CN119286913A

CN119286913A - 水稻OsCLE48基因在提高植物耐盐碱性上的应用

Info

Publication number: CN119286913A
Application number: CN202411535565.XA
Authority: CN
Inventors: 吴德志; 陈健; 邝刘辉
Original assignee: Hunan Agricultural University
Current assignee: Hunan Agricultural University
Priority date: 2024-10-31
Filing date: 2024-10-31
Publication date: 2025-01-10

Abstract

本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及水稻OsCLE48基因在提高植物耐盐碱性上的应用。所述OsCLE48基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，编码的分泌小肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。采用CRISPR基因编辑技术敲除OsCLE48基因，成功获得了功能缺失的水稻突变体。研究表明，敲除该基因显著增强了水稻对盐碱胁迫的耐受能力，突变体在盐碱条件下的存活率和生物量显著优于野生型水稻。此外，通过同样的基因编辑技术，可在玉米、大麦等作物中敲除OsCLE48基因的同源基因，以提高这些植物的耐盐碱性。

Description

水稻OsCLE48基因在提高植物耐盐碱性上的应用

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及水稻OsCLE48基因在提高植物耐盐碱性上的应用。

背景技术

盐碱胁迫指的是土壤中盐分和碱性物质过多，导致水稻生长环境恶化，影响其生长发育。盐碱胁迫引发的代谢紊乱会削弱水稻根系对水分和养分的吸收能力，抑制光合作用，进而导致植株矮小、叶片黄化、结实率降低，严重情况下可造成大面积减产甚至绝收。此外，盐碱胁迫还会破坏土壤结构，导致板结，使根系无法正常生长。

当前，针对盐碱胁迫的应对措施包括：通过选育耐盐碱品种提高水稻抗逆性；改良土壤，如灌溉排盐、施用有机肥和石膏等，以降低土壤盐碱含量；合理灌溉与施肥，增强水稻的抗逆性。与此同时，基因工程技术也被积极应用于探索通过基因改良提升水稻耐盐碱性的途径。

CLE(CLAVATA3/EMBRYO SURROUNDING REGION-RELAT ED)家族是植物中的一类重要信号肽，广泛参与植物的生长、发育及逆境响应调控。研究表明，CLE肽通过调节根冠细胞的分化和发育，增强植物在干旱和盐胁迫下的适应能力。CLE肽还能够激活特定的信号通路，调节植物细胞的离子平衡，从而减少盐对植物生长的抑制作用。此外，CLE家族在增强植物对病害的抵抗中也发挥了重要作用。

目前，CLE小肽在水稻耐盐碱性中的作用研究仍处于初期阶段。

发明内容

为解决上述问题，本发明提供了OsCLE48基因在提高植物耐盐碱性中的应用。

进一步的，所述OsCLE48基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示或与SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列具有95％或95％以上一致性或同一性且表达相同功能蛋白质。

进一步的，所述OsCLE48蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示或如SEQ ID NO.2所示序列的N端和/或C端连接蛋白标签后得到的融合蛋白。

本发明还提供了OsCLE48蛋白在提高植物耐盐碱性中的应用。

本发明还提供了OsCLE48基因、OsCLE48蛋白在耐盐碱植物育种中的应用。

进一步的，所述植物包括水稻、玉米和大麦。

本发明还提供了一种提高植物耐盐碱性的方法，敲除植物中OsCLE48基因或降低OsCLE48蛋白的表达。

本发明还提供了一种耐盐植物育种方法，其特征在于，包括上述提高植物耐盐碱性的方法。

本发明具有以下有益效果：

1.本发明首次克隆并分析了水稻中响应盐碱胁迫的CLE家族基因OsCLE48，公布了其核苷酸序列、氨基酸序列及启动子序列，对阐明水稻耐盐碱性调控的分子机制及育种具有重要意义。

2.本发明通过转基因手段证实了OsCLE48基因参与水稻耐盐碱性，其中敲除该基因显著提高了水稻的耐盐碱性，表明OsCLE48是负调控因子。

3.OsCLE48基因在大麦和玉米中具有同源基因，敲除这些作物中的同源基因可提高它们的耐盐碱性。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1.OsCLE48基因编辑示意图，其中：(A)为OsCLE48的基因结构及其基因编辑类型，(B)为OsCLE48的蛋白结构示意图及保守肽段的氨基酸序列；

图2.OsCLE48基因的表达模式图，其中：(A)为OsCLE48基因在水稻不同组织的表达模式图，(B)为OsCLE48基因在水稻根部盐碱胁迫(20mM Na₂CO₃(pH＝9))下不同处理时间的表达模式图；

图3.OsCLE48基因的突变体材料在盐碱胁迫下的表型差异，其中：(A)为植株表型照片，展示在苗龄14天时，突变体材料和野生型在20mM Na₂CO₃(pH＝9)条件下处理10天后的耐盐碱性差异，(B)对照及处理后野生型与突变体材料的存活率图，(C)对照及处理后野生型与突变体材料的根部及地上部鲜重比较图。

图4.OsCLE48蛋白的亚细胞定位图。

图5.水稻OsCLE48在大麦、玉米中的同源基因氨基酸序列比对图，其中红色方框为功能肽段序列。

具体实施方式

现详细说明本发明的多种示例性实施方式，实施例中方法如无特殊说明均采用常规方法，使用试剂如无特殊说明，均为常规市售试剂或采用常规方法配置的试剂。该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值，以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。

在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。

关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。

如需获取本发明的OsCLE48基因敲除突变体株系，可联系湖南农业大学农学院的吴德志教授，地址：湖南省长沙市芙蓉区湖南农业大学生命科学楼南409；邮编410128。

以下实施例中所涉及的引物序列见下表：

实施例1：中花11和突变体(cle48)植株鉴定及OsCLE48基因克隆

为进一步研究OsCLE48基因在水稻耐盐碱性中的功能，本发明人以水稻品种中花11为背景，通过CRISPR/Cas9基因编辑技术构建了OsCLE48基因的功能缺失突变体。

具体步骤如下：

1)种子处理与培养

将突变体种子表面消毒，采用3％(v/v)过氧化氢溶液处理30分钟后，用蒸馏水清洗5次。消毒后的种子播种于发芽盒中，在培养箱中培养10天，获得水稻幼苗。

2)DNA提取与PCR扩增

剪取水稻幼嫩叶片，使用CTAB法提取水稻基因组DNA。以所提取的DNA为模板，使用引物OsCLE48-CDS-F(SEQ ID NO.4)和OsCLE48-CDS-R(SEQ ID NO.5)进行PCR扩增，扩增得到目的基因的编码区。利用野生型中花11的DNA作为对照扩增，所得的PCR产物经过测序确认，结果显示该片段的核苷酸序列与SEQ ID NO.1一致。

3)OsCLE48启动子区域的扩增

以野生型中花11的DNA为模板，采用引物OsCLE48-promoter-F(SEQ ID NO.8)和OsCLE48-promoter-R(SEQ ID NO.9)进行PCR扩增，获得大约2kb的启动子区域。测序结果表明该启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

4)突变体鉴定

在所构建的突变体中，本发明选择了两个纯合突变体株系：cle48-1和cle48-5。通过测序分析，cle48-1在OsCLE48基因中插入1个A碱基，而cle48-5插入2个A碱基(图1A)，两种突变均导致移码突变，表明这两个株系均为功能性敲除突变体。

5)基因翻译与氨基酸序列分析

利用SnapGene软件将克隆获得的OsCLE48基因的CDS序列进行翻译，得到其编码的氨基酸序列(SEQ ID NO.2)，示意图如图1B所示。

上述涉及的PCR反应程序为：95℃5min，95℃30s，60℃30s，72℃20s，72℃5min，35循环。

PCR反应体系如下表：

PrimerSTAR(Takara)体系	μL
		2×Mix	10
PrimerF/R	1/1
		ddH₂O	7
DNA模板	1

实施例2：OsCLE48基因的表达模式分析

为探讨OsCLE48基因在不同组织及盐碱胁迫下的表达模式，本发明通过荧光定量q-PCR对水稻中花11的不同组织及盐碱胁迫处理后的OsCLE48基因表达水平进行了分析。结果表明，该基因主要在水稻根系中表达，且受盐碱胁迫诱导显著上调(图2)。

实验步骤如下：

1)植物材料准备

按照实施例1的方法，培养水稻中花11至两周苗龄。分别收集水稻的根部(Root)、茎基部(Basal stem)、叶片(Leafblade)、叶柄(Leafsheath)等组织，每种组织均设置3个生物学重复。收集的组织样品迅速用液氮速冻保存，以备后续RNA提取。

2)RNA提取与反转录

利用诺唯赞公司提供的RC411试剂盒提取水稻总RNA。提取后，利用Nanodrop测定RNA的浓度，并将其定量至500ng，用于后续的反转录反应。使用反转录试剂盒(R323，诺唯赞)，将RNA逆转录为cDNA。

3)qPCR反应

使用OsCLE48基因的特异性引物OsCLE48-CDS-F(SEQ ID NO.4)和OsCLE48-CDS-R(SEQ ID NO.5)，以Actin基因作为内参，检测OsCLE48基因在不同组织以及在盐碱胁迫下不同时间点的表达量。

4)qPCR试剂与反应条件

实验采用TSINGKE TSE401 ArtiCanCEO SYBR qPCR Mix试剂盒，按照试剂盒说明进行qPCR反应。每个样品进行3个技术重复。qPCR反应体系如下表所示：

SYBRgreen(擎科)体系	μL
		2×Mix	10
PrimerF/R	0.5/0.5
		ddH₂O	7
cDNA模板	2

实施例3：中花11和突变体(cle48)植株耐盐碱性鉴定

本实施例通过耐盐碱胁迫实验，进一步验证了OsCLE48基因敲除对水稻耐盐碱性的影响。具体步骤如下：

1)水稻幼苗的培养

将水稻中花11、OsCLE48-1、OsCLE48-5突变体种子表面消毒后，置于木村B营养液中水培，培养至水稻幼苗两周。

2)盐碱处理

两周后，将幼苗转移至含有20mM Na₂CO₃(pH＝9)的木村B营养液中处理10天，作为盐碱胁迫处理组。同期设置正常营养液处理组作为对照。

3)表型观察与存活率记录

处理结束后，记录各组水稻的生长情况。结果如图3A和3B所示，盐碱胁迫后，OsCLE48突变体植株的生长情况显著优于野生型中花11，表现为更好的植株状态和更高的存活率。

4)鲜重测定

胁迫处理后，分别收集各组水稻的地上部和根部，测定其鲜重。结果如图3C所示，突变体OsCLE48-1和OsCLE48-5的地上部鲜重在盐碱胁迫后显著高于野生型中花11，表明OsCLE48的敲除有助于增强水稻的耐盐碱性。

实施例4：OsCLE48的亚细胞定位

为了明确OsCLE48基因的亚细胞定位，发明人通过构建OsCLE48的亚细胞定位载体，并将其转化至本氏烟草中表达，结果表明OsCLE48定位于细胞质外体区域(图4)，进一步证实了该基因编码一个分泌型小肽。实验步骤如下：

1)OsCLE48的亚细胞定位载体构建

以克隆所得的OsCLE48编码区为模板，使用引物OsCLE48-ZL035-F(SEQ ID NO.6)和OsCLE48-ZL035-R(SEQ ID NO.7)进行PCR扩增，回收扩增产物。随后，利用SalI酶对亚细胞定位载体ZL035进行酶切反应(37℃30分钟)，并回收酶切产物。通过同源重组法，将OsCLE48克隆至ZL035载体内，测序验证成功后，转化至农杆菌菌株EHA105。

2)农杆菌培养与烟草注射

将转化成功的农杆菌单克隆于5ml LB培养基中过夜培养，培养至OD600达到1.0。收集菌体后，利用烟草转化缓冲液重悬至OD600＝0.8，室温静置3小时。与烟草细胞膜定位Marker(AtPIP2A-RFP)农杆菌菌株等体积混合，注射至本氏烟草叶片中。烟草转化缓冲液配方如下：

烟草转化缓冲液配方(pH＝5.6)	浓度
		MgCl₂(氯化镁)	10mM
MES(脂肪酸甲酯磺酸钠)	10mM
		AS(乙酰丁香酮)	150μM
ddH₂O(双蒸水)	-

3)荧光显微观察

注射后烟草在培养箱中培养48小时，使用激光共聚焦显微镜(蔡司LSM 980)拍摄荧光信号。结果显示，OsCLE48定位于细胞质外体区域，与细胞膜定位Marker无重叠信号，表明该基因在细胞质外体发挥作用。

实施例5：OsCLE48基因物种保守性分析

为了探究OsCLE48基因在其他植物中的保守性，发明人使用BlAST方法在EnsemblPlants数据库中检索该基因在玉米和大麦中的同源序列。在玉米和大麦中检索到的OsCLE48同源基因显示出与水稻OsCLE48基因高度的保守性。比对结果表明，这些同源基因在氨基酸序列上几乎一致，仅在功能肽段序列中发现1个氨基酸的差异(见图5)。分析结果显示，OsCLE48基因在不同植物物种间具有显著的保守性，提示其可能在调控耐盐碱性方面发挥重要作用。

综上所述，OsCLE48基因对水稻的耐盐碱性表现为负调控，敲除该基因或降低其表达量可以增强水稻的耐盐碱性。该基因在其他作物(如玉米和大麦)中的保守性，进一步支持了其在植物耐盐碱性调控中的潜在应用价值。这为今后在其他作物中利用OsCLE48基因提高耐盐碱性提供了理论基础和实践依据。

Claims

1.OsCLE48基因在提高植物耐盐碱性中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述OsCLE48基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示或与SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列具有95％或95％以上一致性或同一性且表达相同功能蛋白质。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述OsCLE48蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示或如SEQ ID NO.2所示序列的N端和/或C端连接蛋白标签后得到的融合蛋白；所述OsCLE48基因的启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

4.OsCLE48蛋白在提高植物耐盐碱性中的应用。

5.OsCLE48基因、OsCLE48蛋白在耐盐碱植物育种中的应用。

6.根据权利要求1-6任一项所述的应用，其特征在于，所述植物包括水稻、玉米和大麦。

7.一种提高植物耐盐碱性的方法，其特征在于，敲除植物中的OsCLE48基因或降低其基因和蛋白的表达。

8.一种耐盐植物育种方法，其特征在于，包括权利要求7所述提高植物耐盐碱性的方法。