CN119331992A - 位于oar1_164254640.1基因的分子标记在湖羊分子标记辅助育种中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于湖羊分子标记辅助育种技术领域，具体涉及位于OAR1_164254640.1基因的分子标记在湖羊分子标记辅助育种中的应用。本发明以湖羊为研究对象，采用PCR扩增，产物直接测序，序列分析的方法，分析CADM2基因多态性，并综合分析多态性位点的不同基因型与不同生长性状间的相关性。分析结果表明：OAR1_164254640.1下游192bp T→C以及235bp T→C与湖羊的初生重、断奶重、六月龄体重极显著相关，CC基因型的初生重、断奶重、六月龄体重极显著高于TT、TC基因型个体。
Description
技术领域
本发明属于湖羊分子标记辅助育种技术领域，具体地说，涉及分子标记OAR1_164254640.1下游192bp T→C以及OAR1_164254640.1下游235bp T→C在湖羊分子标记辅助育种中的应用。
背景技术
湖羊是我国珍稀的绵羊品种，原产于太湖流，所产羔皮花纹美观而著称，是我国特有的羔皮用绵羊品种，也是目前世界上少有的白色羔皮品种，在国际市场上享有很高的声誉，有“软宝石”之称。湖羊肉质鲜美湖羊体型大产肉量高，且肉质鲜美，营养丰富。湖羊肉与其他肉类相比,具有高蛋白、低脂肪、低胆固醇的优点,多汁、膻味小。但湖羊产在肉性能方面与杜泊羊、德国美利奴羊等国外肉用绵羊品种还存在较大差异。因此，非常有必要对湖羊生长性能进行选育，提高湖羊的产肉性能。
本申请人已有授权中国发明专利(公开号：CN109251986A、CN109182553A、CN109251987A、CN109251985A、CN109182554A和CN109055579A)公开了利用GWAS技术筛选的湖羊体尺性状候选功能基因及SNPs，并通过SNPs的群体验证，获得了可用于分子标记辅助育种的SNPs，可用于湖羊肉用性状分子标记辅助育种和湖羊肉用系核心群个体的早期选育。
本申请人还申请了中国发明专利申请(CN114381531A、CN114438232A、CN114574596A、CN114480676A)公开了在CAPN6基因内含子1部分区内有15个SNPs,其中与湖羊体重、体尺性状显著相关的SNPs位点有4个：1.g.43756G＞A与湖羊体长显著相关，AA型个体的体长显著高于GA型个体(P＜0.05)，GG型个体与GA，AA型个体相比差异不显著(P＞0.05)。2.g.43815G＞A与湖羊体高显著相关，AA型个体的体高显著高于GG型个体(P＜0.05)，GA型个体与GG，AA型个体相比差异不显著(P＞0.05)。3.g.43851G＞A与湖羊体长显著相关，AA型个体的体长显著高于GA型个体(P＜0.05)，GG型个体与GA，AA型个体相比差异不显著(P＞0.05)。4.g.43917A＞G与湖羊体长和日增重显著相关，AA与GG型个体的体长显著高于AG型个体(P＜0.05)，AA与GG相比差异不显著(P＞0.05)，GG型个体断奶到六月龄日增重显著高于AA型个体，AG型个体与AA，GG相比差异不显著。
另外，本申请人还申请了中国发明专利申请(CN117757958A、CN117701736A、CN117844943A、CN117683908A)公开了在ARHGAP24基因内含子2部分区内有4个SNPs,其中与湖羊六月龄到周岁日增重和/或周岁重显著相关的SNPs位点有4个：1、g.14979C＞T与湖羊的六月龄到周岁日增重，周岁重显著相关，TT基因型个体的六月龄到周岁日增重与周岁重显著高于CT与CC基因型。2、g.15042C＞T与湖羊的六月龄到周岁日增重，周岁重显著相关，TT基因型个体的六月龄到周岁日增重与周岁重显著高于CT与CC基因型。3、g.15255T＞C与湖羊的六月龄到周岁日增重，周岁重显著相关，CC基因型个体的六月龄到周岁日增重与周岁重显著高于TC与TT基因型个体。4、g.15599G＞T与湖羊的周岁重显著相关，TT基因型个体显著高于GT与GG个体。
CADM（Cell adhesion molecule）是细胞粘附分子由蛋白质家族组成，其功能包括维持细胞极性和肿瘤抑制，包括肝细胞癌（HCC）的几种癌症中可以观察到CADM2基因表达CADM2基因的低表达。CADM2基因在人类的肾细胞癌中被DNA启动子甲基化和/或杂合性丢失所抑制。在日本人群中使用微卫星的全基因组关联研究（561个病例和561个对照）鉴定了CADM2，其为牛皮癣的候选基因。有学者将CADM2识别为全身能量稳态的有力调节剂，降低CADM2表达可以逆转包括肥胖，胰岛素抵抗和葡萄糖稳态受损在内的多种与代谢综合征相关的症状。有研究发现CADM2基因拷贝数变异与中国5个山羊品种的生长性状相关，CADM2基因在山羊不同组织中的表达量不同。
发明内容
为了研究CADM2基因多态性与湖羊生长性状相关性，获得与生长性状相关的遗传标记。本发明以湖羊为研究对象，采用PCR扩增，产物直接测序，序列分析的方法，分析CADM2基因多态性，并综合分析多态性位点的不同基因型与不同生长性状间的相关性。
本发明的一个目的是提供一种检测与湖羊的初生重、断奶重、六月龄体重极显著相关的分子标记的试剂，该分子标记包括分子标记Ⅰ和分子标记Ⅱ，分子标记Ⅰ和分子标记Ⅱ为联锁基因；
分子标记Ⅰ定位为OAR1_164254640.1下游192bp T→C，位于SEQ ID NO:1的第330位点，其为C或T；其中：CC基因型的初生重、断奶重、六月龄体重极显著高于TT、TC基因型个体；
分子标记Ⅱ定位为OAR1_164254640.1下游235bp T→C，位于SEQ ID NO:1的第373位点，其为C或T；其中：CC基因型的初生重、断奶重、六月龄体重极显著高于TT、TC基因型个体。
进一步，本发明的一个目的是提供鉴定所述的分子标记的引物对。
作为优选，所述引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO:2和SEQID NO:3所示。
进一步，本发明的一个目的是提供一种包含所述试剂或所述引物对的试剂盒。
进一步，本发明的一个目的是提供所述试剂或所述引物对或所述的试剂盒在筛选湖羊初生重、断奶重、六月龄体重辅助育种中的应用。
进一步，本发明的一个目的是提供一种扩增产物在筛选湖羊初生重、断奶重、六月龄体重辅助育种中的应用，该扩增产物采用所述的试剂扩增获得，核苷酸序列如SEQ IDNO:1所示。
进一步，本发明的一个目的是提供一种筛选初生重、断奶重、六月龄体重性状的方法，该方法包括如下步骤：提取湖羊基因组DNA，利用引物对进行PCR扩增，对扩增产物中的分子标记进行检测，从而筛选湖羊体重性状；分子标记包括分子标记Ⅰ和分子标记Ⅱ，分子标记Ⅰ和分子标记Ⅱ为联锁基因；
分子标记Ⅰ定位为OAR1_164254640.1下游192bp T→C，位于SEQ ID NO:1的第330位点，其为C或T；其中：CC基因型的初生重、断奶重、六月龄体重极显著高于TT、TC基因型个体；
分子标记Ⅱ定位为OAR1_164254640.1下游235bp T→C，位于SEQ ID NO:1的第373位点，其为C或T；其中：CC基因型的初生重、断奶重、六月龄体重极显著高于TT、TC基因型个体。
作为优选，所述的引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示。
作为优选，PCR 反应体系为25.0μL，KOD OneTM PCR Master Mix 12.5μL，上下游引物各0.2μL，ddH2O 11.1μL。
作为优选，PCR反应程序为：98℃变性10s，53℃退火30s，68℃延伸30s，进行34个循环，PCR 结束后4℃保存。
本发明以湖羊为研究对象，采用PCR扩增，产物直接测序，序列分析的方法，分析CADM2基因多态性，并综合分析多态性位点的不同基因型与不同生长性状间的相关性。分析结果表明：OAR1_164254640.1下游192bp T→C与湖羊的初生重、断奶重、六月龄体重极显著相关，CC基因型的初生重、断奶重、六月龄体重极显著高于TT、TC基因型个体。
附图说明
图1湖羊CAPN6基因SNPs检测引物的PCR扩增，M：DL2000。
图2为本发明扩增产物的核苷酸序列图。
具体实施方式
下面结合本发明实施例，将实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护范围。
1材料与方法
1.1试验材料
试验动物均来自杭州庞大农业开发有限公司，共203只，所选个体健康无疾病。
1.2血液的采集及指标的测定
所有羊只采集颈静脉血5mL，置于EDTA抗凝管，-20℃ 保存。生长性状指标测定包括:体高、体长、胸围。其他指标均由羊场提供。
1.3 DNA 提取和检测
采用血液基因组DNA提取试剂盒(天根, 北京)，提取血液DNA，使用BioTek®EPOCH（美国）检测DNA浓度和纯度。确保样品DNA浓度大于50ng/μL，OD260/OD280处于1.8~2.0。
1.4引物的设计及PCR扩增
引物的设计根据NCBI公布的绵羊CADM2基因序列（Gene ID: 101120371），利用DNAMAN8.0设计引物，引物的序列如表1。
表1 湖羊CADM2基因PCR扩增引物
1.5 PCR扩增
PCR反应程序为：98℃变性10s，53℃退火30s，68℃延伸30s，进行34个循环，PCR 结束后4℃保存。
表2 PCR扩增体系
1.6 PCR产物测序及序列分析
每个样品均按照表1列出的引物进行扩增，扩增产物交由安徽通用生物测序。使用Mutation Surveyor 5.02（Softgenetics，美国）软件分析每个个体的测序峰图确定每个个体突变位置和突变方式。
1.7数据统计与分析
使用little Programe计算PIC值，使用PopGen 32软件计算各SNPs的位点杂合度、Shannon信息含量、基因频率、基因型频率。
多态信息含量分析PIC（Polymorphism information content），表示一个后代所获得某个等位基因来自于它的亲本的同一个等位基因的可能性，是衡量等位基因片段多态性的理想指标计算公式为：
Pi和Pj分别为第i个和第j个等位基因频率；n为等位基因数
位点杂合度He（heterozygosity）指每个基因座上所存在的杂合个体的平均频率。杂合度能客观地反应群体的遗传变异水平，平均杂合度值越大，表明群体内遗传差异也越大，遗传多样性丰富，遗传潜力大，应用于动物遗传育种研究效果好；其数值越低，表明遗传一致性越高，说明群体内遗传变异小，遗传潜力也小。计算公式为：
pi表示第i个等位基因频率
Shannon信息含量
SIC(shannon information content )，计算公式为：
SIC=-ClogPi
其中：Pi为第i个等位基因在群体中的频率，C为常数。
基因频率和基因型频率
①基因的型频率＝基因型个体数/该群体个体数×100%
②基因的频率＝纯合基因型频率+1/2×杂合基因型频率
1.7.1关联分析
使用一般线性模型（General Linear Model，GLM；SPSS 20）挖掘与湖羊肉用新类群核心群体重、体尺性状关联的SNPs。
由于分析的所有个体均为来自同一饲养场，相同饲养环境和管理条件的雌性羊只，因此数据建模时不包括场效应和性别效应。
具体模型为：Y=Xβ+e
其中，Y：湖羊肉用新类群核心群体尺性状、体重性状表型值向量；
β：表型均值、SNP等固定效应向量；
e：残差效应向量；
X为β的关联矩阵。
当Y为湖羊肉用新类群核心群初生重表型值向量时，按照模型Y =Xβ+Sα+e分析。
其中Y：湖羊肉用新类群核心群体尺性状表型值向量；
α：同胞数的固定效应向量；
β：SNP 效应向量；
e：残差效应向量；
X、S分别为β、α的关联矩阵。
2试验结果
2.1湖羊CADM2基因SNPs检测PCR扩增结果
各引物PCR产物亮度较高，条带单一，无非特异性扩增（图1），实际PCR产物与预计PCR扩增产物大小一致，可进行后续PCR-产物直接测序试验。
2.2湖羊CADM2基因PCR扩增产物的核苷酸序列如图2所示，突变分析结果如表3所示，其中红色部分为SNP位点。
表3 湖羊CADM2基因的SNPs位点及突变类型、方式
2.3湖羊CADM2基因群体遗传学分析如表4，表5。
表4 湖羊CADM2基因SNPs位点的遗传参数
表5 湖羊SNPs位点群体遗传学分析
多态信息含量（PIC）是用来判定和分析一个遗传标识所表达的信息含量，PIC＞0.5是高度多态位点，0.25＜PIC＜0.5是中度多态位点，PIC＜0.25是低度多态位点。PIC值越大说明有效等位基因数与杂合度越大，该群体四个SNP位点均为低度多态。
2.4 CADM2基因湖羊的生长性状关联分析
利用“1.7数据统计与分析的关联分析”中的GLM模型分别进行CADM2基因的4个SNPs与湖羊的生长性状的关联分析(表6)。
表6 CADM2基因SNPs与湖羊生长性状的关联分析
注：相同一列数据后面如果没有字母，或者有相同的字母则表示差异不显著（P＞0.05），有不同小的字母则表示差异显著（P＜0.05）。不同大写字母表示差异极显著（P＜0.01）。
分析结果表明：OAR1_164254640.1下游192bp T→C与湖羊的初生重、断奶重、六月龄体重极显著相关，CC基因型的初生重、断奶重、六月龄体重极显著高于TT、TC基因型个体。
OAR1_164254640.1下游235bp T→C与湖羊的初生重、断奶重、六月龄体重极显著相关，CC基因型的初生重、断奶重、六月龄体重极显著高于TT、TC基因型个体。
以上为对本发明实施例的描述，通过对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的。本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施列，而是要符合与本文所公开的原理和新颖点相一致的最宽的范围。
Claims (10)
1.一种检测与湖羊的初生重、断奶重、六月龄体重极显著相关的分子标记的试剂，其特征在于，该分子标记包括分子标记Ⅰ和分子标记Ⅱ，分子标记Ⅰ和分子标记Ⅱ为联锁基因；
分子标记Ⅰ定位为OAR1_164254640.1下游192bp T→C，位于SEQ ID NO:1的第330位点，其为C或T；其中：CC基因型的初生重、断奶重、六月龄体重极显著高于TT、TC基因型个体；
分子标记Ⅱ定位为OAR1_164254640.1下游235bp T→C，位于SEQ ID NO:1的第373位点，其为C或T；其中：CC基因型的初生重、断奶重、六月龄体重极显著高于TT、TC基因型个体。
2.根据权利要求1所述的试剂，其特征在于，该试剂包括引物对。
3.根据权利要求1所述的试剂，其特征在于，引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO:2和SEQID NO:3所示。
4.一种扩增产物，该扩增产物采用权利要求3所述的试剂扩增获得，核苷酸序列如SEQID NO:1所示。
5.一种包含权利要求1-3任意一项权利要求所述试剂的试剂盒。
6.权利要求1-3任意一项权利要求所述的试剂或权利要求4所述的扩增产物或权利要求5所述的试剂盒在筛选湖羊初生重、断奶重、六月龄体重辅助育种中的应用。
7.一种筛选初生重、断奶重、六月龄体重性状的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：提取湖羊基因组DNA，利用引物对进行PCR扩增，对扩增产物中的分子标记进行检测，从而筛选湖羊体重性状；所述分子标记包括分子标记Ⅰ和分子标记Ⅱ，分子标记Ⅰ和分子标记Ⅱ为联锁基因；
分子标记Ⅰ定位为OAR1_164254640.1下游192bp T→C，位于SEQ ID NO:1的第330位点，其为C或T；其中：CC基因型的初生重、断奶重、六月龄体重极显著高于TT、TC基因型个体；
分子标记Ⅱ定位为OAR1_164254640.1下游235bp T→C，位于SEQ ID NO:1的第373位点，其为C或T；其中：CC基因型的初生重、断奶重、六月龄体重极显著高于TT、TC基因型个体。
8. 权利要求7所述的方法，其特征在于，所述的引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示。
9.利要求7所述的方法，其特征在于， PCR 反应体系为25.0μL，KOD OneTM PCR MasterMix 12.5μL，上下游引物各0.2μL，ddH2O 11.1μL。
10.权利要求8或9所述的方法，其特征在于，PCR反应程序为：98℃变性10s，53℃退火30s，68℃延伸30s，进行34个循环，PCR 结束后4℃保存。
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