、细胞增殖抑制剂、促细胞凋亡剂、细胞因子、共刺激分子的激活剂中的一种或多种。

12.包含根据权利要求1~8中任一项所述的抗RAGE抗体的双特异性或多特异性抗体。

13.包含权利要求1~8中任一项所述的抗RAGE抗体或其编码核酸的免疫细胞。

14.根据权利要求13所述的免疫细胞，其为NK细胞、T细胞或树突细胞。

15.包含权利要求1~8中任一项所述的抗RAGE抗体和一种或多种多肽或蛋白的融合蛋白。

16.一种编码权利要求1~8中任一项所述的抗RAGE抗体的核酸分子。

17.一种表达载体，其包含权利要求16所述的核酸分子。

18.一种细胞，其包含权利要求16所述的核酸分子或权利要求17所述的表达载体。

19.权利要求1~8中任一项所述的抗RAGE抗体、权利要求9~11中任一项所述的偶联物、权利要求12所述的双特异性或多特异性抗体、权利要求13或14所述的免疫细胞或权利要求15所述的融合蛋白在制备诊断、治疗和/或预防疾病的药物中的用途。