CN119301147A - 提高对镰孢菌头枯病的抗性的方法和组合物 - Google Patents

Abstract

本发明涉及修饰植物核糖体蛋白L3(RPL3)基因的组合物和方法，任选地提高对镰孢菌头枯病的抵抗力。本发明还涉及使用本发明的方法和组合物产生的对镰孢菌头枯病(Fusarium head blight)具有改进的抗性的植物。

Description

提高对镰孢菌头枯病的抗性的方法和组合物

【关于以电子方式提交序列表的声明】

2023年3月24日生成并随之提交的XML格式的XML格式序列表，标题为1499-35_ST26.xml，大小为278,127字节，特此通过引用并入其公开规范中。

【优先权声明】

根据35U.S.C.§119(e)的规定，本申请要求获得2022年4月7日提交的美国临时申请编号63/328,313的利益，其全部内容通过引用并入本文。

【发明领域】

本发明涉及修饰植物中核糖体蛋白L3(RPL3)基因的组合物和方法，任选地提高对镰孢菌头枯病的抗性。本发明还涉及使用本发明的方法和组合物产生的对镰孢菌头枯病具有改进抗性的植物。

【发明背景】

杀菌剂、栽培实践和遗传抗性的组合用于控制镰孢菌头枯病(FHB)。对FHB的抗性是定量的，Fhb1 QTL是最常用的抗性来源。杀菌剂通常会受到病原体产生耐药性的影响，因此随着时间的推移，效果会降低或失效。目前抗性位点(如Fhb1 QTL)仅提供部分定量抗性。需要新的抗性来源，可以选择性地与现有基因座堆叠以增强对FHB的抗性。

本发明通过提供新的组合物和方法来提高植物中FHB的抵抗力，解决了本领域的不足。

【发明内容】

本发明的一方面提供了植物或其部分，所述植物或其部分包含编码RPL3多肽的内源性核糖体蛋白L3(RPL3)基因中的至少一个突变，其中任选地，至少一个突变导致无可检测到的RPL3多肽或与单端孢霉烯霉菌毒素的结合减少的RPL3多肽，任选地其中至少一个突变是非天然突变。

本发明的第二方面提供了植物细胞，其包括编辑系统，所述编辑系统包括：(a)CRISPR-Cas效应蛋白；(b)向导核酸，包含与编码核糖体蛋白L3(RPL3)多肽的内源性靶基因互补的间隔序列。

本发明的第三方面提供了植物细胞，所述植物细胞包含一个或多个内源性核糖体蛋白L3(RPL3)基因中的至少一个突变，其中，所述至少一个突变是使用编辑系统引入的替换、插入和/或缺失，该系统包含与一个或多个内源性RPL3基因中的靶位点结合的核酸结合结构域，任选地，其中，至少一个突变是非天然突变。

本发明的第四方面提供了提供多种植物的方法，所述植物(i)包含突变的RPL3多肽，该多肽与单端孢霉烯霉菌毒素的结合减少，(ii)对镰孢菌头枯病(FHB)的抗性增加(例如，对FHB病原体禾谷镰孢菌(Fusarium graminearum)的抗性增加)，(iii)具有降低的禾谷镰孢菌(Fusarium graminearum)负荷，和/或(iv)对脱氧雪腐镰孢菌烯醇(DON)的耐受性增加，所述方法包括在生长区种植两种或多种本发明的植物，从而提供多种植物，所述植物与和不包含至少一个突变的多个对照植物相比在一个或多个内源性RPL3基因中缺乏至少一个突变的多个对照植物相比，(i)包含突变的RPL3多肽，其与单端孢霉烯霉菌毒素的结合减少，(ii)对镰孢菌头枯病(FHB)的抗性增加(例如，对FHB病原体，禾谷镰孢菌(Fusariumgraminearum)的抗性增加)，(iii)具有降低的禾谷镰孢菌(Fusarium graminearum)负荷，和/或(iv)对脱氧雪腐镰孢菌烯醇(DON)的耐受性增加。

本发明的第五方面提供了生产/培育无转基因编辑的植物的方法，其包括：将本发明的植物与无转基因的植物杂交，从而将至少一个无转基因的突变引入植物中；以及选择包含所述至少一个突变且无转基因的后代植物，从而产生无转基因编辑的植物，其中任选地，所述至少一个突变是非天然突变。

第六方面提供了在核糖体蛋白L3(RPL3)基因中产生变异的方法，其包括：将编辑系统引入植物细胞中，其中，所述编辑系统靶向编码RPL3多肽的RPL3基因的区，并将所述RPL3基因的区与所述编辑系统接触，从而将突变引入RPL3基因并在植物细胞的RPL3基因中产生变异。

本发明的第七方面提供了用于编辑植物细胞基因组中特定位点的方法，所述方法包括：以位点特异性方式切割植物细胞中内源性核糖体蛋白L3(RPL3)基因内的靶位点，所述内源性RPL3基因：(a)包含核苷酸序列，该核苷酸序列与SEQ ID NO：72、73、75、76、78、79、80、81、83、84、86或87之任一个具有至少80％的序列同一性，(b)包含与SEQ ID NO：89～139之任一个核苷酸序列具有至少80％序列同一性的区，和/或(c)编码与SEQ ID NO：74、77、82、85或88具有至少80％序列同一性的氨基酸序列，从而在植物细胞的内源性RPL3基因中产生编辑，并产生包含内源性RPL3基因编辑的植物细胞。

第八方面提供了制备植物的方法，所述方法包括：(a)使包含内源性核糖体蛋白L3(RPL3)基因的植物细胞群与核酸酶接触，该核酸酶与核酸结合结构域(例如，编辑系统)相连，该核酸结合结构域结合的序列(i)与SEQ ID NO：72、73、75、76、78、79、80、81、83、84、86或87的核苷酸序列之任一个具有至少80％的序列同一性，(ii)包含与SEQ ID NO：89～139之任一个核苷酸序列具有至少80％序列同一性的区，和/或(iii)编码与SEQ ID NO：74、77、82、85或88具有至少80％序列同一性的氨基酸序列；(b)从内源性RPL3基因已突变的植物细胞群中选择植物细胞，从而产生包含内源性RPL3基因突变的植物细胞；(c)将选定的植物细胞生长成包含编码RPL3多肽的内源基因突变的植物，其中突变减少或消除RPL3多肽结合单端孢霉烯霉菌毒素(任选地，脱氧雪腐镰孢菌烯醇(DON))的能力。

第九方面提供了在植物中增加对镰孢菌头枯病(FHB)的抗性(例如，增加对FHB病原体，禾谷镰孢菌(Fusarium graminearum)的抗性)和/或对单端孢霉烯霉菌毒素(任选脱氧雪腐镰孢菌烯醇(DON))的耐受性的方法，其包括：(a)使包含内源性核糖体蛋白L3(RPL3)基因的植物细胞与靶向内源性RPL3基因的核酸酶接触，其中核酸酶与核酸结合结构域(例如，编辑系统)相连，该核酸结合结构域与内源性RPL3基因中的靶位点结合，并且内源性RPL3基因：(i)包含核苷酸序列，该核苷酸序列与SEQ ID NO：72、73、75、76、78、79、80、81、83、84、86或87之任一个具有至少80％的序列同一性，(ii)包含与SEQ ID NO：89～139的任一个核苷酸序列具有至少80％序列同一性的区，和/或(iii)编码与SEQ ID NO：74、77、82、85或88具有至少80％序列同一性的氨基酸序列，从而产生包含内源性RPL3基因突变的植物细胞；(b)将植物细胞培养成包含内源性RPL3基因突变的植物，从而增加对FHB的抗性和/或增加对植物中单端孢霉烯霉菌毒素的耐受性。

第十方面提供了产生植物或其部分的方法，所述植物或其部分包含至少一个具有突变的核糖体蛋白L3(RPL3)基因的细胞，所述方法包括用包含切割结构域和核酸结合结构域的核酸酶接触植物或植物部分中内源性RPL3基因中的靶位点，其中核酸结合结构域与内源性RPL3基因中的靶位点结合，其中内源性RPL3基因(a)包含与SEQ ID NO：72、73、75、76、78、79、80、81、83、84、86或87的核苷酸序列具有至少80％序列同一性的序列；(b)包含与SEQID NO：89～139之任一个具有至少80％的同一性的区；和/或(c)编码与SEQ ID NO：74、77、82、85或88具有至少80％的序列同一性的氨基酸序列，从而产生包含至少一个在内源性RPL3基因中发生突变的细胞的植物或其部分。

本发明的第十一方面提供了产生植物或其部分的方法，所述植物或其部分包含内源性RPL3基因中的突变，产生突变的RPL3多肽，该多肽与单端孢霉烯霉菌毒素的结合减少，所述方法包括将植物或植物部分中的内源性RPL3基因中的靶位点与包含切割结构域和核酸结合结构域的核酸酶接触，其中，核酸酶的核酸结合结构域与内源性RPL3基因中的靶位点结合，其中，内源性RPL3基因：(a)包含与SEQ ID NO：72、73、75、76、78、79、80、81、83、84、86、或87的核苷酸序列之任一个具有至少80％序列同一性的序列；(b)包含与SEQ ID NO：89～139之任一个具有至少80％的同一性的区；和/或(c)编码与SEQ ID NO：74、77、82、85或88具有至少80％的序列同一性的氨基酸序列，从而产生内源基因突变的植物或其部分，该突变产生突变的RPL3多肽，该多肽与单端孢霉烯霉菌毒素的结合减少。

第十二方面提供了向导核酸，其与内源性核糖体蛋白L3(RPL3)基因中的靶位点结合，基因识别号(gene ID)为TraesCS4A02G208000(SEQ ID NO：72)、TraesCS4B02G111500(SEQ ID NO：75)、TraesCS4D02G109200(SEQ ID NO：78)、TraesCS5A02G112400(SEQ ID NO：80)、TraesCS5B02G118400(SEQ ID NO：83)、和/或TraesCS5D02G129200(SEQ ID NO：86)，任选地，其中靶位点位于内源性RPL3基因区内，该区与SEQ ID NO：89～139之任一个具有至少80％的序列同一性。

在第十三方面，提供了系统，该系统包括本发明的向导核酸和与向导核酸结合的CRISPR-Cas效应蛋白。

第十四方面提供了包含CRISPR-Cas效应蛋白与向导核酸结合的基因编辑系统，其中，向导核酸包含与内源性核糖体蛋白L3(RPL3)基因结合的间隔序列。

在第十五方面，提供了包含向导核酸和包含切割结构域的CRISPR-Cas效应蛋白的复合物，其中，向导核酸与RPL3基因中的靶位点结合，其中内源性RPL3基因(a)包含与SEQID NO：72、73、75、76、78、79、80、81、83、84、86或87的核苷酸序列之任一个具有至少80％序列同一性的序列；(b)包含与SEQ ID NO：89～139之任一个具有至少80％的同一性的区；和/或(c)编码与SEQ ID NO：74、77、82、85或88具有至少80％的序列同一性的氨基酸序列，并且切割结构域切割RPL3基因中的靶链。

在第十六方面，提供了表达盒，所述表达盒包括(a)编码CRISPR-Cas效应蛋白的多核苷酸，该效应蛋白包含切割结构域和(b)与RPL3基因中的靶位点结合的向导核酸，其中，向导核酸包含间隔序列，所述间隔序列互补并结合(i)与SEQ ID NO：72、73、75、76、78、79、80、81、83、84、86或87的核苷酸序列之任一个具有至少80％序列同一性的核酸部分；(ii)与SEQ ID NO：89～139之任一个核苷酸序列具有至少80％序列同一性的核酸部分；和/或(iii)核酸部分编码与SEQ ID NO：74、77、82、85或88具有至少80％的序列同一性的氨基酸序列。

在第十七方面，提供了在植物中产生内源性核糖体蛋白L3(RPL3)基因突变的方法，所述方法包括：(a)将基因编辑系统靶向一个或多个内源性RPL3基因的部分，该基因包含与SEQ ID NO：89～139之任一个具有至少90％序列同一性的序列；和(b)选择一种植物，所述植物包含在一个或多个内源性RPL3基因区的修饰，该区与SEQ ID NO：89～139之任一个具有至少90％的序列同一性。

在第十八方面，提供的植物在其基因组中包含一个或多个突变的核糖体蛋白L3(RPL3)基因，这些基因是通过本发明的方法产生的。

本发明的进一步方面提供了植物或其植物部分，所述植物或其部分包含至少一个内源性核糖体蛋白L3(RPL3)基因中的一个突变，该基因的基因识别号(gene ID)为TraesCS4A02G208000(SEQ ID NO：72)、TraesCS4B02G111500(SEQ ID NO：75)、TraesCS4D02G109200(SEQ ID NO：78)、TraesCS5A02G112400(SEQ ID NO：80)、TraesCS5B02G118400(SEQ ID NO：83)和/或TraesCS5D02G129200(SEQ ID NO：86)，任选地，其中至少一个突变是非天然突变。

本发明的第十九方面提供了包含突变的核糖体蛋白L3(RPL3)基因的核酸，其中任选地，突变的RPL3基因包含外显子3中的突变。

第二十方面提供了编码核糖体蛋白L3(RPL3)多肽的突变核酸，任选地该突变位于RPL3基因的外显子3中，其中突变导致无可检测到的RPL3多肽或与单端孢霉烯霉菌毒素的结合减少的RPL3多肽。

在另一方面，提供了突变的RPL3基因，其中突变的内源性RPL3基因包含与SEQ IDNO：147、149、151、153或155之任一个具有至少90％序列同一性的核酸序列和/或编码突变的RPL3多肽，该多肽与SEQ ID NO：148、150、152、154或156之任一个具有至少90％序列同一性，任选地，其中突变的内源性RPL3基因包含非天然突变。

进一步提供在其基因组中包含一个或多个核糖体蛋白L3(RPL3)基因的植物，这些基因具有通过本发明的方法产生的突变，其中任选地植物(a)表现出对镰孢菌头枯病(FHB)的抗性增加(例如，对FHB病原体禾谷镰孢菌(Fusarium graminearum)的抗性增加)，(b)表现出禾谷镰孢菌(Fusarium graminearum)的量减少，例如，禾谷镰孢菌(F.graminearum)负荷减少；(c)表现出对脱氧雪腐镰孢菌烯醇(DON)的耐受性增加；和/或(d)在感染FHB(由FHB的病原体(禾谷镰孢菌(Fusarium graminearum))感染)时产生积累较少单端孢霉烯霉菌毒素(例如，DON)的种子，其中突变可以是非天然突变。

此外，还提供用于制备本发明植物的多肽、多核苷酸、核酸构建体、表达盒和载体。

本发明的这些和其他方面在下面的发明描述中更详细地阐述。

【序列的简要描述】

SEQ ID NO：1～17是可用于本发明的示例性Cas12a氨基酸序列。

SEQ ID NO：18～20是可用于本发明的示例性Cas12a核苷酸序列。

SEQ ID NO：21～22是编码启动子和内含子的示例性调节序列。

SEQ ID NO：23～29是可用于本发明的示例性胞嘧啶脱氨酶序列。

SEQ ID NO：30～40是可用于本发明的示例性腺嘌呤脱氨酶氨基酸序列。

SEQ ID NO：41是可用于本发明的示例性尿嘧啶-DNA糖基化酶抑制剂(UGI)序列。

SEQ ID NO：42～44提供了V型CRISPR-Cas12a核酸酶的原间隔子相邻基序位置的实例。

SEQ ID NO：45～47提供了可用于本发明的肽标签和亲和多肽的实例。

SEQ ID NO：48～58提供了可用于本发明的RNA募集基序和相应的亲和多肽的实例。

SEQ ID NO：59～60是可用于本发明的示例性Cas9多肽序列。

SEQ ID NO：61～71是可用于本发明的示例性Cas9多核苷酸序列。

SEQ ID NO：72、75、78、80、83或86是来自小麦的RPL3基因组序列的实例。SEQ IDNO：73、76、79、81、84或87是来自小麦的RPL3 cDNA序列的实例。

SEQ ID NO：74、77、82、85或88是来自小麦的RPL3多肽序列的实例。

SEQ ID NO：89～139是RPL3基因组和编码序列的部分或区的实例。

SEQ ID NO：140～146是可用于本发明的向导核酸的间隔序列的实例。

SEQ ID NO：147、149、151、153和155是突变的RPL3基因的实例。

SEQ ID NO：148、150、152、154和156是分别由SEQ ID NO：147、149、151、153和155编码的突变的RPL3多肽的实例。

【详细说明】

下面将结合附图和实施例对本发明进行描述，其中显示了本发明的实施例。本描述并非旨在成为实现发明的所有不同方式或可以添加到本发明中的所有功能的详细目录。例如，关于一个实施例图示的特征可以合并到其他实施例中，并且关于特定实施例图示的特征可以从其他实施例中删除。因此，本发明设想的是，在本发明的某些实施例中，本文所阐述的任何特征或特征的组合都可以被排除或省略。此外，本文所建议的各种实施例的许多变化和补充对于本领域的技术人员来说是显而易见的，鉴于即时公开，这些变化和补充并不偏离本发明。因此，以下描述旨在说明本发明的一些特定实施例，而不是详尽地指定它们的所有排列、组合和变化。

除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。本文对本发明的描述中使用的术语仅用于描述特定的实施例，而不是为了限制本发明。

本文引用的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献均通过引用完整地纳入与参考文献展示的句子和/或段落相关的教义。

除非上下文另有说明，否则具体的目的是使本文中描述的发明的各种特征可以任意组合使用。此外，本发明还设想了在本发明的某些实施例中，本文所阐述的任何特征或特征的组合都可以被排除或省略。为了说明，如果说明书规定组合物包含成分A、B和C，则具体指A、B或C中的任意，或它们的组合，可以单独或以任意组合省略和否认。

如在本发明的描述和所附权利要求中所使用的，单数形式“a”、“an”和“the”也意在包括复数形式，除非上下文另有明确说明。

同样，如本文所用，“和/或”是指并包含一个或多个相关所列项目的任何和所有可能的组合，以及用替代项(“或”)解释时组合的缺乏。

术语“约”，如本文在指诸如量或浓度等的可测量值时所使用的，是指包括±10％、±5％、±1％、±0.5％甚至±0.1％以及指定值的变化。例如，“约X”，其中X是可测量值，意味着包括X以及X的±10％、±5％、±1％、±0.5％甚至±0.1％的变化。此处提供的可衡量值范围可能包括其中的任何其他范围和/或单个值。

如本文所用，诸如“X与Y之间”和“约X与Y之间”等短语应被解释为包括X和Y。如本文所用，诸如“在约X和Y之间”的短语是指“在约X和约Y之间”，而诸如“从约X～Y”的短语是指“从约X～约Y”。

除非本文中另有说明，否则本文中对值范围的引用仅旨在作为单独引用落在该范围内的每个单独值的简写方法，并且每个单独的值都被纳入说明书中，就好像它是在本文中单独引用的一样。例如，如果披露了范围10～15，则也会披露11、12、13和14。

本文中使用的术语“包括”(“comprise”、“comprises”和“comprising”)，指定了所述特征、整数、步骤、操作、元素和/或组件的存在，但不排除存在或添加一个或多个其他特征、整数、步骤、操作、元素、组件和/或其组。

如本文所用，过渡性短语“基本上由”是指权利要求的范围被解释为包括权利要求中引用的特定材料或步骤，以及那些对要求保护的发明的最重要和新颖特性无实质性影响的材料或步骤。因此，在本发明的权利要求中使用术语“基本上由其组成“并不意味着被解释为等同于”包括”。

如本文所用，术语“增加”、“增加(ing)”、“增加(ed)”、“增强”、“增强(ed)”、“增强(ing)”和“增强(ment)”(及其语法变体)描述了与对照相比至少约5％、10％、15％、20％、25％、50％、75％、100％、150％、200％、300％、400％、500％或更高的升高。例如，如本文所述，包含RPL3基因突变的植物可以与缺乏所述至少一种突变的对照植物相比，表现出对镰孢菌头枯病(FHB)的抗性增加(例如，对FHB病原体禾谷镰孢菌(Fusarium graminearum)的抗性增加，例如，FHB病原体禾谷镰孢菌(Fusarium graminearum)的感染症状减轻)。对照植物通常与编辑的植物相同，但对照植物未经过类似的编辑，因此无所述突变。对照植物可能是同基因植物和/或野生型植物。因此，对照植物可以是与本文中描述的突变渗入的实验对象植物相同的育种系、品种或栽培品种，但对照育种系、品种或栽培品种无突变。在一些实施方式中，在相同的生长条件下，例如，在相同的环境条件(土壤、水合、光、热、养分等)下，对本发明的植物和对照植物进行比较。

如本文所用，术语“减少”、“减少(ed)”、“减少(ing)”、“下降”、“减弱”和“降低”(及其语法变体)描述，例如，与对照相比，至少减少约5％、10％、15％、20％、25％、35％、50％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或100％。在具体实施方式中，减少可以导致无或基本上无(例如，微不足道的量，小于约10％甚至5％)的可检测活性或量。例如，如本文所述，包含RPL3基因突变的植物可以与缺乏所述突变的对照植物相比，表现出单端孢霉烯霉菌毒素与突变的RPL3多肽的结合减少，或表现出禾谷镰孢菌(Fusarium graminearum)的量减少，例如，禾谷镰孢菌(F.graminearum)负荷降低。

如本文所用，术语“表达”、“表达(s)”、“表达(ed)”或“表达(sion)”等，相对于核酸分子和/或核苷酸序列(例如，RNA或DNA)表示核酸分子和/或核苷酸序列被转录和任选地翻译。因此，核酸分子和/或核苷酸序列可以表达感兴趣的多肽，或者例如功能性非翻译RNA。

“异源”或“重组”核苷酸序列是与其被引入的宿主细胞非天然相关的核苷酸序列，包括天然存在的核苷酸序列的非天然存在的多个拷贝。“异源”核苷酸/多肽可能来自外来物种，或者，如果来自同一物种，则通过故意的人类干预，其组成和/或基因组位点从其天然形式进行了实质性修饰。

“天然”或“野生型”核酸、核苷酸序列、多肽或氨基酸序列是指天然存在的或内源性的核酸、核苷酸序列、多肽或氨基酸序列。在某些情况下，“野生型”核酸是未按本文所述编辑的核酸，并且可能与可能按本文所述编辑的“内源性”基因(例如，突变的内源性基因)不同。在某些情况下，“野生型”核酸(例如，未编辑的)可能与发现野生型核酸的生物体是异源的(例如，转基因生物体)。例如，“野生型内源性核糖体蛋白L3(RPL3)基因”是天然存在于参考生物体中或内源性的RPL3基因，例如植物，例如小麦植物、大麦植物、燕麦植物、斯佩尔特小麦植物，并且可以按照本文所述进行修饰，之后，这种修饰的内源性基因不再是野生型的。在一些实施方案中，内源性RPL3基因可以但不限于内源性RPL3A基因或内源性RPL3B基因，其中，内源性RPL3A基因是RPL3A-1基因、RPL3A-2基因和/或RPL3A-3基因，和/或RPL3B基因是RPL3B-1基因、RPL3B-2基因和/或RPL3B-3基因，其中任选地，所述修饰可以是在RPL3A基因、RPL3A-1基因、RPL3A-2基因、RPL3A-3基因、RPL3B基因、RPL3B-1基因、RPL3B-2基因和/或RPL3B-3基因中的一个或多个中。

如本文所用，术语“杂合子”是指不同的等位基因驻留在同源染色体上的相应位点的遗传状态。

如本文所用，术语“纯合子”是指相同的等位基因驻留在同源染色体上的相应位点的遗传状态。

如本文所用，术语“等位基因”是指出现在特定基因座的两个或多个不同核苷酸或核苷酸序列之一。

“无效等位基因”是由基因突变引起的无功能等位基因，其导致相应蛋白质的产生完全缺乏或产生无功能的蛋白质。

“隐性突变”是当纯合子时产生表型的基因中的突变，但当基因座是杂合子时，表型是不可观察到的。

“显性突变”是指在基因的非突变拷贝存在下产生突变表型的基因突变。显性突变可以是功能丧失或获得突变、亚等位基因突变、超等位基因突变或功能弱丧失或功能弱获得。

“显性阴性突变”是产生改变的基因产物(例如，相对于野生型具有异常功能)的突变，该基因产物对野生型等位基因或基因产物的功能产生不利影响。例如，“显性阴性突变”可能会阻断野生型基因产物的功能。显性阴性突变也可以称为“反效等位基因突变”。

“半显性突变”是指在杂合生物体中表型的外显率小于在纯合生物体中观察到的外显率的突变。

“弱功能丧失突变”是导致基因产物与野生型基因产物相比具有部分功能或功能降低(部分失活)的突变。

“亚等位基因突变”是导致基因功能部分丧失的突变，其可能通过表达降低(例如，蛋白质和/或RNA减少)或功能性能降低(例如活性降低)发生，但不是功能/活性的完全丧失。“亚型”等位基因是由基因突变引起的半功能性等位基因，可产生相应的蛋白质，其功能效率在正常值的1％～99％之间。

“超等位基因突变”是导致基因产物表达增加，和/或基因产物活性增加的突变。

如本文所用，“非天然突变”是指通过人类干预产生的突变，并且不同于在自然界中发生的同一基因中发现的突变(例如，天然发生的突变))。

“基因座”是基因或标记或等位基因所在的染色体上的位置。在一些实施方案中，一个基因座可以包含一个或多个核苷酸。

如本文所用，术语“期望等位基因”、“目标等位基因”和/或“感兴趣的等位基因”可互换地指代与期望性状相关的等位基因。在一些实施方案中，期望的等位基因可以与给定性状的增加或减少(相对于对照)或给定性状相关联，这取决于期望的表型的性质。

当所述性状与性状相关联时，标记是与性状“关联”的，并且当标记的存在是所需性状或性状形式是否和/或在多大程度上出现在构成该标记的植物/种质中的指标时。同样，当一个标记与一个等位基因或染色体间隔相关联时，当该标记的存在表明该等位基因或染色体间隔是否存在于构成该标记的植物/种质中时，该标记就与该标记“关联”。

如本文所用，术语“回交”和“回交”是指后代植物被回交回其亲本之一一次或多次(例如，1、2、3、4、5、6、7、8等)的过程。在回交方案中，“供体”亲本是指具有所需基因或要渗入的基因位点的亲本植物。“受体”亲本(使用一次或多次)或“循环”亲本(使用两次或更多次)是指基因或基因座被渗入的亲本植物。例如，参见Ragot,M.et al.Marker-assistedBackcrossing:A Practical Example,in Techniques et Utilisations des MarqueursMoleculaires Les Colloques,Vol.72,pp.45-56(1995)；and Openshaw et al.,Marker-assisted Selection in Backcross Breeding,in Proceedings of the Symposium“Analysis of Molecular Marker Data”,pp.41-43(1994)。最初的杂交产生了F1代。术语“BC1”是指循环亲本的第二次使用，“BC2”是指循环亲本的第三次使用，依此类推。

如本文所用，术语“杂交”或“杂交”是指配子通过授粉融合以产生后代(例如，细胞、种子或植物)。该术语包括有性杂交(一种植物与另一种植物授粉)和自交(自花授粉，例如，当花粉和胚珠来自同一植物时)。术语“杂交”是指通过授粉将配子融合以产生后代的行为。

如本文所用，术语“渗入”、“渗入”和“渗入”是指基因位点或遗传位点的所需等位基因或等位基因的组合从一个遗传背景到另一个的天然和人工传递。例如，位于指定基因座的所需等位基因可以通过同一物种的两个亲本之间的有性杂交传递给至少一个(例如，一个或多个)后代，其中至少一个亲本在其基因组中具有所需的等位基因。或者，例如，等位基因的传递可以通过两个供体基因组之间的重组来实现，例如，在融合的原生质体中，其中至少一个供体原生质体在其基因组中具有所需的等位基因。所需的等位基因可以是标记物、QTL、转基因等的选定等位基因。包含所需等位基因的后代可以回交一次或多次(例如，1、2、3、4或更多次)到具有所需遗传背景的品系，选择所需的等位基因，结果是所需的等位基因固定在所需的遗传背景中。例如，在非水分胁迫条件下与产量增加相关的标记可能会从供体渗入不包含标记并且在非水分胁迫条件下不会表现出产量增加的循环亲本。然后可以将产生的后代回交一次或多次并选择，直到后代具有与在循环亲本背景下非水分胁迫条件下产量增加相关的遗传标记。

“遗传图谱”是描述给定物种内一条或多条染色体上的基因座之间的遗传连锁关系，通常以图表或表格形式描述。对于每个遗传图谱，基因座之间的距离是通过它们之间的重组频率来测量的。可以使用各种标记物检测基因座之间的重组。遗传图谱是映射种群、所用标记类型以及不同种群之间每个标记的多态性潜力的产物。基因座之间的顺序和遗传距离可能因遗传图谱而异。

如本文所用，术语“基因型”是指个体(或个体组)在一个或多个遗传位点的遗传构成，与可观察和/或可检测和/或显现的性状(表型)相对。基因型由个体从亲本那里继承的一个或多个已知基因座的等位基因定义。术语基因型可用于指代个体在单个基因座、多个基因座的遗传构成，或者更一般地说，术语基因型可用于指代个体对其基因组中所有基因的基因构成。基因型可以间接表征，例如，使用标记物和/或通过核酸测序直接表征。

本文使用的术语“种质”是指来自个体(例如植物)、一组个体(例如植物品系、品种或家族)的遗传物质，或源自品系、品种、物种或培养物的克隆。种质可以是生物体或细胞的一部分，也可以与生物体或细胞分开。一般来说，种质为遗传物质提供特定的基因组成，为生物体或细胞培养物的部分或全部遗传品质奠定了基础。如本文所用，种质包括可以从中生长新植物的细胞、种子或组织，以及可以培养成整株植物的植物部分(例如，叶、茎、芽、根、花粉、细胞等)。

如本文所用，术语“栽培品种”和“品种”是指一组相似的植物，其通过结构或遗传特征和/或性能可以与同一物种内的其他品种区分开来。

如本文所用，术语“外来的”、“外来的品系”和“外来的种质”是指任何非精英的植物、品系或种质。一般来说，外来植物/种质不是来自任何已知的优良植物或种质，而是被选择用于将一个或多个所需的遗传元件引入育种计划(例如，将新的等位基因引入育种计划)。

如本文所用，在植物育种的上下文中，术语“杂交”是指植物是遗传上不同的亲本的后代，通过杂交不同品系或品种或物种产生的，包括但不限于两个自交系之间的杂交。

如本文所用，术语“近交”是指基本上纯合的植物或变种。该术语可以指在整个基因组中基本上是纯合子的植物或植物品种，或者相对于特定感兴趣的基因组部分基本上是纯合子的植物或植物品种。

“单倍型”是个体在多个遗传位点的基因型，即等位基因的组合。通常，定义单倍型的遗传位点在物理和遗传上是相关的，即在同一染色体片段上。术语“单倍型”可以指特定基因座的多态性，例如单个标记基因座，或沿染色体片段的多个基因座的多态性。

一种植物，其中至少一个(例如一个或多个，例如1、2、3或4个或多个)内源性RPL3基因(例如，内源性RPL3A基因、内源性RPL3A-1基因、内源性RPL3A-2基因、内源性RPL3A-3基因、内源性RPL3B基因、内源性RPL3B-1基因、内源性RPL3B-2基因、内源性RPL3B-3)如本文所述进行修饰(例如，包括此处描述的修饰)可导致单端孢霉烯霉菌毒素与由至少一个修饰的内源性RPL3基因编码的RPL3多肽的结合减少，可导致对镰孢菌头枯病(FHB)的抗性/耐受性增加(例如，对FHB病原体，禾谷镰孢菌(Fusarium graminearum)的抗性/耐受性增加，例如，FHB感染症状减轻，例如，禾谷镰孢菌(Fusarium graminearum)感染症状减轻)，可导致对单端孢霉烯霉菌毒素(例如，DON)的耐受性增加，可表现出植物中存在的禾谷镰孢菌(Fusarium graminearum)量减少(例如，禾谷镰孢菌(F.graminearum)负荷降低)，和/或可导致植物，所述植物与不包含(无)至少一个内源性RPL3基因修饰的植物相比，感染禾谷镰孢菌(Fusarium graminearum)时能够产生积累较少单端孢霉烯霉菌毒素的种子。

单端孢霉烯霉菌毒素脱氧雪腐镰孢菌烯醇(DON)被认为通过与植物的RPL3多肽结合而充当禾谷镰孢菌(F.graminearum)的毒力因子。不希望受任何特定理论的限制，修改RPL3基因使得DON结合编码的RPL3多肽的能力降低或无能力，可能会降低真菌感染植物或其部分的能力，导致植物或其部分对真菌感染的抵抗力/耐受性增加，和/或真菌负荷降低。因此，如本文所述，编码RPL3多肽的内源性RPL3基因的修饰可能调节疾病对禾谷镰孢菌(Fusarium graminearum)的反应和/或可能增加对禾谷镰孢菌(F.graminearum)产生的霉菌毒素的耐受性，和/或可导致植物或其部分包含降低的禾谷镰孢菌(F.graminearum)负荷。

如本文所用，“对FHB的抗性增加”是指在本发明的植物或其部分中对禾谷镰孢菌(F.graminearum)感染的抗性增加约20％～约100％(例如，约20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％或以上)，或其中的任何范围或值，与对照植物(例如，如本文所述的不包含内源性RPL3基因突变的植物)相比。抗性的增加也可以称为对FHB的耐受性增加。这种抗性的增加可以观察为植物病害症状的减轻，任选地在植物或其部分的真菌生长或发育无伴随的变化。在一些实施方案中，增加的抗性可以通过感染症状的减少来测量(例如，减少约20％～约100％；例如，约20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％)，或其中的任何范围或值，由禾谷镰孢菌(F.graminearum)引起，例如植物种子头状花序中受感染的小穗白化的疾病症状减少。可以在小穗感染禾谷镰孢菌(F.graminearum)后测量抗性或耐受性，也可以通过将植物的种子头状花序暴露于霉菌毒素(任选DON)来测量。因此，疾病检测可能会查看小穗。感染禾谷镰孢菌(F.graminearum)的小穗表现出过早的白化和黄化。当按从1～9的等级排名时，抗病性可以用与对照植物相比白化的减少来衡量。疾病通常记录在量表上，抗性以低于对照的相对评分来衡量。例如，参见Hales et al.,Type II Fusarium head blight susceptibility conferred by aregion on wheat chromosome 4DJ.Exp.Bot.71(16):4703-4714(2020)；Hales et al.还发现疾病严重程度可以根据显示疾病症状的区来衡量，例如，测量显示疾病症状的小穗的数量。在一些实施方案中，测量了“II型”抗性，因此，在测量被感染的小穗的数量时，与对照植物相比，测试植物(例如，如本文所述的编辑的植物)减少一个受感染的小穗表明测试植物更具抗性。另请参见Wu et al.,Linking Multi-Omics to Wheat Resistance Types toFusarium Head Blight to Reveal the Underlying Mechanisms.Int J Mol Sci.2022；23(4):2280.Published 2022February 18.doi:10.3390/ijms23042280。

如本文所用，“单端孢霉烯霉菌毒素与突变的RPL3多肽的结合减少”是指单端孢霉烯霉菌毒素与突变的RPL3的结合减少约15％～约100％(例如，约15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％或更多)，或其中的任何范围或值。如Hassan等人(Toxins 8:261(2016))进一步描述的亲和色谱技术，通过标准亲和色谱技术测量单端孢霉烯霉菌毒素与突变的RPL3的结合减少。

如本文所用，“减少的禾谷镰孢菌(F.graminearum)负荷”或“减少的真菌负荷”是指与对照植物(当暴露于真菌，禾谷镰孢菌(F.graminearum))相比，存在于包括至少一个内源性RPL3基因突变(一个或多个)的植物中的禾谷镰孢菌(F.graminearum)的量减少。如本文所述，内源性RPL3基因的突变可导致禾谷镰孢菌(F.graminearum)负荷减少约40％～约100％(例如，约40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、与对照发电厂相比，67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％)或其任何范围或值。植物中携带的禾谷镰孢菌(F.graminearum)负荷或植物中禾谷镰孢菌(F.graminearum)的量可以通过例如，定量PCR技术进行测量，例如，Bakker和McCormick描述的技术(Phytopathology 109:993-1002(2019))。

如本文所用，短语“当感染禾谷镰孢菌(Fusarium graminearum)时，单端孢霉烯霉菌毒素积累减少的种子”是指与在至少一个内源性RPL3基因中不包含/无突变(一种或多种)的植物产生的种子相比，单端孢霉烯霉菌毒素的水平/量降低的种子，如本文所述。单端孢霉烯霉菌毒素的减少量可能约为0～约十亿分之3。在一些实施方案中，与在至少一个内源性RPL3基因中无突变(一个或多个)的植物相比，单端孢霉烯霉菌毒素的量可以减少约40％～约100％(例如，约40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％)或其中的任何范围或值。

如本文所用，对禾谷镰孢菌(F.graminearum)产生的霉菌毒素的“耐受性增加”，例如，对单端孢霉烯霉菌毒素(例如DON)的耐受性增加是指对霉菌毒素的敏感性降低，例如单端孢霉烯霉菌毒素(例如DON)。在一些实施方案中，如本文所述，包含内源性RPL3基因中的一个或多个突变的植物或其部分可以与在至少一个内源性RPL3基因中无突变(一个或多个)的植物相比，表现出对单端孢霉烯霉菌毒素(例如，DON)约10％～约100％的耐受性增加/敏感性降低(例如，约15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％或更多)，或其中的任何范围或值。在一些实施方案中，对单端孢霉烯霉菌毒素的耐受性可以如上所述使用小穗白化和黄化来测量。

如本文所用的“对照植物”是指不包含经编辑的RPL3基因或如本文所述的赋予增强/改善性状(例如，产量性状)或改变表型的基因的植物。对照植物用于识别和选择如本文所述编辑的植物，并且与对照植物相比，所述植物具有增强的性状或改变的表型。合适的对照植物可以是用于产生包含突变的RPL3基因的植物的亲本系植物，例如，如本文所述，在内源性RPL3基因中无编辑的野生型植物。合适的对照植物也可以是含有赋予其他性状的重组核酸的植物，例如，具有增强除草剂耐受性的转基因植物。在某些情况下，合适的对照植物可以是杂合子或半合子转基因植物系的后代，所述植物系缺乏本文所述的突变的RPL3基因，称为阴性分离株或阴性同基因系。

增强的性状(例如，改进的产量性状)可以包括，例如，与对照植物相比，从种植到成熟的天数减少，茎的大小增加，叶子的数量增加，营养阶段植物高度生长速率的增加，玉米穗大小的增加，每株植物的穗干重增加，每穗的籽粒数增加，每株籽粒的重量增加，减少穗空洞、延长籽粒灌浆期、降低株高、增加根枝数量、增加总根长、增加产量、提高氮利用效率和/或提高水分利用效率。改变的表型可以是，例如，植物高度、生物量、树冠面积、花青素含量、叶绿素含量、施用的水、含水量和水分利用效率。

在一些实施方案中，本发明的植物可以包含一种或多种改进的产量性状，包括但不限于，在一些实施方案中，一种或多种改进的产量性状包括与如本文所述的无RPL3基因突变的对照植物相比，更高的产量(蒲式耳/英亩)、增加的生物量、增加的植物高度、增加的茎直径、增加的叶面积、增加的花数、增加的籽粒行数、任选地，其中穗长不显著减少，增加籽粒数，增加籽粒大小，增加穗长，减少分蘖数，减少穗状枝条数，增加荚数，包括增加每个节点的荚数和/或增加每株植物的荚数，增加每个荚果的种子数，增加种子数，增加种子大小，和/或增加种子重量(例如，增加100粒种子重量)。在一些实施方案中，本发明的植物可以包含一种或多种改进的产量性状，包括但不限于与对照植物或其部分相比，任选地增加产量(蒲/英亩)、种子大小(包括籽粒大小)、种子重量(包括籽粒重量)、增加的籽粒行数(任选地，其中穗长不显著减少)、增加的豆荚数、增加的每个豆荚的种子数和增加的穗长。

如本文所用，“性状”是植物或特定植物材料或细胞的生理、形态、生化或物理特性。在某些情况下，这种特性是人眼可见的，可以通过机械方式测量，例如种子或植物的大小、重量、形状、形状、形状、长度、高度、生长速度和发育阶段，或者可以通过生化技术进行测量，例如检测蛋白质、淀粉、某些代谢物或种子或叶子的含油量，或通过观察代谢或生理过程，例如，通过测量对缺水或特定盐或糖浓度的耐受性，或通过测量一个或多个基因的表达水平，例如，通过采用Northern分析、RT-PCR、微阵列基因表达测定或报告基因表达系统，或通过农业观察，如高渗胁迫耐受性或产量。然而，任何技术都可用于测量转基因植物中任何选定的化合物或大分子的数量、比较水平或差异。

本文中使用的“增强性状”是指如本文所述，由RPL3基因突变产生的植物特征。这些性状包括但不限于增强的农事性状，其特征是植物形态、生理学、生长和发育、产量、营养增强、病虫害抵抗力或环境或化学耐受性。在一些实施方案中，增强的性状/改变的表型可以是，例如，从种植到成熟的天数减少，茎秆大小增加，叶数增加，营养阶段植物株高生长速率增加，穗大小增加，每株植物穗干重增加，每穗的籽粒数增加，每株籽粒的重量增加，每株植物的籽粒数增加，减少穗空洞，延长籽粒灌浆期，降低株高，增加根枝数，增加总根长，耐旱性，提高水分利用效率，耐寒性，提高氮利用效率和/或增加产量。在一些实施方案中，一个性状是在非胁迫条件下增加的产量或在环境压力条件下增加的产量。胁迫条件可以包括生物和非生物胁迫，例如，干旱、阴凉处、真菌病害、病毒病、细菌病、虫害、线虫侵扰、低温暴露、热暴露、渗透胁迫、氮养分可用性降低、磷养分可用性降低和植物密度高。“产量”受许多特性的影响，包括但不限于植物高度、植物生物量、豆荚数量、植物上的豆荚位置、节间数量、豆荚碎裂的发生率、粒径、穗大小、穗尖填充、籽粒败育、结瘤和固氮效率、养分同化效率、对生物和非生物胁迫的抵抗力、碳同化、植物结构、抗倒伏、种子发芽百分比、幼苗活力和幼年性状。产量还受发芽效率(包括胁迫条件下的发芽)、生长速率(包括胁迫条件下的生长速率)、开花时间和持续时间、穗数、穗大小、穗重、每个穗或豆荚的种子数、种子大小、种子成分(淀粉、油、蛋白质)和种子填充特性的影响。

本文也使用了术语“性状修饰”，包括通过在包含内源性RPL3基因突变的植物中的特征中产生可检测到的差异来改变天然发生的性状，如本文所述，相对于不包含突变的植物，例如野生型植物或阴性分离株。在某些情况下，可以定量评估性状修饰。例如，与对照植物相比，性状修饰可导致观察到的性状特征或表型的增加或减少。众所周知，修饰后的性状可能存在天然变化。因此，与对照植物相比，观察到的性状改变可导致植物中性状特征或表型的正常分布和量级发生变化。

本公开涉及具有改进的经济相关特性的植物，更具体地说，对镰孢菌头枯病(FHB)的抗性或耐受性增加的植物(例如，对FHB病原体的抗性/耐受性增加，例如，减少FHB感染的症状，例如，减少禾谷镰孢菌(Fusarium graminearum)感染后的感染症状)，减少禾谷镰孢菌(F.graminearum)负荷，禾谷镰孢菌(Fusarium graminearum)感染后DON积累减少，对单端孢霉烯霉菌毒素的耐受性增加，例如脱氧雪腐镰孢菌烯醇(DON)和/或当携带种子的植物感染禾谷镰孢菌(Fusarium graminearum)时，植物具有产生减少的单端孢霉烯霉菌毒素积累的种子的能力。在一些实施方案中，本发明的植物可以进一步包含如本文所述修饰的RPL3基因，该基因产生具有减少与单端孢霉烯霉菌毒素结合的修饰的RPL3多肽。在一些实施方案中，本发明的植物包含如本文所述修饰的RPL3基因，该基因产生检测不到的RPL3多肽或截短的RPL3多肽。在一些实施方案中，植物可以进一步表现出改进的产量特性和/或改进的植物结构(这可以有助于改进的产量性状)。更具体地说，本公开涉及包含本文所述的RPL3基因突变的植物，其中所述植物与无所述突变的对照植物相比，对镰孢菌头枯病(FHB)具有增加的抗性或耐受性(例如，FHB症状减轻)和/或对单端孢霉烯霉菌毒素的耐受性增加，并且任选地增加产量。在一些实施方案中，本公开的植物表现出与产量相关的改进性状，包括但不限于提高氮利用效率、增加氮胁迫耐受性、增加水分利用效率和/或增加耐旱性，如下文中定义和讨论的。

产量可以定义为作物中具有经济价值的可衡量产品。产量可以在数量和/或质量的范围内定义。产量可以直接取决于几个因素，例如，器官的数量和大小(例如，花的数量)，植物结构(例如，枝条的数量，植物生物量，例如，增加的根生物量，更陡峭的根角和/或更长的根等)，开花时间和持续时间，谷物填充期。根系结构和发育、光合效率、养分吸收、抗逆性、早期活力、延迟衰老和功能保持绿色表型可能是决定产量的因素。因此，优化上述因素有助于提高作物产量。

本文中提到的产量相关性状的增加/改善也可以理解为植物一个或多个部分的生物量(重量)增加，其中可以包括地上和/或地下(可收获)植物部分。特别是，这种可收获的部分是种子，并且公开方法的执行导致植物产量增加，特别是相对于合适的对照植物的种子产量增加。植物的“产量”一词可以与营养生物量(根和/或芽生物量)、生殖器官和/或所述植物的繁殖体(如种子)有关。

本公开的植物产量的增加可以通过多种方式来衡量，包括测试重量、每株植物的种子数、种子重量、每单位面积的种子数(例如，种子或每英亩种子的重量)、每英亩的蒲式耳、每英亩的吨数或每公顷的公斤数。产量的增加可能是由于关键生化化合物(如氮、磷和碳水化合物)的利用得到改善，或者是由于对环境压力(如寒冷、高温、干旱、盐、阴凉、植物密度高以及害虫或病原体的攻击)的改善反应。

“产量增加”可以表现为以下一项或多项：(i)植物一个或多个部分的植物生物量(重量)增加，特别是植物的地上(可收获)部分，增加根生物量(增加根数、增加根厚度、增加根长)或任何其他可收获部分的生物量增加；或(ii)增加早期活力，本文定义为发芽后约3周地上区改良的幼苗。

“早期活力”是指植物积极健康的生长，尤其是在植物生长的早期阶段，这可能是由于植物更好地适应环境而增加的植物适应性的结果(例如，优化能源资源的利用、养分的吸收以及在芽和根之间分配碳分配)。例如，早期活力可以是种子在种植后发芽和出现的能力与幼苗在出现后生长和发育的能力的组合。具有早期活力的植物也显示出更高的幼苗存活率和更好的作物定植，这通常会导致高度均匀的田地，大多数植物基本上同时达到不同的发育阶段，这通常会导致产量增加。因此，可以通过测量各种因素来确定早期活力，例如籽粒重量、发芽百分比、出苗率、幼苗生长、幼苗高度、根长、根和芽生物量、冠层大小和颜色等。

此外，产量的增加也可以表现为种子总产量的增加，这可能是由于每株植物的种子重量增加，和/或基于单个种子的增加而导致的种子生物量(种子重量)的一次或多次增加，例如每株植物的花/圆锥花序；豆荚数量增加；节点数量增加；每穗/植物的花(“小花”)数量增加；提高种子填充率；填充种子的数量增加；种子大小增加(长度、宽度、面积、周长和/或重量)，这也会影响种子的组成；和/或种子体积增加，这也会影响种子的组成。在一个实施方案中，增加产量可以提高种子产量，例如增加种子重量；填充种子的数量增加；和/或增加的收获指数。

产量的增加也可导致结构的改变，或者可能是由于植物结构的改变而发生的。

产量增加也可以表现为收获指数增加，该指数表示为可收获部分(如种子)的产量与总生物量的比率

该公开还延伸到植物的可收获部分，例如但不限于种子、叶子、果实、花、圆荚、豆荚、角果、果仁、茎、根茎、块茎和鳞茎。该公开还涉及从此类植物的可收获部分衍生的产品，例如干颗粒、粉末、油、脂肪和脂肪酸、淀粉或蛋白质。

本公开提供了提高植物“产量”或植物或植物部分的“广英亩产量”的方法，定义为每单位面积可收获的植物部分，例如种子或种子重量，每英亩磅数、每英亩磅数、每英亩蒲式耳数、每英亩吨数、每英亩吨数、千克/公顷。

本文中使用的“氮利用效率”是指导致植物产量、生物量、活力和每施氮单位生长速率增加的过程。这些过程可以包括植物对氮的吸收、同化、积累、信号传导、传感、再易位(植物内)和使用氮。

本文中使用的“提高氮利用效率”是指植物在正常或标准条件下承受相同量的可用/施用氮时，植物生长、发育或产量比正常更快或更好的能力；植物正常生长、发育或产量的能力，或在低于最佳可用/施用氮量的情况下或在氮限制条件下更快或更好的生长、发育或产量的能力。

本文中使用的“氮限制条件”是指提供足够或成功的植物代谢、生长、繁殖成功和/或生存能力所需的氮量少于最佳量的生长条件或环境。

如本文所用，“增加的氮胁迫耐受性”是指植物在有效/施用氮量低于最佳量的情况下，或在氮限制条件下正常生长、发育或产量的能力，或生长、发育或产量更快或更好的能力。

提高植物氮利用效率可以在田间转化为收获相似数量的产量，同时提供更少的氮，或者通过提供最佳/足够量的氮来提高产量。氮素利用效率的提高可以提高植物的氮素胁迫耐受性，还可以提高作物品质和种子的生化成分，如蛋白质产量和油分产量。术语“提高的氮利用效率”、“增强的氮利用效率”和“耐氮胁迫性”在本公开中可互换使用，指的是在氮限制条件下生产力提高的植物。

本文中使用的“水利用效率”是指每单位水蒸气蒸腾时被树叶吸收的二氧化碳量。它构成了在干燥环境中控制植物生产力的最重要特性之一。“耐旱性”是指植物适应干旱或干旱条件的程度。植物对缺水的生理反应包括叶萎蔫、叶面积减少、叶脱落以及通过将养分引导到植物的地下部分来刺激根系生长。通常，植物在开花和种子发育(生殖阶段)更容易受到干旱的影响，因为植物的资源被转移以支持根系生长。此外，脱落酸(ABA)是一种植物胁迫激素，可诱导叶片气孔(参与气体交换的微小孔隙)闭合，从而减少蒸腾作用造成的水分流失，并降低光合作用的速度。这些反应在短期内提高了植物的用水效率。术语“提高的用水效率”、“增强的用水效率”和“提高耐旱性”在本公开中可互换使用，以指代在限水条件下生产率提高的植物。

本文中使用的“提高的水分利用效率”是指植物在正常或标准条件下受到相同数量的可用/施用水时，植物生长、发育或比正常更快或更好的产量的能力；植物在可用/应用水量减少(水输入)或在水分胁迫或缺水胁迫条件下正常生长、发育或产量的能力，或生长、发育或产量更快或更好的能力。

本文中使用的“耐旱性增强”是指植物在可用/施用水量减少和/或在急性或慢性干旱条件下正常生长、发育或产量的能力，或生长、发育或产量比正常更快或更好的能力；当可用/应用的水量(水输入)减少或在缺水胁迫条件下或在急性或慢性干旱条件下，植物正常生长、发育或产量的能力。

本文中使用的“干旱胁迫”是指导致水分不足并使植物受到胁迫和/或对植物组织造成损害和/或对谷物/作物产量产生负面影响的干旱期(急性或慢性/长期)；导致水分不足和/或温度升高并使植物受到压力和/或植物组织损伤和/或对谷物/作物产量产生负面影响的干燥期(急性或慢性/长期)。

本文中使用的“缺水”是指提供的水分少于植物充分/成功生长和发育所需的最佳水量的条件或环境。

本文中使用的“缺水”是指提供超过植物/作物充分/成功生长和发育所需水量(少于/不足或多/过量)的水量，从而使植物受到压力和/或对植物组织造成损害和/或对谷物/作物产量产生负面影响的条件或环境。

本文中使用的“水分短缺胁迫”是指提供的水量少于/不足的水量超过植物/农作物充足/成功生长和发育所需的水量，从而使植物受到压力和/或对植物组织造成损害和/或对谷物产量产生负面影响的条件或环境。

本文中使用的术语“核酸”、“核酸分子”、“核苷酸序列”和“多核苷酸”是指线性或支链、单链或双链或其杂交的RNA或DNA。该术语还包括RNA/DNA杂交体。当合成产生dsRNA时，不太常见的碱基，如肌苷、5-甲基胞嘧啶、6-甲基腺嘌呤、次黄嘌呤等也可用于反义、dsRNA和核酶配对。例如，含有尿苷和胞苷的C-5丙炔类似物的多核苷酸已被证明以高亲和力结合RNA，并且是基因表达的有效反义抑制剂。也可以进行其他修饰，例如对磷酸二酯骨架或RNA核糖基团中的2'-羟基的修饰。

本文使用的术语“核苷酸序列”是指核苷酸的杂聚物或这些核苷酸从核酸分子的5'至3'末端的序列，包括DNA或RNA分子，包括cDNA、DNA片段或部分、基因组DNA、合成(例如，化学合成的)DNA、质粒DNA、mRNA和反义RNA，其中任何一种都可以是单链或双链。术语“核苷酸序列”、“核酸”、“核酸分子”、“核酸构建体”、“寡核苷酸”和“多核苷酸”在本文中也互换使用，指代核苷酸的杂聚物。本文提供的核酸分子和/或核苷酸序列在本文中以5'至3'方向从左到右表示，并使用美国序列规则37CFR§§1.821～1.825和世界知识产权组织(WIPO)标准ST.25中规定的核苷酸字符表示。本文中使用的“5'区”可以表示最接近多核苷酸5'端的多核苷酸区。因此，例如，多核苷酸5'区中的元素可以位于从位于多核苷酸5'端的第一个核苷酸到位于多核苷酸中间的核苷酸的任何位置。本文中使用的“3'区”可以表示最接近多核苷酸3'端的多核苷酸区。因此，例如，多核苷酸3'区中的元素可以位于从位于多核苷酸3'端的第一个核苷酸到位于多核苷酸中间的核苷酸的任何位置。

本文中用于核酸的术语“片段”或“部分”是指长度相对减少的核酸相对于参考核酸(例如，减少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、20、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850或900个或更多核苷酸或其中的任何范围或值)，包括，基本上由和/或由与参考核酸的相应部分相同或几乎相同的连续核苷酸的核苷酸序列组成例如，70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78、79％、80％、81％、82％、83％、84％、80％、82％、84％、95％、96％、97％、98％、99％相同)。在适当的情况下，这样的核酸片段可以包含在更大的多核苷酸中，而它是其中的组成部分。例如，本发明的向导核酸的重复序列可以包含野生型CRISPR-Cas重复序列的“部分”(例如，野生型CRISPR-Cas重复序列；例如，来自CRISPR Cas系统的重复序列，例如Cas9、Cas12a(Cpf1)、Cas12b、Cas12c(C2c3)、Cas12d(CasY)、Cas12e(CasX)、Cas12g、Cas12h、Cas12i、C2c4、C2c5、C2c8、C2c9、C2c10、Cas14a、Cas14b和/或Cas14c等)。

在一些实施方案中，核酸片段可以包含编码RPL3多肽的核酸的约5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195、200、205、210、215、220、225、230、235、240、245、250、255、260、265、270、275、280、285、290、295、300、305、310、320、330、340、350、360、370、380、390、395、400、410、415、420、425、430、435、440、445、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1100、1150、1200、1250、1300、1350、1400、1450、1500、1550、1600、1650、1700、1750、1800、1900、2000、2100、2200、2300、2400或2500个或更多连续核苷酸，或其中的任何范围或值，或基本上由或由其组成，任选地RPL3基因的片段可以约为10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、110、115、120、125、130、135、140、145、150个连续核苷酸～约155、160、165、170、175、180、185、190、195、200、205、210、215、220、225、230、240、245、250、255、255、260、265、270、275、280、285、290、295、300、305、310、315、320、325、330、340、345、350、355、360、365、370、375、380、385、390、395或400，或更多的连续核苷酸在长度上，或其中的任何范围或值(例如，SEQ ID NO：72、73、75、76、78、79、80、81、83、84、86或87之任一个的部分或片段(例如，SEQ ID NO：89～139之任一个)。

在一些实施方案中，“序列特异性核酸结合域”可以与编码例如如本文所述的核糖体蛋白L3(RPL3)多肽的核苷酸序列(例如DNA、RNA)的一个或多个片段或部分结合。

如本文中所用的关于多肽，术语“片段”或“部分”可以指长度相对于参考多肽缩短的多肽，并且其包含与参考多肽的相应部分相同或几乎相同(例如，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％相同)的连续氨基酸的氨基酸序列，或基本上由或由其组成。在适当的情况下，这样的多肽片段可以包含在较大多肽中，其作为组成部分。在一些实施方案中，多肽片段可以包含参考多肽的至少约2、3、4、5、6、7、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、125、150、175、200、225、250、260、270、90、95、100、125、175、200、225、250、260、270、280个或290个或更多连续氨基酸，或基本上由或由其组成。在一些实施方案中，多肽片段可以包含RPL3多肽(例如，SEQ ID NO：74、77、82、85或88中任何一项的片段或部分)的约10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、230、240或250个或更多连续氨基酸残基，或其中的任何范围或值，或基本上由或由其组成。在一些实施方案中，RPL3多肽的片段可以是多肽或其部分的N末端(例如，参见SEQ ID NO：74、77、82、85或88中任意一个的从约残基10～约残基200的连续氨基酸序列)。在一些实施方案中，RPL3多肽的片段可以是编码RPL3多肽的至少一个内源性基因(例如，RPL31基因和/或RPL3B基因)中产生的突变的结果，如本文所述(例如，在植物中的一个或多个内源性RPL3基因中的缺失、插入等)。

在一些实施方案中，当包含在植物中时，编码RPL3多肽的至少一个内源性基因中产生的突变可以导致植物，所述植物与不包含所述缺失的植物相比，具有与单端孢霉烯霉菌毒素(例如，DON)的结合减少的RPL3多肽。在一些实施方案中，如本文所述，包含内源性RPL3基因突变的植物与不包含所述突变的植物相比，可表现出对单端孢霉烯霉菌毒素的耐受性增加，可表现出对镰孢菌头枯病(FHB)的抗性/耐受性增加(例如，对FHB的病原体禾谷镰孢菌(Fusarium graminearum)的抗性/耐受性增加，例如，FHB感染症状的减少，例如，禾谷镰孢菌(Fusarium graminearum)感染的症状减少)，和/或可表现出/携带降低的禾谷镰孢菌(Fusarium graminearum)负荷，例如，禾谷镰孢菌(F.graminearum)的水平/数量降低。RPL3基因可以在一个或多个位置进行编辑(并使用一个或多个不同的编辑工具)，从而提供包含一个或多个突变的RPL3基因。在一些实施方案中，如本文所述突变的RPL3多肽可以包含一个或多个编辑，其可导致多肽具有一个或多个氨基酸残基的缺失(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350或380个或更多连续氨基酸残基，以及其中的任何范围或值(例如，截短的多肽)，任选地缺失约10～约200个连续氨基酸残基(例如，约10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190或200，以及其中的任何范围或值)。

在一些实施方案中，“部分”或“区”关于核酸时是指来自基因(例如，来自RPL3基因的连续核苷酸)的至少2、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195、200、210、220、230、240、250、260、270、280、285、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、395、400、405、410、415、420、425、430、435、440、445、450、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900、2000、2100、2200、2300、2400或2500个或更多连续核苷酸，任选地RPL3基因的“部分”或“区”可以约为20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145或150个连续核苷酸，至约155、160、165、170、175、180、185、190、195、200、205、210、215、220、225、230、240、245、250、255、255、260、265、270、275、280、285、290、295、300、305、310、315、320、325、330、340、345、350、355、356、357、358或359个或更多的连续核苷酸在长度上，或其中的任何范围或值(例如，SEQ ID NO：72、73、75、76、78、79、80、81、83、84、86或87之任一个的部分或区(例如，SEQ IDNO：89～139中的任何一项)。

在一些实施方案中，RPL3多肽序列的“部分”或“区”可以是长度约为5～约225个或更多的连续氨基酸残基(例如，长度约5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、1699、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224，或225，或更多连续氨基酸残基(例如，SEQ ID NO：74、77、82、85或88之任一个的一部分，任选地该部分或区来自RPL3多肽的N端，例如，包含SEQ ID NO：74、77、82、85或88之任一个从约残基10～约残基225的连续氨基酸残基的序列。

如本文中关于核酸，术语“功能片段”是指编码多肽功能片段的核酸。关于多肽的“功能片段”是多肽的片段，它保留了天然参考多肽的一种或多种活性。

本文使用的术语“基因”是指能够用于产生mRNA、反义RNA、miRNA、抗microRNA反义寡脱氧核糖核苷酸(AMO)等的核酸分子。基因可能能够也可能不能用于产生功能性蛋白质或基因产物。基因可以包括编码区和非编码区(例如，内含子、调节元件、启动子、增强子、终止序列和/或5'和3'非翻译区)。基因可以被“分离”，其意思是基本上或大体上不含通常与自然状态下的核酸相关的组分的核酸。这些组分包括其他细胞材料、重组生产中的培养基和/或用于化学合成核酸的各种化学物质。

术语“突变”是指点突变(例如，错义或无意义，或导致移码的单个碱基对的插入或缺失)、插入、缺失、反转和/或截断。当突变是氨基酸序列中的一个残基被另一个残基取代，或者序列中一个或多个残基的缺失或插入时，通常通过识别原始残基、残基在序列中的位置以及新取代的残基的身份来描述突变。截断可以包括在多肽的C端或多肽的N端的截断。多肽的截短可能是编码多肽的基因的相应5'端或3'端缺失的结果。当一个或多个碱基对的缺失或插入引入基因时，可能会发生移码突变，任选地导致框外突变或框内突变。基因中的移码突变可导致产生与野生型多肽更长、更短或长度相同的多肽，具体取决于第一个终止密码子出现在基因突变区之后的时间。例如，产生过早终止密码子的框外突变可以产生比野生型多肽短的多肽，或者，在某些实施方案中，多肽可能不存在/无法检测。DNA反转是遗传片段在染色体区内旋转的结果。

本文使用的术语“互补性”或“互补性”是指在允许的盐和温度条件下通过碱基配对实现多核苷酸的天然结合。例如，序列“A-G-T”(5'到3')与互补序列“T-C-A”(3'到5')结合。两个单链分子之间的互补性可能是“部分”的，其中只有一些核苷酸结合，或者当单链分子之间存在完全互补性时，它可能是完全的。核酸链之间的互补程度对核酸链之间杂交的效率和强度有显著影响。

本文中使用的“互补”可以表示与对照核苷酸序列的100％互补性，也可以表示与对照核苷酸序列小于100％的互补性(例如，约70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86、87、88、89％、90％、91、92、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％等，互补性)。

具有同源性的不同核酸或蛋白质在本文中称为“同源物”。术语同源物包括来自同一物种和其他物种的同源序列以及来自同一物种和其他物种的直系同源序列。“同源性”是指两个或多个核酸和/或氨基酸序列之间的相似性水平，以位置同一性(即序列相似性或同一性)的百分比表示。同源性也是指不同核酸或蛋白质之间功能特性相似的概念。因此，本发明的组合物和方法还包括本发明的核苷酸序列和多肽序列的同源物。本文使用的“直系同源”是指在物种形成过程中由共同祖先基因产生的不同物种中的同源核苷酸序列和/或氨基酸序列。本发明的核苷酸序列的同源物与本发明的所述核苷酸序列具有实质性的序列同一性(例如，至少约70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、89％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或100％)。

如本文所用，“序列同一性”是指两个最佳对齐的多核苷酸或多肽序列在组分(例如核苷酸或氨基酸)的对齐窗口中保持不变的程度。“同一性”可以通过已知方法轻松计算，包括但不限于以下中描述的方法：Computational Molecular Biology(Lesk,A.M.,ed.)Oxford University Press,New York(1988)；Biocomputing:Informatics and GenomeProjects(Smith,D.W.,ed.)Academic Press,New York(1993)；Computer Analysis ofSequence Data,Part I(Griffin,A.M.,and Griffin,H.G.,eds.)Humana Press,NewJersey(1994)；Sequence Analysis in Molecular Biology(von Heinje,G.,ed.)Academic Press(1987)；and Sequence Analysis Primer(Gribskov,M.and Devereux,J.,eds.)Stockton Press,New York(1991)。

本文使用的术语“百分比序列同一性”或“百分比同一性”是指当两个序列最佳对齐时，参考(“查询”)多核苷酸分子(或其互补链)的线性多核苷酸序列中相同核苷酸的百分比，与测试(“实验”)多核苷酸分子(或其互补序列)相比。在一些实施方案中，“序列同一性百分比”可以指氨基酸序列中相同氨基酸与参考多肽相比的百分比。

本文使用的短语“基本相同”或“大体相同”在两个核酸分子、核苷酸序列或多肽序列的上下文中，是指两个或多个序列或子序列至少具有约70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或100％的核苷酸或氨基酸残基同一性，当与最大的对应比较和对齐时，使用以下序列比较算法之一或通过目视检查进行测量时。在本发明的一些实施方案中，本发明的核苷酸序列的连续核苷酸区存在基本同一性，为约10个核苷酸～约20个核苷酸、约10个核苷酸～约25个核苷酸、约10个核苷酸～约30个核苷酸、约15个核苷酸～约25个核苷酸、约30个核苷酸～约40个核苷酸，约50个核苷酸～约60个核苷酸，约70个核苷酸～约80个核苷酸，约90个核苷酸～约100个核苷酸，约100个核苷酸～约200个核苷酸，约100个核苷酸～约300个核苷酸，约100个核苷酸～约400个核苷酸，约100个核苷酸～约500个核苷酸，约100个核苷酸～约600个核苷酸，约100个核苷酸～约800个核苷酸，约100个核苷酸～约900个核苷酸，或更长的长度，或其中的任何范围，直到序列的全长。在一些实施方案中，核苷酸序列在至少约20个核苷酸上可以是基本相同的(例如，约20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、50、60、70或80个核苷酸或更多)。

在本发明的一些实施方案中，本发明的多肽的连续氨基酸残基区存在基本同一性，约3个氨基酸残基～约20个氨基酸残基，约5个氨基酸残基～约25个氨基酸残基，约7个氨基酸残基～约30个氨基酸残基，约10个氨基酸残基～约25个氨基酸残基，约15个氨基酸残基～约30个氨基酸残基，约20个氨基酸残基～约40个氨基酸残基，约25个氨基酸残基～约40个氨基酸残基，约25个氨基酸残基～约50个氨基酸残基，约30个氨基酸残基～约50个氨基酸残基，约40个氨基酸残基～约50个氨基酸残基，约40个氨基酸残基～约70个氨基酸残基，约50个氨基酸残基～约70个氨基酸残基，约60个氨基酸残基～约80个氨基酸残基，约70个氨基酸残基～约80个氨基酸残基，约90个氨基酸残基～约100个氨基酸残基，或更长的氨基酸残基，以及其中的任何范围，直至序列的全长。在一些实施方案中，多肽序列可以在至少约8个连续的氨基酸残基上彼此基本相同(例如，约8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、130、140、150、175、200、225、250、300、350或在更长的氨基酸或更多的连续氨基酸残基)。在一些实施方案中，两个或多个RPL3多肽可以在至少8个连续氨基酸～约350个连续氨基酸上相同或基本相同(例如，至少70％～99.9％相同，例如，约70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、85％、86％、87％、88、89、90、91％、92、93、94、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或99.9％相同或其中的任何范围或值)。在一些实施方案中，两个或多个RPL3多肽可以在至少8、9、10、11、12、13、14或15个连续氨基酸～约20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40个连续氨基酸上相同或基本相同。

对于序列比较，通常一个序列充当参考序列，测试序列将与之进行比较。使用序列比较算法时，将测试序列和参考序列输入计算机，必要时指定子序列坐标，并指定序列算法程序参数。然后，序列比较算法根据指定的程序参数计算测试序列相对于参考序列的百分比序列标识。

用于对齐比较窗口的序列的最优比对为本领域技术人员所熟知，并且可以通过诸如Smith和Waterman的局部同源算法、Needleman和Wunsch的同源比对算法、Pearson和Lipman的相似性搜索方法等工具进行，任选地通过这些算法的计算机化实现，例如GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，作为威斯康星软件包(Accelrys Inc.,San Diego,CA)的一部分提供。测试序列和参考序列的对齐片段的“同一性分数”是两个对齐序列共享的同一性组分的数量除以参考序列片段中的成分总数，例如，整个参考序列或参考序列的较小定义部分。百分比序列同一性表示为同一性分数乘以100。一个或多个多核苷酸序列的比较可以是与全长多核苷酸序列或其的一部分进行比较，也可以是与较长的多核苷酸序列进行比较。出于本发明的目的，对于翻译的核苷酸序列，也可以使用BLASTX 2.0版来确定“百分比同一性”，对于多核苷酸序列，也可以使用BLASTN 2.0版来确定。

当两个核苷酸序列在严格的条件下相互杂交时，也可以认为这两个核苷酸序列本质上是互补的。在一些实施方案中，两个被认为实质互补的核苷酸序列在高度严格的条件下彼此杂交。

在核酸杂交实验(例如Southern和Northern杂交)的背景下，“严格的杂交条件”和“严格的杂交洗涤条件”是序列依赖性的，并且在不同的环境参数下是不同的。有关核酸杂交的广泛指南，请参见Tijssen Laboratory Techniques in Biochemistry andMolecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes part Ichapter 2“Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acidprobe assays”Elsevier,New York(1993)。通常，在规定的离子强度和pH值下，选择高度严格的杂交和洗涤条件，使其比特定序列的热熔点(T_m)低约5℃。

T_m是50％的靶序列与完美匹配的探针杂交的温度(在定义的离子强度和pH值下)。选择非常严格的条件，使其等于特定探针的T_m。在Southern或Northern印迹中，用于杂交互补核苷酸序列的严格杂交条件的一个例子是50％甲酰胺与1mg肝素在42℃下杂交，杂交过夜。高度严格的洗涤条件的一个例子是0.1 5M NaCl在72℃下放置约15分钟。严格洗涤条件的一个例子是在65℃下进行0.2×SSC洗涤15分钟(参见Sambrook，下文，有关SSC缓冲液的描述)。通常，在进行高严格度洗涤之前进行低严格度洗涤，以去除背景探针信号。例如，对于超过100个核苷酸的双链体，中等严格度洗涤的一个例子是在45℃下用1×SSC洗涤15分钟。例如，超过100个核苷酸的双链体的低严格度洗涤示例是在40℃下用4～6×SSC洗涤15分钟。对于短探针(例如，约10～50个核苷酸)，严格的条件通常涉及盐浓度低于约1.0M Na离子，在pH值为7.0～8.3时通常约为0.01～1.0M Na离子浓度(或其他盐)，温度通常至少约为30℃。也可以通过添加不稳定剂(如甲酰胺)来实现严格的条件。通常，在特定杂交测定中观察到的信噪比为无关探针观察到的信噪比2倍(或更高)时表明检测到特异性杂交。如果它们编码的蛋白质基本相同，那么在严格条件下不相互杂交的核苷酸序列仍然基本相同。例如，当使用遗传密码允许的最大密码子简并性创建核苷酸序列的复制时，就会发生这种情况。

本发明的多核苷酸和/或重组核酸构建体(例如，表达盒和/或载体)可以针对表达进行密码子优化。在一些实施方案中，本发明的编辑系统的多核苷酸、核酸构建体、表达盒和/或载体(例如，包含/编码序列特异性核酸结合结构域(例如，序列特异性核酸结合结构域(例如，DNA结合结构域)来自多核苷酸引导的核酸内切酶、锌指核酸酶、转录激活因子样效应核酸酶(TALEN)、Argonaute蛋白和/或CRISPR-Cas核酸内切酶(例如，CRISPR-Cas效应蛋白)(例如，I型CRISPR-Cas效应蛋白、II型CRISPR-Cas效应蛋白、III型CRISPR-Cas效应蛋白、IV型CRISPR-Cas效应蛋白、V型CRISPR-Cas效应蛋白或VI型CRISPR-Cas效应蛋白))、核酸酶(例如，核酸内切酶(例如，Fok1)、多核苷酸引导的核酸内切酶、CRISPR-Cas核酸内切酶(例如，CRISPR-Cas效应蛋白)、锌指核酸酶和/或转录激活因子样效应核酸酶(TALEN))、脱氨酶蛋白/结构域(例如腺嘌呤脱氨酶、胞嘧啶脱氨酶)、编码逆转录酶蛋白或结构域的多核苷酸、编码5'-3'核酸外切酶多肽的多核苷酸和/或亲和多肽，肽标签等)可能针对植物中的表达进行了密码子优化。在一些实施方案中，本发明的密码子优化的核酸、多核苷酸、表达盒和/或载体与未经密码子优化的参考核酸、多核苷酸、表达盒和/或载体具有约70％～约99.9％以上(例如，70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.9％或100％)的同一性。

在本文描述的任何实施方案中，本发明的多核苷酸或核酸构建体可以操作性地与多种启动子和/或其他调节元件结合，以便在植物和/或植物的细胞中表达。因此，在一些实施方案中，本发明的多核苷酸或核酸构建体可以进一步包括一个或多个启动子、内含子、增强子和/或终止子，这些启动子、内含子、增强子和/或终止子可操作地连接到一个或多个核苷酸序列。在一些实施方案中，启动子可以操作性地与内含子(例如，Ubi1启动子和内含子)相关联。在一些实施方案中，与内含子相关的启动子可以称为“启动子区”(例如，Ubi1启动子和内含子)。

本文中用于多核苷酸的“可操作连接”或“可操作关联”是指所指示的元件在功能上彼此相关，并且通常也具有物理上相关。因此，本文使用的术语“可操作连接”或“可操作关联”是指单个核酸分子上功能相关的核苷酸序列。因此，可操作地连接到第二核苷酸序列的第一核苷酸序列意味着第一核苷酸序列与第二核苷酸序列处于功能关系中的情况。例如，如果启动子影响所述核苷酸序列的转录或表达，则启动子与核苷酸序列可操作相关。本领域的技术人员将理解，只要控制序列的功能是指导其表达，控制序列(例如，启动子)就不需要与其可操作地相关的核苷酸序列相邻。因此，例如，中间未翻译但转录的核酸序列可以存在于启动子和核苷酸序列之间，并且启动子仍然可以被认为与核苷酸序列“可操作连接”。

如本文所用，“术语连接”，在指多肽时，是指一种多肽与另一种多肽的结合。一个多肽可以直接(例如，通过肽键)或通过接头连接到另一个多肽(在N端或C端)。

术语“接头”是本技术认可的，是指一个化学基团，或连接两个分子或部分的分子，例如，融合蛋白的两个结构域，例如，核酸结合多肽或结构域和肽标签和/或逆转录酶和与肽标签结合的亲和多肽；或DNA核酸内切酶多肽或结构域和肽标签和/或逆转录酶和与肽标签结合的亲和多肽。接头可以由单个连接分子组成，也可以由多个连接分子组成。在一些实施方案中，接头可以是有机分子、基团、聚合物或化学部分，例如二价有机部分。在一些实施方案中，接头可以是氨基酸，也可以是肽。在一些实施方案中，所述接头是肽。

在一些实施方案中，可用于本发明的肽接头的长度可以是约2～约100个或更多的氨基酸，例如，约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100或更长的氨基酸(例如，约2～约40个，约2～约50个，约2～约60个，约4～约40个，约4～约50个，约4～约60个，约5～约40个，约5～约50个，约5～约60个，约9～约40个，约9～约50个，约9～约60个，约10～约40个，约10～约50个，约10～约60个，或约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16，17，18，19，20，21，22，23，24，25个氨基酸～约26，27，28，29，30，31，32，33，34，35，36，37，38，39，40，41，42，43，44，45，46，47，48，49，50，51，52，53，54，55，56，57，58，59，60，61，62，63，64，65，66，67，68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100或更长的氨基酸(例如，长度约为105、110、115、120、130、140、150或更多氨基酸)。在一些实施方案中，肽接头可以是GS接头。

如本文所用，术语“连接”或“融合”是指一种多核苷酸与另一种多核苷酸的结合。在一些实施方案中，两个或多个多核苷酸分子可以通过接头连接，接头可以是有机分子、基团、聚合物或化学部分，例如二价有机部分。一个多核苷酸可以通过共价或非共价连接或结合，包括例如Watson-Crick碱基配对，或通过一个或多个连接核苷酸与另一个多核苷酸(在5'端或3'端)连接或融合。在一些实施方案中，某种结构的多核苷酸基序可以插入到另一个多核苷酸序列中(例如，向导RNA中发夹结构的延伸)。在一些实施方案中，连接核苷酸可以是天然存在的核苷酸。在一些实施方案中，连接核苷酸可以是非天然存在的核苷酸。

“启动子”是控制或调节与启动子可操作相关的核苷酸序列(例如，编码序列)的转录的核苷酸序列。由启动子控制或调节的编码序列可以编码多肽和/或功能性RNA。通常，“启动子”是指包含RNA聚合酶II结合位点并指导转录起始的核苷酸序列。通常，启动子位于相对于相应编码序列的编码区起点的5'或上游。启动子可能包含充当基因表达调节因子的其他元件；例如，启动子区。这些包括TATA盒共有序列，通常还包括CAAT盒共有序列(Breathnach and Chambon，(1981)Annu.Rev.Biochem.50：349)。在植物中，CAAT盒可以被AGGA盒取代(Messing et al.,(1983)in Genetic Engineering of Plants,T.Kosuge,C.Meredith and A.Hollaender(eds.),Plenum Press,pp.211-227)。

本发明有用的启动子可以包括，例如，组成型、诱导型、暂时调节、发育调节、化学调节、组织优选和/或组织特异性启动子，用于制备重组核酸分子，例如“合成核酸构建体”或“蛋白质-RNA复合物”。这些不同类型的启动子是本领域已知的。

启动子的选择可能因表达的时间和空间要求而异，也可能根据要转化的宿主细胞而有所不同。许多不同生物体的启动子在本领域是众所周知的。基于本领域存在的广泛知识，可以为感兴趣的特定宿主生物体选择合适的启动子。因此，例如，对模式生物中高度组成型表达基因的上游启动子了解很多，并且这些知识可以很容易地获得并在其他系统中根据需要实施。

在一些实施方案中，在植物中起作用的启动子可以与本发明的构建体一起使用。可用于在植物中驱动表达的启动子的非限制性示例包括RubisCo小亚基基因1(PrbcS1)的启动子、肌动蛋白基因(Pactin)的启动子、硝酸盐还原酶基因(Pnr)的启动子和复制的碳酸酐酶基因1(Pdca1)的启动子(参见Walker et al.,Plant Cell Rep.23:727-735(2005)；Liet al.Gene 403:132-142(2007)；Li etal.Mol Biol.Rep.37:1143-1154(2010))。PrbcS1和Pactin是组成型启动子，Pnr和Pdca1是诱导型启动子。Pnr由硝酸盐诱导并被铵抑制(Liet al.Gene 403：132-142(2007))，Pdca1由盐诱导(Li et al.Mol Biol.Rep.37：1143-1154(2010))。在一些实施方案中，可用于本发明的启动子是RNA聚合酶II(Pol II)启动子。在一些实施方案中，来自玉蜀黍的U6启动子或7SL启动子可能对本发明的构建体有用。在一些实施方案中，来自玉蜀黍的U6c启动子和/或7SL启动子可用于驱动向导核酸的表达。在一些实施方案中，来自甘氨酸max的U6c启动子、U6i启动子和/或7SL启动子可能对本发明的构建体有用。在一些实施方案中，来自甘氨酸max的U6c启动子、U6i启动子和/或7SL启动子可用于驱动向导核酸的表达。

对植物有用的组成型启动子的例子包括但不限于cestrum病毒启动子(cmp)(美国专利号7,166,770)、水稻肌动蛋白1启动子(Wang等人(1992)Mol.Cell.Biol.12：3399-3406；以及美国专利号5,641,876)、CaMV 35S启动子(Odell等人(1985)Nature 313：810-812)、CaMV 19S启动子(Lawton等人(1987)Plant Mol.Biol.9：315-324)、nos启动子(Ebert等人(1987)Proc.Natl.Acad.Sci USA 84：5745-5749)，Adh启动子(Walker等人(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84：6624-6629)，蔗糖合酶启动子(Yang&Russell(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：4144-4148)和泛素启动子。源自泛素的组成型启动子在许多细胞类型中积累。泛素启动子已经从几种植物物种中克隆出来，用于转基因植物，例如向日葵(Binet et al.,1991.Plant Science 79:87-94))、玉米(Christensen et al.,1989.Plant Molec.Biol.12:619-632)和拟南芥(Norris et al.1993.PlantMolec.Biol.21:895-906)。玉米泛素启动子(UbiP)已在转基因单子叶植物系统中开发，其为单子叶植物转化构建的序列和载体在专利申请EP 0 342 926中公开。泛素启动子适用于在本发明的转基因植物，特别是单子叶植物中的核苷酸序列中表达。此外，McElroy等人(Mol.Gen.Genet.231：150-160(1991))描述的启动子表达盒可以很容易地修饰用于本发明核苷酸序列的表达，并且特别适合于单子叶宿主使用。

在一些实施方案中，组织特异性/组织优选的启动子可用于在植物细胞中表达异源多核苷酸。组织特异性或优选的表达模式包括但不限于绿色组织特异性或优选、根特异性或优选、茎特异性或优选、花特异性或优选或花粉特异性或优选。适合在绿色组织中表达的启动子包括许多调节参与光合作用的基因的启动子，其中许多是从单子叶植物和双子叶植物中克隆的。在一个实施方案中，可用于本发明的启动子是来自磷酸烯醇羧化酶基因的玉米PEPC启动子(Hudspeth&Grula，Plant Molec.Biol.12：579-589(1989)]。组织特异性启动子的非限制性例子包括与编码种子储存蛋白(如β-辅大豆球蛋白、十字花素、油菜籽蛋白和菜豆球蛋白)、玉米醇溶蛋白或油体蛋白(如油橄榄素)或参与脂肪酸生物合成的蛋白质(包括酰基载体蛋白、硬脂酰-ACP去饱和酶和脂肪酸去饱和酶(FAD 2-1))相关的基因，以及胚胎发育过程中表达的其他核酸(如Bce4、例如，参见Kridl et al.(1991)SeedSci.Res.1：209-219；以及欧洲专利号255378)。可用于在植物(特别是玉米)中表达本发明核苷酸序列的组织特异性或组织优先启动子包括但不限于那些在根、髓、叶或花粉中直接表达的。例如，在WO 93/07278中披露了此类启动子，此处通过引用完整并入。可用于本发明的组织特异性或组织优选启动子的其他非限制性实例，即美国专利6,040,504中公开的棉花rubisco启动子；美国专利5,604,121中公开的水稻蔗糖合酶启动子；由Framond描述的根特异性启动子(FEBS290：103-106(1991)；EP 0 452269Ciba-Geigy)；美国专利5,625,136(Ciba-Geigy)中描述的茎特异性启动子，它驱动玉米trpA基因的表达；WO 01/73087中公开的黄化曲叶病毒启动子；和花粉特异性或优选启动子，包括但不限于来自水稻的ProOsLPS10和ProOsLPS11(Nguyen et al.Plant Biotechnol.Reports 9(5):297-306(2015))、来自玉米的ZmSTK2_USP(Wang et al.Genome 60(6):485-495(2017))，来自番茄的LAT52和LAT59(Twell et al.Development 109(3):705-713(1990))，Zm13(美国专利号10,421,972)，来自拟南芥的PLA₂-δ启动子(美国专利号7,141,424)和/或来自玉米的ZmC5启动子(国际PCT公布号WO1999/042587。

植物组织特异性/组织优选启动子的其他例子包括但不限于根毛特异性顺式元件(RHE)(Kim et al.The Plant Cell 18:2958-2970(2006))、根特异性启动子RCc3(Jeonget al.Plant Physiol.153：185-197(2010))和RB7(美国专利号5459252)、凝集素启动子(Lindstrom et al.(1990)Der.Genet.11：160-167；and Vodkin(1983)Prog.Clin.Biol.Res.138：87-98)、玉米醇脱氢酶1启动子(Dennis et al.(1984)NucleicAcids Res.12：3983-4000)、S-腺苷-L-蛋氨酸合成酶(SAMS)(Vander Mijnsbrugge et al.(1996)Plant and Cell Physiology，37(8)：1108-1115)，玉米光收获复合物启动子(Bansal et al.(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：3654-3658)，玉米热休克蛋白启动子(O'Dell et al.(1985)EMBO J.5：451-458；and Rochester et al.(1986)EMBO J.5：451-458)，豌豆小亚基RuBP羧化酶启动子(Cashmore,“Nuclear genes encoding the smallsubunit of ribulose-l,5-bisphosphate carboxylase”pp.29-39In:GeneticEngineering of Plants(Hollaender ed.,Plenum Press1983；and Poulsen et al.(1986)Mol.Gen.Genet.205:193-200)，Ti质粒甘露氨酸合酶启动子(Langridge et al.(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：3219-3223)，Ti质粒胭脂氨酸合酶启动子(Langridgeet al.(1989)，同上)，矮牵牛查尔酮异构酶启动子(van Tunen et al.(1988)EMBO J.7：1257-1263)，富含豆甘氨酸的蛋白质1启动子(Keller et al.(1989)Genes Dev.3：1639-1646)，截短的CaMV 35S启动子(O'Dell et al.(1985)Nature 313：810-812)、马铃薯马铃薯糖蛋白启动子(Wenzler et al.(1989)Plant Mol.Biol.13：347-354)、根细胞启动子(Yamamoto et al.(1990)Nucleic Acids Res.18：7449)、玉米醇溶蛋白启动子(Kriz etal.(1987)Mol.Gen.Genet.207:90-98；Langridge et al.(1983)Cell 34:1015-1022；Reina et al.(1990)Nucleic Acids Res.18:6425；Reina et al.(1990)Nucleic AcidsRes.18:7449；and Wandelt etal.(1989)Nucleic Acids Res.17:2354)，球蛋白-1启动子(Belanger et al.(1991)Genetics 129:863-872)，α-微管蛋白cab启动子(Sullivan etal.(1989)Mol.Gen.Genet.215:431-440)，PEPCase启动子(Hudspeth&Grula(1989)PlantMol.Biol.12:579-589)，R基因复合物相关启动子(Chandler et al.(1989)Plant Cell 1:1175-1183)和查尔酮合酶启动子(Franken et al.(1991)EMBO J.10：2605-2612)。

可用于种子特异性表达的是豌豆球蛋白启动子(Czako et al.(1992)Mol.Gen.Genet.235：33-40；以及美国专利号5,625,136中公开的种子特异性启动子。在成熟叶中表达的有用启动子在衰老开始时转换，例如来自拟南芥的SAG启动子(Gan etal.(1995)Science 270：1986-1988)。

此外，可以使用在叶绿体中起作用的启动子。此类启动子的非限制性示例包括噬菌体T3基因9的5'UTR和美国专利号7,579,516中公开的其他启动子。本发明有用的其他启动子包括但不限于S-E9小亚基RuBP羧化酶启动子和Kunitz胰蛋白酶抑制剂基因启动子(Kti3)。

本发明有用的其他调节元件包括但不限于内含子、增强子、终止序列和/或5'和3'非翻译区。

可用于本发明的内含子可以是在植物中鉴定并从中分离的内含子，然后插入表达盒中用于植物的转化。正如本领域技术人员所理解的那样，内含子可以包含自我切除所需的序列，并在框架中掺入核酸构建体/表达盒中。内含子可以用作间隔子，以分离一个核酸构建体中的多个蛋白质编码序列，也可以将内含子用于一个蛋白质编码序列中，例如，稳定mRNA。如果它们在蛋白质编码序列中使用，则它们将插入“框内”，包括切除位点。内含子也可能与启动子相关，以改善或修饰表达。例如，可用于本发明的启动子/内含子组合包括但不限于玉米Ubi1启动子和内含子的组合(例如，参见SEQ ID NO：21和SEQ ID NO：22)。

可用于本发明的内含子的非限制性实例包括来自ADHI基因的内含子(例如，Adh1-S内含子1、2和6)、泛素基因(Ubi1)、RuBisCO小亚基(rbcS)基因、RuBisCO大亚基(rbcL)基因、肌动蛋白基因(例如，肌动蛋白-1内含子)、丙酮酸脱氢酶激酶基因(pdk)、硝酸盐还原酶基因(NR)、复制的碳酸酐酶基因1(Tdca1)、psbA基因、atpA基因或其任意组合。

在一些实施方案中，本发明的多核苷酸和/或核酸构建体可以是“表达盒”或可以包含在表达盒内。如本文所用，“表达盒”是指重组核酸分子，其包含例如本发明的一个或多个多核苷酸(例如，编码序列特异性核酸结合结构域的多核苷酸、编码脱氨酶蛋白或结构域的多核苷酸、编码逆转录酶蛋白或结构域的多核苷酸、编码5'-3'核酸外切酶多肽或结构域的多核苷酸)、向导核酸和/或逆转录酶(RT)模板)，其中多核苷酸与一个或多个对照序列(例如，启动子、终止子等)可操作地相关。因此，在一些实施方案中，可以提供一个或多个表达盒，其设计用于表达例如本发明的核酸构建体(例如，编码序列特异性核酸结合结构域的多核苷酸、编码核酸酶多肽/结构域的多核苷酸、编码脱氨酶蛋白/结构域的多核苷酸、编码逆转录酶蛋白/结构域的多核苷酸、编码5'-3'核酸外切酶多肽/结构域的多核苷酸，编码肽标签的多核苷酸，和/或编码亲和多肽的多核苷酸等，或包含向导核酸、扩展向导核酸和/或RT模板等)。当本发明的表达盒包含多个多核苷酸时，多核苷酸可以操作地连接到驱动所有多核苷酸表达的单个启动子上，或者多核苷酸可以操作上连接到一个或多个单独的启动子上(例如，三个多核苷酸可以由任意组合中的一个或多个启动子驱动)。当使用两个或多个单独的启动子时，启动子可能是相同的启动子，也可能是不同的启动子。因此，编码序列特异性核酸结合结构域的多核苷酸、编码核酸酶蛋白/结构域的多核苷酸、编码CRISPR-Cas效应蛋白/结构域的多核苷酸、编码脱氨酶蛋白/结构域的多核苷酸、编码逆转录酶多肽/结构域(例如，RNA依赖性DNA聚合酶)的多核苷酸和/或编码5'-3'核酸外切酶多肽/结构域的多核苷酸，向导核酸、扩展向导核酸和/或RT模板当包含在单个表达盒中时，可以分别与单个启动子或任意组合的单独启动子进行操作连接。

包含本发明的核酸构建体的表达盒可以是嵌合的，这意味着其至少一个(例如，一个或多个)组分相对于其至少一个其他组分是异源的(例如，来自宿主生物体的启动子可操作地连接到在宿主生物体中表达的目标多核苷酸，其中，目标多核苷酸来自与宿主不同的生物体，或者通常不与该启动子结合发现)。表达盒也可以是天然存在的表达盒，但以用于异源表达的重组形式获得。

表达盒可以选择包括转录和/或翻译终止区(即终止区)和/或在所选宿主细胞中起作用的增强子区。本领域已知的多种转录终止子和增强子可用于表达盒。转录终止子负责终止转录和纠正mRNA多聚腺苷酸化。终止区和/或增强子区可以是转录起始区的天然区，可以是例如，编码序列特异性核酸结合蛋白的基因、编码核酸酶的基因、编码逆转录酶的基因、编码脱氨酶的基因等的天然区，或者可以是宿主细胞的天然区，或者可以是另一个来源的天然区(例如，外源或异源的，例如，启动子、编码序列特异性核酸结合蛋白的基因、编码核酸酶的基因、编码核酸酶的基因、编码脱氨酶的基因等，或宿主细胞，或它们的任意组合)。

本发明的表达盒还可以包括编码任选标记的多核苷酸，该多核苷酸可用于选择转化的宿主细胞。如本文所用，“任选标记物”是指多核苷酸序列，当表达时，该序列赋予表达该标记物的宿主细胞独特的表型，从而允许将这种转化的细胞与那些无标记物的细胞区分开来。这样的多核苷酸序列可以编码任选或可筛选的标记，这取决于该标记是否赋予了可以通过化学手段选择的性状，例如通过使用选择性试剂(例如，抗生素等)，或者该标记是否只是一个可以通过观察或测试识别的性状，例如通过筛选(例如荧光)。本领域已知许多合适的任选标记物的实例，并且可以用于本文描述的表达盒中。

除了表达盒外，本文描述的核酸分子/构建体和多核苷酸序列可以与载体结合使用。术语“载体”是指用于将核酸(或核酸(s))转移、递送或引入细胞的组合物。载体包含核酸构建体(例如，表达盒)，该构建体包含要转移、递送或引入的核苷酸序列。用于转化宿主生物体的载体是本领域公认的。一般种类载体的非限制性示例包括病毒载体、质粒载体、噬菌体载体、噬菌粒载体、黏粒载体、福斯质粒载体、噬菌体、人工染色体、小圆环或双链或单链线性或环状形式的农杆菌二元载体，它们可能是也可能不是自传递或可移动的。在一些实施方案中，病毒载体可以包括但不限于逆转录病毒、慢病毒、腺病毒、腺相关或单纯疱疹病毒载体。本文定义的载体可以通过整合到细胞基因组中或存在于染色体外(例如，具有复制起点的自主复制质粒)来转化原核或真核宿主。此外，还包括穿梭载体，其是指能够在两种不同的宿主生物体中天然或设计地复制的DNA载体，它可以从放线菌和相关物种、细菌和真核生物(例如，高等植物、哺乳动物、酵母或真菌细胞)中选择。在一些实施方案中，载体中的核酸在适当的启动子或其他调节元件的控制下，并可操作地连接到宿主细胞中转录的适当启动子或其他调节元件。该载体可以是在多个宿主中起作用的双功能表达载体。在基因组DNA的情况下，这可能包含其自己的启动子和/或其他调节元件，而在cDNA的情况下，它可能在适当的启动子和/或其他调节元件的控制下，以便在宿主细胞中表达。因此，本发明的核酸或多核苷酸和/或包含它们的表达盒可以包含在如本文所述和本领域已知的载体中。

如本文所用，“接触”、“接触(ing)”、“接触(ed)”及其语法变体是指在适合进行所需反应(例如，转化、转录控制、基因组编辑、切口和/或切割)的条件下将所需反应的组分放在一起。例如，靶核酸可以与序列特异性核酸结合蛋白(例如，多核苷酸引导的核酸内切酶、CRISPR-Cas核酸内切酶(例如，CRISPR-Cas效应蛋白)、锌指核酸酶、转录激活因子样效应核酸酶(TALEN)和/或Argonaute蛋白))和脱氨酶或编码相同的核酸构建体接触，在序列特异性核酸结合蛋白，逆转录酶和/或脱氨酶表达的条件下，序列特异性核酸结合蛋白与靶核酸结合，逆转录酶和/或脱氨酶可以与序列特异性核酸结合蛋白融合或募集到序列特异性核酸结合蛋白上(例如，通过与序列特异性核酸结合蛋白融合的肽标签和与逆转录酶和/或脱氨酶融合的亲和标签)，因此，脱氨酶和/或逆转录酶位于靶核酸附近，从而修饰靶核酸。可以使用利用其他蛋白质-蛋白质相互作用的募集逆转录酶和/或脱氨酶的其他方法，也可以使用RNA-蛋白质相互作用和化学相互作用进行蛋白质-蛋白质和蛋白质-核酸募集。

如本文所用，“修饰(ing)”或“修饰(tion)”是指目标核酸的包括目标核酸的编辑(例如，突变)、共价修饰、交换/取代核酸/核苷酸碱基、缺失、切割、切口和/或改变转录控制。在一些实施方案中，修饰可以包括任何类型的一个或多个单碱基变化(SNP)。

在目标多核苷酸的上下文中，“引入”、“引入(ing)”、“引入(ed)”(及其语法变体)是指将感兴趣的核苷酸序列(例如，多核苷酸、RT模板、核酸构建体和/或向导核酸)呈现给植物、植物部分或其细胞，以使核苷酸序列进入细胞内部的方式。

术语“转化”或“转染”可以互换使用，本文中使用的是指将异源核酸引入细胞中。细胞的转化可以是稳定的或短暂的。因此，在一些实施方案中，宿主细胞或宿主生物体(例如，植物)可以用本发明的多核苷酸/核酸分子稳定地转化。在一些实施方案中，宿主细胞或宿主生物体可以用本发明的多核苷酸/核酸分子瞬时转化。

在多核苷酸的背景下，“瞬时转化”是指多核苷酸被引入细胞中，而不是整合到细胞的基因组中。

在多核苷酸引入细胞的上下文中，通过“稳定引入(ing)”或“稳定引入(ed)”旨在使引入的多核苷酸稳定地掺入细胞的基因组中，因此细胞与多核苷酸一起稳定转化。

本文使用的“稳定转化”或“稳定转化”是指将核酸分子引入细胞并整合到细胞的基因组中。因此，整合的核酸分子能够被其后代遗传，更具体地说，被多个连续世代的后代遗传。本文中使用的“基因组”包括核基因组和质体基因组，因此包括将核酸整合到例如叶绿体或线粒体基因组中。本文使用的稳定转化也可以指在染色体外维持的转基因，例如，作为小染色体或质粒。

瞬时转化可以通过例如酶联免疫吸附测定(ELISA)或Western blot来检测，这可以检测由引入生物体的一个或多个转基因编码的肽或多肽的存在。例如，可以通过细胞基因组DNA与核酸序列的Southern印迹杂交测定来检测细胞的稳定转化，这些核酸序列与引入生物体(例如植物)的转基因的核苷酸序列特异性杂交。例如，可以通过细胞RNA与核酸序列的Northern印迹杂交测定来检测细胞的稳定转化，这些核酸序列与引入宿主生物体的转基因核苷酸序列特异性杂交。细胞的稳定转化也可以通过例如聚合酶链反应(PCR)或本领域众所周知的其他扩增反应来检测，采用与转基因的靶序列杂交的特异性引物序列，导致转基因序列的扩增，这可以根据标准方法进行检测。转化也可以通过本领域已知的直接测序和/或杂交方案来检测。

因此，在一些实施方案中，本发明的核苷酸序列、多核苷酸、核酸构建体和/或表达盒可以瞬时表达和/或它们可以稳定地掺入宿主生物体的基因组中。因此，在一些实施方案中，本发明的核酸构建体(例如，包含用于如本文所述编辑的多核苷酸的一个或多个表达盒)可以被瞬时引入到具有向导核酸的细胞中，因此，无DNA保留在细胞中。

本发明的核酸构建体可以通过本领域技术人员已知的任何方法引入植物细胞中。转化方法的非限制性实例包括通过细菌介导的核酸递送(例如，通过农杆菌)、病毒介导的核酸递送、碳化硅或核酸晶须介导的核酸递送、脂质体介导的核酸递送、显微注射、微粒轰炸、磷酸钙介导的转化、环糊精介导的转化、电穿孔、纳米颗粒介导的转化、超声处理、浸润、PEG介导的核酸摄取，以及导致核酸进入植物细胞的任何其他电、化学、物理(机械)和/或生物机制，包括它们的任意组合。转化真核生物和原核生物的程序在本领域是众所周知和常规的，并且在整个文献中都有描述(例如，参见Jiang et al.2013.Nat.Biotechnol.31:233-239；Ran et al.Nature Protocols 8:2281-2308(2013))。本领域已知的各种植物转化方法的一般指南包括Mikiet al.(“Procedures for Introducing Foreign DNA intoPlants”in Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology,Glick,B.R.andThompson,J.E.,Eds.(CRC Press,Inc.,Boca Raton,1993),pages 67-88)and Rakowoczy-Trojanowska(Cell.Mol.Biol.Lett.7:849-858(2002))。

在本发明的一些实施方案中，细胞的转化可以包括核转化。在其他实施方案中，细胞的转化可以包括质体转化(例如，叶绿体转化)。在更进一步的实施方案中，本发明的核酸可以通过常规育种技术引入细胞中。在一些实施方案中，可以通过农杆菌转化将多核苷酸、表达盒和/或载体中的一个或多个引入植物细胞中。

因此，多核苷酸可以通过本领域公知的任意数量方式引入植物、植物部分、植物细胞中。本发明的方法不依赖于将一个或多个核苷酸序列引入植物的特定方法，仅依赖于它们进入细胞内部。当需要引入多个多核苷酸时，它们可以组装为单个核酸构建体的一部分，也可以作为单独的核酸构建体组装，并且可以位于相同或不同的核酸构建体上。因此，多核苷酸可以在单个转化事件中或单独的转化事件中引入目标细胞，或者，可以将多核苷酸作为育种方案的一部分掺入植物中。

本发明旨在通过编辑技术对植物中的核糖体蛋白L3(RPL3)基因(例如，RPL3A基因、RPL3A-1基因、RPL3A-2基因、RPL3A-3基因、RPL3B基因、RPL3B-1基因、RPL3B-2基因和/或RPL3B-3基因)进行修饰，以提供表现出单端孢霉烯霉菌毒素与由修饰的RPL3基因编码的RPL3多肽结合减少的植物，对脱氧雪腐镰孢菌烯醇(DON)的耐受性增加，对镰孢菌头枯病(FHB)的抵抗力增加(例如，对FHB病原体禾谷镰孢菌(Fusarium graminearum)的抵抗力增加，例如，FHB感染症状减轻，例如，禾谷镰孢菌(Fusarium graminearum)感染症状减轻))，和/或禾谷镰孢菌(Fusarium graminearum)负荷减少。具体来说，RPL3基因编码核糖体蛋白L3(RPL3)多肽，这些多肽与镰孢菌头枯病(FHB)毒力因子，单端孢霉烯霉菌毒素相互作用。特别是，单端孢霉烯霉菌毒素(DON)被认为通过与核糖体蛋白L3(RPL3)结合来抑制真核蛋白合成，从而起到毒力因子的作用。因此，不希望受到任何特定理论的限制，可以通过修改RPL3基因来降低真菌感染植物或其部分的能力，使得DON结合编码的RPL3多肽的能力降低或无能力，从而导致植物或其部分对真菌感染的抵抗力/耐受性增加，FHB感染的症状减轻，真菌负荷减少和/或霉菌毒素在受感染植物部分的积累减少，例如，当感染禾谷镰孢菌(Fusarium graminearum)时，植物可能产生积累较少的单端孢霉烯霉菌毒素(例如，DON)的种子。编码RPL3多肽的内源性RPL3基因的修饰可以调节对禾谷镰孢菌(Fusariumgraminearum)的疾病反应，可能增加对禾谷镰孢菌(F.graminearum)产生的霉菌毒素的耐受性，可导致植物或其部分包含减少的禾谷镰孢菌(F.graminearum)负荷和/或可导致植物或其部分含有较少量的霉菌毒素(例如，与来自不包含本文所述的至少一个内源性RPL3基因突变的植物的种子相比，具有降低霉菌毒素水平的种子。

在小麦中，RPL3基因包括RPL3A、RPL3A-1、RPL3A-2、RPL3A-3、RPL3B、RPL3B-1、RPL3B-2和/或RPL3B-3，其中每一个或其任何组合都可以在植物中被靶向。因此，可用于本发明的编辑策略可以包括在一个或多个RPL3基因(例如，1、2、3、4、5和/或6个RPL3基因)中产生突变。例如，可以在植物的一个或多个RPL3A基因和/或一个或多个RPL3B基因中产生一个或多个突变。在一些实施方案中，可以在RPL3A-1基因、RPL3A-2基因和/或RPL3A-3基因的一个或多个(1、2或全部3个)和/或RPL3B-1基因、RPL3B-2基因和/或RPL3B-3的一个或多个中产生一个或多个突变。在一些实施方案中，突变可以是非天然突变。突变可能有助于生产植物，其表现出(1)单端孢霉烯霉菌毒素与由修饰的RPL3基因编码的RPL3多肽的结合减少，(2)对脱氧雪腐镰孢菌烯醇(DON)的耐受性增加，(3)对镰孢菌头枯病(FHB)的抵抗力增加(例如，对FHB病原体禾谷镰孢菌(Fusarium graminearum)的抵抗力增加，例如，FHB感染症状减轻，例如，禾谷镰孢菌(Fusarium graminearum)感染症状减轻)和/或(4)禾谷镰孢菌(Fusarium graminearum)负荷减少，包括例如，替换、缺失和/或插入等。在某些方面，编辑技术生成的突变可以是点突变。在一些实施方案中，如本文所述的一个或多个RPL3基因的突变导致敲低一个或多个RPL3基因的表达，例如，减少编码的多肽的产生。在一些实施方案中，如本文所述的一个或多个RPL3基因的突变导致一个或多个RPL3基因的敲除，导致无可检测到的编码的多肽产生。在一些实施方案中，提供了突变的RPL3基因，该基因包含与SEQID NO：147、149、151、153或155中任何一项具有至少90％序列同一性的核酸序列，和/或编码与SEQ ID NO：148、150、152、154或156中任何一项具有至少90％序列同一性的突变的RPL3多肽。

在一些实施方案中，本发明提供了植物或其部分，所述植物或其部分包含编码RPL3多肽的内源性核糖体蛋白L3(RPL3)基因(例如，在一个或多个RPL3基因中)中的至少一个突变，其中任选地，内源性RPL3基因的至少一个突变导致无可检测到的RPL3多肽或与单端孢霉烯霉菌毒素的结合减少的RPL3多肽。不受任何特定理论的限制，RPL3多肽被认为能够调节对禾谷镰孢菌(Fusarium graminearum)的疾病反应和/或增加对脱氧雪腐镰孢菌烯醇(DON)的耐受性。

在一些实施方案中，内源性RPL3基因是内源性RPL3A基因或内源性RPL3B基因，其中编码的RPL3多肽分别是RPL3A多肽或RPL3B多肽。在一些实施方案中，一个或多个RPL3基因中的突变可以是非天然突变。在一些实施方案中，RPL3基因中的突变可以是无效突变。在一些实施方案中，突变可以是敲除突变或敲低突变。如本文所述，敲除突变可导致很少或无表达和/或编码的RPL3多肽无(0％)活性。敲低突变可导致修饰的RPL3多肽的表达降低，而RPL3多肽在产生时可能使结合单端孢霉烯霉菌毒素(例如，DON)的能力降低至少5％(例如，突变的RPL3多肽(由突变的内源性RPL3基因产生)对霉菌毒素的结合减少约5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％，以及其中的任何范围或值)。

在一些实施方案中，植物或其部分是单子叶植物。在一些实施方案中，所述植物是小麦植物、大麦植物、斯佩尔特小麦植物或燕麦植物。在一些实施方案中，植物是小麦植物，并且内源性RPL3基因的突变可以在A基因组中，任选地在染色体4A或染色体5A中，在B基因组中，在D基因组中，或在它们的任意组合，任选地在A基因组和B基因组中，其中内源性RPL3基因任选地是RPL3A基因和/或RPL3B基因。在一些实施方案中，RPL3A基因是RPL3A-1基因、RPL3A-2基因和/或RPL3A-3基因和/或RPL3B基因是RPL3B-1基因、RPL3B-2基因和/或RPL3B-3基因。

FHB抗性是一种数量性状，已经被经典提出并被广泛接受，小麦可以表现出对这种疾病的五种不同类型的抗性：(I)对穗组织内病原体的初始感染的抗性；(II)对疾病随后在整个穗传播的抵抗力；(III)对霉菌毒素积累的抵抗力；(IV)对籽粒感染的抵抗力和/或(V)对产量性能的抵抗力(Venske et al.Front.Plant Sci.13June 2019；doi.org/10.3389/fpls.2019.00727))。因此，除了如本文所述的内源性RPL3基因中的突变外，本发明的植物或其部分还可以包含一个或多个附加的镰孢菌头枯病抗性等位基因。在一些实施方案中，一个或多个额外的镰孢菌头枯病抗性等位基因可以是一个或多个数量性状座位(QTL)。Venske et al.(Front.Plant Sci.13June 2019；doi.org/10.3389/fpls.2019.00727)报道，共有556个QTL分布在小麦的所有亚基因组和染色体上。在一些实施方案中，包含如本文所述的RPL3基因突变的本发明植物可以进一步包含一个或多个(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个或更多)与镰孢菌头枯病抗性相关的QTL(例如，堆叠)，其中QTL可以包括但不限于Fhb1、Fhb2、Fhb3、Fhb4、Fhb5、Fhb6和/或Fhb7。

在一些实施方案中，提供了植物细胞，所述植物细胞包括编辑系统，所述编辑系统包括：(a)CRISPR-Cas效应蛋白；(b)向导核酸(例如，gRNA、gDNA、crRNA、crDNA、sgRNA、sgDNA)，其包含与编码核糖体蛋白L3(RPL3)多肽的内源性靶基因互补的间隔序列。该编辑系统可用于在编码RPL3多肽的内源性靶基因中产生突变。在一些实施方案中，内源性靶基因是内源性核糖体蛋白L3(RPL3)基因(例如，一个或多个内源性RPL3基因)，任选内源性RPL3A基因和/或内源性RPL3B基因，任选内源性RPL3A-1基因、RPL3A-2基因、RPL3A-3基因、RPL3B-1基因、RPL3B-2基因和/或RPL3B-3基因。在一些实施方案中，突变可以是非天然突变。在一些实施方案中，内源性靶基因：(a)包含与SEQ ID NO：72、73、75、76、78、79、80、81、83、84、86或87中的任何一项具有至少80％序列同一性的核苷酸序列，(b)包含与SEQ IDNO：89～139中的任何一项具有至少80％序列同一性的区，(c)编码与SEQ ID NO：74、77、82、85或88之任一个具有至少80％序列同一性的序列。在一些实施方案中，编辑系统的向导核酸可以包含SEQ ID NO：140～146之任一个核苷酸序列(间隔序列，例如，一个或多个间隔序列，或其反向互补序列)。

可用于本发明的植物、其植物部分或植物细胞中的RPL3基因的突变可以是任何类型的突变，包括碱基替换、碱基缺失和/或碱基插入。在一些实施方案中，非天然突变可以包括对A、T、G或C的碱基取代。在一些实施方案中，突变可以是至少一个碱基对的缺失(例如，1个碱基对～约100个碱基对；例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100个连续碱基对；例如，1～约50个连续碱基对，1～约30个连续碱基对，1～约15个连续碱基对)或插入至少一个碱基对(例如，1个碱基对～约16个碱基对；例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16个连续碱基对)，任选地，其中，所述缺失或插入是框外缺失或框外插入。在一些实施方案中，一个或多个RPL3基因中的突变可以是非天然突变。在一些实施方案中，突变的内源性RPL3基因包含与SEQ ID NO：147、149、151、153或155中任何一项具有至少90％序列同一性的核酸序列和/或编码突变的RPL3多肽，其与SEQ ID NO：148、150、152、154或156中任何一项具有至少90％序列同一性。

RPL3基因的突变可能位于RPL3基因的5'区(例如，RPL3A基因和/或RPL3B基因)，任选地位于编码RPL3多肽的N末端区的RPL3基因的5'区(例如，5'编码区(外显子))。在一些实施方案中，突变可以是框外缺失或框外插入，这可导致截短的多肽，或者很少或无可检测到的多肽。在一些实施方案中，框外缺失或框外插入可以是无效突变。在一些实施方案中，位于RPL3基因5'区的突变可以是导致过早终止密码子(例如，框外碱基插入或框外碱基缺失)和截短的RPL3多肽，或者任选地导致很少或无可检测到的RPL3多肽。在一些实施方案中，突变可以导致截短的RPL3多肽，任选地RPL3多肽的C端截短，任选地，其中C端截短导致从多肽的C端部分缺失约50个氨基酸残基～约300个氨基酸残基(例如，约50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、1699、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、255、260、270、280、285、290、295或300个或更多残基，或其中的任何范围或值，来自RPL3多肽的C端，例如，SEQ ID NO：74、77、82、85或88)。

可用于在RPL3基因中产生这些突变和其他突变的编辑工具类型包括任何碱基编辑器或切割器，其通过使用与本文所述的RPL3基因(例如，一个或多个RPL3基因，例如，RPL3A基因和/或RPL3B基因)的一部分或区具有至少80％互补性的间隔子引导至靶位点，。

在一些实施方案中，RPL3基因的突变位于内源性RPL3基因的一部分或区内，该部分或区与SEQ ID NO：89～139的核苷酸序列具有至少80％(80、81、82、83、84、85、86、87、88、84、85、86、88、89、87、90、91、92、92、94、95、96、97、98、99或100％)序列同一性。

可用于本发明的内源性RPL3基因(例如，内源性靶基因)编码核糖体蛋白L3(RPL3)多肽，并包括内源性RPL3A基因、内源性RPL3B基因、内源性RPL3A-1基因、内源性RPL3A-2基因、内源性RPL3A-3基因、内源性RPL3B-1基因、内源性RPL3B-2基因和/或内源性RPL3B-3基因。在一些实施方案中，内源性RPL3基因(例如，内源性靶基因)(1)可以包含与SEQ ID NO：72、73、75、76、78、79、80、81、83、84、86或87之任一个具有至少80％序列同一性的核酸序列，(2)可以包含与SEQ ID NO：89～139之任一个具有至少80％序列同一性的RPL3基因的区和/或(3)可以编码与SEQ ID NO：74、77、82、85或88之任一个具有至少80％序列同一性的RPL3多肽。

在一些实施方案中，在内源性RPL3基因(至少一个内源性RPL3基因中，例如在一个或多个RPL3基因中)包含至少一个(例如，一个或多个)突变，任选地非天然突变的植物(例如，小麦植物、斯佩尔特小麦植物、燕麦植物或燕麦植物)表现出(1)单端孢霉烯霉菌毒素与由修饰的RPL3基因编码的RPL3多肽的结合减少，(2)对脱氧雪腐镰孢菌烯醇(DON)的耐受性增加，(3)对镰孢菌头枯病(FHB)的抵抗力/耐受性增加(例如，对FHB病原体禾谷镰孢菌(Fusarium graminearum)的抵抗力增加，和/或FHB症状减轻)，(4)减少禾谷镰孢菌(Fusarium graminearum)负荷和/或(5)感染禾谷镰孢菌(Fusarium graminearum)时产生的种子积累较少的单端孢霉烯霉菌毒素(例如，DON)，与无至少一种突变的植物(例如，同基因植物(例如，野生型未编辑的植物或空分离株)相比。在一些实施方案中，植物可以包含突变的内源性RPL3基因，该基因包含与SEQ ID NO：147、149、151、153或155中的任何一项具有至少90％序列同一性的核酸序列和/或编码突变的RPL3多肽，其与SEQ ID NO：148、150、152、154或156中任何一项具有至少90％序列同一性。

在一些实施方案中，植物可以从本发明的植物部分和/或植物细胞再生，如本文所述，包含一个或多个内源性RPL3基因(内源性RPL3A基因和/或内源性RPL3B基因)中的突变，其中，再生植物包含一个或多个内源性RPL3基因的突变和表型为(1)减少单端孢霉烯霉菌毒素与由修饰的内源性RPL3基因编码的RPL3多肽的结合，(2)增加对脱氧雪腐镰孢菌烯醇(DON)的耐受性，(3)增加对镰孢菌头枯病(FHB)的耐药性/耐受性(例如，增加对FHB病原体禾谷镰孢菌(Fusarium graminearum)的耐受性和/或FHB症状减轻)，(4)减少禾谷镰孢菌(Fusarium graminearum)负荷，和/或(5)感染禾谷镰孢菌(Fusarium graminearum)时种子积累较少的单端孢霉烯霉菌毒素(例如DON)，与无至少一种突变的植物(例如，同基因植物(例如，野生型未编辑的植物或空分离株)相比。在一些实施方案中，再生植物可以包含突变的内源性RPL3基因，该基因与SEQ ID NO：147、149、151、153或155中的任何一种具有至少90％的序列同一性和/或编码的突变的RPL3多肽与SEQ ID NO：148、150、152、154或156中的任何一种具有至少90％的序列同一性。

在一些实施方案中，提供了植物细胞，所述植物细胞包含内源性核糖体蛋白L3(RPL3)基因内的至少一个(例如，一个或多个)突变，其中，至少一个突变是使用编辑系统引入的替换、插入或缺失，该系统包含与内源性RPL3基因中的靶位点结合的核酸结合结构域。在一些实施方案中，突变可以是非天然突变。在一些实施方案中，替换、插入或缺失导致例如氨基酸替换。在一些实施方案中，替换、插入或缺失导致例如提早终止密码子。在一些实施方案中，替换、插入或缺失导致例如，截短的RPL3蛋白和/或RPL3蛋白的缺失(例如，截断导致无或很少可检测到的蛋白质)。在一些实施方案中，至少一个突变可以是点突变，任选地导致过早终止密码子，任选地导致截短的RPL3蛋白，任选地无或很少或无可检测到的RPL3蛋白。在一些实施方案中，RPL3基因内的至少一个突变是插入和/或缺失，任选地，至少一个突变可以是框外插入或框外缺失。在一些实施方案中，内源性RPL3基因是内源性RPL3A基因和/或内源性RPL3B基因，其中，内源性RPL3基因可以是内源性RPL3A-1基因、内源性RPL3A-2基因、内源性RPL3A-3基因、内源性RPL3B-1基因、内源性RPL3B-2基因和/或内源性RPL3B-3基因。在一些实施方案中，植物细胞可以包含突变的内源性RPL3基因，该基因与SEQID NO：147、149、151、153或155中的任何一种具有至少90％的序列同一性和/或编码的突变的RPL3多肽与SEQ ID NO：148、150、152、154或156中的任何一种具有至少90％的序列同一性。

在一些实施方案中，植物细胞的RPL3基因中的靶位点可以位于内源性RPL3基因的区或部分内，该区与SEQ ID NO：89～139的核苷酸序列之任一个具有至少80％的序列同一性。

在一些实施方案中，在切割后可以通过编辑系统进行突变，该系统包含核酸酶和核酸结合结构域，与序列中的靶位点结合，该序列与SEQ ID NO：72、73、75、76、78、79、80、81、83、84、86或87之任一个编码的序列具有至少80％的序列同一性，任选地在与SEQ IDNO：72、73、75、76、78、79、80、81、83、84、86或87中编码之任一个序列具有至少80％序列同一性的序列的5'区内，任选地在RPL3基因组序列的第三个外显子中或相邻，或与SEQ ID NO：89～139中编码之任一个序列具有至少80％序列同一性的序列，并且RPL3基因内的至少一个突变是在核酸酶切割后产生的。在一些实施方案中，至少一个突变可导致无效等位基因。

在一些实施方案中，植物细胞可以再生成包含至少一种突变的植物，任选地一种非天然突变，其中从植物细胞再生的植物表现出以下表型(1)单端孢霉烯霉菌毒素与由修饰的内源性RPL3基因编码的RPL3多肽的结合减少，(2)对脱氧雪腐镰孢菌烯醇(DON)的耐受性增加，(3)对镰孢菌头枯病(FHB)的抵抗力/耐受性增加(例如，对FHB病原体禾谷镰孢菌(Fusarium graminearum)的抵抗力增加，和/或FHB症状减轻)，(4)减少禾谷镰孢菌(Fusarium graminearum)负荷，和/或(5)感染禾谷镰孢菌(Fusarium graminearum)时产生的种子积累较少的单端孢霉烯霉菌毒素(例如，DON)，与无至少一种突变的植物(例如，同基因植物(例如，野生型未编辑的植物或空分离株)相比。

在一些实施方案中，提供了生产/培育无转基因编辑的植物(例如，小麦植物、斯佩尔特小麦植物、燕麦植物、大麦植物)的方法，所述方法包括：将本发明的植物(例如，在一个或多个RPL3基因中包含一个或多个突变(例如，非天然突变)的植物，并且具有以下表型(1)单端孢霉烯霉菌毒素与通过修饰的RPL3基因编码的RPL3多肽的结合减少，(2)增加对脱氧雪腐镰孢菌烯醇(DON)的耐受性，(3)增加对镰孢菌头枯病(FHB)的抵抗力/耐受性(例如，增加对FHB病原体禾谷镰孢菌(Fusarium graminearum)的抵抗力和/或FHB症状减轻)，(4)减少禾谷镰孢菌(Fusarium graminearum)负荷，和/或(5)当感染禾谷镰孢菌(Fusariumgraminearum)时，产生的种子积累较少的单端孢霉烯霉菌毒素(例如，DON)，与无转基因植物杂交，从而将突变引入无转基因的植物中；并选择包含突变且无转基因的后代植物，从而产生无转基因编辑的植物。

本文还提供了提供多种植物(例如，小麦植物、斯佩尔特小麦植物、燕麦植物、大麦植物)的方法，其表型为(1)单端孢霉烯霉菌毒素与由修饰的内源性RPL3基因编码的RPL3多肽的结合减少，(2)对脱氧雪腐镰孢菌烯醇(DON)的耐受性增加，(3)对镰孢菌头枯病(FHB)的抗性/耐受性增加(例如，对FHB病原体禾谷镰孢菌(Fusarium graminearum)的抵抗力增加，和/或减轻FHB的症状，(4)减少禾谷镰孢菌(Fusarium graminearum)负荷，和/或(5)当感染禾谷镰孢菌(Fusarium graminearum)时，产生积累较少单端孢霉烯霉菌毒素(例如，DON)的种子，所述方法包括种植两种或多种本发明的植物(例如，在生长区(例如田地(例如，耕地、农田)、生长室、温室、娱乐区、草坪和/或路边等种植2、3、4、5、6、7、8、9、10、200、40、100、200、300、500、1000、2000、3000、400、5000或10,000株或更多本发明植物)，从而提供了具有以下表型的多种植物，与多个缺乏所述突变的对照植物相比：(1)单端孢霉烯霉菌毒素与由修饰的内源性RPL3基因编码的RPL3多肽的结合减少，(2)对脱氧雪腐镰孢菌烯醇(DON)的耐受性增加，(3)对镰孢菌头枯病(FHB)的抵抗力/耐受性增加(例如，对FHB病原体禾谷镰孢菌(Fusarium graminearum)的抵抗力增加，和/或FHB症状减轻)，(4)减少禾谷镰孢菌(Fusarium graminearum)负荷，和/或(5)感染禾谷镰孢菌(Fusarium graminearum)时产生的种子积累较少的单端孢霉烯霉菌毒素(例如，DON)。

在一些实施方案中，提供了在植物中的内源性核糖体蛋白L3(RPL3)基因中产生突变的方法，其包括：(a)将基因编辑系统靶向内源性RPL3基因的区，该区包含与SEQ ID NO：89～139之任一个具有至少90％序列同一性的序列；(b)选择一种植物，所述植物包含位于内源性RPL3基因区的修饰，该区与SEQ ID NO：89～139中的任何一种具有至少90％的序列同一性。在一些实施方案中，修饰是框外缺失或框外插入，任选地导致截短的核糖体蛋白L3(RPL3)多肽，任选地导致无或很少可检测到的RPL3多肽。在一些实施方案中，突变可导致突变的RPL3基因与SEQ ID NO：147、149、151、153或155中的任何一种具有至少90％的序列同一性和/或编码的突变的RPL3多肽与SEQ ID NO：148、150、152、154或156中的任何一种具有至少90％的序列同一性。

在一些实施方案中，提供了在核糖体蛋白L3(RPL3)基因中产生变异的方法，所述方法包括：将编辑系统引入植物细胞中，其中，所述编辑系统靶向编码RPL3多肽的RPL3基因的区，并将所述RPL3基因的区与所述编辑系统接触，从而将突变引入RPL3基因并在植物细胞的RPL3基因中产生变异。在一些实施方案中，RPL3基因包含核苷酸序列，该核苷酸序列与SEQ ID NO：72、73、75、76、78、79、80、81、83、84、86或87之任一个具有至少80％序列同一性，和/或编码与SEQ ID NO：74、77、82、85或88具有至少80％序列同一性的氨基酸序列，其中任选地，所靶向的RPL3基因的区包含与SEQ ID NO：89～139之任一个核苷酸序列至少80％的序列同一性。在一些实施方案中，将植物细胞中内源性RPL3基因的区与编辑系统接触产生植物细胞，在其基因组中包含经过编辑的内源性RPL3基因，所述方法还包括：(a)从植物细胞再生植物；(b)使植物自交以产生后代植物(E1)；(c)测定(b)的后代植物对镰孢菌头枯病(FHB)的抗性增加、禾谷镰孢菌(Fusarium graminearum)负荷减少、对脱氧雪腐镰孢菌烯醇(DON)的耐受性增加，和/或产生积累较少单端孢霉烯霉菌毒素(DON)的种子的能力；以及(d)选择植物，所述植物与对照植物相比，表现出对镰孢菌头枯病(FHB)的抗性增加、禾谷镰孢菌(Fusarium graminearum)负荷增加、对脱氧雪腐镰孢菌烯醇(DON)的耐受性增加，和/或能够产生积累较少单端孢霉烯霉菌毒素(DON)的种子的能力的后代植物，以产生表现出对镰孢菌头枯病(FHB)的抗性增加、禾谷镰孢菌(Fusarium graminearum)负荷降低、对脱氧雪腐镰孢菌烯醇(DON)的耐受性增加，和/或能够产生积累较少单端孢霉烯霉菌毒素(DON)的种子的能力的选择后代植物。在一些实施方案中，所述方法还包括(e)使(d)的选定子代植物自交以产生子代植物(E2)；(f)测定(e)的后代植物对镰孢菌头枯病(FHB)的抗性增加、禾谷镰孢菌(Fusarium graminearum)负荷减少、对脱氧雪腐镰孢菌烯醇(DON)的耐受性增加，和/或能够产生积累较少单端孢霉烯霉菌毒素(DON)的种子的能力；以及(g)选择后代植物，所述后代植物与对照植物相比，对镰孢菌头枯病(FHB)的抗性增加，减少禾谷镰孢菌(Fusarium graminearum)负荷，增加对脱氧雪腐镰孢菌烯醇(DON)的耐受性和/或能够产生积累较少单端孢霉烯霉菌毒素(DON)的种子的能力，以产生表现出对镰孢菌头枯病(FHB)的抗性增加，减少禾谷镰孢菌(Fusarium graminearum)负荷，对脱氧雪腐镰孢菌烯醇(DON)的耐受性增加，和/或能够产生积累较少单端孢霉烯霉菌毒素(DON)的种子的能力的选定后代植物，任选地重复(e)～(g)一次或多次。在一些实施方案中，编辑可以导致突变的RPL3基因与SEQ ID NO：147、149、151、153或155之任一个具有至少90％的序列同一性和/或编码的突变的RPL3多肽与SEQ ID NO：148、150、152、154或156之任一个具有至少90％的序列同一性。

在一些实施方案中，提供了检测植物或植物部分(例如植物细胞)中突变的RPL3基因(内源性RPL3基因，例如RPL3A和/或RPL3B的突变)的方法，所述方法包括在植物的基因组中检测RPL3基因，该基因在区内具有至少一个突变，该区与SEQ ID NO：89～139中任何一项的核苷酸序列具有至少80％序列同一性(例如，至少约80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、99或100％序列同一性)。在一些实施方案中，提供了检测突变核糖体蛋白L3(RPL3)基因的方法，所述方法包括在植物的基因组中检测编码截短多肽的内源性突变的RPL3基因，其中任选地，所述突变位于RPL3基因的5'区(任选地，在外显子3内或附近)，该基因与SEQ ID NO：89～139之任一个核苷酸序列具有至少80％的序列同一性。在一些实施方案中，检测到的突变是框外缺失或框外插入。在一些实施方案中，被检测到的突变的RPL3基因包含与SEQ ID NO：147、149、151、153或155之任一个具有至少90％序列同一性的核酸序列，和/或编码与SEQ ID NO：148、150、152、154或156之任一个具有至少90％序列同一性的突变的RPL3多肽。

在一些实施方案中，提供了在植物细胞的基因组中编辑特定位点的方法，所述方法包括：以位点特异性方式切割植物细胞中内源性核糖体蛋白L3(RPL3)基因内的靶位点，所述内源性RPL3基因：(a)包含核苷酸序列，该核苷酸序列与SEQ ID NO：72、73、75、76、78、79、80、81、83、84、86或87之任一个具有至少80％的序列同一性，(b)包含与SEQ ID NO：89～139之任一个核苷酸序列具有至少80％序列同一性的区，和/或(c)编码与SEQ ID NO：74、77、82、85或88具有至少80％序列同一性的氨基酸序列，从而在植物细胞的内源性RPL3基因中产生编辑，并产生包含内源性RPL3基因编辑的植物细胞。在一些实施方案中，内源性RPL3基因是内源性RPL3A基因和/或内源性RPL3B基因(任选地，RPL3A-1基因、RPL3A-2基因、RPL3A-3基因、RPL3B-1基因、RPL3B-2基因和/或RPL3B-3基因)，其中任选地在两个或多个内源性RPL3基因中产生编辑(例如，RPL3A基因、RPL3A-1基因、RPL3A-2基因、RPL3A-3基因、RPL3B基因、RPL3B-1基因、RPL3B-2基因和/或RPL3B-3基因中的两个或多个)。在一些实施方案中，植物细胞可以来自小麦植物、斯佩尔特小麦植物、大麦植物或燕麦植物，任选地，其中植物细胞来自小麦植物。

在一些实施方案中，内源性RPL3基因中的编辑导致突变，包括但不限于碱基缺失、碱基替换或碱基插入。在一些实施方案中，至少一个突变可以位于RPL3基因的5'区，例如，在RPL3基因组序列的第三个外显子中或附近/相邻，其中“接近”或“相邻”是指在第三个外显子的约1～约110个连续核苷酸内的区。在某些实施方案中，编辑可以导致至少一个突变，该突变是至少一个碱基对的插入(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16个碱基对，例如，1～约16个碱基对)。在一些实施方案中，编辑可以导致至少一个突变，突变为缺失，任选地，其中，所述缺失的长度约为1～约100个连续碱基对，例如，1～约50个连续碱基对，约1～约30个连续碱基对或约1～约15个连续碱基对的长度。可用于本发明的缺失或插入可以是框外插入或框外缺失。在一些实施方案中，框外插入或框外缺失可导致提早终止密码子和截短的蛋白质，任选地，其中框外插入或框外缺失导致无或很少可检测到的蛋白质(例如，敲除或无效突变)。在一些实施方案中，RPL3基因中的编辑导致RPL3多肽截短，任选地RPL3多肽的C端截短，任选地，其中C端截短导致RPL3多肽的C端约50个氨基酸残基～约300个氨基酸残基的缺失(例如，约50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、1699、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、255、260、270、275、280、290、295或300，以及其中的任何范围或值)。在一些实施方案中，突变可以是非天然突变。在一些实施方案中，编辑可导致突变的RPL3基因与SEQ ID NO：147、149、151、153或155之任一个具有至少90％的序列同一性和/或编码的突变的RPL3多肽与SEQ ID NO：148、150、152、154或156之任一个具有至少90％的序列同一性。

在一些实施方案中，编辑方法可以进一步包括从包含内源性RPL3基因编辑的植物细胞再生植物，从而产生包含其内源性RPL3基因编辑(任选地在RPL3基因的5'端，任选地在或接近/相邻于第三个外显子)并且与无编辑的对照植物相比具有一种或多种改进的产量性状的表型的植物。

在一些实施方案中，提供了制备植物的方法，所述方法包括：(a)使包含内源性核糖体蛋白L3(RPL3)基因的植物细胞群与核酸酶接触，该核酸酶与核酸结合结构域(例如，编辑系统)连接，该结构域结合的序列(i)与SEQ ID NO：72、73、75、76、78、79、80、81、83、84、86或87的任意一个核苷酸序列具有至少80％的序列同一性，(ii)包含与SEQ ID NO：89～139之任一个核苷酸序列具有至少80％序列同一性的区，和/或(iii)编码与SEQ ID NO：74、77、82、85或88具有至少80％序列同一性的氨基酸序列；(b)从内源性RPL3基因已突变的植物细胞群中选择植物细胞，从而产生包含内源性RPL3基因突变的植物细胞；(c)将选定的植物细胞培养成包含编码RPL3多肽的内源基因突变的植物，其中任选地，与无至少一个突变的植物(例如，同基因植物(例如，野生型未编辑的植物或空分离株)相比，其中突变减少或消除RPL3多肽结合单端孢霉烯霉菌毒素(例如，脱氧雪腐镰孢菌烯醇(DON))的能力，增加对脱氧雪腐镰孢菌烯醇(DON)的耐受性，增加对镰孢菌头枯病(FHB)的抗性/耐受性(例如，对FHB病原体禾谷镰孢菌(Fusarium graminearum)的抵抗力增加，和/或减轻FHB感染的症状)，减少禾谷镰孢菌(Fusarium graminearum)负荷和/或赋予植物感染禾谷镰孢菌(Fusariumgraminearum)时产生积累较少单端孢霉烯霉菌毒素(例如，DON)的种子的能力。

在一些实施方案中，提供了在植物中增加对镰孢菌头枯病(FHB)的抗性的方法(例如，增加对FHB病原体禾谷镰孢菌(Fusarium graminearum)的抗性和/或减轻FHB感染的症状(例如，当感染禾谷镰孢菌(Fusarium graminearum)时FHB症状减轻))、增加对单端孢霉烯霉菌毒素的耐受性、任选的脱氧雪腐镰孢菌烯醇(DON)、减少禾谷镰孢菌(Fusariumgraminearum)负荷和/或赋予产生较少单端孢霉烯霉菌毒素(例如，DON)积累的种子的能力在植物感染禾谷镰孢菌(Fusarium graminearum)时，包括(a)使包含内源性核糖体蛋白L3(RPL3)基因的植物细胞与靶向内源性RPL3基因的核酸酶接触，其中核酸酶与核酸结合结构域(例如，编辑系统)连接，该核酸结合域与内源性RPL3基因中的靶位点结合，并且内源性RPL3基因：(i)包含与SEQ ID NO：72、73、75、76、78、79、80、81、83、84、86或87之任一个具有至少80％序列同一性的核苷酸序列，(ii)包含与SEQ ID NO：89～139之任一个核苷酸序列具有至少80％序列同一性的区，和/或(iii)编码与SEQ ID NO：74、77、82、85或88具有至少80％序列同一性的氨基酸序列，从而产生包含内源性RPL3基因突变的植物细胞；(b)将植物细胞培养成包含内源性RPL3基因突变的植物，从而增加对FHB的抗性，增加对单端孢霉烯霉菌毒素的耐受性，减少植物中的禾谷镰孢菌(Fusarium graminearum)负荷和/或当感染禾谷镰孢菌(Fusarium graminearum)时，赋予产生积累较少的单端孢霉烯霉菌毒素(例如，DON)的种子的能力。

在一些实施方案中，提供了生产植物或其部分的方法，所述植物或其部分包含至少一个具有突变的核糖体蛋白L3(RPL3)基因的细胞，所述方法包括将植物或植物部分中内源性RPL3基因中的靶位点与包含切割结构域和核酸结合结构域的核酸酶接触，其中核酸结合结构域与内源性RPL3基因中的靶位点结合，其中内源性RPL3基因(a)包含与SEQ ID NO：72、73、75、76、78、79、80、81、83、84、86或87的核苷酸序列具有至少80％序列同一性的序列；(b)包含与SEQ ID NO：89～139之任一个具有至少80％的同一性的区；和/或(c)编码与SEQID NO：74、77、82、85或88具有至少80％的序列同一性的氨基酸序列，从而产生包含至少一个在内源性RPL3基因中具有突变的细胞(例如，一个或多个突变的内源性RPL3基因)的植物或其部分，其中任选地在内源性RPL3基因中的突变产生与单端孢霉烯霉菌毒素结合减少的RPL3多肽，和/或包含至少一个在内源性RPL3基因中发生突变的细胞的植物表现出(i)对脱氧雪腐镰孢菌烯醇(DON)的耐受性增加，(ii)对镰孢菌头枯病(FHB)的抵抗力/耐受性增加(例如，对FHB病原体禾谷镰孢菌(Fusarium graminearum)的抵抗力增加，和/或FHB感染症状减轻(例如，感染禾谷镰孢菌(Fusarium graminearum)时FHB症状减轻))，(iii)增加对单端孢霉烯霉菌毒素的耐受性，任选的脱氧雪腐镰孢菌烯醇(DON)，(iv)减少禾谷镰孢菌(Fusarium graminearum)负荷和/或表现出产生积累较少单端孢霉烯霉菌毒素(例如，DON)种子的能力，与无至少一种突变的植物(例如，同基因植物(例如，野生型未编辑的植物或空分离株)相比。

本文还提供了生产植物或其部分的方法，所述植物或其部分包含内源性RPL3基因中的突变，该基因产生与单端孢霉烯霉菌毒素结合减少的突变的RPL3多肽，所述方法包括将植物或植物部分中内源性RPL3基因中的靶位点与包含切割结构域和核酸结合结构域的核酸酶接触，其中，核酸酶的核酸结合结构域与内源性RPL3基因中的靶位点结合，其中，内源性RPL3基因：(a)包含与SEQ ID NO：72、73、75、76、78、79、80、81、83、84、86、或87的核苷酸序列之任一个具有至少80％序列同一性的序列；(b)包含与SEQ ID NO：89～139之任一个具有至少80％的同一性的区；和/或(c)编码与SEQ ID NO：74、77、82、85或88具有至少80％的序列同一性的氨基酸序列，从而产生内源性RPL3基因突变的植物或其部分，该突变产生突变的RPL3多肽，与单端孢霉烯霉菌毒素的结合降低。在一些实施方案中，在内源性RPL3基因中具有突变的植物或其部分产生突变的RPL3多肽，其与单端孢霉烯霉菌毒素的结合减少，进一步表现出以下表型：(1)对脱氧雪腐镰孢菌烯醇(DON)的耐受性增加，(2)对镰孢菌头枯病(FHB)的抗性/耐受性增加(例如，对FHB病原体，禾谷镰孢菌(Fusarium graminearum)的抗性增加，和/或减轻FHB的症状)，(3)减少禾谷镰孢菌(Fusarium graminearum)负荷，和/或(4)感染禾谷镰孢菌(Fusarium graminearum)时产生的种子积累较少的单端孢霉烯霉菌毒素(例如，DON)。

在本发明的一些实施方案中，核酸酶切割内源性RPL3基因，从而将突变引入内源性RPL3基因。在一些实施方案中，所述突变是非天然突变。在一些实施方案中，突变可以是碱基替换、碱基缺失和/或碱基插入。在一些实施方案中，突变可以是点突变。在一些实施方案中，突变可以是敲除突变(例如，基因无效，或无基因表达)或敲低突变(例如，表达降低或功能降低)。

在一些实施方案中，该突变是无效突变。在一些实施方案中，突变可以是插入，任选的框外插入。在一些实施方案中，突变可以是缺失，任选的框外缺失(例如，缺失1～约100个碱基对)。在一些实施方案中，突变导致提早终止密码子，任选地导致截短的蛋白质。

在一些实施方案中，如本文所述在内源性RPL3基因中发生突变的植物可以包含与单端孢霉烯霉菌毒素结合减少的突变的RPL3多肽，和/或可表现出：与无内源性RPL3基因突变的对照植物相比对脱氧雪腐镰孢菌烯醇(DON)的耐受性增加，对镰孢菌头枯病(FHB)的抗性/耐受性增加(例如，对FHB病原体，禾谷镰孢菌(Fusarium graminearum)的抗性/耐受性增加，和/或减轻FHB症状)，禾谷镰孢菌(Fusarium graminearum)负荷降低，和/或感染禾谷镰孢菌(Fusarium graminearum)时产生积累较少单端孢霉烯霉菌毒素(例如，DON)的种子的能力。

在一些实施方案中，核酸酶可以切割内源性RPL3基因，从而将突变引入内源性RPL3基因。本发明有用的核酸酶可以是可用于编辑/修饰目标核酸的任何核酸酶。此类核酸酶包括但不限于锌指核酸酶、转录激活因子样效应核酸酶(TALEN)、核酸内切酶(例如Fok1)和/或CRISPR-Cas效应蛋白。同样，任何可用于本发明的核酸结合结构域可以是任何可用于编辑/修饰目标核酸的DNA结合结构域或RNA结合结构域。此类核酸结合结构域包括但不限于锌指、转录激活因子样DNA结合结构域(TAL)、Argonaute和/或CRISPR-Cas效应DNA结合结构域。

在一些实施方案中，本发明的方法可导致突变的RPL3基因与SEQ ID NO：147、149、151、153或155之任一个具有至少90％的序列同一性和/或编码的突变的RPL3多肽与SEQ IDNO：148、150、152、154或156之任一个具有至少90％的序列同一性。

本文使用的“核酸结合结构域”是指结合或能够结合核酸(例如，靶核酸)的多肽或结构域。核酸结合结构域可以是位点和/或序列特异性核酸结合结构域。DNA结合结构域是一个示例核酸结合结构域，它可以是位点和/或序列特异性的核酸结合结构域。在一些实施方案中，核酸结合结构域(例如，DNA结合结构域)包含在核酸结合多肽中。本文使用的“核酸结合蛋白”或“核酸结合多肽”是指以位点和/或序列特异性方式结合和/或能够结合核酸的多肽。在一些实施方案中，核酸结合结构域可以是序列特异性核酸结合结构域，例如但不限于来自例如多核苷酸引导的核酸内切酶、CRISPR-Cas效应蛋白(例如CRISPR-Cas核酸内切酶)、锌指核酸酶、转录激活因子样效应核酸酶(TALEN)和/或Argonaute蛋白的序列特异性结合结构域。在一些实施方案中，核酸结合多肽包含切割结构域(例如核酸酶结构域)，例如但不限于核酸内切酶(例如Fok1)、多核苷酸引导的核酸内切酶、CRISPR-Cas核酸内切酶、锌指核酸酶和/或转录激活因子样效应核酸酶(TALEN)。在一些实施方案中，核酸结合结构域是可以与一个或多个核酸分子(例如，如本文所述的与向导核酸形成复合物)结合(例如，形成复合物)的多肽，该核酸分子可以将核酸结合结构域导向或引导至特定的目标核苷酸序列(例如，基因组的基因位点)，它与一个或多个核酸分子(或其部分或区)互补，从而导致核酸结合域与特定靶位点的核苷酸序列结合。在一些实施方案中，核酸结合结构域是如本文所述的CRISPR-Cas效应蛋白。在一些实施方案中，本发明的多核苷酸和/或核酸构建体可以是“表达盒”或可以包含在表达盒内。

在一些实施方案中，提供了在植物或植物部分中编辑内源性核糖体蛋白L3(RPL3)基因(例如，RPL3A和/或RPL3B)的方法，所述方法包括将植物或植物部分中内源性RPL3基因中的靶位点与胞嘧啶碱基编辑系统接触，该系统包含胞嘧啶脱氨酶和与内源性RPL3中的靶位点结合的核酸结合域基因，其中内源性RPL3基因：(a)包含与SEQ ID NO：72、73、75、76、78、79、80、81、83、84、86或87的核苷酸序列之任一个具有至少80％序列同一性的序列；(b)包含与SEQ ID NO：89～139之任一个具有至少80％的同一性的区；和/或(c)编码与SEQ IDNO：74、77、82、85或88之任一个具有至少80％序列同一性的氨基酸序列，从而编辑植物或其部分中的内源性RPL3基因，并产生包含至少一个具有内源性RPL3基因突变的细胞的植物或其部分。

在一些实施方案中，提供了在植物或植物部分中编辑内源性核糖体蛋白L3(RPL3)基因(例如，RPL3A和/或RPL3B)的方法，所述方法包括将植物或植物部分中内源性RPL3基因中的靶位点与腺苷碱基编辑系统接触，该系统包括腺苷脱氨酶和与内源性RPL3中的靶位点结合的核酸结合域基因，其中内源性RPL3基因：(a)包含与SEQ ID NO：72、73、75、76、78、79、80、81、83、84、86或87的核苷酸序列之任一个具有至少80％序列同一性的序列；(b)包含与SEQ ID NO：89～139之任一个具有至少80％的同一性的区；和/或(c)编码与SEQ ID NO：74、77、82、85或88之任一个具有至少80％序列同一性的氨基酸序列，从而编辑植物或其部分中的内源性RPL3基因，并产生包含至少一个具有内源性RPL3基因突变的细胞的植物或其部分。

在一些实施方案中，突变可以是替换、插入和/或缺失，任选地，其中插入或缺失是框外插入或框外缺失。在一些实施方案中，突变可以包括对A、T、G或C的碱基替换。在一些实施方案中，突变可以是非天然突变。在一些实施方案中，突变可以是约1bp～约100个连续碱基对的缺失(例如框外缺失)，任选地为1～约50个连续碱基对，1～约30个连续碱基对，或1～约15个连续碱基对。在一些实施方案中，突变可以是至少一个碱基对的插入(例如，框外插入)(例如，1个碱基对～约16个碱基对；例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16个连续碱基对，任选地1、2、4、5、7、8、9、10、11、13或14个连续碱基对)。RPL3基因中的突变可以位于RPL3基因的5'区，任选地，其中突变可以位于编码RPL3多肽的内源性RPL3基因的部分或区内(例如，编码区(外显子))。在一些实施方案中，RPL3基因中的突变可以位于RPL3基因的外显子3中或附近。本文中使用的“在外显子3中或附近”是指RPL3基因外显子3的5'或3'区中的1～约110个连续核苷酸(例如，在与外显子3相邻的5'或3'中约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100个连续核苷酸)。在一些实施方案中，作为框外缺失或框外插入的RPL3基因突变可导致截短的多肽和/或可导致很少或无可检测到的多肽。在一些实施方案中，框外缺失或框外插入可以是无效突变。在一些实施方案中，框外缺失或框外插入可以位于RPL3基因的5'区(例如，在外显子3中或附近)，这导致提早终止密码子(例如，框外碱基插入或框外碱基缺失)和截短的RPL3多肽，任选地导致很少或无可检测到的RPL3多肽，任选地导致无功能的RPL3多肽。

在一些实施方案中，本发明的方法可以导致突变的RPL3基因与SEQ ID NO：147、149、151、153或155中的任何一种具有至少90％的序列同一性和/或编码的突变的RPL3多肽与SEQ ID NO：148、150、152、154或156中的任何一种具有至少90％的序列同一性。

在一些实施方案中，本发明提供了生产包含内源性核糖体蛋白L3(RPL3)基因突变的植物的方法(例如，RPL3A基因、RPL3A-1基因、RPL3A-2基因、RPL3A-3基因、RPL3B基因、RPL3B-1基因、RPL3B-2基因和/或RPL3B-3基因)和至少一个目标多核苷酸，所述方法包括将包含内源性RPL3基因中至少一个突变的本发明植物(第一植物)与包含至少一个目标多核苷酸的第二植物杂交以产生后代植物；并选择包含RPL3基因中的至少一个突变和至少一个目标多核苷酸的后代植物，从而产生包含内源性RPL3基因突变和至少一个目标多核苷酸的植物。

本发明还提供了产生包含内源性RPL3基因突变的植物的方法(例如，RPL3A基因、RPL3A-1基因、RPL3A-2基因、RPL3A-3基因、RPL3B基因、RPL3B-1基因、RPL3B-2基因和/或RPL3B-3基因)和至少一个目标多核苷酸，所述方法包括将至少一个目标多核苷酸引入本发明的植物中，所述植物包含RPL3基因中的至少一个突变，从而产生包含RPL3基因中的至少一个突变和至少一个目标多核苷酸的植物。在一些实施方案中，所述植物是小麦植物、燕麦植物、大麦植物、斯佩尔特小麦植物。在一些实施方案中，所述植物是小麦植物。

在一些实施方案中，还提供了产生包含内源性RPL3基因突变的植物的方法(例如，RPL3A基因、RPL3A-1基因、RPL3A-2基因、RPL3A-3基因、RPL3B基因、RPL3B-1基因、RPL3B-2基因和/或RPL3B-3基因)并表现出改进的产量性状、改进的植物结构和/或改进的防御性状的表型，所述方法包括将第一植物，所述植物是本发明的植物，其中包含RPL3基因中的至少一个突变，与表现出改进的产量性状、改进的植物结构和/或改进的防御性状的表型的第二植物杂交；并选择包含RPL3基因突变和提高产量性状、改进植物结构和/或改进防御性状表型的后代植物，从而产生包含内源性RP3基因突变的植物，所述植物与对照植物相比，表现出产量性状提高、植物结构和/或防御性状改善的表型。

进一步提供一种控制容器(例如，栽盆或种子盘等)、生长室、温室、田野、娱乐区、草坪或路边的杂草的方法，所述方法包括将除草剂施用于本发明的一个或多个(多株)植物(例如，包含RPL3基因(例如，如本文所述，RPL3A基因、RPL3A-1基因、RPL3A-2基因、RPL3A-3基因、RPL3B基因、RPL3B-1基因、RPL3B-2基因和/或RPL3B-3基因)中的至少一个突变的植物))，其生长在容器、生长室、温室、田野、休闲区、草坪或路边，从而控制生长有一种或多种植物的容器，生长室、温室、田野、休闲区、草坪或路边的杂草。

在一些实施方案中，提供了减少昆虫对植物捕食的方法，所述方法包括将杀虫剂施用于本发明的一种或多种植物，任选地，其中，一种或多种植物生长在容器、生长室、温室、田野、休闲区、草坪或路边，从而减少昆虫对一种或多种植物的捕食。

在一些实施方案中，提供了减少植物真菌病害的方法，所述方法包括将杀菌剂施用于本发明的一种或多种植物，任选地，其中一种或多种植物生长在容器、生长室、温室、田野、休闲区、草坪或路边，从而减少一种或多种植物上的真菌病害。

目标多核苷酸可以是可以赋予植物所需表型或以其他方式改变表型或基因型的任何多核苷酸。在一些实施方案中，目标多核苷酸可以是赋予除草剂耐受性、抗虫性、线虫抗性、抗病性、增加产量、增加营养利用效率或非生物胁迫抗性的多核苷酸。

因此，根据本发明偏好处理的植物或植物栽培品种包括所有通过基因改造获得遗传物质的植物，这些遗传物质赋予这些植物特别有利的有用特性(“性状”)。这些特性的例子包括更好的植物生长、活力、抗逆性、站立性、抗倒伏性、养分吸收、植物营养和/或产量，特别是改善生长、提高对高温或低温的耐受性、提高对干旱或水或土壤盐度水平的耐受性、提高开花性能、更容易收获、加速成熟、更高的产量、更高的质量和/或更高的收获产品的营养价值，延长收获产品的储存寿命和/或可加工性。

这种特性的进一步例子是对动物和微生物害虫的抵抗力增强，例如对昆虫、蛛形纲动物、线虫、螨虫、蛞蝓和蜗牛的抵抗力，例如，对其在植物中形成的毒素。在编码赋予对此类动物和微生物害虫(特别是昆虫)耐受特性的蛋白质的DNA序列中，将特别提到来自苏云金芽孢杆菌的遗传物质，该遗传物质编码文献中广泛描述的Bt蛋白，并为本领域技术人员所熟知。还将提及从细菌中提取的蛋白质，例如Photorhabdus(WO97/17432和WO98/08932)。特别要提及Bt Cry或VIP蛋白，包括CrylA、CryIAb、CryIAc、CryIIA、CryIIIA、CryIIIB2、Cry9c、Cry2Ab、Cry3Bb和CryIF蛋白或其毒性片段，以及它们的杂交体或组合，特别是CrylF蛋白或源自CrylF蛋白的杂交体(例如杂交CrylA-CrylF蛋白或其毒性片段)，CrylA型蛋白或其毒性片段，优选CrylAc蛋白或源自CrylAc蛋白的杂交体(例如杂交CrylAb-CrylAc蛋白)或CrylAb或Bt2蛋白或其毒性片段，Cry2Ae、Cry2Af或Cry2Ag蛋白或其毒性片段，CrylA.105蛋白或其毒性片段，VIP3Aa19蛋白，VIP3Aa20蛋白，在COT202或COT203棉花事件中产生的VIP3A蛋白，如Estruch et al.(1996),Proc Natl Acad Sci US A.28；93(11):5389-94中所述的VIP3Aa蛋白或其毒性片段，WO2001/47952中描述的Cry蛋白，来自致病杆菌属(如WO98/50427中所述)、沙雷氏菌(特别是来自嗜虫沙雷氏菌)或光杆状菌属物种菌株的杀虫蛋白，例如WO98/08932中描述的来自光杆状菌属的Tc蛋白。此外，这些蛋白质中任何一种的变体或突变体在某些氨基酸(1～10，优选1～5)上与上述任何命名序列不同，特别是它们的毒性片段的序列，或与转运肽融合的蛋白质，例如质体转运肽，或其他蛋白质或肽，也包括在本文中。

这种特性的另一个特别强调的例子是赋予对一种或多种除草剂的耐受性，例如咪唑啉酮、磺脲类、草甘膦或草胺膦。在编码蛋白质(即目标多核苷酸)的DNA序列中，这些蛋白质赋予转化植物细胞和植物对某些除草剂的耐受性，将特别提到WO2009/152359中描述的bar或PAT基因或天蓝色链霉菌基因，它赋予对草铵膦除草剂的耐受性，编码合适的EPSPS(5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸-合酶)的基因，它赋予对以EPSPS为目标的除草剂的耐受性，特别是除草剂，如草甘膦及其盐类、编码草甘膦-n-乙酰转移酶的基因或编码草甘膦氧化还原酶的基因。其他合适的除草剂耐受性状包括至少一种ALS(乙酰乳酸合酶)抑制剂(例如，WO2007/024782)、突变的拟南芥ALS/AHAS基因(例如，美国专利6,855,533)、编码2,4-D-单加氧酶的基因，赋予对2,4-D(2,4-二氯苯氧乙酸)的耐受性和编码麦草畏单加氧酶的基因，赋予对麦草畏(3,6-二氯-2-甲氧基苯甲酸)的耐受性。

这种特性的其他例子是对植物病原真菌、细菌和/或病毒的抵抗力增加，例如，由于系统获得性抗性(SAR)、系统素、植物抗毒素、激发剂以及抗性基因和相应表达的蛋白质和毒素。

在转基因植物或植物栽培品种中特别有用的转基因事件，可以按照本发明偏好处理，包括事件531/PV-GHBK04(棉花，昆虫控制，WO2002/040677描述)，事件1143-14A(棉花，昆虫控制，未存放，WO2006/128569描述)；事件1143-51B(棉花，昆虫控制，未存放，在WO2006/128570中描述)；事件1445(棉花、耐除草剂、未存放，在US-A 2002-120964或WO2002/034946中描述)；事件17053(水稻，除草剂耐受性，以PTA-9843的形式存放，在WO2010/117737中描述)；事件17314(水稻、除草剂耐受性，以PTA-9844的形式存放，在WO2010/117735中描述)；事件281-24-236(棉花、昆虫控制-除草剂耐受性，以PTA-6233的形式存放，在WO2005/103266或US-A 2005-216969中描述)；事件3006-210-23(棉花、昆虫控制-除草剂耐受性，以PTA-6233的形式存放，在US-A 2007-143876或WO2005/103266中描述)；事件3272(玉米，品质性状，以PTA-9972的形式存放，在WO2006/098952或US-A 2006-230473中描述)；事件33391(小麦、除草剂耐受性，以PTA-2347形式存放，在WO2002/027004中描述)，事件40416(玉米、昆虫控制-除草剂耐受性，以ATCC PTA-11508形式存放，在WO11/075593中描述)；事件43A47(玉米、昆虫控制-除草剂耐受性，以ATCC PTA-11509存放，在WO2011/075595中描述)；事件5307(玉米、昆虫控制，以ATCC PTA-9561存放，在WO2010/077816中描述)；事件ASR-368(常绿草，耐除草剂，以ATCC PTA-4816的形式存放，在US-A2006-162007或WO2004/053062中描述)；事件B16(玉米、除草剂耐受性、未存放，在US-A2003-126634中描述)；事件BPS-CV127-9(大豆、除草剂耐受性，以NCIMB No.41603存放，在WO2010/080829中描述)；事件BLRl(油菜，恢复雄性不育，以NCIMB 41193存放，在WO2005/074671中描述)，事件CE43-67B(棉花，昆虫控制，以DSMACC2724存放，在US-A 2009-217423或WO2006/128573中描述)；事件CE44-69D(棉花、昆虫控制、未存放，在US-A2010-0024077中描述)；事件CE44-69D(棉花，昆虫控制，未存放，WO2006/128571中描述的)；事件CE46-02A(棉花，昆虫控制，未存放，WO2006/128572中描述的)；事件COT102(棉花、昆虫控制、未存放，在US-A 2006-130175或WO2004/039986中描述)；事件COT202(棉花、昆虫控制、未存放，在US-A 2007-067868或WO2005/054479中描述)；事件COT203(棉花，昆虫控制，未存放，在WO2005/054480中描述)；)；事件DAS21606-3/1606(大豆、除草剂耐受性，以PTA-11028的形式存放，在WO2012/033794中描述)，事件DAS40278(玉米、除草剂耐受性，以ATCC PTA-10244的形式存放，在WO2011/022469中描述)；事件DAS-44406-6/pDAB8264.44.06.l(大豆、除草剂耐受性，以PTA-11336形式存放，在WO2012/075426中描述)，事件DAS-14536-7/pDAB8291.45.36.2(大豆、除草剂耐受性，以PTA-11335形式存放，在WO2012/075429中描述)，事件DAS-59122-7(玉米、昆虫控制-除草剂耐受性，以ATCC PTA 11384形式存放，在US-A 2006-070139中描述)；事件DAS-59132(玉米、昆虫控制-除草剂耐受性，未存放，在WO2009/100188中描述)；事件DAS68416(大豆、除草剂耐受性，以ATCC PTA-10442形式存放，在WO2011/066384或WO2011/066360中描述)；事件DP-098140-6(玉米，除草剂耐受性，以ATCC PTA-8296存放，在US-A 2009-137395或WO 08/112019中描述)；事件DP-305423-1(大豆，质量性状，未存放，在US-A 2008-312082或WO2008/054747中描述)；事件DP-32138-1(玉米，杂交系统，以ATCC PTA-9158的形式存放，在US-A 2009-0210970或WO2009/103049中描述)；事件DP-356043-5(大豆，除草剂耐受性，以ATCC PTA-8287存放，在US-A 2010-0184079或WO2008/002872中描述)；事件EE-I(茄子，昆虫控制，未存放，WO 07/091277中描述)；事件Fil 17(玉米，耐除草剂，以ATCC 209031存放，在US-A 2006-059581或WO 98/044140中描述)；事件FG72(大豆、除草剂耐受性，以PTA-11041形式存放，在WO2011/063413中描述)，事件GA21(玉米、除草剂耐受性，以ATCC 209033存放，在US-A 2005-086719或WO 98/044140中描述)；事件GG25(玉米，除草剂耐受性，以ATCC 209032的形式存放，在US-A 2005-188434或WO98/044140中描述)；事件GHB119(棉花，昆虫控制-除草剂耐受性，以ATCC PTA-8398的形式存放，在WO2008/151780中描述)；事件GHB614(棉花，耐除草剂，以ATCC PTA-6878形式存放，在US-A 2010-050282或W02007/017186中描述)；事件GJ11(玉米，除草剂耐受性，以ATCC209030存放，在US-A 2005-188434或WO98/044140中描述)；事件GM RZ13(甜菜，病毒抗性，存放为NCIMB-41601，在WO2010/076212中描述)；事件H7-l(甜菜，耐除草剂，存放为NCIMB41158或NCIMB 41159，在US-A 2004-172669或WO 2004/074492中描述)；事件JOPLINl(小麦，抗病性，未存放，在US-A 2008-064032中描述)；事件LL27(大豆、除草剂耐受性，以NCIMB41658的形式存放，在WO2006/108674或US-A 2008-320616中描述)；事件LL55(大豆、除草剂耐受性，以NCIMB 41660存放，在WO 2006/108675或US-A 2008-196127中描述)；事件LLcotton25(棉花，耐除草剂，以ATCC PTA-3343的形式存放，在WO2003/013224或US A2003-097687中描述)；事件LLRICE06(水稻、耐除草剂，以ATCC 203353形式存放，在US 6,468,747或WO2000/026345中描述)；事件LLRice62(水稻，耐除草剂，以ATCC 203352沉积，在WO2000/026345中描述)，事件LLRICE601(水稻，耐除草剂，以ATCC PTA-2600存放，在US-A2008-2289060或WO2000/026356中描述)；事件LY038(玉米，品质性状，以ATCC PTA-5623形式存放，在US-A 2007-028322或WO2005/061720中描述)；事件MIR162(玉米、昆虫控制，以PTA-8166的形式存放，在US-A 2009-300784或WO2007/142840中描述)；事件MIR604(玉米、昆虫控制，未存放，在US-A 2008-167456或WO2005/103301中描述)；事件MON15985(棉花、昆虫控制，以ATCC PTA-2516的形式存放，在US-A 2004-250317或WO2002/100163中描述)；事件MON810(玉米、昆虫控制，未存放，在US-A 2002-102582中描述)；事件MON863(玉米、昆虫控制，以ATCC PTA-2605的形式存放，在WO2004/011601或US-A 2006-095986中描述)；事件MON87427(玉米，授粉控制，以ATCC PTA-7899存放，在WO2011/062904中描述)；事件MON87460(玉米，抗逆性，以ATCC PTA-8910形式存放，在WO2009/111263或US-A 2011-0138504中描述)；事件MON87701(大豆、昆虫控制，以ATCC PTA-8194存放，在US-A 2009-130071或WO2009/064652中描述)；事件MON87705(大豆，质量性状-除草剂耐受性，以ATCCPTA-9241的形式存放，在US-A 2010-0080887或WO2010/037016中描述)；事件MON87708(大豆、除草剂耐受性，以ATCC PTA-9670存放，在WO2011/034704中描述)；事件MON87712(大豆，产量，以PTA-10296形式存放，在WO2012/051199中描述)，事件MON87754(大豆，质量性状，以ATCC PTA-9385存放，在WO2010/024976中描述)；事件MON87769(大豆，品质性状，以ATCCPTA-8911形式存放，在US-A2011-0067141或WO2009/102873中描述)；事件MON88017(玉米、昆虫控制-除草剂耐受性，以ATCC PTA-5582的形式存放，在US-A 2008-028482或WO2005/059103中描述)；事件MON88913(棉花，耐除草剂，以ATCC PTA-4854形式存放，在WO2004/072235或US-A 2006-059590中描述)；事件MON88302(油菜、除草剂耐受性，以PTA-10955形式存放，在WO2011/153186中描述)、事件MON88701(棉花、耐除草剂，以PTA-11754形式存放，在WO2012/134808中描述)、事件MON89034(玉米、昆虫控制，以ATCC PTA-7455形式存放，在WO 07/140256或US-A2008-260932中描述)；事件MON89788(大豆、除草剂耐受性，以ATCCPTA-6708的形式存放，在US-A 2006-282915或WO2006/130436中描述)；事件MSl 1(油菜，授粉控制-除草剂耐受性，以ATCC PTA-850或PTA-2485的形式存放，在WO2001/031042中描述)；事件MS8(油菜，授粉控制-除草剂耐受性，以ATCC PTA-730的形式存放，在WO2001/041558或US-A 2003-188347中描述)；事件NK603(玉米，除草剂耐受性，以ATCC PTA-2478的形式存放，在US-A 2007-292854中描述)；事件PE-7(水稻、昆虫控制、未存放，WO2008/114282中描述的)；事件RF3(油菜，授粉控制-除草剂耐受性，以ATCC PTA-730的形式存放，在WO2001/041558或US-A2003-188347中描述)；事件RT73(油菜、除草剂耐受性、未存放，在WO2002/036831或US-A 2008-070260中描述)；事件SYHT0H2/SYN-000H2-5(大豆，除草剂耐受性，以PTA-11226的形式存放，在WO2012/082548中描述)，事件T227-1(甜菜，耐除草剂，未存放，在WO2002/44407或US-A 2009-265817中描述)；事件T25(玉米、除草剂耐受性、未存放，在US-A 2001-029014或WO2001/051654中描述)；事件T304-40(棉花，昆虫控制-除草剂耐受性，存放为ATCC PTA-8171，在US-A2010-077501或WO2008/122406中描述)；事件T342-142(棉花，昆虫控制，未存放，WO2006/128568中描述的)；事件TC1507(玉米、昆虫控制-除草剂耐受性，未存放，在US-A 2005-039226或WO2004/099447中描述)；事件VIP1034(玉米、昆虫防治-除草剂耐受性，以ATCC PTA-3925存放，在WO2003/052073中描述)，事件32316(玉米、昆虫防治-除草剂耐受性，以PTA-11507存放，在WO2011/084632中描述)，事件4114(玉米、昆虫防治-除草剂耐受性，以PTA-11506存放，在W02011/084621中描述)，事件EE-GM3/FG72(大豆，除草剂耐受性，ATCC登录号PTA-11041)任选地与事件EE-GM1/LL27或事件EE-GM2/LL55(WO2011/063413A2)堆放、事件DAS-68416-4(大豆、除草剂耐受性、ATCC登录号PTA-10442，WO2011/066360Al)，事件DAS-68416-4(大豆，除草剂耐受性，ATCC登录号PTA-10442，WO2011/066384Al)，事件DP-040416-8(玉米，昆虫控制，ATCC登录号PTA-11508，WO2011/075593Al)，事件DP-043A47-3(玉米，昆虫控制，ATCC登录号PTA-11509，WO2011/075595Al)，事件DP-004114-3(玉米，昆虫防治，ATCC登录号PTA-11506，WO2011/084621Al)，事件DP-032316-8(玉米，昆虫控制，ATCC登录号PTA-11507，WO2011/084632Al)，事件MON-88302-9(油菜，除草剂耐受性，ATCC登录号PTA-10955、WO2011/153186Al)、事件DAS-21606-3(大豆、除草剂耐受性、ATCC登录号PTA-11028，WO2012/033794A2)，事件MON-87712-4(大豆，质量性状，ATCC登录号PTA-10296，WO2012/051199A2)，事件DAS-44406-6(大豆，堆叠除草剂耐受性，ATCC登录号PTA-11336，WO2012/075426Al)，事件DAS-14536-7(大豆，堆叠除草剂耐受性，ATCC登录号PTA-11335，WO2012/075429Al)，事件SYN-000H2-5(大豆，除草剂耐受性，ATCC登录号PTA-11226，WO2012/082548A2)，事件DP-061061-7(油菜，除草剂耐受性，无保藏号，WO2012071039Al)，事件DP-073496-4(油菜，除草剂耐受性，无保藏号，US2012131692)，事件8264.44.06.1(大豆，堆叠除草剂耐受性，登录号PTA-11336，WO2012075426A2)，事件8291.45.36.2(大豆，堆叠除草剂耐受性，登录号PTA-11335，WO2012075429A2)，事件SYHT0H2(大豆，ATCC登录号PTA-11226，WO2012/082548A2)，事件MON88701(棉花，ATCC登录号PTA-11754，WO2012/134808Al)，事件KK179-2(紫花苜蓿，ATCC登录号PTA-11833，WO2013/003558Al)，事件pDAB8264.42.32.1(大豆，堆叠除草剂耐受性，ATCC登录号PTA-11993，WO2013/010094Al)，事件MZDT09Y(玉米，ATCC登录号PTA-13025，WO2013/012775Al)。

赋予所讨论的所需性状的基因/事件(例如，目标多核苷酸)也可能在转基因植物中彼此结合存在。可以提到的转基因植物的例子是重要的农作物，如谷物(小麦、水稻、黑小麦、大麦、黑麦、燕麦)、玉米、大豆、土豆、甜菜、甘蔗、西红柿、豌豆和其他类型的蔬菜、棉花、烟草、油菜以及水果植物(水果苹果、梨、柑橘类水果和葡萄)，特别强调玉米，大豆、小麦、大米、马铃薯、棉花、甘蔗、烟草和油菜。特别强调的特征是植物对昆虫、蛛形纲动物、线虫、蛞蝓和蜗牛的抵抗力增加，以及植物对一种或多种除草剂的抵抗力增加。

可以按照本发明偏好处理的此类植物、植物部分或植物种子的市售实例包括以GENUITY、RIB ROUNDUP VTDOUBLE VT TRIPLE BOLLGARD ROUNDUP READY 2 ROUNDUP 2XTENDTM、INTACTA RR2 VISTIVE 和/或XTENDFLEX^TM商品名称来销售或分销的商业产品，例如植物种子。

可用于本发明的核糖体蛋白L3(RPL3)基因(例如，RPL3A和/或RPL3B)包括任何内源性RPL3基因，其中本文描述的突变可以与无至少一种突变的植物相比(例如，同基因植物(例如，野生型未编辑的植物或空分离株)，赋予一种或多种表型(1)单端孢霉烯霉菌毒素与由突变的RPL3基因编码的RPL3多肽的结合减少，(2)对脱氧雪腐镰孢菌烯醇(DON)的耐受性增加，(3)对镰孢菌头枯病(FHB)的抵抗力/耐受性增加(例如，对FHB病原体禾谷镰孢菌(Fusarium graminearum)的抵抗力增加，和/或FHB症状减轻)，(4)减少禾谷镰孢菌(Fusarium graminearum)负荷，和/或(5)感染禾谷镰孢菌(Fusarium graminearum)时产生积累较少单端孢霉烯霉菌毒素(例如，DON)的种子。

在一些实施方案中，内源性RPL3基因(a)包含与SEQ ID NO:：72、73、75、76、78、79、80、81、83、84、86或87的核苷酸序列之任一个具有至少80％序列同一性的序列；(b)包含与SEQ ID NO：89～139之任一个具有至少80％的同一性的区；和/或(c)编码与SEQ ID NO：74、77、82、85或88之任一个具有至少80％同一性的氨基酸序列。

在一些实施方案中，植物中内源性RPL3基因中的至少一个突变可以是碱基替换、碱基缺失和/或碱基插入，任选地是非天然突变。在一些实施方案中，植物中内源性RPL3基因的至少一个突变可导致植物具有以下表型：(1)单端孢霉烯霉菌毒素与由突变的RPL3基因编码的RPL3多肽的结合减少(2)对脱氧雪腐镰孢菌烯醇(DON)的耐受性增加，(3)对镰孢菌头枯病(FHB)的抗性/耐受性增加(例如，对FHB病原体禾谷镰孢菌(Fusariumgraminearum)的抵抗力增加，和/或FHB症状减轻)，(4)减少禾谷镰孢菌(Fusariumgraminearum)负荷，和/或(5)感染禾谷镰孢菌(Fusarium graminearum)时产生积累较少单端孢霉烯霉菌毒素(例如，DON)的种子，与无至少一种突变的植物(例如，同基因植物(例如，野生型未编辑的植物或空分离株)。

在一些实施方案中，内源性RPL3基因中的突变可以是碱基替换、碱基缺失和/或至少1个碱基对的碱基插入。在一些实施方案中，碱基缺失可以是1个核苷酸～约100个连续核苷酸(例如，约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100个碱基对，或其中的任何范围或值，例如，1～约50个碱基对、1～约30个碱基对、1～约15个碱基对，或其中的任何范围或值)，任选地，当突变位于约2～约100个连续核苷酸处时(例如，2～约50、60、70、80或更多连续碱基对，2～约30个连续碱基对，2～约15个连续碱基对))。在一些实施方案中，内源性RPL3基因中的突变可以是RPL3核酸的1～约16个核苷酸的碱基插入，任选地1～16个连续核苷酸(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16个核苷酸)。在一些实施方案中，内源性RPL3基因中的突变可以是导致截短的RPL3蛋白(例如，截短的核糖体蛋白L3(RPL3)多肽)的框外插入或框外缺失，或很少或无可检测到的RPL3蛋白，和/或RPL3多肽在其与单端孢霉烯霉菌毒素(例如，DON)结合的能力中无功能，任选地，其中突变导致本文中描述的一种或多种表型。在一些实施方案中，至少一个突变可以是碱基替换，也可以是A、T、G或C的替换。可用于本发明的突变可能是点突变。在一些实施方案中，突变可以是非天然突变。

在一些实施方案中，内源性RPL3基因的突变可以在切割后通过编辑系统进行，该系统包括核酸酶和与靶核酸内的靶位点(例如，RPL3基因，例如RPL3A基因、RPL3A-1基因、RPL3A-2基因、一个RPL3A-3基因、RPL3B基因、RPL3B-1基因、RPL3B-2基因和/或RPL3B-3基因)结合的核酸结合域，靶核酸包含与SEQ ID NO：72、73、75、76、78、79、80、81、83、84、86或87之任一个核苷酸序列具有至少80％的序列同一性的序列，和/或编码与SEQ ID NO：74、77、82、85或88之任一个核苷酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列，其中任选地，所述靶位点位于RPL3基因的区：该区包含的序列与SEQ ID NO：89～139之任一个具有至少80％同一性。

在一些实施方案中，如本文所述的突变可导致突变的RPL3基因与SEQ ID NO：147、149、151、153或155之任一个具有至少90％的序列同一性和/或编码的突变的RPL3多肽与SEQ ID NO：148、150、152、154或156之任一个具有至少90％的序列同一性。在一些实施方案中，提供了经修饰的RPL3多肽，其包含与SEQ ID NO：148、150、152、154或156之任一个具有至少90％序列同一性的序列。

进一步提供了与核糖体蛋白L3(RPL3)基因(例如，RPL3A基因、RPL3A-1基因、RPL3A-2基因、RPL3A-3基因、RPL3B基因、RPL3B-1基因、RPL3B-2基因和/或RPL3B-3基因)中的靶位点结合的向导核酸(例如，gRNA、gDNA、crRNA、crDNA)，其中靶位点位于与SEQ ID NO：89～139之任一个核苷酸序列具有至少80％的序列同一性的RPL3基因中的区。在一些实施方案中，所述向导核酸包含包含SEQ ID NO：140～146的任意一个或多个核苷酸序列的间隔子，或其反向互补。

在一些实施方案中，提供了小麦植株或其部分(Triticum aestivum)，其包含至少一个内源性核糖体蛋白L3(RPL3)基因中的一个突变，该基因的基因识别号(gene ID)为TraesCS4A02G208000(SEQ ID NO：72)、TraesCS4B02G111500(SEQ ID NO：75)、TraesCS4D02G109200(SEQ ID NO：78)、TraesCS5A02G112400(SEQ ID NO：80)、TraesCS5B02G118400(SEQ ID NO：83)和/或TraesCS5D02G129200(SEQ ID NO：86)，任选地，其中突变可以是非天然突变。

在一些实施方案中，提供了与核糖体蛋白L3(RPL3)基因中的靶核酸结合的向导核酸，RPL3基因的基因识别号(gene ID)为TraesCS4A02G208000(SEQ ID NO：72)、TraesCS4B02G111500(SEQ ID NO：75)、TraesCS4D02G109200(SEQ ID NO：78)、TraesCS5A02G112400(SEQ ID NO：80)、TraesCS5B02G118400(SEQ ID NO：75)、TraesCS4D02G109200(SEQ ID NO：78)、TraesCS5A02G112400(SEQ ID NO：80)、TraesCS5B02G118400(SEQ ID NO：83)和/或TraesCS5D02G129200(SEQ ID NO：86)。

在一些实施方案中，提供了系统，该系统包括向导核酸，该向导核酸包含具有SEQID NO：140～146之任一项核苷酸序列的间隔子(例如，一个或多个间隔子)或其反向互补，以及与向导核酸结合的CRISPR-Cas效应蛋白。在一些实施方案中，该系统还可以包括与向导核酸结合的tracr核酸和CRISPR-Cas效应蛋白，其中tracr核酸和向导核酸共价连接。

如本文所用，“与向导核酸结合的CRISPR-Cas效应蛋白”是指CRISPR-Cas效应蛋白和向导核酸之间形成的复合物，以便将CRISPR-Cas效应蛋白引导至基因中的靶位点。

本发明还提供一种基因编辑系统，该系统包含与向导核酸结合的CRISPR-Cas效应蛋白，并且向导核酸包含与内源性RPL3基因结合的间隔序列，任选地其中内源性RPL3(a)包含与SEQ ID NO：72、73、75、76、78、79、80、81、83、84、86或87的核苷酸序列之任一个具有至少80％序列同一性的序列；(b)包含与SEQ ID NO：89～139之任一个具有至少80％的同一性的区；和/或(c)编码与SEQ ID NO：74、77、82、85或88具有至少80％的序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，向导核酸的间隔序列可以包含SEQ ID NO：140～146之任一个核苷酸序列，或其反向互补。在一些实施方案中，基因编辑系统还可以包括与向导核酸结合的tracr核酸和CRISPR-Cas效应蛋白，其中tracr核酸和向导核酸共价连接。

本发明还提供一种复合物，该复合物包含CRISPR-Cas效应蛋白，该效应蛋白包含切割结构域和向导核酸，其中，向导核酸与内源性RPL3基因中的靶位点结合，其中，内源性RPL3基因：(a)包含与SEQ ID NO：72、73、75、76、78、79、80、81、83、84、86或87的核苷酸序列之任一个具有至少80％序列同一性的序列；(b)包含与SEQ ID NO：89～139之任一个具有至少80％的同一性的区；和/或(c)编码与SEQ ID NO：74、77、82、85或88具有至少80％的序列同一性的氨基酸序列，并且切割结构域切割RPL3基因中的靶链。

在一些实施方案中，提供表达盒，其包含(a)编码CRISPR-Cas效应蛋白的多核苷酸，该效应蛋白包含切割结构域和(b)与内源性RPL3基因中的靶位点结合的向导核酸，其中，向导核酸包含间隔序列，其互补并结合(i)与SEQ ID NO：72、73、75、76、78、79、80、81、83、84、86或87之任一个核苷酸序列具有至少80％序列同一性的核酸部分；(ii)与SEQ IDNO：89～139之任一个核苷酸序列具有至少80％的序列同一性的核酸部分；和/或(iii)编码与SEQ ID NO：74、77、82、85或88具有至少80％的序列同一性氨基酸序列的核酸部分。

还提供了编码突变核糖体蛋白L3(RPL3)多肽(例如，RPL3A、RPL3A-1、RPL3A-2、RPL3A-3、RPL3B、RPL3B-1、RPL3B-2和/或RPL3B-3)的突变核酸，其中任选地，当存在于植物或植物部分时，突变的RPL3多肽/突变的RPL3基因导致植物包含表型的表型(1)单端孢霉烯霉菌毒素与由修饰的RPL3基因编码的RPL3多肽的结合减少，(2)对脱氧雪腐镰孢菌烯醇(DON)的耐受性增加，(3)对(FHB)的抵抗力/耐受性增加(例如，对FHB病原体禾谷镰孢菌(Fusarium graminearum)的抵抗力增加，和/或FHB症状减轻)，(4)减少禾谷镰孢菌(Fusarium graminearum)负荷，和/或(5)感染禾谷镰孢菌(Fusarium graminearum)时产生的种子积累较少的单端孢霉烯霉菌毒素(例如，DON)，与无至少一种突变的植物(例如，同基因植物(例如，野生型未编辑的植物或空分离株))相比。

本发明的核酸构建体(例如，包含序列特异性核酸结合结构域(例如，序列特异性DNA结合结构域)、CRISPR-Cas效应结构域、脱氨酶结构域、逆转录酶(RT)、RT模板和/或向导核酸等)和包含相同的表达盒/载体可用作本发明的编辑系统，用于修饰目标核酸(例如，内源性RPL3基因，例如，内源性RPL3A基因、内源性RPL3A-1基因、内源性RPL3A-2基因、内源性RPL3A-3基因、内源性RPL3B基因、内源性RPL3B-1基因、内源性RPL3B-2基因、内源性RPL3B-3基因)和/或其表达。

任何包含内源性RPL3基因的植物，能够赋予以下至少一种表型：(1)减少单端孢霉烯霉菌毒素与由修饰的RPL3基因编码的RPL3多肽的结合，(2)增加对脱氧雪腐镰孢菌烯醇(DON)的耐受性，(3)增加对(FHB)的抗性/耐受性(例如，增加对FHB病原体，禾谷镰孢菌(Fusarium graminearum)的抗性和/或减少FHB症状)，(4)减少禾谷镰孢菌(Fusariumgraminearum)负荷，和/或(5)按照本文所述进行修饰时(以及感染禾谷镰孢菌(Fusariumgraminearum)时)，产生的种子积累较少的单端孢霉烯霉菌毒素(例如，DON)，与无至少一种突变的植物(例如，同基因植物(例如，野生型未编辑的植物或空分离株)相比。如本文所述(例如，使用本发明的多肽、多核苷酸、RNP、核酸构建体、表达盒和/或载体)这些内源性RPL3基因可以被修饰(例如突变，例如碱基编辑、切割、切口等)以改善植物中的一种或多种产量性状。

可用于本发明的编辑系统可以是现在已知或之后开发的任何位点特异性(序列特异性)基因组编辑系统，该系统可以以靶标特异性方式引入突变。例如，编辑系统(例如，位点或序列特异性编辑系统)可以包括但不限于CRISPR-Cas编辑系统、巨核酸酶编辑系统、锌指核酸酶(ZFN)编辑系统、转录激活因子样效应核苷酸酶(TALEN)编辑系统、碱基编辑系统和/或引物编辑系统，每个系统都可以包含一个或多个多肽和/或一个或多个多核苷酸，当在细胞中作为系统表达时可以以序列特异性方式修饰(突变)目标核酸。在一些实施方案中，编辑系统(例如，位点特异性或序列特异性编辑系统)可以包含一个或多个多核苷酸和/或一个或多个多肽，包括但不限于核酸结合结构域(DNA结合结构域)、核酸酶和/或其他多肽，和/或多核苷酸。

在一些实施方案中，编辑系统可以包含一个或多个序列特异性核酸结合域(DNA结合域)，这些结合域可以来自例如多核苷酸引导的核酸内切酶、CRISPR-Cas核酸内切酶(例如CRISPR-Cas效应蛋白)、锌指核酸酶、转录激活因子样效应核酸酶(TALEN)和/或Argonaute蛋白。在一些实施方案中，编辑系统可以包含一个或多个切割结构域(例如核酸酶)，包括但不限于核酸内切酶(例如Fok1)、多核苷酸引导的核酸内切酶、CRISPR-Cas核酸内切酶(例如CRISPR-Cas效应蛋白)、锌指核酸酶和/或转录激活因子样效应核酸酶(TALEN)。在一些实施方案中，编辑系统可以包含一个或多个多肽，这些多肽包括但不限于脱氨酶(例如，胞嘧啶脱氨酶、腺嘌呤脱氨酶)、逆转录酶、Dna2多肽和/或5'瓣状核酸内切酶(FEN)。在一些实施方案中，编辑系统可以包含一个或多个多核苷酸，包括但不限于CRISPR阵列(CRISPR向导)核酸、扩展向导核酸和/或逆转录酶模板。

在一些实施方案中，修饰或编辑核糖体蛋白L3(RPL3)基因的方法可以包括将目标核酸(例如，编码核糖体蛋白L3(RPL3)多肽的核酸，例如RPL3A多肽、RPL3B多肽等)与碱基编辑融合蛋白(例如，序列特异性DNA结合蛋白(例如、CRISPR-Cas效应蛋白或结构域)融合至脱氨酶结构域(例如，腺嘌呤脱氨酶和/或胞嘧啶脱氨酶)和向导核酸接触，其中向导核酸能够将碱基编辑融合蛋白引导/靶向到目标核酸，从而编辑目标核酸内的基因座。在一些实施方案中，碱基编辑融合蛋白和向导核酸可以包含在一个或多个表达盒中。在一些实施方案中，目标核酸可以与碱基编辑融合蛋白和包含向导核酸的表达盒接触。在一些实施方案中，序列特异性核酸结合融合蛋白和向导可以作为核糖核蛋白(RNP)提供。在一些实施方案中，一个细胞可以与多个碱基编辑融合蛋白和/或一个或多个向导核酸接触，这些向导核酸可以靶向细胞中的一个或多个靶核酸。

在一些实施方案中，修饰或编辑核糖体蛋白L3(RPL3)基因的方法可以包括将目标核酸(例如，编码RPL3多肽的核酸)与序列特异性核酸结合融合蛋白(例如，与肽标签融合的序列特异性DNA结合蛋白(例如，CRISPR-Cas效应蛋白或结构域)，一种脱氨酶融合蛋白，包含脱氨酶结构域(例如，腺嘌呤脱氨酶和/或胞嘧啶脱氨酶)，与能够与肽标签结合的亲和多肽融合，以及向导核酸接触，其中，向导核酸能够引导/靶向序列特异性核酸结合融合蛋白到目标核酸，并且序列特异性核酸结合融合蛋白能够募集脱氨酶融合蛋白通过肽标签-亲和多肽相互作用到目标核酸，从而在目标核酸内编辑一个基因座。在一些实施方案中，序列特异性核酸结合融合蛋白可以与结合肽标签的亲和多肽融合，脱氨酶可以与肽标签融合，从而将脱氨酶募集到序列特异性核酸结合融合蛋白和目标核酸上。在一些实施方案中，序列特异性结合融合蛋白、脱氨酶融合蛋白和向导核酸可以包含在一个或多个表达盒中。在一些实施方案中，目标核酸可以与序列特异性结合融合蛋白、脱氨酶融合蛋白和包含向导核酸的表达盒接触。在一些实施方案中，序列特异性核酸结合融合蛋白、脱氨酶融合蛋白和向导可以作为核糖核蛋白(RNP)提供。

在一些实施方案中，可以使用诸如引物编辑之类的方法在内源性RPL3基因中产生突变。在引物编辑中，RNA依赖性DNA聚合酶(逆转录酶，RT)和逆转录酶模板(RT模板)与序列特异性核酸结合结构域结合使用，赋予以序列特异性方式识别和结合靶标的能力，并且还可导致靶标内含PAM的链出现缺口。核酸结合结构域可以是CRISPR-Cas效应蛋白，在这种情况下，CRISPR阵列或向导RNA可以是扩展向导，其包含包含引物结合位点(PSB)的扩展部分，编辑被掺入基因组(模板)。与碱基编辑类似，引物编辑可以利用募集蛋白质以用于编辑靶位点的各种方法，这些方法包括所选基因组编辑过程中使用的蛋白质和核酸之间的非共价和共价相互作用。

如本文所用，“CRISPR-Cas效应蛋白”是裂解或切割核酸、结合核酸(例如，靶核酸和/或向导核酸)和/或识别、认出或结合本文定义的向导核酸的蛋白质或多肽或其结构域。在一些实施方案中，CRISPR-Cas效应蛋白可以是酶(例如核酸酶、核酸内切酶、切口酶等)或其部分和/或可以作为酶发挥作用。在一些实施方案中，CRISPR-Cas效应蛋白是指包含核酸酶活性或其中核酸酶活性已被降低或消除的CRISPR-Cas核酸酶多肽或其结构域，和/或包含切口酶活性或其中切口酶已被减少或消除，和/或包含单链DNA切割活性(ss DNAse活性)或其中ss DNAse活性已被降低或消除，和/或包含自加工RNAse活性或自加工RNAse活性已被降低或消除。CRISPR-Cas效应蛋白可以与靶核酸结合。

在一些实施方案中，序列特异性核酸结合结构域可以是CRISPR-Cas效应蛋白。在一些实施方案中，CRISPR-Cas效应蛋白可以来自I型CRISPR-Cas系统、II型CRISPR-Cas系统、III型CRISPR-Cas系统、IV型CRISPR-Cas系统、V型CRISPR-Cas系统或VI型CRISPR-Cas系统。在一些实施方案中，本发明的CRISPR-Cas效应蛋白可以来自II型CRISPR-Cas系统或V型CRISPR-Cas系统。在一些实施方案中，CRISPR-Cas效应蛋白可以是II型CRISPR-Cas效应蛋白，例如Cas9效应蛋白。在一些实施方案中，CRISPR-Cas效应蛋白可以是V型CRISPR-Cas效应蛋白，例如Cas12效应蛋白。

在一些实施方案中，CRISPR-Cas效应蛋白可以包括但不限于Cas9、C2c1、C2c3、Cas12a(也称为Cpf1)、Cas12b、Cas12c、Cas12d、Cas12e、Cas13a、Cas13b、Cas13c、Cas13d、Casl、CaslB、Cas2、Cas3、Cas3'、Cas3“、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9(也称为Csnl和Csx12)、Cas10、Csyl、Csy2、Csy3、Csel、Cse2、Cscl、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmrl、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csbl、Csb2、Csb3、Csxl7、Csxl4、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csxl、Csxl5、Csfl、Csf2、Csf3、Csf4(dinG)和/或Csf5核酸酶，其中任选地CRISPR-Cas效应蛋白可以是Cas9、Cas12a(Cpf1)、Cas12b、Cas12c(C2c3)、Cas12d(CasY)、Cas12e(CasX)、Cas12g、Cas12h、Cas12i、C2c4、C2c5、C2c8、C2c9、C2c10、Cas14a、Cas14b和/或Cas14c效应蛋白。

在一些实施方案中，可用于本发明的CRISPR-Cas效应蛋白可以包含其核酸酶活性位点的突变(例如，RuvC、HNH，例如Cas12a核酸酶结构域的RuvC位点；例如，Cas9核酸酶结构域的RuvC位点和/或HNH位点)。CRISPR-Cas效应蛋白的核酸酶活性位点发生突变，因此不再包含核酸酶活性，通常被称为“死亡”，例如dCas。在一些实施方案中，与无突变的相同CRISPR-Cas效应蛋白相比，其核酸酶活性位点发生突变的CRISPR-Cas效应蛋白结构域或多肽具有受损的活性或降低的活性，例如切口酶、Cas9切口酶、Cas12a切口酶。

可用于本发明的CRISPR Cas9效应蛋白或CRISPR Cas9效应结构域可以是任何已知或后来鉴定的Cas9核酸酶。在一些实施方案中，CRISPR Cas9多肽可以是例如来自链球菌属(例如，化脓性链球菌、嗜热链球菌)、乳杆菌属、双歧杆菌属、坎德氏菌属、明串珠菌属、酒类球菌属、片球菌属、魏斯氏菌属和/或欧陆森氏菌属的Cas9多肽。示例Cas9序列包括但不限于SEQ ID NO：59和SEQ ID NO：60的氨基酸序列或SEQ ID NO：61～71的核苷酸序列。

在一些实施方案中，CRISPR-Cas效应蛋白可以是来源于化脓性链球菌的Cas9多肽，并识别PAM序列基序NGG、NAG、NGA(Mali et al,Science 2013；339(6121):823-826)。在一些实施方案中，CRISPR-Cas效应蛋白可以是来源于嗜热链球菌的Cas9多肽，并识别PAM序列基序NGGNG和/或NNAGAAW(W＝A或T)(例如，参见Horvath et al,Science,2010；327(5962):167-170,and Deveau et al,J Bacteriol2008；190(4):1390-1400)。在一些实施方案中，CRISPR-Cas效应蛋白可以是来源于变形链球菌的Cas9多肽，并识别PAM序列基序NGG和/或NAAR(R＝A或G)(参见，例如，Deveau et al，J BACTERIOL 2008；190(4)：1390-1400)。在一些实施方案中，CRISPR-Cas效应蛋白可以是来源于金黄色链球菌的Cas9多肽，并识别PAM序列基序NNGRR(R＝A或G)。在一些实施方案中，CRISPR-Cas效应蛋白可以是来源于金黄色葡萄球菌的Cas9蛋白，其识别PAM序列基序N GRRT(R＝A或G)。在一些实施方案中，CRISPR-Cas效应蛋白可以是来源于金黄色葡萄球菌的Cas9多肽，其识别PAM序列基序NGRRV(R＝A或G)。在一些实施方案中，CRISPR-Cas效应蛋白可以是来源于脑膜炎奈瑟菌并识别PAM序列基序N GATT或N GCTT(R＝A或G，V＝A，G或C)(例如参见Hou et ah，PNAS2013,1-6)。在上述实施方案中，N可以是任何核苷酸残基，例如A、G、C或T之任一个。在一些实施方案中，CRISPR-Cas效应蛋白可以是来源于沙氏纤毛菌的Cas13a蛋白，其识别单个3'A、U或C的原间隔子侧翼序列(PFS)(或RNA PAM(rPAM))序列基序，其可能位于目标核酸内。

在一些实施方案中，CRISPR-Cas效应蛋白可以来源于Cas12a，Cas12a是V型成簇规则间隔短回文重复序列(CRISPR)-Cas核酸酶，例如参见SEQ ID NO：1～20)。Cas12a在几方面与更知名的II型CRISPR Cas9核酸酶不同。例如，Cas9识别一个富含G的原间隔子相邻基序(PAM)，该基序位于其向导RNA(gRNA、sgRNA、crRNA、crDNA、CRISPR阵列)3'处结合位点(原间隔子、靶核酸、靶DNA)(3'-NGG)，而Cas12a识别位于靶核酸5'处的富含T的PAM(5'-TTN、5'-TTTN)。事实上，Cas9和Cas12a结合其向导RNA的方向相对于它们的N和C末端几乎是相反的。此外，Cas12a酶使用单向导RNA(gRNA、CRISPR阵列、crRNA)而不是天然Cas9系统中的双向导RNA(sgRNA(例如，crRNA和tracrRNA))，并且Cas12a处理自己的gRNA。此外，Cas12a核酸酶活性产生交错的DNA双链断裂，而不是Cas9核酸酶活性产生的平末端，Cas12a依赖于单个RuvC结构域切割两条DNA链，而Cas9利用HNH结构域和RuvC结构域进行切割。

可用于本发明的CRISPR Cas12a效应蛋白/结构域可以是任何已知或后来鉴定的Cas12a多肽(以前称为Cpf1)(例如，参见美国专利号9,790,490，该专利因其公开的Cpf1(Cas12a)序列而通过引用并入)。术语“Cas12a”、“Cas12a多肽”或“Cas12a结构域”是指包含Cas12a多肽或其片段的RNA引导核酸酶，其中包含Cas12a的向导核酸结合结构域和/或Cas12a的活性、非活性或部分活性DNA切割结构域。在一些实施方案中，可用于本发明的Cas12a可以包含核酸酶活性位点(例如，Cas12a结构域的RuvC位点)的突变。在其核酸酶活性位点发生突变的Cas12a结构域或Cas12a多肽，因此不再包含核酸酶活性，通常称为死亡Cas12a(例如，dCas12a)。在一些实施方案中，在其核酸酶活性位点发生突变的Cas12a结构域或Cas12a多肽可能具有受损的活性，例如，可能具有切口酶活性。

任何可用于碱基编辑的脱氨酶结构域/多肽都可以与本发明一起使用。在一些实施方案中，脱氨酶结构域可以是胞嘧啶脱氨酶结构域或腺嘌呤脱氨酶结构域。可用于本发明的胞嘧啶脱氨酶(或胞嘧啶脱氨酶)可以是来自任何生物体的任何已知或后来鉴定的胞嘧啶脱氨酶(例如，参见美国专利号10,167,457和Thuronyi等人，Nat.Biotechnol.37：1070-1079(2019)，其中每个均通过引用并入本文，用于其胞嘧啶脱氨酶的公开)。胞嘧啶脱氨酶可以催化胞苷或脱氧胞苷分别水解脱氨为尿苷或脱氧尿苷。因此，在一些实施方案中，可用于本发明的脱氨酶或脱氨酶结构域可以是胞嘧啶脱氨酶结构域，催化胞嘧啶水解脱氨为尿嘧啶。在一些实施方案中，胞嘧啶脱氨酶可以是天然存在的胞嘧啶脱氨酶的变体，包括但不限于灵长类动物(例如，人、猴、黑猩猩、大猩猩)、狗、牛、大鼠或小鼠。因此，在一些实施方案中，本发明有用的胞嘧啶脱氨酶可以与野生型胞嘧啶脱氨酶具有约70％～约100％同一性(例如，与天然存在的胞嘧啶脱氨酶约70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性及其中的任何范围或值)。

在一些实施方案中，可用于本发明的胞嘧啶脱氨酶可以是载脂蛋白B mRNA编辑复合物(APOBEC)家族脱氨酶。在一些实施方案中，胞嘧啶脱氨酶可以是APOBEC1脱氨酶、APOBEC2脱氨酶、APOBEC3A脱氨酶、APOBEC3B脱氨酶、APOBEC3C脱氨酶、APOBEC3D脱氨酶、APOBEC3F脱氨酶、APOBEC3G脱氨酶、APOBEC3H脱氨酶、APOBEC4脱氨酶、人活化诱导脱氨酶(hAID)、rAPOBEC1、FERNY和/或CDA1，任选地pmCDA1、atCDA1(例如，At2g19570)及其演化版本(例如，SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28或SEQ ID NO：29)。在一些实施方案中，胞嘧啶脱氨酶可以是具有SEQ ID NO：23氨基酸序列的APOBEC1脱氨酶。在一些实施方案中，胞嘧啶脱氨酶可以是具有SEQ ID NO：24氨基酸序列的APOBEC3A脱氨酶。在一些实施方案中，胞嘧啶脱氨酶可以是CDA1脱氨酶，任选地是具有SEQ ID NO：25氨基酸序列的CDA1。在一些实施方案中，胞嘧啶脱氨酶可以是FERNY脱氨酶，任选地是具有SEQ ID NO：26氨基酸序列的FERNY。在一些实施方案中，可用于本发明的胞嘧啶脱氨酶可以与天然存在的胞嘧啶脱氨酶的氨基酸序列(例如，进化的脱氨酶)具有约70％～约100％的同一性(例如，70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或100％同一性)。在一些实施方案中，可用于本发明的胞嘧啶脱氨酶可以与SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25或SEQ ID NO：26的氨基酸序列(例如，与SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、SEQID NO：25、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28或SEQ ID NO：29的氨基酸序列具有至少80％、至少90％、至少92％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少99.5％的同一性)具有约70％～约99.5％的同一性(例如，约70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99.5％同一性)。在一些实施方案中，编码胞嘧啶脱氨酶的多核苷酸可以被密码子优化以在植物中表达，并且密码子优化的多肽可以与参考多核苷酸具有约70％～99.5％的同一性。

在一些实施方案中，本发明的核酸构建体可以进一步编码尿嘧啶糖基化酶抑制剂(UGI)(例如，尿嘧啶-DNA糖基化酶抑制剂)多肽/结构域。因此，在一些实施方案中，编码CRISPR-Cas效应蛋白和胞嘧啶脱氨酶结构域的核酸构建体(例如，编码融合蛋白，该融合蛋白包含与胞嘧啶脱氨酶结构域融合的CRISPR-Cas效应蛋白结构域，和/或融合肽标签或融合能够结合肽标签的亲和多肽的CRISPR-Cas效应蛋白结构域和/或融合肽标签或融合能够结合肽标签的亲和多肽的脱氨酶蛋白结构域)可以进一步编码尿嘧啶-DNA糖基化酶抑制剂(UGI)，其中任选地，其中UGI可以针对在植物中的表达进行密码子优化。在一些实施方案中，本发明提供了包含CRISPR-Cas效应多肽、脱氨酶结构域和UGI的融合蛋白和/或编码相同蛋白的一个或多个多核苷酸，其中任选地，其中一个或多个多核苷酸可以针对在植物中的表达进行密码子优化。在一些实施方案中，本发明提供了融合蛋白，其中CRISPR-Cas效应多肽、脱氨酶结构域和UGI可以融合到如本文所述的肽标签和亲和多肽的任意组合上，从而将脱氨酶结构域和UGI募集到CRISPR-Cas效应多肽和目标核酸上。在一些实施方案中，向导核酸可以与募集RNA基序连接，并且脱氨酶结构域和/或UGI中的一个或多个可以与能够与募集RNA基序相互作用的亲和多肽融合，从而将脱氨酶结构域和UGI募集到目标核酸。

本发明有用的“尿嘧啶糖基化酶抑制剂”可以是能够抑制尿嘧啶-DNA糖基化酶碱基切除修复酶的任何蛋白质。在一些实施方案中，UGI结构域包含野生型UGI或其片段。在一些实施方案中，可用于本发明的UGI结构域可以与天然存在的UGI结构域的氨基酸序列具有约70％～约100％相同(例如，70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82、84％、85％、82％、89％、90％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或100％相同以及其中的任何范围或值)。在一些实施方案中，UGI结构域可以包含SEQ ID NO：41的氨基酸序列或与SEQ ID NO：41的氨基酸序列具有约70％～约99.5％序列同一性的多肽(例如，与SEQ ID NO：41的氨基酸序列至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少99.5％同一性)。例如，在一些实施方案中，UGI结构域可以包含SEQ ID NO：41的氨基酸序列片段，该片段与SEQ IDNO：41的氨基酸序列的连续核苷酸的一部分100％相同(例如，10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80个连续核苷酸；例如，约10、15、20、25、30、35、40、45，至约50、55、60、65、70、75、80个连续核苷酸)。在一些实施方案中，UGI结构域可以是已知UGI(例如，SEQ IDNO：41)的变体，与已知的UGI具有约70％～约99.5％的序列同一性(例如，70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％序列同一性以及其中的任何范围或值)。在一些实施方案中，编码UGI的多核苷酸可以针对在植物(例如植物)中表达而进行密码子优化，并且密码子优化的多肽可以与参考多核苷酸具有约70％～约99.5％的同一性。

可用于本发明的腺嘌呤脱氨酶(或腺苷脱氨酶)可以是来自任何生物体的任何已知或后来鉴定的腺嘌呤脱氨酶(例如，参见美国专利号10,113,163，该专利通过引用并入本文以公开其腺嘌呤脱氨酶)。腺嘌呤脱氨酶可以催化腺嘌呤或腺苷的水解脱氨反应。在一些实施方案中，腺嘌呤脱氨酶可以分别催化腺苷或脱氧腺苷的水解脱氨为肌苷或脱氧肌苷。在一些实施方案中，腺苷脱氨酶可以催化DNA中腺嘌呤或腺苷的水解脱氨反应。在一些实施方案中，由本发明的核酸构建体编码的腺嘌呤脱氨酶可以产生目标核酸正义(例如，“+”；模板)链中的A→G转换，或产生目标核酸反义(例如，“-”，互补)链中的T→C转换。

在一些实施方案中，腺苷脱氨酶可以是天然存在的腺嘌呤脱氨酶的变体。因此，在一些实施方案中，腺苷脱氨酶可以与野生型腺嘌呤脱氨酶具有约70％～100％相同(例如，与天然存在的腺嘌呤脱氨酶约70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90、91％、92％、93、94、95％、96％、97％、98％或100％相同，以及其中的任何范围或值)。在一些实施方案中，脱氨酶或脱氨酶在自然界中不存在，并且可以称为工程化的、突变的或进化的腺苷脱氨酶。因此，例如，经过工程改造、突变或进化的腺嘌呤脱氨酶多肽或腺嘌呤脱氨酶结构域可能与天然存在的腺嘌呤脱氨酶多肽/结构域约有70％～99.9％的相同(例如，与天然存在的腺嘌呤脱氨酶多肽或腺嘌呤脱氨酶结构域有约70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％，92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99、99.1、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％同一性及其中的任何范围或值)。在一些实施方案中，腺苷脱氨酶可以来自细菌(例如，大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、流感嗜血杆菌、新月柄杆菌等)。在一些实施方案中，编码腺嘌呤脱氨酶多肽/结构域的多核苷酸可以针对在植物中表达进行密码子优化。

在一些实施方案中，腺嘌呤脱氨酶结构域可以是野生型tRNA特异性腺苷脱氨酶结构域，例如，tRNA特异性腺苷脱氨酶(TadA)和/或突变/进化的腺苷脱氨酶结构域，例如突变/进化的tRNA特异性腺苷脱氨酶结构域(TadA*)。在一些实施方案中，TadA结构域可以来自大肠杆菌。在一些实施方案中，TadA可以被修饰，例如，相对于全长TadA，截短、缺失一个或多个N-末端和/或C-末端氨基酸(例如，相对于全长TadA，可以缺少一个或多个N-末端和/或C-末端氨基酸残基(例如，相对于全长TadA，可以缺少1、2、3、4、5、6、7、7、8、9、10、11、11、12、13、14、15、6、17、18、19或20个N-末端和/或C末端氨基酸残基。在一些实施方案中，TadA多肽或TadA结构域不包含N-末端蛋氨酸。在一些实施方案中，野生型大肠杆菌TadA包含SEQID NO：30的氨基酸序列。在一些实施方案中，突变/进化的大肠杆菌TadA*包含SEQ ID NO：31～40的氨基酸序列(例如，SEQ ID NO：31、32、33、34、35、36、37、38、39或40)。在一些实施方案中，编码TadA/TadA*的多核苷酸可以针对在植物中表达进行密码子优化。

胞嘧啶脱氨酶催化胞嘧啶脱氨并导致胸苷(通过尿嘧啶中间体)，导致基因组互补链中的C到T转换或G到A转换。因此，在一些实施方案中，由本发明的多核苷酸编码的胞嘧啶脱氨酶产生目标核酸的正义(例如，“+”；模板)链中的C→T转换或目标核酸的反义(例如，“-”，互补)链中的G→A转换。

在一些实施方案中，由本发明的核酸构建体编码的腺嘌呤脱氨酶产生靶核酸的正义(例如，“+”；模板)链中的A→G转换或靶核酸的反义(例如，“-”，互补)链中的T→C转换。

本发明的编码碱基编辑器的核酸构建体，其中碱基编辑器包含序列特异性核酸结合蛋白和胞嘧啶脱氨酶多肽，以及编码相同的核酸构建体/表达盒/载体，可以与向导核酸组合使用，用于修饰靶核酸，包括但不限于在靶核酸中产生C→T或G→A突变，包括但不限于质粒序列；在编码序列中产生C→T或G→A突变以改变氨基酸同一性；在编码序列中产生C→T或G→A突变以产生终止密码子；在编码序列中产生C→T或G→A突变以破坏起始密码子；在基因组DNA中产生点突变以破坏功能；和/或在基因组DNA中产生点突变以破坏剪接连接。

本发明的核酸构建体编码碱基编辑器，其包含序列特异性核酸结合蛋白和腺嘌呤脱氨酶多肽，以及编码相同的表达盒和/或载体可以与向导核酸组合使用，以修饰目标核酸，包括但不限于在目标核酸中产生A→G或T→C突变，包括但不限于质粒序列；在编码序列中产生A→G或T→C突变以改变氨基酸同一性；在编码序列中产生A→G或T→C突变以产生终止密码子；在编码序列中产生A→G或T→C突变以破坏起始密码子；在基因组DNA中产生点突变以破坏功能；和/或在基因组DNA中产生点突变以破坏剪接连接。

本发明的核酸构建体包含CRISPR-Cas效应蛋白或其融合蛋白，可以与向导RNA(gRNA、CRISPR阵列、CRISPR RNA、crRNA)组合使用，旨在与编码的CRISPR-Cas效应蛋白或结构域一起发挥作用，以修饰目标核酸。可用于本发明的向导核酸包括至少一个间隔序列和至少一个重复序列。向导核酸能够与由本发明的核酸构建体编码和表达的CRISPR-Cas核酸酶结构域形成复合物，并且间隔序列能够与目标核酸杂交，从而引导复合物(例如，CRISPR-Cas效应融合蛋白(例如，CRISPR-Cas效应结构域与脱氨酶结构域融合和/或CRISPR-Cas效应结构域与肽标签或亲和多肽融合募集脱氨酶结构域和任选的UGI)到靶核酸，其中靶核酸可以被脱氨酶结构域修饰(例如，切割或编辑)或调节(例如，调节转录)。

例如，编码与胞嘧啶脱氨酶结构域相连的Cas9结构域(例如融合蛋白)的核酸构建体可以与Cas9向导核酸结合使用以修饰目标核酸，其中融合蛋白的胞嘧啶脱氨酶结构域使目标核酸中的胞嘧啶碱基脱氨基，从而编辑目标核酸。在另一个示例中，编码与腺嘌呤脱氨酶结构域相连的Cas9结构域(例如，融合蛋白)的核酸构建体可以与Cas9向导核酸组合使用以修饰靶核酸，其中融合蛋白的腺嘌脱氨酶结构域使靶核酸中的腺苷碱基脱氨基，从而编辑目标核酸。

同样，编码与胞嘧啶脱氨酶结构域或腺嘌呤脱氨酶结构域(例如，融合蛋白)相连的Cas12a结构域(或其他选定的CRISPR-Cas核酸酶，例如C2c1、C2c3、Cas12b、Cas12c、Cas12d、Cas12e、Cas13a、Cas13b、Cas13c、Cas13d、Casl、CaslB、Cas2、Cas3、Cas3'、Cas3“、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9(也称为Csnl和Csx12)、Cas10、Csyl、Csy2、Csy3、Csel、Cse2、Cscl、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmrl、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csbl、Csb2、Csb3、Csxl7、Csxl4、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csxl、Csxl5、Csfl、Csf2、Csf3、Csf4(dinG)和/或Csf5)的核酸编辑体可与Cas12a向导核酸(或其他选定的CRISPR-Cas核酸酶的向导核酸)结合使用以修饰目标核酸，其中，融合蛋白的胞嘧啶脱氨酶结构域或腺嘌呤脱氨酶结构域使靶核酸中的胞嘧啶碱基脱氨基，从而编辑靶核酸。

本文中使用的“向导核酸”、“向导RNA”、“gRNA”、“CRISPR RNA/DNA”、“crRNA”或“crDNA”是指包含至少一个间隔序列的核酸，该间隔序列与靶DNA(例如，原间隔序列)互补(并杂交)和至少一个重复序列(例如，V型Cas12a CRISPR-Cas系统的重复序列，或其片段或部分；II型Cas9 CRISPR-Cas系统的重复序列或其片段；V型C2c1 CRISPR Cas系统的重复序列，或其片段；CRISPR-Cas系统，例如C2c3、Cas12a(也称为Cpf1)、Cas12b、Cas12c、Cas12d、Cas12e、Cas13a、Cas13b、Cas13c、Cas13d、Casl、CaslB、Cas2、Cas3、Cas3'、Cas3“、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9(也称为Csnl和Csx12)、Cas10、Csyl、Csy2、Csy3、Csel、Cse2、Cscl、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmrl、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csbl、Csb2、Csb3、Csxl7、Csxl4、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csxl、Csxl5、Csfl、Csf2、Csf3、Csf4(dinG)和/或Csf5的重复序列，或其片段)，其中，重复序列可以与间隔序列的5'端和/或3'端相连。本发明的gRNA的设计可以基于I型、II型、III型、IV型、V型或VI型CRISPR-Cas系统。

在一些实施方案中，Cas12a gRNA可以包含从5'到3'的重复序列(全长或其部分(“手柄”)；例如，假结状结构)和间隔序列。

在一些实施方案中，一个向导核酸可以包含多个重复序列-间隔序列(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10或多个重复-间隔序列)(例如，重复-间隔-重复，例如，重复-间隔-重复-间隔-重复-间隔-重复-间隔-重复-间隔等)。

本发明的向导核酸是合成的、人造的，在自然界中不存在。gRNA可以很长，可以用作适配体(如MS2募集策略)或悬挂在间隔子上的其他RNA结构。

本文中使用的“重复序列”是指例如野生型CRISPR Cas基因座(例如，Cas9基因座、Cas12a基因座、C2c1基因座等)的任何重复序列或合成crRNA的重复序列，该序列与本发明的核酸构建体编码的CRISPR-Cas效应蛋白发挥功能。可用于本发明的重复序列可以是CRISPR-Cas基因座(例如，I型、II型、III型、IV型、V型或VI型)的任何已知或后来鉴定的重复序列，或者它可以是设计用于在I、II、III、IV、V或VI型CRISPR-Cas系统中发挥作用的合成重复序列。重复序列可以包括发夹结构和/或茎环结构。在一些实施方案中，重复序列可以在其5'末端形成假结状结构(即，“手柄”)。因此，在一些实施方案中，重复序列可以与来自野生型I型CRISPR-Cas基因座、II型、CRISPR-Cas基因座、III型、CRISPR-Cas基因座、IV型CRISPR-Cas基因座、V型CRISPR-Cas基因座和/或VI型CRISPR-Cas基因座的重复序列相同或基本相同。来自野生型CRISPR-Cas基因座的重复序列可以通过既定算法确定，例如使用CRISPRdb提供的CRISPRfinder(参见Grissa et al.,Nucleic Acids Res.35(Web Serverissue):W52-7)。在一些实施方案中，重复序列或其部分在其3'端与间隔序列的5'端相连，从而形成重复间隔序列(例如，引导核酸、向导RNA/DNA、crRNA、crDNA)。

在一些实施方案中，重复序列包含至少10个核苷酸(例如，约10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50～100个或更多核苷酸，或其中的任何范围或值)，或基本上由或由其组成，具体取决于特定的重复以及包含重复的向导核酸是经过加工的还是未加工的。在一些实施方案中，重复序列包括、基本上由或由约10～约20个、约10～约30个、约10～约45个、约10～约50个、约15～约30个、约15～约40个、约15～约45个、约15～约50个、约20～约30个、约20～约40个，约20～约50个，约30～约40个，约40～约80个，约50～约100个或更多核苷酸组成。

与间隔序列的5'端相连的重复序列可以包含重复序列的一部分(例如，野生型重复序列的5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35或多个连续核苷酸)。在一些实施方案中，与间隔序列的5'端相连的重复序列的一部分可以是约5～约10个连续核苷酸的长度(例如，约5、6、7、8、9、10个核苷酸)并且与野生型CRISPR Cas重复核苷酸序列的同一区(例如，5'端)具有至少90％的序列同一性(例如，至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高(例如，99.1、99.2、99.3、99.4、99.5、99.6、99.7、99.8、99.9或100％))。在一些实施方案中，重复序列的一部分可以包含在其5'末端的假结状结构(例如，“手柄”)。

本文中使用的“间隔序列”是与目标核酸互补的核苷酸序列(例如，目标DNA)(例如，原间隔序列)(例如，(a)与SEQ ID NO：72、73、75、76、78、79、80、81、83、84、86或87或SEQID NO：89～139之任一个核苷酸序列具有至少80％的序列同一性，和/或(b)编码与SEQ IDNO：74、77、82、85或88之任一个具有至少80％的序列同一性的序列的氨基酸序列的连续核苷酸的一部分。在一些实施方案中，间隔序列(例如，一个或多个间隔序列)可以包括但不限于SEQ ID NO：140～146之任一个核苷酸序列。分隔序列可以是完全互补的或基本互补的(例如，至少约70％互补(例如，约70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多(例如，99.1、99.2、99.3、99.4、99.5、99.6、99.7、99.8、99.9或100％))。因此，在一些实施方案中，与目标核酸相比，间隔序列可以有1、2、3、4或5个错配，这些错配可以是连续的或非连续的。在一些实施方案中，间隔序列可以与目标核酸具有70％的互补性。在其他实施方案中，间隔核苷酸序列可以与目标核酸具有80％的互补性。在还其它实施方案中，间隔核苷酸序列可以与目标核酸(原间隔序列)具有85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或99.5％的互补性，等等。在一些实施方案中，间隔序列与目标核酸是100％互补的。间隔序列的长度可以从约15个核苷酸～约30个核苷酸(例如，15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸，或其中的任何范围或值)。因此，在一些实施方案中，间隔序列可以在长度至少约为15个核苷酸～约30个核苷酸的目标核酸的区(例如，原间隔序列)上具有完全互补或实质性互补。在一些实施方案中，间隔子的长度约为20个核苷酸。在一些实施方案中，间隔子的长度约为21、22或23个核苷酸。

在一些实施方案中，向导核酸的间隔序列的5'区可以与靶DNA相同，而间隔子的3'区可以与靶DNA(例如，V型CRISPR-Cas)基本互补，或者向导核酸的间隔序列的3'区可以与靶DNA相同，而间隔子的5'区可能与目标DNA(例如，II型CRISPR-Cas)基本互补，因此，间隔子序列与目标DNA的总体互补性可能小于100％。因此，例如，在V型CRISPR-Cas系统的向导核酸中，例如，20个核苷酸的间隔序列的5'区(即种子区)中的前1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个核苷酸可能与目标DNA 100％互补，而间隔序列3'区的其余核苷酸基本上与目标DNA是互补的(例如，至少约70％互补)。在一些实施方案中，间隔序列的5'端的前1～8个核苷酸(例如，前1、2、3、4、5、6、7、8、核苷酸以及其中的任何范围)可以与目标DNA100％互补，而间隔序列的3'区中的其余核苷酸基本上与目标DNA是互补的(例如，至少约50％互补(例如，50％、55％、60％、65％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、84％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多))。

再举一个例子，在II型CRISPR-Cas系统的向导核酸中，例如，20个核苷酸间隔序列的3'区(即种子区)中的前1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个核苷酸可能与目标DNA 100％互补，而间隔序列5'区的其余核苷酸基本上与目标DNA互补(例如，至少约70％互补)。在一些实施方案中，间隔序列的3'端的前1～10个核苷酸(例如，前1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个核苷酸，以及其中的任何范围)可以与目标DNA100％互补，而间隔序列的5'区中的其余核苷酸基本上与目标DNA互补(例如，至少约50％的互补性(例如，至少约50％、55％、60％、65％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多或其中的任何范围或值))。

在一些实施方案中，间隔子的种子区长度约为8～约10个核苷酸，长度约为5～约6个核苷酸，或长度约为6个核苷酸。

如本文所用，“靶核酸”、“靶DNA”、“靶核苷酸序列”、“靶区”或“基因组中的靶区”是指植物基因组中的区与本发明的向导核酸中的间隔序列完全互补(100％互补)或基本互补(例如，至少70％互补(例如，70％、71％、72％、73％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多)))。对CRISPR-Cas系统有用的靶区可以位于生物体基因组(例如，植物基因组)中PAM序列的紧邻3'(例如，V型CRISPR-Cas系统)或紧邻5'(例如，II型CRISPR-Cas系统)。目标区可以从位于PAM序列附近的至少15个连续核苷酸(例如，16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30个核苷酸等)的任何区中选择。

“原间隔序列”是指目标双链DNA，特别是目标DNA的一部分(例如，或基因组中的目标区)与CRISPR重复-间隔序列(例如，向导核酸、CRISPR阵列、crRNA)的间隔序列完全或基本互补(和杂交)。

在V型CRISPR-Cas(例如，Cas12a)系统和II型CRISPR-Cas(Cas9)系统的情况下，原间隔序列的侧面是(例如，紧邻)原间隔相邻基序(PAM)。对于IV型CRISPR-Cas系统，PAM位于非靶链的5'端和靶链的3'端(参见下面的示例)。

在II型CRISPR-Cas(例如，Cas9)系统的情况下，PAM位于目标区的3'处。I型CRISPR-Cas系统的PAM位于靶链的5'处。无已知的III型CRISPR-Cas系统的PAM。Makarova等人描述了CRISPR系统的所有类别、类型和亚型的命名法(Nature Reviews Microbiology13：722-736(2015))。向导结构和PAM由R.Barrangou(Genome Biol.16：247(2015))描述。

规范的Cas12a PAM富含T。在一些实施方案中，规范的Cas12a PAM序列可以是5'-TTN、5'-TTTN或5'-TTTV。在一些实施方案中，规范的Cas9(例如，酿脓链球菌)PAM可以是5'-NGG-3'。在一些实施方案中，可以使用非规范的PAM，但效率可能较低。

额外的PAM序列可以由本领域技术人员通过既定的实验和计算方法确定。因此，例如，实验方法包括靶向侧翼有所有可能的核苷酸序列的序列，并识别不进行靶向的序列成员，例如通过转化目标质粒DNA(Esvelt et al.2013.Nat.Methods10:1116-1121；Jiang etal.2013.Nat.Biotechnol.31:233-239).在某些方面，计算方法可以包括对天然间隔子进行BLAST搜索，以识别噬菌体或质粒中的原始靶DNA序列，并对齐这些序列以确定与靶序列相邻的保守序列(Briner and Barrangou.2014.Appl.Environ.Microbiol.80:994-1001；Mojica et al.2009.Microbiology 155:733-740)。

在一些实施方案中，本发明提供了包含本发明核酸构建体的表达盒和/或载体(例如，本发明的编辑系统的一个或多个组分)。在一些实施方案中，可以提供包含本发明的核酸构建体和/或一个或多个向导核酸的表达盒和/或载体。在一些实施方案中，本发明的核酸构建体编码碱基编辑器(例如，包含CRISPR-Cas效应蛋白和脱氨酶结构域(例如，融合蛋白)的构建体)或用于碱基编辑的组件(例如，与肽标签或亲和多肽融合的CRISPR-Cas效应蛋白、与肽标签或亲和多肽融合的脱氨酶结构域，和/或与肽标签或亲和多肽融合的UGI)，可以包含在相同或与包含一个或多个向导核酸的表达盒或载体不同的表达盒或载体上。当编码碱基编辑器或用于碱基编辑的组分的核酸构建体包含在与包含向导核酸的表达盒或载体不同的表达盒或载体上时，目标核酸可以彼此和向导核酸以任何顺序接触(例如，提供)编码碱基编辑器或用于碱基编辑的组分的表达盒或载体，例如，在提供包含向导核酸的表达盒之前、同时或之后(例如，与目标核酸接触)。

本发明的融合蛋白可以包含序列特异性核酸结合结构域(例如，序列特异性DNA结合结构域)、CRISPR-Cas多肽和/或与肽标签相互作用的融合肽标签或亲和多肽的脱氨酶结构域，如本领域所知，用于将脱氨酶募集到目标核酸。募集方法还可以包括与RNA募集基序相连的向导核酸和与能够与RNA募集基序相互作用的亲和多肽融合的脱氨酶，从而将脱氨酶募集到目标核酸。或者，可以使用化学相互作用将多肽(例如脱氨酶)募集到目标核酸中。

可用于本发明的肽标签(例如，表位)可以包括但不限于GCN4肽标签(例如，Sun-Tag)、c-Myc亲和标签、HA亲和标签、His亲和标签、S亲和标签、蛋氨酸-His亲和标签、RGD-His亲和标签、FLAG八肽、strep标签或strep标签II，V5标签和/或VSV-G表位。任何可能与多肽连接的表位，并且对于其存在可能与另一个多肽连接的相应亲和多肽，都可以与本发明一起用作肽标签。在一些实施方案中，肽标签可以包含肽标签的1个或2个或多个拷贝(例如，重复单元、多聚化表位(例如，串联重复序列))(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或更多的重复单元。在一些实施方案中，与肽标签相互作用/结合的亲和多肽可以是抗体。在一些实施方案中，所述抗体可以是scFv抗体。在一些实施方案中，与肽标签结合的亲和多肽可以是合成的(例如，为亲和相互作用而进化的)，包括但不限于亲和体、反钙蛋白、单体和/或DARPin(例如参见Sha等人，ProteinSci.26(5)：910-924(2017))；Gilbreth(Curr Opin Struc Biol 22(4)：413-420(2013))，美国专利号9,982,053，每项均通过引用完整纳入与亲和体、反卡林、单体和/或DARPins相关的教义。肽标签序列示例及其亲和多肽包括但不限于SEQ ID NO：45～47的氨基酸序列。

在一些实施方案中，向导核酸可以与RNA募集基序相连，并且待募集的多肽(例如脱氨酶)可以与与RNA募集基序结合的亲和多肽融合，其中，向导与目标核酸结合，并且RNA募集基序与亲和多肽结合，从而将多肽募集到向导中，并使目标核酸与多肽(例如脱氨酶)接触。在一些实施方案中，可以将两个或多个多肽募集到一个向导核酸中，从而将目标核酸与两个或多个多肽(例如脱氨酶)接触。RNA募集基序示例及其亲和多肽包括但不限于SEQID NO：48～58的序列。

在一些实施方案中，与亲和多肽融合的多肽可以是逆转录酶，并且向导核酸可以是与RNA募集基序相连的延伸向导核酸。在一些实施方案中，RNA募集基序可以位于延伸向导核酸的延伸部分的3'末端(例如，5'-3'，重复-间隔-延伸部分(RT模板-引物结合位点)-RNA募集基序)。在一些实施方案中，RNA募集基序可以包埋在延伸部分。

在本发明的一些实施方案中，扩展的向导RNA和/或向导RNA可以与一个或多个RNA募集基序(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或多个基序；例如，至少10～约25个基序)相连，任选地，其中两个或多个RNA募集基序可以是相同的RNA募集基序或不同的RNA募集基序。在一些实施方案中，RNA募集基序和相应的亲和多肽可以包括但不限于端粒酶Ku结合基序(例如Ku结合发夹)和相应的亲和多肽Ku(例如Ku异二聚体)、端粒酶Sm7结合基序和相应的亲和多肽Sm7、MS2噬菌体操纵子茎环和相应的亲和多肽MS2外壳蛋白(MCP)，PP7噬菌体操纵子茎环和相应的亲和多肽PP7外壳蛋白(PCP)，SfMu噬菌体Com茎环和相应的亲和多肽Com RNA结合蛋白，PUF结合位点(PBS)和亲和多肽Pumilio/fem-3mRNA结合因子(PUF)，和/或合成RNA-适配体和适配体配体作为相应的亲和多肽。在一些实施方案中，RNA募集基序和相应的亲和多肽可以是MS2噬菌体操纵子茎环和亲和多肽MS2外壳蛋白(MCP)。在一些实施方案中，RNA募集基序和相应的亲和多肽可以是PUF结合位点(PBS)和亲和多肽Pumilio/fem-3mRNA结合因子(PUF)。

在一些实施方案中，用于募集多肽和核酸的组分可以是那些通过化学相互作用发挥作用的组分，这些化学相互作用可以包括但不限于雷帕霉素诱导的FRB-FKBP的二聚化；生物素-链霉亲和素；SNAP标签；Halo标签；CLIP标签；化合物诱导的DmrA-DmrC异二聚体；双功能配体(例如，两种蛋白质结合化学物质融合在一起，例如，二羟叶酸还原酶(DHFR)。

在一些实施方案中，本发明的核酸构建体、表达盒或载体对于在植物中的表达进行的优化可以是与包含相同多核苷酸但尚未针对植物表达进行密码子优化的核酸构建体、表达盒或载体的约70％～100％的相同(例如，约70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或100％)。

进一步提供的是包含突变的核糖体蛋白L3(RPL3)基因的核酸，其中任选地，突变的RPL3基因包含外显子3中的突变。

另一方面提供了编码核糖体蛋白L3(RPL3)多肽的突变核酸，任选地突变位于RPL3基因的外显子3中，其中突变导致无可检测到的RPL3多肽或与单端孢霉烯霉菌毒素的结合减少的RPL3多肽。

本文进一步提供包含一个或多个本发明的多核苷酸、向导核酸、核酸构建体、表达盒或载体的细胞。

本发明的核酸构建体(例如，包含序列特异性DNA结合结构域、CRISPR-Cas效应结构域、脱氨酶结构域、逆转录酶(RT)、RT模板和/或向导核酸等的构建体)和包含相同的表达盒/载体可用作本发明的编辑系统，用于修饰目标核酸和/或其表达。

可以使用本发明的多肽、多核苷酸、核糖核蛋白(RNP)、核酸构建体、表达盒和/或载体对植物或植物部分(或植物分组，例如，分成属或更高阶分类)的靶核酸进行修饰(例如，突变，例如碱基编辑、切割、切口等)，包括单子叶植物。在一些实施方式中，单子叶植物是小麦植物、燕麦植物、斯佩尔特小麦植物和/或大麦植物。可以按本文所述进行改性的植物和/或植物部分可以是任何小麦、燕麦、斯佩尔特小麦或大麦物种/品种/栽培品种的植物和/或植物部分。

本文中使用的术语“植物部分”包括但不限于生殖组织(例如，花瓣、萼片、雄蕊、雌蕊、花托、花药、花粉、花、果实、花芽、胚珠、种子、胚胎、仁、核、穗、穗轴和壳)；营养组织(例如，叶柄、茎、根、根毛、根尖、髓、胚芽鞘、茎、芽、枝、树皮、顶端分生组织、腋芽、子叶、下胚轴和叶)；维管组织(例如韧皮部和木质部)；特化细胞，如表皮细胞、薄壁细胞、厚角细胞、厚壁细胞、气孔、保卫细胞、角质层、叶肉细胞；愈伤组织；和插条。术语“植物部分”还包括植物细胞，包括植物和/或植物部分、植物原生质体、植物组织、植物器官、植物细胞组织培养物、植物愈伤组织、植物丛等中的完整的植物细胞。本文中使用的“芽”是指包括叶和茎在内的地上部分。本文中使用的术语“组织培养物”包括组织、细胞、原生质体和愈伤组织的培养物。

如本文所用，“植物细胞”是指植物的结构和生理单位，其通常包括细胞壁但也包括原生质体。本发明的植物细胞可以是孤立的单个细胞的形式，也可以是培养的细胞，或者可以是更高组织单元的一部分，例如，植物组织(包括愈伤组织)或植物器官。在一些实施方案中，植物细胞可以是藻类细胞。“原生质体”是无细胞壁或只有部分细胞壁的孤立植物细胞。因此，在本发明的一些实施方案中，包含本发明的核酸分子和/或核苷酸序列的转基因细胞是任何植物或植物部分的细胞，包括但不限于根细胞、叶细胞、组织培养细胞、种子细胞、花细胞、果实细胞、花粉细胞、等等。在本发明的某些方面，植物部分可以是植物种质。在某些方面，植物细胞可以是不会再生成植物的非繁殖植物细胞。

“植物细胞培养物”是指植物单位的培养物，例如原生质体、细胞培养细胞、植物组织中的细胞、花粉、花粉管、胚珠、胚囊、受精卵和处于不同发育阶段的胚胎。

如本文所用，“植物器官”是植物的独特且具有明显结构和分化的部分，例如根、茎、叶、花芽或胚胎。

本文中使用的“植物组织”是指组织成结构和功能单元的一组植物细胞。包括培育和培养的任何植物组织。该术语包括但不限于整株植物、植物器官、植物种子、组织培养物以及组织成结构和/或功能单元的任何植物细胞组。将本术语结合或缺少上述或本定义所包含的任何特定类型的植物组织来使用，并不意味着排除任何其他类型的植物组织。

在本发明的一些实施方案中，提供了转基因组织培养物或转基因植物细胞培养物，其中，所述转基因组织或细胞培养物包含本发明的核酸分子/核苷酸序列。在一些实施方案中，可以通过将转基因植物与非转基因植物杂交，并在植物的后代中选择包含所需基因编辑且转基因不用于产生编辑的植物，来消除从转基因组织或细胞发育而来的植物中的转基因。

任何包含内源性RPL3基因的大麦植物、小麦植物、斯佩尔特小麦植物或燕麦植物都可以按照本文所述进行修饰，以提供具有(1)修饰的内源性RPL3基因，该基因产生RPL3多肽，该多肽与单端孢霉烯霉菌毒素的结合减少，(2)对脱氧雪腐镰孢菌烯醇(DON)的耐受性增加，(3)对镰孢菌头枯病(FHB)的抗性/耐受性增加(例如，对FHB病原体禾谷镰孢菌(Fusarium graminearum)的抗性增加，和/或FHB症状减轻)，(4)减少禾谷镰孢菌(Fusariumgraminearum)负荷，和/或(5)在感染禾谷镰孢菌(Fusarium graminearum)时产生积累较少单端孢霉烯霉菌毒素(例如，DON)的种子的植物，与缺少至少一种突变的植物(例如，同基因植物(例如，野生型未编辑的植物或空分离株)相比。在一些实施方案中，植物可以是小麦植物，并且内源性RPL3基因中的至少一个突变可以在A基因组中，任选地在染色体4A或染色体5A中，在B基因组中，在D基因组中，或在其任意组合中，任选地在A基因组和B基因组中，任选地，其中，内源性RPL3基因是RPL3A基因和/或RPL3B基因。在一些实施方案中，RPL3A基因可以是RPL3A-1基因、RPL3A-2基因和/或RPL3A-3基因和/或RPL3B基因是RPL3B-1基因、RPL3B-2基因和/或RPL3B-3基因。在一些实施方案中，至少一个突变可以是非天然突变。

除了如本文所述的内源性RPL3基因突变外，本发明的植物或其部分可以进一步包含一个或多个额外的镰孢菌头枯病抗性等位基因。在一些实施方案中，一个或多个额外的镰孢菌头枯病抗性等位基因可以是一个或多个数量性状座位(QTL)。据信至少有556个QTL分布在小麦的所有亚基因组和染色体上。因此，在一些实施方案中，本发明的植物包含如本文所述的RPL3基因突变，可以进一步包含一个或多个与镰孢菌头枯病抗性相关的QTL(例如，堆叠的)，其中QTL可以包括但不限于Fhb1、Fhb2、Fhb3、Fhb4、Fhb5、Fhb6和/或Fhb7。

现在将参考以下实施例来描述本发明。应该理解的是，这些实施例并不是为了将权利要求的范围限制在本发明上，而是为了作为某些实施方案的例证。熟练的技术人员遇到的示例方法中的任何变化都旨在落入本发明的范围。

【实施例】

【实施例1】

开发了一种策略，在TraesCS4A02G208000(SEQ ID NO：72)、TraesCS4B02G111500(SEQ ID NO：75)、TraesCS4D02G109200(SEQ ID NO：78)、TraesCS5A02G112400(SEQ ID NO：80)、TraesCS5B02G118400(SEQ ID NO：83)和/或TraesCS5D02G129200(SEQ ID NO：86)的小麦核糖体蛋白L3基因中产生截断、敲除或敲低编辑，以产生对镰孢菌头枯病(FHB)感染(病原体，禾谷镰孢菌(Fusarium graminearum))具有增强抗性的植物或其部分、对镰孢菌毒素脱氧雪腐镰孢菌烯醇(DON)的抗性/耐受性增加，对镰孢菌头枯病(FHB)的抗性/耐受性增加(例如，对FHB病原体禾谷镰孢菌(Fusarium graminearum)的耐受性增加，和/或FHB症状减轻)，禾谷镰孢菌(Fusarium graminearum)负荷降低，和/或提供产生积累较少单端孢霉烯霉菌毒素的种子或其他植物部分的植物。为了产生一系列等位基因，设计了多个Cas12a向导核酸，这些核酸包含与一个或多个RPL3基因(参见表2)内的靶标具有互补性(参见表1)的间隔子(SEQ ID NO：140～146)(参见表1)并被放入构建体中。

筛选了在RPL3基因中携带编辑的品系，那些显示约10％的测序读数在目标基因中具有编辑的品系被推进到下一代。

【表1：间隔子】

PWsp500	TACTCTCAACTCAGTCTGGGCAC	SEQ ID NO：140
			PWsp501	TACTCTCAACTCTGTCTGGGCAC	SEQ ID NO：141
PWsp502	CACTCTCAACTCTGTCTGGGCTC	SEQ ID NO：142
			PWsp503	TCTTCTCAAGCTGCATATGGATT	SEQ ID NO：143
PWsp504	AGTTATCGCCCATACCCAGGTCA	SEQ ID NO：144
			PWsp505	TTCTTGCCCGCATCACAGTCATA	SEQ ID NO：145
PWsp506	TTCTTTCCTGAATCACTGTCATA	SEQ ID NO：146

【表2：等位基因、基因组、cDNA、蛋白质序列和用于编辑的示例靶区】

【实施例2：RPL3的经编辑的等位基因】

对如实施例1中描述的编辑的植物中的RPL3基因进行序列分析，并鉴定出RPL3的一系列等位基因，并总结在表3中。

【表3：RPL3的经编辑的等位基因】

【实施例3：生长室中的镰孢菌病评估】

将每个小麦品种/变种/品系的两克小麦种子播种在装有巴氏杀菌土壤培养基的一升栽盆中。小麦种子可以在荧光灯下的温室条件下发芽，光周期为14小时。在小麦开花开始时，小麦头状花序或小麦小穗受到喷洒禾谷镰孢菌(F.graminearum)分生孢子，例如禾谷镰孢菌(F.graminearum)NRRL 5883的攻击。通过将含有0.01％Tween20的水倒在板上并将孢子刮成悬浮液，从5天龄的PDA板中收获分生孢子。喷洒孢子后，将小麦植株转移到湿度为100％的雾室中三天，以允许感染。

感染后20天，停止浇水，让小麦植株干燥三周后再收获。收获和收集单个小麦头状花序。确定每个出现小麦穗枯病症状的头状花序的疾病严重程度。疾病严重程度的计算方法是患病小穗数除以每个头状花序的小穗总数。

每个顶部的种子都是手工收获的，种子质量被称重。计算每个处理中每盆的平均种子重量。

【实施例4：小麦幼苗镰孢菌病害的评估】

任何小麦品种/变种/品系的种子都播种在1升栽盆中，每个栽盆在直径为20厘米的塑料栽盆中，每个栽盆中含有巴氏杀菌土壤培养基。将种子和植物保存在室温温室中，光照时间为14小时。

禾谷镰孢菌(Fusarium graminearum)菌株的菌丝体，如NRRL-5883，在恒定光照下在PDA平板上生长5天。通过在平板上倒入几毫升无菌水(0.01％吐温20)并用无菌刮刀刮擦琼脂表面来收获菌丝和分生孢子。将接种物中孢子的浓度调节至约2×10⁵孢子/mL

禾谷镰孢菌(F.graminearum)的接种在种子中出芽后开始，每隔一个晚上接种一次，持续10天。禾谷镰孢菌(F.graminearum)的接种物用喷雾器以每罐约30mL的速度施用。每次接种后，立即用高架喷雾器对植物进行喷雾。

小麦穗枯病是通过镰孢菌侵染的严重程度来评估的，通过每克(CFU/g)植物组织的镰孢菌菌落形成单位的数量来确定。

【实施例5：温室中镰孢菌病害的评估】

将每个小麦品种/变种/品系的两克小麦种子播种在装有巴氏杀菌土壤培养基的一升栽盆中。小麦种子可以在荧光灯下的温室条件下发芽，光周期为14小时。在开花期(Feekes 10.5.1)，小麦头状花序或小麦小穗通过喷洒禾谷镰孢菌(Fusariumgraminearum)分生孢子悬浮液而受到感染。可以通过将禾谷镰孢菌(F.graminearum)的匀浆菌丝体(例如菌株NRRL 5883)接种到PDA板上，然后在室温下在恒定光照下孵育5天来制备真菌孢子悬浮液。然后通过用硫酸镁缓冲液(10mM MgSO₄；0.01％吐温20)淹没平板并用无菌刮刀轻轻刮擦琼脂表面来收获真菌孢子。调整孢子浓度，用加压手动喷雾器每头状花序施用约50,000个分生孢子。生长室相对湿度增加至90％三天，用于允许感染，然后再次恢复正常。小麦种子处理好后，停止浇水，让麦穗完全干燥。收获和收集单个小麦头状花序。确定每个出现小麦穗枯病症状的小麦头状花序的疾病严重程度。疾病严重程度的计算方法是患病小穗数除以每个头状花序的小穗总数。

【实施例6：镰孢菌病的田间评估】

当植物发育达到中泌乳期和蜡熟期之间时，通过评估60个头状花序一重复(即300个头状花序/处理)来对小麦穗枯病病害和发病率进行田间评估。小麦头状花序是手工收割的，当谷物完全成熟时，使用Almaco单株和头状花序脱粒机(Almaco,Iowa)进行脱粒。从每个重复行获得的谷物样本来评估100个核的重量。使用单因素方差分析(ANOVA)分析疾病严重程度、发病率和100个核重量的数据。

上述内容对本发明具有示例性，不应被解释为对其限制。本发明由以下权利要求定义，其中包含权利要求等价物。

Claims (115)

1.植物或其部分，其在编码内源性核糖体蛋白L3(RPL3)多肽的RPL3基因中包含至少一个(例如，一个或多个)突变，任选地，其中，至少一个突变导致无可检测到的RPL3多肽或与单端孢霉烯霉菌毒素的结合减少的RPL3多肽。

2.根据权利要求1所述的植物或其部分，其中，单端孢霉烯霉菌毒素是脱氧雪腐镰孢菌烯醇(DON)。

3.根据权利要求1或权利要求2所述的植物或其部分，其中，所述至少突变是敲低突变或敲除突变。

4.根据上述权利要求之任一项所述的植物或其部分，其中，所述至少突变是无效突变。

5.根据上述权利要求之任一项所述的植物或其部分，其中，所述至少一个突变是碱基取代、碱基缺失和/或碱基插入。

6.根据上述权利要求之任一项所述的植物或其部分，其中，所述至少一个突变包括对A、T、G或C的碱基取代。

7.根据上述权利要求之任一项所述的植物或其部分，其中，所述至少一个突变是至少一个碱基对的碱基缺失，任选地缺失约1个碱基对～约100个连续碱基对。

8.根据权利要求1～5之任一项所述的植物或其部分，其中，所述至少一个突变是至少一个碱基对的碱基插入。

9.根据权利要求5或权利要求7所述的植物或其部分，其中，所述碱基缺失是框外缺失。

10.根据权利要求5或权利要求8所述的植物或其部分，其中，所述碱基插入是框外插入。

11.根据权利要求9所述的植物或其部分，其中，框外缺失产生/导致提早终止密码子。

12.根据权利要求10所述的植物或其部分，其中，框外插入产生/导致提早终止密码子。

13.根据上述权利要求之任一项所述的植物或其植物部分，其中，内源性RPL3基因中的至少一个突变导致截短的RPL3多肽。

14.根据权利要求5、7、9、11或13所述的植物或植物部分，其中，碱基缺失包括RPL3基因的全部或部分的缺失，例如，

参考SEQ ID NO：72的核苷酸位置编号，约核苷酸位置1250～核苷酸位置2706的缺失，

参考SEQ ID NO：75的核苷酸位置编号，约核苷酸位置1120～核苷酸位置2522的缺失，

参考SEQ ID NO：78的核苷酸位置编号，约核苷酸位置1240～核苷酸位置2705的缺失，

参考SEQ ID NO：80的核苷酸位置编号，约核苷酸位置1080～核苷酸位置2566的缺失，

参考SEQ ID NO：83的核苷酸位置编号，约核苷酸位置1080～核苷酸位置2643的缺失，

参考SEQ ID NO：86的核苷酸位置编号，约核苷酸位置1230～核苷酸位置2613的缺失

(例如，参见RPL3基因的区，如SEQ ID NO：89～139)。

15.根据权利要求5、7、9、11或13所述的植物或其植物部分，其中，碱基缺失导致从RPL3多肽的C端缺失一个或多个氨基酸残基(例如，SEQ ID NO：74、77、82、85或88的氨基酸序列之任一个中的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280或290个残基的缺失)。

16.根据上述权利要求之任一项所述的植物或其部分，其中，所述至少一个突变位于内源性RPL3基因的外显子3中。

17.根据上述权利要求所述的植物或其部分，其中，所述内源性RPL3基因是RPL3A基因和/或RPL3B基因。

18.根据权利要求14所述的植物或其部分，其中，所述RPL3A基因是RPL3A-1基因、RPL3A-2基因和/或RPL3A-3基因。

19.根据权利要求14所述的植物或其部分，其中，所述RPL3B基因是RPL3B-1基因、RPL3B-2基因和/或RPL3B-3基因。

20.根据上述权利要求之任一项所述的植物或其部分，其中，所述内源性RPL3基因

包含与SEQ ID NO：72、73、75、76、78、79、80、81、83、84、86或87的核苷酸序列之任一个具有至少80％序列同一性的核苷酸序列，和/或

包含与SEQ ID NO：89～139之任一个核苷酸序列具有至少80％序列同一性的区。

21.根据上述权利要求之任一项所述的植物或其部分，其中，所述内源性RPL3基因编码与SEQ ID NO：74、77、82、85或88的氨基酸序列之任一个具有至少80％的序列同一性的多肽。

22.根据上述权利要求之任一项所述的植物或其部分，其中，所述至少一个突变是非天然突变。

23.根据上述权利要求之任一项所述的植物或其部分，其中，所述植物或其部分表现出对镰孢菌头枯病(FHB)的抗性增加(例如，对FHB病原体禾谷镰孢菌(Fusariumgraminearum)的抗性增加)。

24.根据上述权利要求之任一项所述的植物或其部分，其中，所述植物或其部分表现出禾谷镰孢菌(Fusarium graminearum)的量减少，例如，禾谷镰孢菌(F.graminearum)负荷降低。

25.根据上述权利要求之任一项所述的植物或其部分，其中，所述植物或其部分表现出对脱氧雪腐镰孢菌烯醇(DON)的耐受性增加。

26.根据上述权利要求之任一项所述的植物或其部分，其中，所述植物在感染FHB(由FHB的病原体(禾谷镰孢菌(Fusarium graminearum))感染)时产生的种子积累较少的单端孢霉烯霉菌毒素(例如DON)。

27.根据上述权利要求之任一项所述的植物或其部分，其中，所述植物是单子叶植物。

28.根据上述权利要求之任一项所述的植物或其部分，其中，所述植物是小麦、大麦、斯佩尔特小麦或燕麦。

29.根据上述权利要求之任一项所述的植物或其部分，其中，所述植物是小麦，任选地，其中，内源性RPL3基因中的至少一个突变在A基因组中，任选地在染色体4A或染色体5A中，在B基因组中，在D基因组中，或在它们的任意组合中，任选地在A基因组和B基因组中。

30.根据上述权利要求之任一项所述的植物或其部分，还包括一个或多个额外的镰孢菌头枯病抗性等位基因。

31.根据权利要求30所述的植物或其部分，其中，一个或多个额外的镰孢菌头枯病抗性等位基因是一个或多个数量性状座位(QTL)。

32.根据上述权利要求之任一项所述的植物或其部分，其中，所述至少一种突变导致突变的RPL3基因，其与SEQ ID NO：147、149、151、153或155的核苷酸序列之任一个具有至少90％的序列同一性和/或编码突变的RPL3多肽，该多肽与SEQ ID NO：148、150、152、154或156的氨基酸序列之任一个具有至少90％的序列同一性。

33.植物细胞，其包括编辑系统，所述编辑系统包括：

(a)CRISPR-Cas相关效应蛋白；和

(b)向导核酸(例如，gRNA、gDNA、crRNA、crDNA)，其包含与植物细胞中编码核糖体蛋白L3(RPL3)多肽的内源性靶基因互补的间隔序列。

34.根据权利要求33所述的植物细胞，其中，所述编辑系统在内源性靶基因中产生突变。

35.根据权利要求33或权利要求34所述的植物细胞，其中，所述内源性靶基因是编码RPL3多肽的内源性RPL3基因。

36.根据权利要求33～35之任一项所述的植物细胞，其中，所述内源性靶基因：

(a)包含与SEQ ID NO：72、73、75、76、78、79、80、81、83、84、86或87的核苷酸序列之任一个具有至少80％序列同一性的核苷酸序列，

(b)包含与SEQ ID NO：89～139之任一个核苷酸序列具有至少80％序列同一性的区，和/或

(c)编码与SEQ ID NO：74、77、82、85或88的氨基酸序列之任一个具有至少80％的序列同一性的氨基酸序列。

37.根据权利要求33～36之任一项所述的植物细胞，其中，所述向导核酸包括SEQ IDNO：140～146之任一个核苷酸序列(例如，间隔序列)。

38.根据权利要求33～37之任一项所述的植物细胞，其中，所述植物细胞是小麦植物细胞、大麦植物细胞、燕麦植物细胞或斯佩尔特小麦植物细胞。

39.植物，其从权利要求1～32之任一项所述的植物部分或权利要求33～38之任一项所述的植物细胞再生。

40.根据权利要求39所述的植物，其中，所述植物表现出对镰孢菌头枯病(FHB)的抗性增加(例如，对FHB病原体禾谷镰孢菌(Fusarium graminearum)的抗性增加，和/或FHB症状降低)，任选地，其中，所述植物表现出降低的禾谷镰孢菌(Fusarium graminearum)负荷。

41.根据权利要求39或权利要求40所述的植物，其中，所述植物或其部分表现出对单端孢霉烯霉菌毒素，脱氧雪腐镰孢菌烯醇(DON)的耐受性增加，和/或产生在感染禾谷镰孢菌(Fusarium graminearum)时积累较少单端孢霉烯霉菌毒素(例如，DON)的种子。

42.植物细胞，其包含一个或多个内源性核糖体蛋白L3(RPL3)基因中的至少一个突变，其中，所述至少一个突变是使用编辑系统引入的替换、插入和/或缺失，该系统包含与一个或多个内源性RPL3基因中的靶位点结合的核酸结合域。

43.根据权利要求42所述的植物细胞，其中，所述靶位点位于RPL3基因的区内，所述区包含与SEQ ID NO：89～139之任一个核苷酸序列具有至少80％序列同一性的序列。

44.根据权利要求42或权利要求43所述的植物细胞，其中，所述编辑系统还包括核酸酶，并且核酸结合结构域与序列内的靶位点结合，该序列与SEQ ID NO：72、73、75、76、78、79、80、81、83、84、86或87的核苷酸序列之任一个具有至少80％的序列同一性和/或区内的靶位点结合，该区与SEQ ID NO：89～139之任一个核苷酸序列具有至少80％的序列同一性，并且至少一个突变是在核酸酶切割后产生的。

45.根据权利要求42～44之任一项所述的植物细胞，其中，所述至少一个突变导致内源性RPL3基因的敲低或敲除。

46.根据权利要求42～45之任一项所述的植物细胞，其中，所述突变是无效等位基因。

47.根据权利要求42～46之任一项所述的植物细胞，其中，所述突变是非天然突变。

48.根据权利要求44～47之任一项所述的植物细胞，其中，所述核酸酶是锌指核酸酶、转录激活因子样效应核酸酶(TALEN)、核酸内切酶(例如Fok1)或CRISPR-Cas效应蛋白。

49.根据权利要求42～48之任一项所述的植物细胞，其中，所述核酸结合结构域是锌指、转录激活因子样DNA结合结构域(TAL)、Argonaute或CRISPR-Cas效应DNA结合结构域。

50.根据权利要求42～49之任一项所述的植物细胞，其中，所述一个或多个内源性RPL3基因内的至少一个突变是插入和/或缺失，任选地，至少一个突变是框外插入或框外缺失。

51.根据权利要求42～50之任一项所述的植物细胞，其中，所述一个或多个内源性RPL3基因内的至少一个突变是插入和/或缺失导致终止密码子的提前，任选地，其中，至少一个突变是导致终止密码子提前的框外插入或框外缺失，任选地截短蛋白。

52.根据权利要求42～51之任一项所述的植物细胞，其中，所述一个或多个内源性RPL3基因内的至少一个突变包含点突变。

53.根据权利要求42～52之任一项所述的植物细胞，其中，所述突变导致突变的RPL3基因，所述突变的RPL3基因：

与SEQ ID NO：147、149、151、153或155的核苷酸序列之任一个具有至少90％的序列同一性，和/或

编码突变的RPL3多肽，所述突变的RPL3多肽与SEQ ID NO：148、150、152、154或156的氨基酸序列之任一个具有至少90％的序列同一性。

54.从权利要求42～53之任一项所述的植物细胞再生的植物，所述植物包含一个或多个内源性RPL3基因中的至少一个突变，并表现出以下的表型

(a)对镰孢菌头枯病(FHB)的抗性增加(例如，对FHB病原体禾谷镰孢菌(Fusariumgraminearum)的抗性增加)，

(b)感染禾谷镰孢菌(Fusarium graminearum)时，产生的种子积累较少的单端孢霉烯霉菌毒素(例如DON)，

(c)对脱氧雪腐镰孢菌烯醇(DON)的耐受性增加，和/或

(d)与缺失至少一种非天然突变的对照植物或其部分相比，禾谷镰孢菌(Fusariumgraminearum)负荷降低，其中植物任选地为小麦、大麦、斯佩尔特小麦或燕麦。

55.生产/培育无转基因编辑的植物的方法，其包括：

将权利要求1～32、39～41或54之任一项所述的植物与无转基因植物杂交，从而将至少一个突变引入无转基因植物中；和

选择包含至少一个突变且无转基因的后代植物，从而产生无转基因编辑的植物。

56.提供多种植物的方法，所述植物

表现出对镰孢菌头枯病(FHB)的抗性增加(例如，对FHB病原体禾谷镰孢菌(Fusariumgraminearum)的抗性增加，和/或FHB症状减轻)；

当感染禾谷镰孢菌(Fusarium graminearum)时，产生的种子积累较少的单端孢霉烯霉菌毒素(例如DON)；

禾谷镰孢菌(Fusarium graminearum)负荷减少；和/或

对脱氧雪腐镰孢菌烯醇(DON)的耐受性增加，

所述方法包括在生长区种植权利要求1～32、39～41或54之任一项的两种或两种以上的植物，从而提供多种植物，所述植物与多种对照植物相比，

表现出对镰孢菌头枯病(FHB)的抗性增加(例如，对FHB病原体禾谷镰孢菌(Fusariumgraminearum)的抗性增加，和/或FHB症状减轻)；

当感染禾谷镰孢菌(Fusarium graminearum)时，产生的种子积累较少的单端孢霉烯霉菌毒素(例如DON)；

禾谷镰孢菌(Fusarium graminearum)负荷减少；和/或

对脱氧雪腐镰孢菌烯醇(DON)的耐受性增加。

57.在植物中内源性核糖体蛋白L3(RPL3)基因中产生突变的方法，其包括：

(a)将基因编辑系统靶向内源性RPL3基因的一个区，该区包含与SEQ ID NO：89～139之任一个核苷酸序列具有至少90％序列同一性的序列；和

(b)选择一种植物，其包含位于内源性RPL3基因区的修饰，该区与SEQ ID NO：89～139之任一个核苷酸序列具有至少90％的同一性。

58.在核糖体蛋白L3(RPL3)基因中产生变异的方法，其包括：

将编辑系统引入植物细胞中，其中，所述编辑系统靶向编码RPL3多肽的RPL3基因区，以及

将RPL3基因的区与编辑系统接触，从而将突变引入RPL3基因并在植物细胞的RPL3基因中产生变异。

59.根据权利要求58所述的方法，其中，所述内源性RPL3基因包含核苷酸序列，该核苷酸序列与SEQ ID NO：72、73、75、76、78、79、80、81、83、84、86或87的核苷酸序列的任一种具有至少80％序列同一性和/或编码与SEQ ID NO：74、77、82、85或88的氨基酸序列之任一个具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。

60.根据权利要求58或权利要求5759所述的方法，其中，所述被靶向的内源性RPL3基因的区包含与SEQ ID NO：89～139之任一个核苷酸序列至少80％的序列同一性。

61.根据权利要求58～60之任一项所述的方法，其中，将植物细胞中内源性RPL3基因的区与编辑系统接触，产生植物细胞，在其基因组中包含经过编辑的RPL3基因，所述方法还包括：

(a)从所述植物细胞再生植物；

(b)使所述植物自交以产生后代植物(E1)；

(c)测定(b)的后代植物用于：

(i)增加对镰孢菌头枯病(FHB)的抗性，

(ii)减少的禾谷镰孢菌(Fusarium graminearum)负荷，

(iii)种子在感染禾谷镰孢菌(Fusarium graminearum)时积累较少的单端孢霉烯霉菌毒素(例如DON)，和/或

(iv)对脱氧雪腐镰孢菌烯醇(DON)的耐受性增加；和

(d)选择后代植物，所述后代植物与对照植物相比，表现出：

(i)对FHB的抗性增加，

(ii)减少的禾谷镰孢菌(Fusarium graminearum)负荷，

(iii)种子在感染禾谷镰孢菌(Fusarium graminearum)时积累较少的单端孢霉烯霉菌毒素，和/或

(iv)对DON的耐受性更高。

62.根据权利要求61所述的方法，其还包括

(e)使(d)的选定后代植物自交以产生后代植物(E2)；

(f)测定(e)的后代植物用于：

(i)增加对FHB的抗性，

(ii)减少的禾谷镰孢菌(Fusarium graminearum)负荷，

(iii)种子在感染禾谷镰孢菌(Fusarium graminearum)时积累较少的单端孢霉烯霉菌毒素，和/或(iv)对DON的耐受性增加；和

(g)选择后代植物，所述后代植物与对照植物相比，表现出以下特点：

(i)对FHB的抗性增加，

(ii)减少的禾谷镰孢菌(Fusarium graminearum)负荷，

(iii)种子在感染禾谷镰孢菌(Fusarium graminearum)时积累较少的单端孢霉烯霉菌毒素，和/或

(iv)对DON的耐受性更高，

任选择重复(e)～(g)一次或多次。

63.在植物中检测突变的RPL3基因(内源性RPL3基因中的突变)的方法，其包括在植物的基因组中检测RPL3基因，该基因在与SEQ ID NO：89～139之任一个核苷酸序列具有至少80％序列同一性的区内具有至少一个突变。

64.根据权利要求63所述的方法，其中，被检测到的突变的RPL3基因包含与SEQ ID NO：147、149、151、153或155的核苷酸序列之任一个具有至少90％序列同一性的核酸序列。

65.在植物细胞的基因组中编辑特定位点的方法，所述方法包括：以位点特异性方式切割植物细胞中内源性核糖体蛋白L3(RPL3)基因内的靶位点，其中，内源性RPL3基因

(a)包含与SEQ ID NO：72、73、75、76、78、79、80、81、83、84、86或87的核苷酸序列之任一个具有至少80％的序列同一性的核苷酸序列，

(b)包含与SEQ ID NO：89～139之任一个核苷酸序列具有至少80％序列同一性的区，和/或

(c)编码与SEQ ID NO：74、77、82、85或88的氨基酸序列之任一个具有至少80％的序列同一性的氨基酸序列，从而在植物细胞的内源性RPL3基因中产生编辑，并产生包含内源性RPL3基因编辑的植物细胞。

66.根据权利要求65所述的方法，还包括从包含内源性RPL3基因编辑的植物细胞再生植物，从而产生包含内源性RPL3基因编辑的植物。

67.根据权利要求65或权利要求66所述的方法，其中，所述RPL3基因是RPL3A基因和/或RPL3B基因，任选地，其中，所述RPL3A基因是RPL3A-1基因、RPL3A-2基因和/或RPL3A-3基因，所述RPL3B基因是RPL3B-1基因、RPL3B-2基因和/或RPL3B-3基因。

68.根据权利要求65～67之任一项所述的方法，其中，植物是小麦，任选地，其中，内源性RPL3基因中的至少一个非天然突变在A基因组中，任选地在染色体4A或染色体5A中，在B基因组中，在D基因组中，或在它们的任意组合中，任选地在A基因组和B基因组中。

69.根据权利要求65～68之任一项所述的方法，其中，编辑导致非天然突变。

70.根据权利要求65～69之任一项所述的方法，其中，包含内源性RPL3基因编辑的植物包含突变的RPL3多肽，所述突变的RPL3多肽与单端孢霉烯霉菌毒素的结合减少，与缺乏内源性RPL3基因编辑的对照植物相比，表现出对镰孢菌枯萎病(FHB)的抗性增加(例如，对FHB病原体禾谷镰孢菌(Fusarium graminearum)的抗性增加)，表现出降低的禾谷镰孢菌(Fusarium graminearum)负荷，表现出对脱氧雪腐镰孢菌烯醇(DON)的耐受性增加，和/或感染禾谷镰孢菌(Fusarium graminearum)时产生的种子积累较少的单端孢霉烯霉菌毒素(例如，DON)。

71.根据权利要求65～70之任一项所述的方法，其中，编辑导致内源性RPL3基因的突变，该突变产生具有减少与脱氧雪腐镰孢菌烯醇(DON)结合的RPL3多肽。

72.根据权利要求65～71之任一项所述的方法，其中，编辑导致：

突变的RPL3基因，其与SEQ ID NO：147、149、151、153或155的核苷酸序列之任一个具有至少90％的序列同一性，和/或

突变的RPL3基因，其编码突变的RPL3多肽，所述突变的RPL3多肽与SEQ ID NO：148、150、152、154或156中任一氨基酸序列具有至少90％的序列同一性。

73.制造植物的方法，其包括：

(a)使包含至少一个内源性RPL3基因的植物细胞群与连接有核酸结合结构域(例如，编辑系统)的核酸酶接触，该核酸结合域与至少一个内源性RPL3基因中的靶位点结合，其中，至少一个内源性RPL3基因：

(i)包含与SEQ ID NO：72、73、75、76、78、79、80、81、83、84、86或87的核苷酸序列之任一个具有至少80％序列同一性的核苷酸序列，

(ii)包含与SEQ ID NO：89～139之任一个核苷酸序列具有至少80％序列同一性的区，和/或

(iii)编码与SEQ ID NO：74、77、82、85或88的氨基酸序列之任一个具有至少80％的序列同一性的氨基酸序列，

(b)从内源性RPL3基因已突变的植物细胞群中选择植物细胞，从而产生包含内源性RPL3基因突变的植物细胞；和

(c)将选定的植物细胞生长成包含编码RPL3多肽的内源基因突变的植物，其中，突变减少或消除RPL3多肽结合单端孢霉烯霉菌毒素，任选地，脱氧雪腐镰孢菌烯醇(DON)的能力。

74.在植物中增加对镰孢菌头枯病(FHB)的抗性(例如，增加对FHB病原体禾谷镰孢菌(Fusarium graminearum)的抗性)和/或对单端孢霉烯霉菌毒素，任选地，脱氧雪腐镰孢菌烯醇(DON)的耐受性的方法，其包括

(a)使包含内源性核糖体蛋白L3(RPL3)基因的植物细胞与靶向内源性RPL3基因的核酸酶接触，其中，核酸酶与核酸结合域(例如，编辑系统)连接，该核酸结合域与内源性RPL3基因中的靶位点结合，并且内源性RPL3基因：

(i)包含与SEQ ID NO：72、73、75、76、78、79、80、81、83、84、86或87的核苷酸序列之任一个具有至少80％序列同一性的核苷酸序列，

(ii)包含与SEQ ID NO：89～139之任一个核苷酸序列具有至少80％序列同一性的区，和/或

(iii)编码与SEQ ID NO：74、77、82、85或88的氨基酸序列之任一个具有至少80％的序列同一性的氨基酸序列，从而产生包含内源性RPL3基因突变的植物细胞；和

(b)将植物细胞生长成包含内源性RPL3基因突变的植物，从而在植物中增加对FHB的抗性和/或增加对单端孢霉烯霉菌毒素的耐受性。

75.生产植物或其部分的方法，所述植物或其部分包含至少一个具有突变的内源性核糖体蛋白L3(RPL3)基因的细胞，所述方法包括将植物或植物部分中的内源性RPL3基因中的靶位点与包含切割结构域和核酸结合结构域的核酸酶接触，其中，核酸结合结构域与内源性RPL3基因中的靶位点结合，其中，内源性RPL3基因：

(a)包含与SEQ ID NO：72、73、75、76、78、79、80、81、83、84、86或87的核苷酸序列之任一个具有至少80％序列同一性的序列；

(b)包含与SEQ ID NO：89～139之任一个核苷酸序列具有至少80％同一性的区；和/或

(c)编码与SEQ ID NO：74、77、82、85或88的氨基酸序列之任一个具有至少80％的序列同一性的氨基酸序列，从而产生包含至少一个具有内源性RPL3基因突变的细胞的植物或其部分。

76.根据权利要求74或权利要求75所述的方法，其中，内源性RPL3基因的突变产生与单端孢霉烯霉菌毒素的结合减少的RPL3多肽。

77.生产包含内源性RPL3基因突变的植物或其部分的方法，所述突变产生与单端孢霉烯霉菌毒素结合减少的突变的RPL3多肽，所述方法包括将植物或植物部分中内源性RPL3基因中的靶位点与包含切割结构域和核酸结合结构域的核酸酶接触，其中，核酸酶的核酸结合域与内源性RPL3基因中的靶位点结合，其中，内源性RPL3基因：

(a)包含与SEQ ID NO：72、73、75、76、78、79、80、81、83、84、86或87的核苷酸序列之任一个具有至少80％序列同一性的序列；

(b)包含与SEQ ID NO：89～139之任一个核苷酸序列具有至少80％同一性的区；和/或

(c)编码与SEQ ID NO：74、77、82、85或88的氨基酸序列之任一个具有至少80％的序列同一性的氨基酸序列，从而产生具有内源性RPL3基因突变的植物或其部分，该突变产生了与单端孢霉烯霉菌毒素的结合减少的突变的RPL3多肽。

78.根据权利要求73～77所述的方法，其中，核酸酶裂解内源性RPL3基因，从而将突变引入内源性RPL3基因中。

79.根据权利要求73～78之任一项所述的方法，其中，所述突变是非天然突变。

80.根据权利要求73～79之任一项所述的方法，其中，所述突变是碱基替换、碱基缺失和/或碱基插入。

81.根据权利要求73～80之任一项所述的方法，其中，所述突变是敲除或敲低突变。

82.根据权利要求73～81之任一项所述的方法，其中，所述突变是无效突变。

83.根据权利要求73～82之任一项所述的方法，其中，所述突变是框外插入或框外缺失。

84.根据权利要求73～83之任一项所述的方法，其中，所述突变导致提早的终止密码子，任选地导致截短的蛋白质。

85.根据权利要求73～84之任一项所述的方法，其中，所述突变包括点突变。

86.根据权利要求73～85之任一项所述的方法，其中，所述突变是一个碱基对～约100个碱基对的缺失。

87.根据权利要求73～86之任一项所述的方法，其中，所述核酸酶是锌指核酸酶、转录激活因子样效应核酸酶(TALEN)、核酸内切酶或CRISPR-Cas效应蛋白。

88.根据权利要求73～87之任一项所述的方法，其中，所述核酸结合结构域是锌指、转录激活因子样DNA结合结构域(TAL)、Argonaute或CRISPR-Cas效应DNA结合结构域。

89.根据权利要求73或75～88之任一项所述的方法，其中，具有内源性RPL3基因突变的植物与无内源性RPL3基因突变的对照植物相比，表现出对镰孢菌头枯病(FHB)的抗性增加(例如，对FHB病原体禾谷镰孢菌(Fusarium graminearum)的抗性增加)、禾谷镰孢菌(Fusarium graminearum)负荷降低、对脱氧雪腐镰孢菌烯醇(DON)的耐受性增加，和/或产生积累较少单端孢霉烯霉菌毒素(例如，DON)的种子。

90.根据权利要求73～89之任一项所述的方法，其中，所述RPL3基因是RPL3A基因或RPL3B基因，任选地，其中，所述RPL3A基因是RPL3A-1基因、RPL3A-2基因和/或RPL3A-3基因，所述RPL3B基因是RPL3B-1基因、RPL3B-2基因和/或RPL3B-3基因。

91.根据权利要求73～90之任一项所述的方法，其中，所述至少一个突变导致突变的RPL3基因，所述突变的RPL3基因：

与SEQ ID NO：147、149、151、153或155的核苷酸序列之任一个具有至少90％的序列同一性，和/或

编码突变的RPL3多肽，所述突变的RPL3多肽与SEQ ID NO：148、150、152、154或156中任一氨基酸序列具有至少90％的序列同一性。

92.通过权利要求73～91中所述的任一种方法生产的植物。

93.与内源性核糖体蛋白L3(RPL3)基因中的靶核酸结合的向导核酸具有的基因识别号(geneID)为TraesCS4A02G208000(SEQ ID NO：72)、TraesCS4B02G111500(SEQ ID NO：75)、TraesCS4D02G109200(SEQ ID NO：78)、TraesCS5A02G112400(SEQ ID NO：80)、TraesCS5B02G118400(SEQ ID NO：83)和/或TraesCS5D02G129200(SEQ ID NO：86)。

94.与RPL3基因中的靶位点结合的向导核酸，其中，靶位点位于RPL3基因的区内，该区与SEQ ID NO：89～139之任一个核苷酸序列具有至少80％的序列同一性。

95.根据权利要求93或权利要求94所述的向导核酸，其中，所述向导核酸包括具有SEQID NO：140～146之任一个核苷酸序列的间隔子。

96.系统，其包含权利要求93～95之任一项所述的向导核酸和与向导核酸结合的CRISPR-Cas效应蛋白。

97.根据权利要求96所述的系统，其还包括与所述向导核酸和CRISPR-Cas效应蛋白结合的tracr核酸，任选地，其中，所述tracr核酸和所述向导核酸共价连接。

98.基因编辑系统，其包括与向导核酸结合的CRISPR-Cas效应蛋白，其中，所述向导核酸包含与RPL3基因结合的间隔序列。

99.根据权利要求98所述的基因编辑系统，其中，所述RPL3基因：

(a)包含与SEQ ID NO：72、73、75、76、78、79、80、81、83、84、86或87的核苷酸序列之任一个具有至少80％的序列同一性的核苷酸序列，

(b)包含与SEQ ID NO：89～139之任一个核苷酸序列具有至少80％序列同一性的区，和/或

(c)编码与SEQ ID NO：74、77、82、85或88的氨基酸序列之任一个具有至少80％的序列同一性的氨基酸序列。

100.根据权利要求98或权利要求99所述的基因编辑系统，其中，所述向导核酸包括间隔序列，该间隔序列具有SEQ ID NO：140～146之任一个核苷酸序列。

101.根据权利要求98～100之任一项所述的基因编辑系统，其还包括与所述向导核酸和CRISPR-Cas效应蛋白结合的tracr核酸，其中，所述tracr核酸和所述向导核酸共价连接。

102.根据权利要求98～101之任一项所述的基因编辑系统，其中，所述RPL3基因编码RPL3A多肽或RPL3B多肽。

103.复合物，其包含含有切割结构域和向导核酸(例如，gRNA)的CRISPR-Cas效应蛋白，其中，向导核酸与RPL3基因中的靶位点结合，其中，所述RPL3基因

(a)包含与SEQ ID NO：72、73、75、76、78、79、80、81、83、84、86或87的核苷酸序列之任一个具有至少80％序列同一性的核苷酸序列，

(b)包含与SEQ ID NO：89～139之任一个核苷酸序列具有至少80％序列同一性的区，和/或

(c)编码与SEQ ID NO：74、77、82、85或88的氨基酸序列之任一个具有至少80％的序列同一性的氨基酸序列，其中，切割结构域切割RPL3基因中的靶链。

104.一种表达盒，其包含(a)编码CRISPR-Cas效应蛋白的多核苷酸，其包含切割结构域和(b)与内源性RPL3基因中的靶位点结合的向导核酸，其中，向导核酸包含间隔序列，所述间隔序列互补并结合

(i)与SEQ ID NO：72、73、75、76、78、79、80、81、83、84、86或87的核苷酸序列之任一个具有至少80％序列同一性的核酸部分；

(ii)与SEQ ID NO：89～139之任一个核苷酸序列具有至少80％序列同一性的核酸部分；和/或

(iii)核酸部分编码与SEQ ID NO：74、77、82、85或88的氨基酸序列之任一个具有至少80％的序列同一性的氨基酸序列。

105.突变的内源性RPL3基因，其中，突变的内源性RPL3基因：

包含与SEQ ID NO：147、149、151、153或155的核苷酸序列之任一个具有至少90％序列同一性的核酸序列，和/或

编码突变的RPL3多肽，所述突变的RPL3多肽与SEQ ID NO：148、150、152、154或156中任一氨基酸序列具有至少90％的序列同一性，

任选地，其中，突变的内源性RPL3基因包含非天然突变。

106.植物或其植物部分，其包含在至少一个内源性核糖体蛋白L3(RPL3)基因中的至少一个突变，其基因识别号(geneID)为TraesCS4A02G208000(SEQ ID NO：72)、TraesCS4B02G111500(SEQ ID NO：75)、TraesCS4D02G109200(SEQ ID NO：78)、TraesCS5A02G112400(SEQ ID NO：80)、TraesCS5B02G118400(SEQ ID NO：83)和/或TraesCS5D02G129200(SEQ ID NO：86)。

107.突变的内源性RPL3基因，其中，突变的内源性RPL3基因包含具有如本文所述的突变的核酸序列，任选地在RPL3基因的外显子3中突变，任选地，其中，突变是非天然突变。

108.生产植物的方法，所述植物包含一个或多个内源性核糖体蛋白L3基因中的突变和至少一个目标多核苷酸，所述方法包括：

将第一植物，其为权利要求1～32、39～41、54或95之任一项所述的植物，与包含至少一个目标多核苷酸的第二植物杂交，以产生后代植物；和

选择包含RPL3基因的突变和至少一个目标多核苷酸的后代植物，从而产生包含一个或多个内源性RPL3基因中的突变和至少一个目标多核苷酸的植物。

109.生产包含一个或多个内源性RPL3基因中的突变和至少一个目标多核苷酸的植物的方法，所述方法包括

将至少一个目标多核苷酸引入权利要求1～30、36～38、49、50或95之任一项所述的植物中，从而

产生包含一个或多个内源性RPL3基因的突变和至少一个目标多核苷酸的植物。

110.生产植物的方法，所述植物包含一个或多个内源性RPL3基因的突变，并表现出改进的产量性状、改进的植物结构和/或改进的防御性状的表型，其包括：

将第一植物，其为即权利要求1～30、36～38、49、50、92或106之任一项所述的植物，与表现出改善的产量性状、改善的植物结构和/或改善的防御性状的表型的第二植物杂交；和

选择包含一个或多个内源性RPL3基因突变和改进的产量性状、改进的植物结构和/或改进的防御性状表型的后代植物，从而产生植物，所述植物包含一个或多个内源性RPL3基因突变，并与对照植物相比表现出产量性状改善、植物结构和/或防御性状改善表型。

111.控制容器(例如栽盆或种子盘等)、生长室、温室、田野、休闲区、草坪或路边中杂草的方法，其包括：

将除草剂应用于权利要求1～30、36～38、49、50、92或106之任一项的一种或多种(多株)植物，这些植物生长在容器、生长室、温室、田野、休闲区、草坪或路边，

从而控制生长有一种或多种植物的容器、生长室、温室、田野、休闲区、草坪或路边的杂草。

112.减少昆虫对植物捕食的方法，其包括对权利要求1～30、36～38、49、50、92或106之任一项的一种或多种植物施用杀虫剂，从而减少昆虫对一种或多种植物的捕食。

113.减少植物上真菌病害的方法，其包括将杀真菌剂施用于权利要求1～30、36～38、49、50、92或106之任一项的一种或多种植物，从而减少一种或多种植物上的真菌病害。

114.根据权利要求112或113所述的方法，其中，所述一种或多种植物生长于容器、生长室、温室、田野、休闲区、草坪或路边。

115.根据权利要求108～114之任一项所述的方法，其中，所述目标多核苷酸赋予除草剂耐受性、抗虫性、抗病性、增加产量、增加养分利用效率或非生物抗逆性。