CN119351425A - 具有增强外源基因表达水平的核酸分子及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种具有增强外源基因表达水平的核酸分子及其应用。本发明使用一种核苷酸序列，其表达的34个氨基酸（后简称C肽），添加在待表达的目的蛋白N端，可以提升目标蛋白表达量。同时，在上述核苷酸后添加一段核苷酸序列表达一段来源于病毒的短肽2A肽序列，通过2A肽自我切割分离C肽和目的蛋白，得到完整的目的蛋白。避免这段氨基酸对目的蛋白原有功能的影响。本发明通过这种方法，可提高外源蛋白在293真核体系中瞬转表达量。为蛋白早期筛选和功能研究奠定基础。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种具有增强外源基因表达水平的核酸分子及其应用。
背景技术
重组蛋白是通过载体将目的蛋白的基因引入宿主细胞，通过宿主细胞的生物机制使其表达出特定蛋白。目前已开发了各种载体系统以及宿主细胞，包括原核生物，如大肠杆菌和真核生物（例如酵母菌、昆虫细胞和哺乳动物细胞），以产生接近其自然状态的广谱重组蛋白，促进生化研究、工业催化、食品加工、疫苗和治疗等方面的发展。
高质量的重组蛋白是研究工作和药物开发的重要起始材料。由于蛋白质本身的复杂性，蛋白质表达和纯化往往具有挑战性。蛋白质的某些序列或结构特征可能影响重组蛋白产品的产量和稳定性。大多数蛋白质是脆弱分子，在表达和纯化过程中易受到环境压力的影响。因此，重组蛋白表达往往需要精心规划和工艺优化，以确保重组蛋白的高产量，并尽量减少质量受损。
在瞬转表达中，由于细胞中的外源基因会随着细胞分裂而丢失，目的蛋白表达只能维持几天到十几天时间，存在表达量低的缺点。那么如何提高瞬时转染的表达量，用最短的时间，最低的成本获得更多的重组蛋白用于药效，制剂研究，成为亟待解决的问题。
发明内容
本发明旨在构建一种含有具有增强外源基因表达水平的核酸分子，利用塞姆利基森林脑炎病毒（Semliki forest virus，SFV）的capsid蛋白N端前34个氨基酸（后简称C肽），从而提高瞬转表达系统中重组蛋白。该翻译增强子的氨基酸序列为：MNYIPTQTFYGRRWRPRPAARPWPLQATPVAPVV（SEQ ID NO：5）。在研究表达量较低的蛋白时，在前面加上这段翻译增强子序列，可以显著促进蛋白质翻译。
为了实现上述目的，本发明第一个方面公开了一种增强外源基因表达水平的核酸分子，
其中所述核酸分子的核苷酸序列如SEQ ID NO：1、2、3或4所示。
其中所述核酸分子表达蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示。
本发明第二个方面公开了一种重组表达载体，所述重组表达载体包括上述的核酸分子和目的蛋白基因。
其中，所述重组表达载体还包括DNA载体、RNA载体、质粒、转座子载体、脂质体、CRISPR/Cas9载体或病毒载体。
所述目的蛋白基因中还连接有蛋白标签，所述蛋白标签优选为His标签。
所述核酸分子和目的蛋白基因之间还连接有2A肽；所述2A肽的核苷酸序列如SEQID NO：6所示。
GGCAGCGGCGCCACCAACTTCAGCCTGCTGAAGCAAGCCGGCGACGTGGAGGAGAACCCCGGCCCC（SEQ ID NO：6）。
本发明第三个方面公开了一种重组宿主细胞，将上述的重组表达载体构建进入宿主细胞的基因组中，使得目的蛋白基因在宿主细胞中表达。
本发明第四个方面公开了上述的核酸分子、重组表达载体或宿主细胞在生产重组蛋白系统中的应用。
其中，所述应用生产重组蛋白系统具体为293表达系统。
本发明所制备得到的重组表达载体转染进入293体系中，可提高外源目的蛋白在瞬转系统中的表达量。
本发明在C肽和目的蛋白之间插入密码子优化的2A肽，通过2A肽自我切割分离C肽和目的蛋白，得到完整的目的蛋白；避免外源插入的基因对目的蛋白原有功能的影响。
附图说明
图1为实施例1构建的N端C肽的蛋白表达氨基酸序列的示意图。
图2为实施例1构建的编码N端C肽的蛋白核酸分子核苷酸序列的示意图。
图3为对合成的表达载体S1+042-PTT5，S2+042-PTT5，S3+042-PTT5，S4+042-PTT5以及042-PTT5利用Fortiebio检测不同样品的表达量。
图4为实施例2中SDS-PAGE的染色结果图。
图5为实施例3中Western blot（WB）的条带结果图。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1
1、设计具有N端C肽的蛋白表达序列，如图1-2所示，C肽和蛋白序列之间添加2A肽，用于蛋白表达后自剪切除C肽，保证蛋白N端的完整性，并合成相关质粒。
2、密码子优化
对C肽和2A肽氨基酸序列进行密码子优化，结果如下：
（1）优化序列S1：
TGAACTACATCCCCACACAGACCTTCTATGGCCGGAGATGGAGACCTAGACCTGCTGCTAGACCCTGGCCTCTGCAAGCCACCCCCGTGGCCCCCGTGGTGGGCAGCGGCGCCACAAACTTCTCCCTACTAAAGCAAGCAGGAGATGTTGAGGAGAACCCTGGGCCCC（SEQ ID NO：1）。
（2）优化序列S2：
ATGAATTACATCCCTACGCAAACGTTCTACGGCCGCCGGTGGCGCCCGCGCCCGGCGGCCCGTCCCTGGCCGTTGCAGGCCACTCCGGTGGCTCCCGTCGTCGGCAGCGGCGCCACCAACTTCAGCCTGCTGAAGCAAGCCGGCGACGTGGAGGAGAACCCCGGCCCC（SEQ ID NO：2）。
（3）优化序列S3：
ATGAACTACATCCCCACACAGACCTTCTATGGCCGGAGATGGAGACCTAGACCTGCTGCTAGACCCTGGCCTCTGCAAGCCACCCCCGTGGCCCCCGTGGTGGGCAGCGGCGCCACCAACTTCAGCCTGCTGAAGCAAGCCGGCGACGTGGAGGAGAACCCCGGCCCC（SEQ ID NO：3）。
（4）优化序列S4：
ATGAATTACATCCCTACGCAAACGTTCTACGGCCGCCGGTGGCGCCCGCGCCCGGCGGCCCGTCCCTGGCCGTTGCAGGCCACTCCGGTGGCTCCCGTCGTCGGCAGCGGCGCCACAAACTTCTCCCTACTAAAGCAAGCAGGAGATGTTGAGGAGAACCCTGGGCCC（SEQ ID NO：4）。
2A肽序列：
GGCAGCGGCGCCACCAACTTCAGCCTGCTGAAGCAAGCCGGCGACGTGGAGGAGAACCCCGGCCCC（SEQ ID NO：6）。
委托合成公司合成如上DNA序列，并将其分别插入表达质粒ptt5中，得到表达载体S1+042-PTT5，S2+042-PTT5，S3+042-PTT5，S4+042-PTT5，同时构建不含C肽和2A肽的对照质粒042-PTT5。
042DNA序列（终止密码子为TGA）
ATGGGATGGTCATGTATCATCCTTTTTCTAGTAGCAACTGCAACTGGAGCGTACGCTGAATCAAAGTATGGCCCGCCCTGTCCACCGTGCCCTGCACCCGAGTTTCTTGGAGGACCTTCAGTGTTCTTATTTCCTCCAAAGCCTAAAGATACACTTATGATCTCAAGAACACCTGAAGTGACATGCGTGGTGGTGGATGTGTCACAAGAAGATCCTGAAGTGCAATTTAACTGGTACGTGGATGGAGTGGAAGTGCACAACGCAAAGACTAAGCCTAGAGAAGAACAATTTAACTCAACATACAGAGTGGTGTCAGTGCTTACAGTGCTTCACCAAGATTGGCTTAACGGAAAGGAGTATAAATGCAAAGTGTCAAACAAAGGACTTCCTTCATCAATCGAGAAGACTATATCAAAAGCAAAAGGACAACCTAGAGAACCTCAAGTGTACACACTTCCTCCTTCACAAGAAGAAATGACAAAGAATCAGGTGTCACTTACATGCCTTGTGAAAGGATTCTATCCGTCAGATATCGCAGTGGAATGGGAATCAAACGGACAACCTGAGAATAATTACAAGACTACGCCGCCGGTGCTTGATTCAGATGGATCATTCTTCTTATATTCAAGACTTACAGTGGATAAATCAAGATGGCAAGAAGGAAACGTGTTCTCCTGTTCAGTGATGCACGAAGCACTTCACAACCACTACACACAGAAGAGCTTATCACTTTCACTTGGAAAGGGCGGTGGCATGATCCCTCCTCACGTGCAGAAGTCTGTAAACAACGATATGATCGTGACAGATAACAACGGAGCAGTGAAATTTCCTCAACTTTGCAAATTCTGTGACGTGAGATTCTCGACTTGCGATAACCAGAAGTCGTGTATGTCAAACTGCTCAATCACATCAATCTGCGAGAAGCCGCAGGAAGTGTGCGTGGCAGTGTGGAGAAAGAATGACGAGAATATTACACTTGAAACAGTGTGCCACGATCCTAAACTTCCTTACCACGATTTCATATTGGAAGATGCAGCATCACCTAAATGCATCATGAAAGAGAAGAAGAAGCCAGGTGAAACATTCTTCATGTGTTCATGCTCATCAGATGAATGCAACGATAACATCATCTTCTCTGAGGAATACAACACATCAAACCCTGATTGA（SEQ ID NO：7）
042 氨基酸序列：
MGWSCIILFLVATATGAYAESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGKGGGMIPPHVQKSVNNDMIVTDNNGAVKFPQLCKFCDVRFSTCDNQKSCMSNCSITSICEKPQEVCVAVWRKNDENITLETVCHDPKLPYHDFILEDAASPKCIMKEKKKPGETFFMCSCSSDECNDNIIFSEEYNTSNPD*（SEQ ID NO：8）
3、本发明用于在293体系中瞬时表达外源蛋白，具体操作如下：
培养基为OPM-293 CD05 Medium，4℃冰箱保存，使用前于37°C水浴锅预热。
细胞准备：将Expi293细胞复苏到OPM-293 CD05中，使用125mL 摇瓶培养30mL，120rpm，37°C，8% CO2，80%湿度摇床中进行培养，传代三次以上之后进行接种。将复苏后的细胞密度稀释到0.4~0.7×106cell/ml，120rpm，37°C， 8% CO2，80%湿度摇床中进行培养。
细胞转染表达：
细胞转染 Day0
细胞转染密度应在3-5×106cell/ml，取样测VCD和VIA，若细胞密度过高，用OPM-293 CD05稀释至合适密度。细胞转染时将0.03 mg质粒经0.22 μm滤膜过滤后加入到1.5 mLOPM-293 CD05中，配置成质粒稀释液。将0.09mg PEI加入至1.5 mL OPM-293 CD05中，配置成PEI稀释液。将PEI稀释液加入质粒稀释液进行混合，室温静置20 min。
将DNA-PEI混合物3 mL倒入到30 mL的Expi293细胞内，混匀，在120 rpm，37°C，8%CO2，80%湿度摇床中进行培养。
蛋白表达 Day1-Day7
转染后18～24h添加初始体积5%的OPM-293 ProFeed，在120rpm，37°C，8% CO2，80%湿度条件的摇床中进行培养。转染后2-5天定时取样记录细胞密度和细胞活率，测定培养基中葡萄糖浓度，控制含糖量2-8g/L。转染后第7天离心收获细胞上清液经过滤后分装，-80℃保存，用于后续实验。
实施例2 表达量检测
1、Fortiebio
实验采用基于生物膜干涉（Bio-Layer Interferometry, BLI）技术的OctetRED96e（Sartorius）进行样品定量测试。实验以0.05% PBST作为稀释缓冲液。在实验开始前，将ProA传感器放进缓冲液中预湿10 min以上。将S1+042-PTT5，S2+042-PTT，S3+042-PTT5，S4+042-PTT5，和42-PTT5表达上清分别稀释400倍后加入样品板。实验开始后，将传感器与样品结合180 s，比较结合终点的信号值。信号值越高，表达量越高，以此对5个样品表达量粗略排序。
检测结果如图3所示，表达量：S3+042-PTT5>S4+042-PTT>S2+042-PTT5>S1+042-PTT5>042-PTT5
2、c-dex定量
表1
| 仪器 | Cedex生化分析仪 | Roche |
| 试剂盒 | IgG BIo cdex | Roche |
使用IgG-Bio 检测试剂盒，和Cdex生化分析仪对细胞发酵液中 IgG 进行定量测定。基于比浊法检测原理（含有 IgG Fc 的样本与特异性抗体反应形成可在 340nm 测定的沉淀）
定量检测结果如下：
表2
| 浓度 | |
| 对照质粒042-PTT5 | 123mg/L |
| S1+042-PTT5 | 216mg/L |
| S2+042-PTT5 | 233mg/L |
| S3+042-PTT5 | 428mg/L |
| S4+042-PTT5 | 421mg/L |
结论：
与没有添加该多肽的序列相比，四种密码子序列均可以增加外源蛋白表达。两种检测方法结果一致。
序列S3组合最佳，与没有添加该多肽的序列相比042的表达量提高了248%。
3、SDS-PAGE
蛋白样品制备：取细胞瞬转上清40 μL加入10 μL 的5×Sample Buffer混匀，95℃加热10min，瞬离待上样。
SDS-PAGE：将预制胶板安装到电泳装置后，加入MOPS Running Buffer，取10 μL蛋白Marker和适量蛋白样品按顺序上样。进行SDS-PAGE，130V电压约60-70min，直至蛋白Marker跑至分离胶底部，使用考马斯亮蓝染色后拍照，如图4。
实施例3
为了验证C+2A密码子S3的组合效果，我们更换了V02载体，以及外源蛋白R，设计表达质粒C+2A+R-V02，并委托合成限公司合成相应DNA序列，同时构建不含C肽和2A肽的对照质粒R-V02。
R蛋白DNA序列：
AGCAGAGGCATCAAGGGCAAGAGACAGAGAAGAATCAGCGCCGAGGGCAGCCAAGCCTGCGCCAAGGGCTGCGAGCTGTGCAGCGAGGTGAACGGCTGCCTGAAGTGCAGCCCTAAGCTGTTCATCCTGCTGGAGAGAAACGACATCAGACAAGTGGGCGTGTGCCTGCCTAGCTGCCCTCCTGGCTACTTCGACGCTAGAAACCCTGACATGAACAAGTGCATCAAGTGCAAGATCGAGCACTGCGAGGCCTGCTTCAGCCACAACTTCTGCACCAAGTGCAAGGAGGGCCTGTACCTGCACAAGGGCAGATGCTACCCTGCCTGTCCCGAGGGCAGCAGCGCCGCCAATGGCACCATGGAGTGCAGCAGCCCTGCTCAGTGCGAGATGAGCGAGTGGAGCCCTTGGGGCCCTTGCAGCAAGAAGCAGCAGCTGTGCGGCTTCAGAAGAGGCAGCGAGGAGAGAACAAGAAGAGTGCTGCACGCCCCTGTGGGCGACCACGCCGCCTGCAGCGACACCAAGGAGACAAGAAGATGCACCGTGAGAAGAGTGCCTTGCCCCGAGGGCCAAAAGAGAAGAAAGGGCGGCCAAGGCAGAAGAGAGAACGCCAACAGAAACCTGGCTAGAAAGGAGAGCAAGGAGGCCGGCGCCGGCAGCAGAAGGAGAAAAGGACAGCAACAGCAACAGCAACAAGGCACCGTGGGCCCTCTGACAAGCGCTGGCCCTGCC（SEQ ID NO：9）
R蛋白氨基酸序列：
SRGIKGKRQRRISAEGSQACAKGCELCSEVNGCLKCSPKLFILLERNDIRQVGVCLPSCPPGYFDARNPDMNKCIKCKIEHCEACFSHNFCTKCKEGLYLHKGRCYPACPEGSSAANGTMECSSPAQCEMSEWSPWGPCSKKQQLCGFRRGSEERTRRVLHAPVGDHAACSDTKETRRCTVRRVPCPEGQKRRKGGQGRRENANRNLARKESKEAGAGSRRRKGQQQQQQQGTVGPLTSAGPA（SEQ ID NO：10）。
蛋白瞬时表达方法同实施例1。
表达量检测：
（1）Western Blot
蛋白样品制备：取细胞瞬转上清40 μL加入10 μL 的5×Sample Buffer混匀，95℃加热10min，瞬离待上样。
SDS-PAGE：将预制胶板安装到电泳装置后，加入MOPS Running Buffer，取10 μL蛋白Marker和适量蛋白样品按顺序上样。进行SDS-PAGE，130V电压约60-70min，直至蛋白Marker跑至分离胶底部，准备转膜（转膜液需提前在4℃冰箱预冷）。
转膜：恒流400mA转膜70min，将蛋白转移至PVDF膜上。
封闭：转膜结束后，将PVDF膜浸入快速封闭液中，室温孵育15-25min。
抗体孵育：将一抗（Anti-6X His tag® antibody）和快速封闭液以1:25000浓度稀释，依据蛋白Marker位置将膜按照目的蛋白相应大小进行剪裁，放入稀释好的一抗中，37℃孵育1.5 h或4℃冰箱过夜孵育。TBST漂洗3次，每次10min。将二抗（山羊抗兔IgG H&L-HRP）和快速封闭液以1:20000浓度稀释，将PVDF膜放入二抗稀释液中，37℃孵育1.5h。TBST漂洗3次，每次10min。
显影：将ECL试剂盒的Enhancer Buffer Solution和Peroxide Buffer以1:1比例混合均匀。将PVDF膜在混合液中充分浸润，于全自动发光呈像系统中曝光。WB结果如图5所示，与没有添加该多肽的序列相比，外源蛋白R的分子量没有发生变化，说明2A肽序列成功自剪切，切除了添加的多肽序列，避免其对外源蛋白产生影响。与没有添加该多肽的序列相比，外源蛋白R的表达量有提高。
表3 试剂
| 试剂名称 | 品牌 |
| Anti-6X His tag® antibody | Abcam |
| 山羊抗兔IgG H&L (HRP) | Abcam |
| High-Sig ECL Western Blotting Substrate | Tanon |
| PVDF膜 | Millipore |
（2）Fortiebio
实验采用基于生物膜干涉（Bio-Layer Interferometry, BLI）技术的OctetRED96e（Sartorius）进行样品定量测试。实验以0.05% PBST作为稀释缓冲液。在实验开始前，将HIS2传感器放进缓冲液中预湿10 min以上。实验使用纯化后的蛋白作为标准品，梯度稀释为20、10、5、2.5、1.25、0.625、0.3125 μg/mL后作为标准曲线。将R-V02-D7和C+2A+R-V02-D7分别稀释2倍后加入样品板，并作重复孔为平行对照。实验开始后，将HIS2传感器与样品结合180 s，并使用Data Analysis 9.0分析软件对数据进行分析。最终结果取平行孔中平均值处理。
浓度测试计算结果如表4所示，可以看到，与没有添加该多肽的序列相比，外源蛋白R的表达量提高了197%。
表4
| 信号 | 浓度 | |
| R-V02 | 0.6nm | 20.55mg/L |
| C+2A+R-V02 | 1.78nm | 60.97mg/L |
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.一种增强外源基因表达水平的核酸分子，其特征在于，
其中所述核酸分子的核苷酸序列如SEQ ID NO：1、2、3或4所示。
2.如权利要求1所述的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子表达蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示。
3.一种重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体包括权利要求1所述的核酸分子和目的蛋白基因。
4.如权利要求3所述的重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体还包括DNA载体、RNA载体、质粒、转座子载体、脂质体、CRISPR/Cas9载体或病毒载体。
5.如权利要求3所述的重组表达载体，其特征在于，所述目的蛋白基因中还连接有蛋白标签，所述蛋白标签选为His标签。
6.如权利要求3所述的重组表达载体，其特征在于，所述核酸分子和目的蛋白基因之间还连接有2A肽；所述2A肽的核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示。
7.一种重组宿主细胞，将权利要求3-6任一项所述的重组表达载体构建进入宿主细胞的基因组中，使得目的蛋白基因在宿主细胞中表达。
8.如权利要求1-2任一项所述的核酸分子、权利要求3-6任一项所述的重组表达载体或权利要求7所述的宿主细胞在生产重组蛋白系统中的应用。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述应用生产重组蛋白系统为293表达系统。
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