CN102892890A - 具有增强的产量相关性状的植物和用于制备该植物的方法 - Google Patents

Abstract

本发明总体上涉及分子生物学领域并涉及用于增强植物中多种经济重要的产量相关性状的方法。更具体地，本发明涉及用于通过调节植物中编码2型CLE多肽或BI-1多肽或SEC22多肽的核酸表达来增强植物中产量相关性状的方法。本发明也涉及具有受调节的编码2型CLE多肽或BI-1多肽或SEC22多肽的核酸表达的植物，所述植物相对于对照植物具有增强的产量相关性状。本发明也提供了在实施本发明方法中有用的包含编码2型CLE的核酸的构建体。本发明也提供了在实施本发明方法中有用的编码迄今未知的BI-1的核酸和包含这些核酸的构建体。本发明也提供了在实施本发明方法中有用的编码迄今未知的SEC22的核酸和包含这些核酸的构建体。

Description

具有增强的产量相关性状的植物和用于制备该植物的方法

本发明总体上涉及分子生物学领域并且涉及用于通过调节植物中编码2型CLE多肽的核酸表达而增强植物中产量相关性状的方法。本发明还涉及具有编码2型CLE多肽的核酸的受调节表达的植物，所述植物相对于对应野生型植物或其他对照植物具有增强的产量相关性状。本发明也提供用于本发明方法中的构建体。

本发明总体上涉及分子生物学领域并涉及用于增强植物中多种经济重要的产量相关性状的方法。更具体地，本发明涉及用于通过调节植物中编码BI-1多肽的核酸表达增强植物中产量相关性状的方法。本发明也涉及具有受调节的编码BI-1多肽的核酸表达的植物，所述植物相对于对照植物具有增强的产量相关性状。本发明也提供了在实施本发明方法中有用的编码迄今未知的BI1的核酸和包含这些核酸的构建体。

本发明总体上涉及分子生物学领域并且涉及用于通过调节植物中编码SEC22多肽的核酸表达增强植物中产量相关性状的方法。本发明还涉及具有编码SEC22多肽的核酸的受调节表达的植物，所述植物相对于对应野生型植物或其他对照植物具有增强的产量相关性状。本发明也提供用于本发明方法中的构建体。

持续增长的世界人口和农业用可耕地供应萎缩刺激了有关增加农业效率的研究。常规的作物及园艺学改良手段利用选择性育种技术以鉴定具有受欢迎特性的植物。然而，此类选择性育种技术具有几个缺陷，即这些技术一般耗费很多劳动并且产生这样的植物，其经常含有异源性遗传组分，其可能不总是导致从亲代植物中传递下去的所希望性状。分子生物学进展已经允许人类改良动物及植物的种质。植物的遗传工程使得可以分离和操作遗传物质(一般处于DNA或RNA形式)并且随后导入该遗传物质至植物中。此类技术具有产生具备多种经济学、农学或园艺学改良性状的作物或植物的能力。

具有特殊经济意义的性状是增加的产量。产量通常定义为来自作物的经济价值的可测量结果。该结果可以就数量和/或品质方面进行定义。产量直接取决于几个因素，例如器官的数目和大小、植物构造(例如枝的数目)、种子产生、叶衰老等。根发育、养分摄入量、胁迫耐受性和早期生长势(earlyvigor)也可以是决定产量的重要因素。优化前述因素因而可以对增加作物产量有贡献。

种子产量是特别重要的性状，因为众多植物的种子对人与动物营养是重要的。作物如谷物、稻、小麦、卡诺拉油菜和大豆占超过一半的人类总热量摄入量，无论通过直接消费种子本身或通过消费基于加工的种子而产生的肉产品。作物也是糖、油及工业加工中所用众多类型代谢物的来源。种子含有胚(新苗和新根的起源)和胚乳(萌发期间和幼苗早期生长期间用于胚生长的养分来源)。种子发育涉及多种基因并且需要代谢物从根、叶和茎转移至正在生长的种子中。胚乳尤其同化糖类、油和蛋白质的代谢前体并且将它们合成为贮藏大分子以灌满籽粒。

众多作物的另一个重要性状是早期生长势。改进早期生长势是现代稻育种计划在温带和热带稻品种上的重要目标。长根在水栽稻中对于正确土壤固定是重要的。在将稻直接播种至被淹没田地的情况下，以及在植物必须从水中迅速出苗的情况下，较长的苗与生长势相关。在实施条播的情况下，较长的中胚轴和胚芽鞘对于幼苗良好出苗是重要的。将早期生长势人工改造到植物内的能力将在农业中是极其重要的。例如，不良的早期生长势已经限制了基于玉米带种质(Corn Belt germplasm)的玉米(Zea mayes L.)杂种在欧洲大西洋地区的引种。

又一个重要性状是改进的非生物胁迫耐受性。非生物胁迫是世界范围作物损失的主要原因，对于大多数主要作物植物而言降低平均产量超过50％(Wang等人，Planta 218：1-14，2003)。非生物胁迫可以由干旱、盐度、极端温度、化学毒性和氧化胁迫引起。改善植物对非生物胁迫耐受性的能力将在世界范围对农民而言是巨大的经济优势并且会允许在不利条件期间及在作物栽培否则是不可能的陆地上栽培作物。

作物产量因而可以通过优化前述因素之一而增加。

取决于最终用途，对某些产量性状的改良可能优先于其它的产量性状。例如对于应用如饲料或木材生产或生物燃料资源而言，增加植物营养体部分可能是希望的，而对于应用如面粉、淀粉或油生产而言，增加种子参数可能是尤其希望的。即便在种子参数当中，某些参数可以更优先于其它参数，这取决于应用。多种机制可以对增加种子产量有贡献，无论其形式为增加的种子大小或是增加的种子数目。

增加植物中产量(种子产量和/或生物量)的一种方法可以是通过调节植物的内在生长机制如细胞周期或参与植物生长或参与防御机制的多种信号传导途径。

现在已经发现，可以通过调节植物中编码2型CLE或Bax抑制物-1(BI-1)多肽或其同源物或SEC22的核酸的表达而改善植物中的多种产量相关性状。

背景

2型CLE多肽

CLE多肽代表带有推定的N端分泌信号的小蛋白(＜15kDa)的一个植物特异性家族，所述小蛋白据报道参与信号传导过程(Whitford等人，ProcNatl Acad Sci USA，105(47)：18625-30，2008)。它们均在C端或接近C端共享12至14个氨基酸的保守结构域。Whitford等人将CLE肽组分成组A和组B，其中组A包含2型CLE多肽。WO 2007/138070公开了一种CLE多肽，其中与缺少CLE样转基因的植物相比，当所述CLE多肽在种子中的表达下调时引起较高的种子产量(表述为充实种子数、种子总重量、种子总数和收获指数)；然而，所用的CLE多肽不属于2型CLE多肽组。WO01/96582公开了异位表达包含氨基酸基序KRXXXXGXXPXHX(其中X可以是任何氨基酸)的多种LLP产生不育转基因植物或最多地，产生具有降低能育性的植物。

Bax抑制物-1(BI-1)多肽

Bax抑制物-1蛋白(BI-1)是内质网(ER)和核被膜中带有6至7个跨膜结构域和一个胞质C末端的跨膜蛋白(H ückelhoven，2004，Apoptosis9(3)：299-307)。它们是普遍存在的并且存在于真核及原核生物中。在植物中，它们属于一个小基因家族，例如，拟南芥属(Arabidopsis)中的直至3个成员，并且在多种组织中、在老化期间和应答于非生物及生物胁迫时表达。

已经显示，BI-1蛋白可能具有保护作用对抗由线粒体功能障碍或ER胁迫相关机制引起的细胞死亡。同样，BI-1在植物病原体相互作用期间的作用也已经报道并且其活性可能由Ca²⁺借助CaM-结合来调节(Kamai-Yamada等人(2000，J.Biol Chem.284(41)：27998-8003；Watanabe和Lam，2009，Int J.Mol.Sci.10(7)：3149-67)。另外，Nagano等人(2009，Plant J.，58(1)：122-134)鉴定了一种参与鞘脂代谢的BI-1相互作用蛋白(ScFAH1)，它也定位于ER膜。鉴于鞘脂在活化PCD中的作用，这项研究结果与BI-1作为变阻器(rheostat)调节ER胁迫途径下游的PCD的作用十分一致(Watanabe和Lam，2008，Plant Signal Behavior.3(8)：564-6)。

SEC22多肽

在全部真核细胞中，小泡运输对于维持细胞功能和细胞器功能是至关重要的。N乙基顺丁烯二酰亚胺敏感因子衔接子蛋白受体超家族(SNAREs在小泡/细胞器身份和交换方面发挥关键作用。转运小泡携带来自供体区室的多种载货蛋白至靶区室，并且通过与靶区室的膜融合将载货释放入靶区室中。SNARE分子具有通过在每个转运步骤中形成特异性反式SNARE复合物而启动转运小泡和靶膜之间膜融合的中心作用。SNARE多肽自发形成高度稳定的蛋白质-蛋白质相互作用，所述相互作用有助于克服膜融合所需要的能垒。与其他真核生物相比，高等植物在它们的基因组中编码较多数目的SNARE蛋白。植物缺少特定的SNARE蛋白亚家族，但是也已经演化出少数新类型的SNARE。例如，植物缺少小突触泡蛋白，一类具有N端短调节结构域的SNARE蛋白。SNAREs可以基于它们的亚细胞定位(功能性分类)或根据不变氨基酸残基在SNARE基序中央的出现(结构性分类)进行分类。功能性分类将SNARE分成小泡相关的和靶膜相关的SNARE(分别为v-SNARE和t-SNARE)。备选地，在结构性分类下，SNARE可以分组为Q-SNARE和R-SNARE，原因在于保守的谷氨酰胺或精氨酸残基在SNARE结构域的中央出现。通常，t-SNARE对应于Q-SNARE，并且v-SNARE对应于R-SNARE。小泡驻留性R-SNARE常命名为VAMP(小泡相关膜蛋白)。R-SNARE可以具有短或长的N端调节区，进一步将它们再划分为小蛋白(brevins)(拉丁语缩写brevis，短小)和长蛋白(longins)(拉丁语缩写longus，长)。全部已知的植物R-SNARE属于长蛋白类别(Uemura等人2005；FEBS Lett.579：2842-46)。另外，SNARE蛋白是以存在特定肽结构域SNARE基序为特征的小型多肽(大约200-400个氨基酸)(Jahn和Scheller 2006Nature Reviews 631-643)。SNARE结构域是60-70个氨基酸的片段，由可以借助异源寡聚相互作用形成卷曲螺旋结构的七肽重复序列组成。SNARE与脂质双层的结合经常由C端跨膜结构域(小突触泡蛋白结构域)引起赋予。然而，一些SNARE借助脂质锚形体与膜连接。除SNARE结构域和C端跨膜结构域(小突触泡蛋白结构域)之外，许多SNARE还含有与一系列辅助多肽一起控制体内SNARE蛋白活性的N端调节序列基序。

由植物基因组编码的R-SNARE可以分成3个主要亚家族：VAMP、YKT6和SEC22(Lipka等人Annu.Rev.Annu.Rev.Cell Dev.Biol.2007.23：147-74)。全部的植物R-SNARE是包含延长的N端片段(长蛋白结构域)的所谓长蛋白，其中基于来自人R-SNARE的数据，所述长蛋白可以参与亚细胞定位和SNARE复合物形成，例如，通过与调节性多肽相互作用做到这些(Uemura等人2005；FEBS Lett.579：2842-46)。除了最近发现的耐盐表型(Leshem等人，2006，Proc Natl Acad Sci USA 103：18008-13)之外，在任何拟南芥RSNARE突变体中没有发现其他表型，这表明大部分RSNARE至少部分冗余地发挥作用，这导致难以在植物中推断它们的功能。在植物原生质体中的过量表达研究提出，Sec22和Memb11参与ER-高尔基交界处的顺向转运蛋白质运输(Chatre等人Plant Physiol，2005，第139卷，第1244-1254页)。

概述

2型CLE多肽

出人意料地，现在已经发现，调节编码2型CLE多肽的核酸表达产生了相对于对照植物具有增强的产量相关性状、尤其增加的产量的植物。根据一个实施方案，提供了用于相对于对照植物改善植物中产量相关性状的方法，所述方法包括调节植物中编码2型CLE多肽的核酸表达。

Bax抑制物-1(BI-1)多肽

出人意料地，现在已经发现，调节编码Bax抑制物-1(BI-1)多肽的核酸表达产生这样的植物，所述植物相对于对照植物具有增强的产量相关性状、相对于对照植物特别地具有增加的产量并且相对于对照植物更特别地具有增加的种子产量和/或增加的生物量。根据一个实施方案，提供了用于相对于对照植物增强植物中如本文中提供的产量相关性状的方法，所述方法包括调节植物中编码如本文定义的Bax抑制物-1多肽的核酸表达。

SEC22多肽

出人意料地，现在已经发现，调节编码SEC22多肽的核酸的表达产生了相对于对照植物具有增强的产量相关性状的植物。根据一个实施方案，提供了用于相对于对照植物改善植物中产量相关性状的方法，所述方法包括调节植物中编码SEC22多肽的核酸表达。

在一个优选的实施方案中，目的蛋白(POI)是2型CLE多肽。在第二优选的实施方案中，目的蛋白(POI)是Bax抑制物-1(BI-1)多肽。在第三优选的实施方案中，目的蛋白(POI)是SEC22多肽。

定义

以下定义将在本说明书中自始至终使用。

多肽/蛋白质

术语“多肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用并且指由肽键连接在一起的处于任意长度的聚合形式下的氨基酸。

多核苷酸/核酸/核酸序列/核苷酸序列

术语“多核苷酸”、“核酸序列”、“核苷酸序列”、“核酸”、“核酸分子”在本文中可互换地使用并且指任意长度的聚合非分支形式的核苷酸：核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸，或这二者的组合。

同源物

蛋白质的“同源物”包括这样的肽、寡肽、多肽、蛋白质和酶，它们相对于所讨论的未修饰蛋白具有氨基酸置换、缺失和/或插入并且与作为所述肽、寡肽、多肽、蛋白质和酶来源的未修饰蛋白具有相似的生物学活性和功能活性。

缺失指从蛋白质中移除一个或多个氨基酸。

插入指一个或多个氨基酸残基在蛋白质中预定位点内的导入。插入可以包含单个或多个氨基酸的氨基端融合和/或羧基端融合以及序列内插入。通常，在氨基酸序列内部的插入会比氨基端融合或羧基端融合更小，约1-10个残基级别。氨基端或羧基端融合蛋白或融合肽的实例包括如酵母双杂交系统中所用的转录激活物的结合结构域或激活结构域、噬菌体外壳蛋白、(组氨酸)-6-标签、谷胱甘肽S-转移酶-标签、蛋白A、麦芽糖结合蛋白、二氢叶酸还原酶、Tag·100表位、c-myc表位、

-表位、lacZ、CMP(钙调蛋白结合肽)、HA表位、蛋白C表位和VSV表位。

置换指将蛋白质的氨基酸以具有相似特性(如相似疏水性、亲水性、抗原性、形成或破坏α-螺旋结构或β-折叠结构的倾向)的其它氨基酸替换。氨基酸置换一般是单个残基的，不过可以是簇集性的，这取决于置于多肽上的功能性约束条件，并且可以为1到10个氨基酸变动；插入通常会是约1-10个氨基酸残基级别。氨基酸置换优选地是保守性氨基酸置换。保守性置换表是本领域熟知的(见例如Creighton(1984)Proteins.W.H.Freemanand Company(编著)和下表1)。

表1：保守性氨基酸置换的实例

残基	保守性置换	残基	保守性置换
				Ala	Ser	Leu	Ile；Val
Arg	Lys	Lys	Arg；Gln
				Asn	Gln；His	Met	Leu；Ile
Asp	Glu	Phe	Met；Leu；Tyr
				Gln	Asn	Ser	Thr；Gly
Cys	Ser	Thr	Ser；Val
				Glu	Asp	Trp	Tyr
Gly	Pro	Tyr	Trp；Phe
				His	Asn；Gln	Val	Ile；Leu
Ile	Leu，Val

氨基酸置换、缺失和/或插入可以使用本领域熟知的肽合成技术如固相肽合成法等或通过重组DNA操作而容易地进行。用于操作DNA序列以产生蛋白质的置换、插入或缺失变体的方法是本领域熟知的。例如，用于在DNA中的预定位点处产生置换突变的技术是本领域技术人员熟知的并且包括M13诱变法、T7-Gen体外诱变法(USB，Cleveland，OH)、QuickChange位点定向诱变法(Stratagene，San Diego，CA)、PCR介导的位点定向诱变或其他位点定向诱变法。

衍生物

“衍生物”包括这样的肽、寡肽、多肽，其中与天然存在形式的蛋白质(如目的蛋白)的氨基酸序列相比，它们包含以非天然存在的氨基酸残基对氨基酸的置换或者非天然存在的氨基酸残基的添加。蛋白质的“衍生物”也包含这样的肽、寡肽、多肽，其中与所述多肽的天然存在形式的氨基酸序列相比，它们包含天然存在的改变(糖基化、酰化、异戊二烯化、磷酸化、肉豆蔻酰化、硫酸盐化等)的氨基酸残基或非天然改变的氨基酸残基。与衍生物所来源的氨基酸序列相比，该衍生物可以也包含与所述氨基酸序列共价或非共价结合的一个或多个非氨基酸置换或添加(例如报道分子或其它配体)，如为促进检测该衍生物而结合的报道分子，和与天然存在的蛋白质的氨基酸序列相对比的非天然存在的氨基酸残基。此外，“衍生物”也包括天然存在形式蛋白质与标签肽如FLAG、HIS6或硫氧还蛋白(对于标签肽的综述，见Terpe，Appl.Microbiol.Biotechnol.60，523-533，2003)的融合物。

直向同源物/旁系同源物

直向同源物和旁系同源物包含用来描述基因祖先关系的进化概念。旁系同源物是相同物种内起源于先祖基因复制的基因；而直向同源物是来自不同生物的起源于物种形成的基因，并且也源自共同的祖先基因。

结构域、基序/共有序列/标签

术语“结构域”指沿进化相关蛋白质的序列比对结果而在特定位置处保守的一组氨基酸。尽管在其他位置处的氨基酸可以在同源物之间不同，然而在特定位置处高度保守的氨基酸指示在蛋白质结构、稳定性或功能方面可能是必需的氨基酸。结构域因通过在蛋白质同源物家族的比对序列中的高保守程度而被鉴定，它们可以用作鉴定物以确定任意的所讨论多肽是否属于先前已鉴定的多肽家族。

术语“基序”或“共有序列”或“标签”指在进化相关蛋白质的序列中的短保守区。基序往往是结构域的高度保守部分，不过也可以仅包括该结构域的部分，或可以位于保守结构域之外(若该基序的全部氨基酸位于定义的结构域之外)。

存在用于鉴定结构域的专业数据库，例如，SMART(Schultz等人，(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95，5857-5864；Letunic等人，(2002)NucleicAcids Res 30，242-244)、InterPro(Mulder等，(2003)Nucl.Acids.Res.31，315-318)、Prosite(Bucher和Bairoch(1994)，A generalized profile syntax forbiomolecular sequences motifs and its function in automatic sequenceinterpretation(用于生物分子序列基序的概括特征结构及其在自动化序列解读中的功能)(引自)ISMB-94；第二届分子生物学智能系统国际会议文集(Proceedings 2nd International Conference on Intelligent Systems forMolecular Biology).Altman R.，Brutlag D.，Karp P.，Lathrop R.，Searls D.编著，第53-61页，AAAI Press，Menlo Park；Hulo等，Nucl.Acids.Res.32：D134-D137，(2004))或Pfam(Bateman等，Nucleic Acids Research 30(1)：276-280(2002))。一组用于计算机芯片上分析蛋白质序列的工具是在ExPASY蛋白质组服务器上可获得的(瑞士生物信息研究所(Gasteiger等人，ExPASy：The proteomics server for in-depth protein knowledge andanalysis(用于深入认识和分析蛋白质的蛋白质组服务器)，Nucleic AcidsRes.31：3784-3788(2003))。也可以使用常规技术如通过序列比对鉴定结构域或基序。

用于比对序列以比较的方法是本领域熟知的，此类方法包括GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA和TFASTA。GAP使用Needleman和Wunsch算法((1970)J Mol Biol 48：443-453)以找到使匹配数最大化并使空位数最小化的两个序列的总体(即，覆盖完整序列的)比对结果。BLAST算法(Altschul等人，(1990)J Mol Biol 215：403-10)计算序列同一性百分数并且开展两个序列之间相似性的统计学分析。用于开展BLAST分析的软件是通过国家生物技术信息中心(NCBI)可公开获得的。同源物可以使用例如ClustalW多重序列比对算法(版本1.83)，以默认配对比对参数和百分数评分方法轻易地鉴定。也可以使用MatGAT软件包中的可用方法之一确定相似性和同一性的总体百分数(Campanella等，BMC Bioinformatics.2003年7月10日；4：29.MatGAT：an application that generates similarity/identity matricesusing protein or DNA sequences(MatGAT：使用蛋白质序列或DNA序列产生相似性/同一性矩阵的一种应用)。如对本领域技术人员显而易见，可以进行少许手工编辑以优化保守基序之间的比对。此外，作为使用全长序列鉴定同源物的替代，也可以使用特定的结构域。使用上文提及的程序，使用默认参数，可以确定在完整核酸或氨基酸序列范围或所选结构域或保守基序范围内的序列同一性值。对于局部比对，Smith-Waterman算法是特别有用的(Smith TF，Waterman MS(1981)J.Mol.Biol 147(1)；195-7)。

交互式BLAST

通常，这包括第一BLAST，其中所述的第一BLAST包括将查询序列(例如使用实施例部分的表A中列出的任意序列)针对任意序列数据库，如可公开获得的NCBI数据库进行BLAST。从核苷酸序列开始时，一般使用BLASTN或TBLASTX(使用标准默认值)，并且从蛋白质序列开始时，使用BLASTP或TBLASTN(使用标准默认值)。可以任选地筛选BLAST结果。筛选结果或非筛选结果的全长序列随后针对来自衍生查询序列的生物中的序列进行反向BLAST搜索(第二BLAST)。随后比较第一BLAST和第二BLAST的结果。如果来自第一blast的高阶位命中是来自与衍生该查询序列的物种相同的物种，则鉴定到旁系同源物，随后的反向BLAST理想地产生最高命中当中的所述查询序列；若在第一BLAST中的高阶位命中不是来自与衍生该查询序列的物种相同的物种，则鉴定到直向同源物，并且当反向BLAST时，优选地产生属于最高命中的所述查询序列。

高阶位命中是具有低E-值的那些命中。E-值越低，评分越显著(或换句话说，偶然发现该命中的几率越低)。E-值的计算是本领域熟知的。除了E-值外，比较结果也由同一性百分数评定。同一性百分数指所比较的两个核酸(或多肽)序列之间在特定长度范围内的相同核苷酸(或氨基酸)的数目。在大型家族的情况下，可以使用ClustalW，随后使用邻接树法，以帮助观察相关基因的聚类并鉴定直向同源物和旁系同源物。

杂交

如本文中所定义的术语“杂交”是其中基本上同源的互补核苷酸序列相互复性的过程。杂交过程可以完全在溶液中进行，即两种互补性核酸均处于溶液中。杂交过程也可以在互补性核酸之一固定到基质如磁珠、琼脂糖凝胶(Sepharose)珠或任何其他树脂的情况下发生。杂交过程也可以在互补性核酸之一固定至固相支持体如硝酸纤维素膜或尼龙膜上或通过例如照相平版印刷术固定至例如硅酸玻璃支持物(后者称作核酸阵列或微阵列或称作核酸芯片)上的情况下进行。为使杂交发生，通常将核酸分子热变性或化学变性以使双链解链成为两条单链和/或去除来自单链核酸的发夹或其它二级结构。

术语“严格性”指杂交发生的条件。杂交的严格性受条件如温度、盐浓度、离子强度和杂交缓冲液组成的影响。通常，将低严格条件选择成在限定的离子强度和pH时，低于特定序列的热解链温度(T_m)约30℃。中等严格性条件是此时温度低于T_m约20℃并且高严格性条件是此时温度低于T_m约10℃。高严格杂交条件一般用于分离与靶核酸序列具有高序列相似性的杂交序列。然而，核酸可以在序列上偏离并且因遗传密码子的简并性而依旧编码基本上相同的多肽。因而，有时候可能需要中等严格杂交条件以鉴定此类核酸分子。

Tm是在确定的离子强度和pH时的温度，50％的靶序列在所述温度与完全匹配的探针杂交。T_m取决于溶液条件和探针的碱基组成及长度。例如，较长的序列在较高的温度下特异性杂交。从低于T_m约16℃直至32℃获得最大杂交速率。杂交溶液中一价阳离子的存在降低两条核酸链之间的静电排斥作用，因而促进杂交分子形成；这种作用对于高达0.4M的钠浓度是显而易见的(对于更高浓度，可以忽略这种作用)。甲酰胺降低DNA-DNA和DNA-RNA双链体的解链温度，每百分数甲酰胺降低0.6-0.7℃，并且添加50％甲酰胺允许在30-45℃进行杂交，虽然杂交速率会降低。碱基对错配降低杂交速率及双链体的热稳定性。平均而言并且对于大的探针来说，每％碱基错配Tm下降约1℃。根据杂交分子的类型，可以使用以下等式计算Tm：

1)DNA-DNA杂交分子(Meinkoth和Wahl，Anal.Biochem.，138：267-284，1984)：

T_m＝81.5℃+16.6xlog10[Na⁺]^a+0.41x％[G/C^b]-500x[L^c]^-1-0.61x％甲酰胺

2)DNA-RNA或RNA-RNA杂交分子：

Tm＝79.8+18.5(log10[Na⁺]^a)+0.58(％G/C^b)+11.8(％G/C^b)²-820/L^c

3)寡DNA杂交分子或寡RNA^d杂交分子：

对于＜20个核苷酸：T_m＝2(l_n)

对于20-35个核苷酸：T_m 22+1.46(l_n)

^a或对于其他一价阳离子，而仅在0.01-0.4M范围内是精确的。

^b仅对于％GC在30％至75％范围内是精确的。

^cL＝双链体的长度(以碱基对计)。

^dOligo，寡核苷酸；l_n，＝引物的有效长度＝2×(G/C数)+(A/T数)。

可以使用众多已知技术的任何一种控制非特异性结合，例如用含有蛋白质的溶液封闭薄膜、添加异源性RNA、异源性DNA和SDS至杂交缓冲液，并且用RNA酶处理。对于非同源性探针，可以通过改变以下条件之一进行一系列杂交：(i)渐进地降低复性温度(例如从68℃至42℃)或(ii)渐进地降低甲酰胺浓度(例如从50％至0％)。技术人员了解杂交期间可以加以改变和将维持或改变严格性条件的多种参数。

除了杂交条件之外，杂交特异性一般还取决于杂交后洗涤的功能。为除去因非特异性杂交所致的背景，样品用稀的盐溶液洗涤。此类洗涤的关键因素包括最终洗涤溶液的离子强度和温度：盐浓度越低并且洗涤温度越高，则洗涤的严格性越高。洗涤条件一般在杂交严格性上或低于杂交严格性而进行。阳性杂交产生至少两倍于背景信号的信号。通常，用于核酸杂交分析法或基因扩增检测方法的合适严格性条件如上所述。也可以选择更严格或更不严格的条件。技术人员了解洗涤期间可以加以改变和将维持或改变严格性条件的多种参数。

例如，用于长度大于50个核苷酸的DNA杂交分子的常见高严格杂交条件包括在65℃于1×SSC中或在42℃于1×SSC和50％甲酰胺中杂交，随后在65℃于0.3×SSC中洗涤。用于长度大于50个核苷酸的DNA杂交分子的中等严格杂交条件的实例包括在50℃于4×SSC或在40℃于6×SSC和50％甲酰胺中杂交，随后在50℃于2×SSC中洗涤。杂交分子的长度是杂交核酸的预期长度。当序列已知的核酸杂交时，可以通过比对序列并鉴定本文中所述的保守区而确定杂交分子长度。1×SSC是0.15M NaCl和15mM柠檬酸钠；杂交溶液和洗涤溶液可以额外地包括5×Denhardt试剂、0.5-1.0％SDS、100μg/ml变性的片段化鲑精DNA、0.5％焦磷酸钠。

为了定义严格性水平的目的，可以参考Sambrook等(2001)MolecularCloning：a laboratory manual，第3版，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，CSH，New York或参考Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，N.Y.(1989和年度更新版)。

剪接变体

如本文中所用的术语“剪接变体”包含其中已经切除、替换、移位或添加所选内含子和/或外显子或其中内含子已经缩短或加长的核酸序列的变体。此类变体将是基本上保留蛋白质的生物学活性的一类变体；这可以通过选择性地保留蛋白质的功能片段实现。此类剪接变体可以在自然界中找到或可以人工制造。用于预测和分离此类剪接变体的方法是本领域熟知的(见例如Foissac和Schiex(2005)BMC Bioinformatics.6：25)。

等位变体

等位基因或等位变体是给定基因的替代形式，位于相同染色体位置内。等位变体包含单核苷酸多态性(SNP)和小插入/缺失多态性(INDEL)。INDEL的尺寸通常小于100bp。SNP和INDEL形成在大部分生物的天然存在的多态性株系中的序列变体的最大集合。

内源基因

本文中对“内源”基因的称谓不仅指如植物中以其天然形式(即不存在任何人类干预情况下)存在的所讨论基因，还指处于分离形式的随后被(再)导入植物(转基因)的相同基因(或基本上同源的核酸/基因)。例如，含有这种转基因的转基因植物可以遇到转基因表达的明显降低和/或内源基因表达的明显降低。分离的基因可以从生物分离，或可以是人造的，例如通过化学合成法。

基因改组/定向进化

基因改组或定向进化的组成为：反复DNA改组，随后适当筛选和/或选择以产生编码具有改良生物学活性的蛋白质的核酸或其部分的变体而组成(Castle等人，(2004)Science 304(5674)：1151-4；美国专利5,811,238和6,395,547)。

构建体

额外的调节元件可以包括转录增强子以及翻译增强子。本领域技术人员将知道可能适用于实施本发明的终止子和增强子序列。如定义部分中描述，内含子序列也可以添加至5′非翻译区(UTR)或编码序列中，以提高胞质溶胶中积累的成熟信息的量。其他控制序列(除启动子、增强子、沉默子、内含子序列、3′UTR和/或5′UTR区域之外)可以是蛋白质和/或RNA稳定化元件。此类序列将是已知的或可以由本领域技术人员容易地获得。

本发明的基因构建体可以还包括用于特定细胞类型中维持和/或复制所需要的复制起点序列。一个实例是基因构建体需要作为游离型遗传元件(例如质粒或粘粒分子)在细菌细胞中维持的情况。优选的复制起点包括但不限于f1-ori和colE1。

为检测如本发明方法中所用核酸序列的成功转移和/或选择包含这些核酸的转基因植物，使用标记基因(或报道基因)是有利的。因此，所述基因构建体可以任选地包含一种选择标记基因。在本文的“定义”部分中更详细地描述选择标记。一旦不再需要所述标记基因时，可以从转基因细胞中移除或切除它们。用于标记移除的技术是本领域已知的，有用的技术在上文定义部分中描述。

调节元件/控制序列/启动子

术语“调节元件”、“控制序列”和“启动子”均在本文中可相互交换地使用并且在广泛含义上意指能够实现与之连接的序列表达的调节性核酸序列。术语“启动子”一般指位于基因转录起点上游并参与识别和结合RNA聚合酶及其他蛋白质，因而指导有效连接的核酸转录的核酸控制序列。前述术语包括从典型的真核基因组基因(包括对于精确转录启动所需的TATA框，具有或没有CCAAT框序列)衍生的转录调节序列和应答发育性刺激和/或外部刺激或以组织特异性方式而改变基因表达的额外调节元件(即上游激活序列、增强子和沉默子)。本术语中还包括典型的原核基因的转录调节序列，在此情况下它可以包括-35框序列和/或-10框转录调节序列。术语“调节元件”也包含赋予、激活或增强核酸分子在细胞、组织或器官中表达的合成融合分子或衍生物。

“植物启动子”包含介导编码序列区段在植物细胞中表达的调节元件。因此，植物启动子不需要是植物来源的，而是可以源自病毒或微生物，例如来自侵袭植物细胞的病毒。“植物启动子”也可以源自植物细胞，例如来自用待于本发明方法中表达并且在本文中描述的核酸序列所转化的植物。这也适用于其他“植物”调节性信号，如“植物”终止子。用于本发明方法中的核苷酸序列上游的启动子可以通过一个或多个核苷酸替换、插入和/或缺失进行修饰，但不干扰启动子、可读框(ORF)或3′调节区如终止子或远离ORF存在的其他3′调节区的功能性或活性。还有可能的是，所述启动子的活性因修饰其序列或它们被更活跃的启动子、甚至来自异源生物的启动子彻底替换而增加。为在植物中表达，如上所述，核酸分子必须有效连接至或包含合适的启动子，其中所述的启动子在正确时间点上并以所需要的空间表达模式表达基因。

为鉴定功能性等效启动子，候选启动子的启动子强度和/或表达模式可以通过将该启动子与报道基因有效连接并分析该报道基因在植物多种组织的表达水平和模式而进行分析。合适的熟知报道基因包括例如β-葡糖醛酸糖苷酶或β-半乳糖苷酶。启动子活性通过测量β-葡糖醛酸糖苷酶或β-半乳糖苷酶的酶活性进行分析。启动子强度和/或表达模式可以随后与参考启动子(如在本发明方法中使用的一种启动子)的启动子强度和/或表达模式比较。备选地，启动子强度可以使用本领域已知方法如RNA印迹法及放射自显影图的密度计分析法、定量实时PCR或RT-PCR(Heid等人，1996Genome Methods 6：986-994)，通过量化mRNA水平或通过将本发明方法中所用核酸的mRNA水平与持家基因(如18S rRNA)的mRNA水平比较进行分析。通常，“弱启动子”意指驱动编码序列以低水平表达的启动子。“低水平”意指在每个细胞约1/10,000转录物至约1/100,000转录物、至约1/500,0000转录物的水平。相反，“强启动子”驱动编码序列在高水平、或在每个细胞约1/10转录物至约1/100转录物、至约1/1000转录物上表达。通常，“中等强度启动子”意指以下的启动子，其驱动编码序列以低于强启动子的水平、尤其在全部情况以低于受35S CaMV启动子控制时所获得水平的水平上表达。

有效连接

如本文中所用的术语“有效连接”指启动子序列与目的基因之间功能性地连接，以至于启动子序列能够启动目的基因转录。

组成型启动子

“组成型启动子”指在生长和发育的大部分、但不必全部阶段期间和在大部分环境条件下在至少一个细胞、组织或器官内有转录活性的启动子。下表2a给出组成型启动子的实例。

表2a：组成型启动子的实例

遍在启动子

遍在启动子在生物的基本上全部组织或细胞中有活性。

发育调节性启动子

发育调节性启动子在某些发育阶段期间或在经历发育变化的植物的部分中有活性。

诱导型启动子

诱导型启动子在应答化学刺激(综述见Gatz 1997，Annu.Rev.PlantPhysiol.Plant Mol.Biol.，48：89-108)、环境刺激或物理刺激时具有受诱导或增加的转录启动作用，或可以是“胁迫可诱导的”，即当植物暴露于多种胁迫条件时被激活，或是“病原体可诱导的”，即当植物暴露于多种病原体时被激活。

器官特异性/组织特异性启动子

器官特异性或组织特异性启动子是能够优先在某些器官或组织如叶、根、种子组织等内启动转录的启动子。例如，“根特异性启动子”是在植物根中优势地具有转录活性的启动子，在植物的任何其它部分内基本上无活性，尽管在植物的这些其它部分内允许任何泄露表达。能够仅在某些细胞中启动转录的启动子在本文中称作“细胞特异的”。

下表2b中列出根特异性启动子的实例。

表2b：根特异性启动子的实例

种子特异性启动子主要在种子组织中有转录活性，但不必排他性地在种子组织中有转录活性(在泄露表达的情况下)。种子特异性启动子可以在种子发育期间和/或萌发期间有活性。种子特异性启动子可以是胚乳/糊粉/胚特异性的。下表2c至2f中显示种子特异性启动子(胚乳/糊粉/胚特异性)的实例。种子特异性启动子的其他实例在Qing Qu和Takaiwa(PlantBiotechnol.J.2，113-125，2004)中给出，所述文献的公开内容通过引用方式如完整给出那样并入本文。

表2c：种子特异性启动子的实例

表2d：胚乳特异性启动子的实例

表2e：胚特异性启动子的实例

基因来源	参考文献
		稻OSH1	Sato等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，93：8117-8122，1996
KNOX	Postma-Haarsma等人，Plant Mol.Biol.39：257-71，1999
		PRO0151	WO 2004/070039
PRO0175	WO 2004/070039
		PRO005	WO 2004/070039
PRO0095	WO 2004/070039

表2f：糊粉特异性启动子的实例

如本文中所定义的绿色组织特异性启动子是在绿色组织中优势地具有转录活性的启动子，在植物的任何其它部分内基本上无活性，尽管在该植物的这些其他部分内仍允许任何泄露表达。

下表2g中显示可以用来实施本发明方法的绿色组织特异性启动子的实例。

表2g：绿色组织特异性启动子的实例

基因	表达	参考文献
			玉米正磷酸二激酶	叶特异性	Fukavama等人，2001
玉米磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶	叶特异性	Kausch等人，2001
			稻磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶	叶特异性	Liu等人，2003
稻核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶小亚基	叶特异性	Nomura等人，2000
			稻β扩展蛋白EXBP9	苗特异性	WO 2004/070039
木豆(Pigeonpea)Rubisco小亚基	叶特异性	Panguluri等人，2005
			豌豆RBCS3A	叶特异性

组织特异性启动子的另一个实例是分生组织特异性启动子，其在分生组织中优势地具有转录活性，在植物的任何其它部分内基本上无活性，尽管在该植物的这些其他部分中仍允许任意泄露表达。下表2h中显示可以用来实施本发明方法的绿色分生组织特异性启动子的实例。

表2h：分生组织特异性启动子的实例

终止子

术语“终止子”包括这样的控制序列，其是在转录单位末端的DNA序列，发出对初级转录物进行3′加工和多聚腺苷化以及终止转录的信号。终止子可以衍生自天然基因、来自多种其他植物基因或来自T-DNA。待添加的终止子可以衍生自例如胭脂碱合酶基因或章鱼碱合酶基因或备选地来自另一种植物基因或较不优选地来自任何其他真核基因。

选择标记(基因)/报道基因

“选择标记”、“选择标记基因”或“报道基因”包括对细胞赋予表型的任何基因，其中在所述的细胞内表达所述基因以促进鉴定和/或选择用本发明的核酸构建体所转染或转化的细胞。这些标记基因能够通过一系列不同原理而鉴定核酸分子的成功转移。合适的标记可以选自赋予抗生素耐药性或除草剂抗性、导入新代谢性状或允许目视选择的标记。选择标记基因的实例包括赋予抗生素耐药性的基因(如使新霉素和卡那霉素磷酸化的nptII或使潮霉素磷酸化的hpt或赋予针对例如博来霉素、链霉素、四环素、氯霉素、氨苄青霉素、庆大霉素、遗传霉素(Geneticin)(G418)、壮观霉素或杀稻瘟素的抗性的基因)、赋予除草剂抗性的基因(例如提供

抗性的bar；提供草甘膦抗性的aroA或gox或赋予针对例如咪唑啉酮、膦丝菌素或磺脲类的抗性的基因)或提供代谢性状的基因(如允许植物使用甘露糖作为唯一碳源的manA，或利用木糖的木糖异构酶，或抗营养性标记如2-脱氧葡萄糖抗性)。目视标记基因的表达导致形成颜色(例如β-葡糖醛酸糖苷酶、GUS或β-半乳糖苷酶与其有色底物例如X-Gal)、发光(如萤光素/萤光素酶系统)或荧光(绿色荧光蛋白GFP及其衍生物)。这个名单仅代表少数的可能标记。技术人员熟悉此类标记。取决于生物和选择方法，优选不同的标记。

已知当核酸稳定或瞬时地整合至植物细胞时，仅小部分的细胞摄取外来DNA，并且根据需要，将其整合至细胞的基因组中，这取决于所用的表达载体和使用的转染技术。为了鉴定并选择这些整合体，通常将编码选择标记(如上文所述之一)的基因连同目的基因一起导入宿主细胞。这些标记可以在其中这些基因因例如常规方法所致的缺失而无功能的突变体中使用。此外，编码选择标记的核酸分子可以导入宿主细胞中，与在包含编码本发明多肽或本发明方法中所用多肽的序列在同一载体上，或在单独的载体上。已经用导入的核酸稳定转染的细胞可以例如通过选择作用进行鉴定(例如具有整合的选择标记的细胞存活而其他细胞死亡)。

因为一旦已经成功导入了核酸，则转基因宿主细胞中不再需要或不希望有标记基因，尤其抗生素耐药性基因和除草剂抗性基因，因此用于导入核酸的本发明方法有利地使用能够去掉或切除这些标记基因的技术。一种这样的方法称作共转化法。共转化法使用同时用于转化的两种载体，一种载体携带本发明的核酸而第二种载体携带标记基因。高比例的转化体接受，或在植物的情况下，包含(高达40％或更多的转化体)这两种载体。在用农杆菌(Agrobacterium)转化的情况下，转化体通常仅接受载体的一部分，即侧翼有T-DNA的序列，它通常代表表达盒。标记基因随后可以通过进行杂交而从转化的植物中除去。在另一种方法中，整合至转座子的标记基因用来与想要的核酸一起进行转化(称作Ac/Ds技术)。转化体可以与转座酶来源植物杂交，或转化体用引起转座酶表达的核酸构建体瞬时或稳定转化。在一些情况下(大约10％)，转座子在已经成功发生转化时跳出宿主细胞的基因组并丢失。在其他更多情况下，转座子跳至不同的位置。在这些情况下，标记基因必须通过进行杂交而消除。在微生物学中，开发了实现或促进检测这类事件的技术。又一个有利的方法依赖于所谓重组系统；此方法的优势在于不必通过杂交消除。该类型的最知名系统称作Cre/lox系统。Cre1是去除位于loxP序列之间序列的重组酶。如果标记基因整合于loxP序列之间，则一旦转化已经成功发生，通过重组酶的表达去除标记基因。其他重组系统是HIN/HIX、FLP/FRT和REP/STB系统(Tribble等，J.Biol.Chem.，275，2000：22255-22267；Velmurugan等，J.Cell Biol.，149，2000：553-566)。有可能将本发明的核酸序列以位点特异性方式整合至植物基因组中。自然，这些方法也可以适用于微生物如酵母、真菌或细菌。

转基因的/转基因/重组

为本发明目的，“转基因的”、“转基因”或“重组”就核酸序列而言意指包含该核酸序列的表达盒、基因构建体或载体或用本发明核酸序列、表达盒或载体转化的生物，全部这些构建体均通过重组方法产生，其中

(a)编码在本发明方法中有用的蛋白质的核酸序列，或

(b)与本发明核酸序列有效连接的基因控制序列，例如启动子，或

(c)a)和b)

不处于其天然遗传环境中或已经通过重组方法被修饰，修饰有可能采取例如置换、添加、倒位或插入一个或多个核苷酸残基的形式。天然遗传环境理解为意指来源植物中的天然基因组基因座或染色体基因座或在基因组文库中存在。在基因组文库的情况下，优选地保留、至少部分地保留该核酸序列的天然遗传环境。该环境分布在该核酸序列的至少一侧并且具有至少50bp、优选至少500bp、特别优选至少1000bp、最优选至少5000bp的序列长度。天然存在的表达盒-例如核酸序列的天然启动子与编码本发明方法中有用的多肽的对应核酸序列的天然存在组合，如上文所定义-在这种表达盒通过非天然的合成(“人工”)方法(如诱变处理)被修饰时，变成转基因表达盒。合适的方法例如在US 5,565,350或WO 00/15815中描述。

为本发明目的，如上所述，将转基因植物因而理解为意指在本发明方法中使用的核酸不处在所述植物基因组中它们的天然基因座内，所述核酸有可能同源或异源地表达。然而如所提及，转基因还意指尽管本发明核酸或在本发明方法中所用核酸处于植物基因组中该核酸的天然位置内，然而其序列相对于天然序列而言已经受到修饰，和/或所述天然序列的调节序列已经受到修饰。转基因优选地理解为意指本发明核酸在基因组中的非天然基因座内表达，即发生核酸的同源表达或优选异源表达。在本文中提到了优选的转基因植物。

在本发明的一个实施方案中，“分离”的核酸序列位于非天然染色体环境中。

调节

相对于表达或基因表达，术语“调节”意指这样的过程，在所述过程中与对照植物相比，表达水平因所述的基因表达而改变，该表达水平可以增加或减少。原初的、未调节的表达可以是任何类型的结构性RNA(rRNA、tRNA)或mRNA表达，伴随后续翻译。为了本发明的目的，原初、未调节的表达也可以是不存在任何表达。术语“调节活性”或术语“调节表达”应当意指本发明核酸序列或所编码蛋白质的表达的任何变化，其导致增加的植物产量和/或增加的植物生长。

表达可以从零(不存在表达或不可测量的表达)增加至某个量，或可以从某个量下降至不可测量的微小量或零。

表达

术语“表达”或“基因表达”意指一个特定基因或多个特定基因或特定基因构建体的转录。术语“表达”或“基因表达”尤其意指某个基因或多个基因或基因构建体转录成结构性RNA(rRNA、tRNA)或mRNA，所述mRNA随后翻译成或不翻译成蛋白质。该过程包括DNA的转录和所得mRNA产物的加工。

增加的表达/过量表达

如本文中所用的术语“增加的表达”或“过量表达”意指相对于原有野生型表达水平是额外的任何形式表达。

用于增加基因或基因产物的表达的方法是本领域内充分记录过的，并且包括例如由适宜启动子驱动的过量表达、使用转录增强子或翻译增强子。可以在非异源形式的多核苷酸的适宜位置(一般是上游)内导入作为启动子或增强子元件的分离核酸，以便上调编码目的多肽的核酸的表达。例如，内源性启动子可以通过突变、缺失和/或置换而在体内改变(见Kmiec，US5,565,350；Zarling等，WO9322443)，或可以将分离的启动子以相对于本发明基因的正确方向及距离导入植物细胞，以便控制基因表达。

如果需要多肽表达，则通常希望在多核苷酸编码区的3′末端包括多聚腺苷酸化区。多聚腺苷化区可以源自天然基因、来自多种其他植物基因或来自T-DNA。待添加的3′末端序列可以源自例如胭脂碱合酶基因或章鱼碱合酶基因或备选地来自另一种植物基因或较不优选地来自任何其他真核基因。

内含子序列也可以添加至5′非翻译区(UTR)或部分编码性序列的编码序列上，以增加在胞浆内积累的成熟信息的量。已经证实可剪接内含子在植物表达构建体和动物表达构建体中转录单位内的包含在mRNA水平及蛋白质水平上增加基因表达至多达1000倍(Buchman和Berg(1988)Mol.Cell biol.8：4395-4405；Callis等(1987)Gens Dev 1：1183-1200)。此类内含子增强基因表达的作用一般在所述内含子置于转录单位的5′末端附近时最强烈。玉米内含子Adh1-S内含子1、2和6、Bronze-1内含子的用途是本领域已知的。对于一般信息，见：《玉米手册》，第116章，编者Freeling和Walbot，Springer，N.Y.(1994)。

减少的表达

本文中对“减少的表达”或“降低或基本消除”表达的称谓意指内源基因表达和/或多肽水平和/或多肽活性相对于对照植物的减少。与对照植物相比，所述降低或基本上消除以增加的优选顺序是至少10％、20％、30％、40％或50％、60％、70％、80％、85％、90％、或95％、96％、97％、98％、99％或更多降低。

为了降低或基本消除内源基因在植物中的表达，需要核酸序列的足够长度的基本上连续性核苷酸。为了开展基因沉默，这个长度可以是少至20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10个或更少核苷酸，或者这个长度可以多至整个基因(包括5′和/或3′UTR，部分或全体)。基本上连续的核苷酸片段可以来自编码目的蛋白的核酸(靶基因)或来自能够编码目的蛋白的直向同源物、旁系同源物或同源物的任何核酸。优选地，基本上连续的核苷酸的片段能够与靶基因(有义链或反义链)形成氢键，更优选地，基本上连续的核苷酸片段以增加的优选顺序与靶基因(有义链或反义链)具有50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、100％的序列同一性。编码(功能性)多肽的核酸序列不是本文中所讨论的用于降低或基本消除内源基因表达的多种方法所需的。

表达的这种降低或基本消除可以使用常规工具和技术完成。用于降低或基本消除除内源基因表达的优选方法是在植物中导入并表达这样的基因构建体，其中核酸(在此情况下是来自目的基因或任何核酸的一段基本上连续的核苷酸序列，其中所述的任何核酸能够编码任何一种目的蛋白的直向同源物、旁系同源物或同源物)克隆至所述的基因构建体内作为由间隔区(非编码性DNA)隔开的(部分或完全的)反向重复序列。

在这种优选的方法中，使用核酸或其部分(在此情况下是从目的基因或从任何核酸中衍生的一段基本上连续的核苷酸序列，其中所述的任何核酸能够编码目的蛋白的直向同源物、旁系同源物或同源物)的反向重复序列(优选能够形成发夹结构)，通过RNA介导的沉默作用而降低或基本上消除内源基因的表达。将所述反向重复序列克隆于包含控制序列的表达载体中。非编码性DNA核酸序列(间隔序列，例如基质附着区片段(MAR)、内含子、多接头等)位于形成反向重复序列的两个反向核酸之间。在反向重复序列转录后，形成具有(部分或完全)自身互补结构的嵌合RNA。这种双链RNA结构称作发夹RNA(hpRNA)。hpRNA由植物加工为siRNA，其被掺入RNA诱导性沉默复合物(RISC)中。RISC进一步切开mRNA转录物，从而基本上降低待翻译成多肽的mRNA转录物的数目。对于其他一般细节，见例如Grierson等人(1998)WO 98/53083；Waterhouse等人(1999)WO99/53050。

本发明方法的实施不依赖在植物中导入并表达其中克隆入所述核酸作为反向重复序列的基因构建体，而是几种公知“基因沉默”方法的任何一种或多种方法可以用来实现相同的效果。

这样一种用于降低内源基因表达的方法是RNA介导的基因表达沉默(下调)。在这种情况下，沉默作用由基本上与内源性靶基因相似的双链RNA序列(dsRNA)在植物中触发。这种dsRNA被植物进一步加工成约20至约26个核苷酸，称作短干扰性RNA(siRNA)。siRNA被掺入RNA诱导性沉默复合物(RISC)内，其中所述RISC切割内源性靶基因的mRNA转录物，因而基本上降低待翻译成多肽的mRNA转录物的数目。优选地，双链RNA序列对应于靶基因。

RNA沉默方法的另一个实例包括以有义方向导入核酸序列或其部分(在此情况下是从目的基因或从任何核酸中衍生的一段基本上连续的核苷酸，其中所述的任何核酸能够编码目的蛋白的直向同源物、旁系同源物或同源物)至植物内。“有义方向”指与其mRNA转录物同源的DNA序列。因而将向植物中导入该核酸序列的至少一个拷贝。这种额外的核酸序列会降低内源基因的表达，产生称作共抑制作用的现象。将一个核酸序列的几个额外拷贝导入植物时，基因表达的减少将更明显，因为在高转录物水平与共抑制作用的触发之间存在正相关。

RNA沉默方法的另一个实例包括使用反义核酸序列。“反义”核酸序列包含与编码蛋白质的“有义”核酸序列互补，即与双链cDNA分子的编码链互补，或与mRNA转录物序列互补的核苷酸序列。反义核酸序列优选地互补于待沉默的内源基因。这种互补性可以可以位于基因的“编码区”和/或“非编码区”内。术语“编码区”指包含被翻译成氨基酸残基的密码子的核苷酸序列区。术语“非编码区”指分布在编码区侧翼的被转录但不翻译成氨基酸的5′和3′序列(也称作5′和3′非翻译区)。

反义核酸序列可以根据Watson和Crick碱基配对规则设计。反义核酸序列可以与完整核酸序列互补(在此情况下，来自目的基因或来自能够编码目的蛋白的直向同源物、旁系同源物或同源物的任何核酸中的一段基本上连续的核苷酸)，不过也可以仅与所述核酸序列的一部分(包括mRNA 5′和3′UTR)反义的寡核苷酸。例如，反义寡核苷酸序列可以与编码多肽的mRNA转录物的翻译起点周围的区域互补。合适反义寡核苷酸序列的长度是本领域已知的并且可以从约50、45、40、35、30、25、20、15或10个核苷酸或更小的核苷酸长度开始。本发明的反义核酸序列可以利用本领域已知的方法，使用化学合成反应和酶连接反应额构建。例如，反义核酸序列(例如反义寡核苷酸序列)可以使用天然存在的核苷酸或多种修饰的核苷酸化学地合成，其中所述修饰的核苷酸被设计旨在增加分子的生物学稳定性或增加反义核酸序列与有义核酸序列之间所形成双链体的物理稳定性，例如，可以使用硫代磷酸酯衍生物和吖啶取代的核苷酸。可以用来产生反义核酸序列的修饰核苷酸的实例是本领域熟知的。已知的核苷酸修饰包括甲基化、环化和‘加帽’及用类似物(如肌苷)取代一个或多个天然存在的核苷酸。其他的核苷酸修饰是本领域熟知的。

这种反义核酸序列可以使用其中核酸序列已经以反义方向加以亚克隆(即从插入的核酸中转录的RNA将与目的靶核酸呈反义方向)的表达载体以生物学方式产生。优选地，反义核酸序列在植物中的产生借助稳定整合的核酸构建体进行，其中所述的核酸构建体包含启动子、有效连接的反义寡核苷酸和终止子。

用于本发明方法中沉默作用的核酸分子(无论向植物中导入或在原位(in situ)产生)与编码多肽的mRNA转录物和/或基因组DNA杂交或结合，以便例如通过抑制转录和/或翻译而抑制蛋白质表达。杂交可以通过形成稳定双链体的常规核苷酸互补性所致，或在结合于DNA双链体的反义核酸序列的情况下，因双螺旋大沟内特异性相互作用所致。反义核酸序列可以通过转化或在特定组织部位直接注射而导入植物。备选地，反义核酸序列可以为了靶向所选择的细胞而受到修饰并且随后系统性施用。例如，对于系统性施用，反义核酸序列可以被修饰以便它们特异结合表达在所选择的细胞表面上的受体或抗原，例如通过连接反义核酸序列至与细胞表面受体或抗原结合的肽或抗体。反义核酸序列也可以使用本文中所述的载体递送至细胞内。

根据又一个方面，反义核酸序列是α-异头核酸序列。α-异头核酸序列与互补性RNA形成特定双链杂交分子，其中与惯常b-单元相反，所述链相互平行(Gaultier等人(1987)Nucl Ac Res 15：6625-6641)。反义核酸序列也可以包含2′-O-甲基核糖核苷酸(Inoue等人(1987)Nucl Ac Res 15，6131-6148)或嵌合RNA-DNA类似物(Inoue等人(1987)FEBS Lett.215，327-330)。

内源基因表达的降低或基本上消除也可以使用核酶进行。核酶是具有核糖核酸酶活性的催化性RNA分子，能够切割与其具有互补区域的单链核酸序列，如mRNA。因此，核酶(例如锤头核酶(在Haselhoff和Gerlach(1988)Nature 334，585-591中描述)可以用来催化性切割编码多肽的mRNA转录物，因而大幅度减少待翻译成多肽的mRNA转录物的数目。可以设计对核酸序列具有特异性的核酶(见例如：Cech等人，美国专利号4,987,071；和Cech等人，美国专利号5,116,742)。备选地，与核酸序列相对应的mRNA转录物可以用来从RNA分子的汇集物中选出具有特定核糖核酸酶活性的催化性RNA(Bartel和Szostak(1993)Science 261，1411-1418)。核酶用于植物中基因沉默的用途是本领域已知的(例如Atkins等人(1994)WO 94/00012；Lenne等人(1995)WO 95/03404；Lutziger等人(2000)WO 00/00619；Prinsen等人(1997)WO 97/13865和Scott等人(1997)WO 97/38116)。

基因沉默也可以通过插入诱变(例如T-DNA插入或转座子插入)或通过如Angell和Baulcombe((1999)Plant J.20(3)：357-62)、(Amplicon VIGSWO 98/36083)或Baulcombe(WO 99/15682)及其他人描述的策略实现。

如果内源基因中存在突变和/或在随后导入植物的分离的基因/核酸中存在突变，则基因沉默也可以发生。降低或基本上消除可以由无功能的多肽引起。例如，该多肽可以与多种相互作用性蛋白质结合；一个或多个突变和/或截短作用因而可以提供仍能够结合相互作用性蛋白质(如受体蛋白质)但不能表现其正常功能的多肽(如起信号作用的配体)。

基因沉默的又一种方法是靶定与基因调节区(例如启动子和/或增强子)互补的核酸序列以形成阻止基因在靶细胞中转录的三螺旋结构。见Helene，C.，Anticancer Drug Res.6，569-84，1991；Helene等人，Ann.N.Y.Acad.Sci.660，27-361992；和Maher，L.J.ioassays 14，807-15，1992。

其它方法，如使用针对内源性多肽的抗体以抑制此多肽在植物中的功能，或干扰所述多肽参与的信号途径，对于技术人员将是众所周知的。尤其，可以构思的是人造分子可以用于抑制靶多肽的生物学功能，或用于干扰靶多肽参与其中的信号途径。

备选地，可以建立筛选程序以鉴定在植物群体中基因的天然变体，其中所述的变体编码具有降低活性的多肽。此类天然变体也可以用于例如进行同源重组。

人工和/或天然的微RNA(miRNA)可以用来敲除基因表达和/或mRNA翻译。内源性miRNA是通常19-24个核苷酸长度的单链小RNA。它们的主要功能是调节基因表达和/或mRNA翻译。大多数的植物微RNA(miRNA)与其靶序列具有完全的或接近完全的互补性。然而，存在具有多达5个错配的天然靶。它们由切酶家族的双链特异性RNA酶从具有特征性折回结构的较长的非编码性RNA中加工而来。在加工时，它们通过与RNA诱导性沉默复合物(RISC)的主要成分Argonaute蛋白质结合而掺入该复合体。MiRNA充当RISC的特异性成分，因此它们与细胞质中的靶核酸(大多是mRNA)碱基配对。后续的调节事件包括靶mRNA切割和破坏和/或翻译抑制。miRNA过量表达的作用因此往往在靶基因降低的mRNA水平上反映出来。

通常21个核苷酸长度的人工微RNA(amiRNA)可以经基因工程化以特异性地负调节单个或多个目的基因的基因表达。植物微RNA靶的选择的决定因素是本领域熟知的。用于靶识别的经验参数已经确定并可以用来辅助设计特定的amiRNA(Schwab等人，Dev.Cell 8，517-527，2005)。用于设计并产生amiRNA及其前体的便利工具也是公众可获得的(Schwab等人，2006Plant Cell.200618：1121-1133)。

为了最佳性能，用于降低植物中内源基因表达的基因沉默技术需要使用来自单子叶植物的核酸序列转化单子叶植物，和使用来自双子叶植物的核酸序列转化双子叶植物。优选地，将来自任何给定植物物种的核酸序列导入相同的物种内。例如，将来自稻的核酸序列转化至稻植物内。然而，并非绝对要求待导入的核酸序列起源于与该核酸序列将要导入的植物相同的植物物种。只要内源性靶基因与待导入的核酸之间存在相当大的同源性就足够了。

上文描述的是用于降低或基本消除内源基因在植物中表达的多种方法的实例。本领域技术人员会容易地能够调整前述用于沉默的方法以至于例如通过利用合适启动子而实现降低内源基因在整株植物或在其部分中的表达。

转化

如本文中所提及的术语“导入”或“转化”包括外源性多核苷酸转移至宿主细胞内，无论用于转化的方法是什么。能够后续克隆性增殖(无论通过器官发生或胚发生)的植物组织可以用本发明的基因构建体转化并且可以从中再生完整植物。所选的具体组织根据可用于并且最好适于正在进行转化的具体物种的克隆性增殖系统而变化。示例性靶组织包括叶盘、花粉、胚、子叶、下胚轴、大配子体、愈伤组织、现存的分生组织(例如顶端分生组织、腋芽和根分生组织)和诱导的分生组织(例如子叶分生组织和下胚轴分生组织)。多核苷酸可以瞬时或稳定地导入宿主细胞并且可以非整合地维持，例如作为质粒。备选地，多核苷酸可以整合至宿主基因组内。产生的转化植物细胞随后可以用来以本领域技术人员已知的方式再生出转化的植物。

外来基因转移至植物基因组内称作转化。植物物种的转化现在是相当常规的技术。有利地，几种转化方法中的任一方法可以用来将目的基因导入合适的祖先细胞。用于从植物组织或植物细胞中转化并再生出植物所述的方法可以用于瞬时转化或用于稳定转化。转化方法包括使用脂质体、电穿孔法、增加游离DNA摄入的化学品、DNA直接注射至植物、粒子枪轰击法、使用病毒或花粉的转化法和显微投射法(microprojection)。转化方法可以选自用于原生质体的钙/聚乙二醇法(Krens，F.A.等人，(1982)Nature296，72-74；Negrutiu I等人(1987)Plant Mol Biol 8：363-373)；原生质体的电穿孔法(Shillito R.D.等人(1985)Bio/Technol 3，1099-1102)；对植物材料的微量注射法(Crossway A等人，(1986)Mol.Gen Genet 202：179-185)；DNA或RNA涂布的粒子轰击法(Klein TM等人，(1987)Nature 327：70)、(非整合性)病毒感染等。转基因植物，包括转基因作物植物，优选地通过农杆菌介导的转化法产生。有利的转化方法是在植物中(in planta)的转化法。为此目的，例如有可能将农杆菌作用于植物种子或有可能用农杆菌接种植物分生组织。根据本发明，已经证明将转化的农杆菌悬液作用于完整植物或至少作用于花原基是特别有利的。随后继续培育该植物直至获得所处理植物的种子(Clough和Bent，Plant J.(1998)16，35-743)。用于农杆菌介导的稻转化的方法包括用于稻转化的熟知方法，如以下任一文献中描述的那些方法：欧洲专利申请EP 1198985A1，Aldemita和Hodges(Planta 199：612-617，1996)；Chan等人(Plant Mol Biol 22(3)：491-506，1993)，Hiei等人(Plant J 6(2)：271-282，1994)，所述文献的公开内容通过引用的方式如同充分描述那样并入本文。在玉米转化的情况下，优选的方法如Ishida等人(Nat.Biotechnol 14(6)：745-50，1996)或Frame等人(Plant Physiol 129(1)：13-22，2002)描述，其公开内容通过引用的方式如同充分描述那样并入本文。所述方法例如还在B.Jenes等人，Techniques for Gene，在：TransgenicPlants，第1卷，Engineering and Utilization，编者S.D.Kung和R.Wu，Academic Press(1993)128-143和Potrykus Annu.Rev.Plant Physiol.PlantMolec.Biol.42(1991)205-225)中描述。待表达的核酸或构建体优选地克隆至适于转化根癌农杆菌的载体，例如pBin19(Bevan等人，Nucl.Acids Res.12(1984)8711)。由这种载体转化的农杆菌随后可以按照已知方式用于转化植物，例如作为模型使用的植物，如拟南芥属植物(拟南芥属于本发明的范围，不视为作物植物)，或作物植物，例如烟草植物，通过在农杆菌溶液中浸泡擦伤的叶或切碎的叶并随后将它们在合适培养基中培育。植物借助根癌农杆菌的转化例如由和Willmitzer在Nucl.Acid Res.(1988)16，9877中描述，或尤其从F.F.White，Vectors for GeneTransfer in HigherPlants(用于高等植物中基因转移的载体)；引自Transgenic Plants，第1卷，Engineering and Utilization，S.D.Kung和R.Wu编著，Academic Press，1993，第15-38页中获知。

除了转化随后不得不被再生成完整植物的体细胞之外，也可以转化植物分生组织的细胞，并且尤其那些发育成配子的细胞。在这种情况下，转化的配子遵循天然的植物发育过程，产生转基因植物。因此，例如，将拟南芥种子用农杆菌处理并且从发育植物中获得种子，其中一定比例的所述植物受到转化并且因此是转基因的[Feldman，KA和Marks MD(1987)MolGen Genet 208：274-289；Feldmann K(1992)，在：编者C Koncz，N-H Chua和J Shell，Methods in Arabidopsis Research.Word Scientific，Singapore，第274-289页]。替代性方法基于反复去掉花序并使莲座叶丛中心中的切除部位与转化的农杆菌温育，因而转化的种子同样可以在较晚的时间点获得(Chang(1994)Plant J.5：551-558；Katavic(1994)Mol Gen Genet，245：363-370)。然而，尤其有效的方法是改良的真空渗入法，如“花浸染”法。在真空浸润拟南芥属植物的情况下，将完整的植物在减压下用农杆菌悬液处理[Bechthold，N(1993).C R Acad Sci Paris Life Sci，316：1194-1199]，而在“花浸染法”的情况下，将正在发育的花组织与表面活性剂处理的农杆菌混悬液短暂孵育[Clough，SJ和Bent，AF(1998)The Plant J.16，735-743]。在两种情况下均收获一定比例的转基因种子，并且这些种子可以通过在如上所述的选择条件下培育而与非转基因种子区分。此外，质体的稳定转化是有利的，因为质体在大部分作物中以母系方式遗传，这降低或消除了转基因经花粉流动的风险。叶绿体基因组的转化一般通过已经在Klaus等人，2004[Nature Biotechnology 22(2)，225-229]中示意性展示的方法实现。简而言之，将待转化的序列连同选择标记基因一起克隆至与叶绿体基因组同源的侧翼序列之间。这些同源性侧翼序列指导位点特异性整合至原质体系内。已经对众多不同的植物物种描述了质体转化法，并且综述出自Bock(2001)Transgenic plastids in basic research and plant biotechnology(基础研究和植物生物技术中的转基因质体).J Mol Biol.2001年月21日；312(3)：425-38或Maliga，P(2003)Progress towards commercialization of plastidtransformation technology(质体转化技术商业化进展)，Trends Biotechnol.21，20-28。其他的生物技术进展最近已经以无标记质体转化体的形式报道，其中所述无标记质体转化体可以通过瞬时共整合的标记基因产生(Klaus等人，2004，Nature Biotechnology 22(2)，225-229)。

可以借助技术人员熟悉的全部方法再生出基因修饰的植物细胞。合适的方法可以在S.D.Kung和R.Wu，Potrykus或和Willmitzer的上述出版物中找到。

通常，在转化后，对植物细胞或细胞群体选择一个或多个标记的存在，其中所述的标记由连同目的基因一起被共转移的植物可表达基因编码，随后将转化的材料再生成完整植物。为了选出转化的植物，转化中所获得的植物材料原则上经历选择性条件，从而转化的植物可以与未转化的植物区分。例如，按上述方式获得的种子可以种植，并且在初始培育期后，经受喷洒所致的合适选择作用。另一种可能性在于将种子(如果适宜，在消毒后)在使用合适选择剂的琼脂板上培育，从而仅转化的种子可以长成植物。备选地，对转化的植物筛选选择标记(如上文所述的选择标记)的存在。

在DNA转移和再生后，也可以对推定转化的植物，例如使用DNA印迹分析，评价目的基因的存在、拷贝数和/或基因组构造。备选或额外地，可以使用RNA印迹分析和/或蛋白质印迹分析，监测新导入的DNA的表达水平，这两项技术均是本领域普通技术人员熟知的。

可以通过多种手段增殖产生的转化植物，如通过克隆性增殖或经典育种技术。例如，第一世代(或T1)转化植物可以自交并且可以选择纯合的第二世代(或T2)转化体，并且随后可以通过经典育种技术进一步增殖T2植物。产生的转化生物可以采取多种形式。例如，它们可以是转化细胞与非转化细胞的嵌合体；克隆性转化体(例如，经转化以含有表达盒的全部细胞)；转化组织的和未转化组织的移植体(例如，在植物中，嫁接至未转化接穗的转化根状茎)。

在本申请通篇范围内，用构建体转化或互换地由构建体转化或用核酸转化的植物、植物部分、种子或植物细胞将理解为因通过生物技术手段导入所述构建体或所述核酸而携带这种构建体或这种核酸作为转基因的植物、植物部分、种子或植物细胞。这种植物、植物部分、种子或植物细胞因此包含所述重组构建体或所述重组核酸。在过去导入后不再含有所述重组构建体或所述重组核酸的任何植物、植物部分、种子或植物细胞称作失效分离子、失效合子或失效对照，但是不视为本申请意义范围内用所述构建体或用所述核酸转化的植物、植物部分、种子或植物细胞。

T-DNA激活标签化

T-DNA激活标签化(Hayashi等Science(1992)1350-1353)涉及在目的基因的基因组区域内或基因编码区上游或下游10kb处以如此结构插入T-DNA(通常含有启动子(也可以是翻译增强子或内含子))，使得启动子指导被靶定基因的表达。通常，由靶定基因的天然启动子对所述靶定基因表达的调节作用遭到破坏并且该基因处在新导入的启动子控制下。该启动子一般嵌入T-DNA内。这种T-DNA随机地插入植物基因组，例如通过农杆菌感染，并且导致在所插入T-DNA附近的基因的受调节表达。因靠近所导入启动子的基因的改良表达，产生的转基因植物表现显性表型。

TILLING

术语“TILLING”是“基因组内定向诱导的局部损伤”的缩写并且指用于产生和/或鉴定核酸的诱变技术，其中所述的核酸编码具有受调节表达和/或活性的蛋白质。TILLING也允许选择携带此类突变变体的植物。这些突变变体可以展示在强度或在位置或在时间方面受到调节的表达(例如，如果所述突变影响启动子)。这些突变变体可以显示比由处于其天然形式的基因所显出活性更高的活性。TILLING将高密度诱变法与高通量筛选法组合。一般在TILLING中遵循的步骤是：(a)EMS诱变(Redei GP和KonczC(1992)在Methods in Arabidopsis Research，Koncz C，Chua NH，Schell J编著，Singapore，World Scientific Publishing Co，第16-82页；Feldmann等人，(1994)引自Meyerowitz EM，Somerville CR编著，Arabidopsis.ColdSpring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，第137-172页；Lightner J和Caspar T(1998)引自J Martinez-Zapater，J Salinas编著，Methods on Molecular Biology，第82卷，Humana Press，Totowa，NJ，第91-104页)；(b)DNA制备和个体的汇集；(c)PCR扩增目的区；(d)变性和复性以允许形成异源双链体；(e)DHPLC，其中将异源双链体是否在汇集物中的存在检测为色谱图中的一个额外峰；(f)鉴定突变个体；和(g)对突变PCR产物测序。用于TILLING的方法是本领域熟知的(McCallum等人，(2000)Nat Biotechnol 18：455-457；综述见Stemple(2004)Nat Rev Genet5(2)：145-50)。

同源重组

同源重组允许选择的核酸在基因组中于确定的所选择位置内导入。同源重组是生物科学中常规用于低等生物如酵母或苔藓剑叶藓(Physcomitrella)的标准技术。用于在植物中开展同源重组的方法已经不仅对模式植物(Offringa等，1990EMBO J 9(10)：3077-84)，而且对作物植物例如稻(Terada等人，(2002)Nat Biotech 20(10)：1030-4；Iida和Terada(2004)Curr Opin Biotech 15(2)：132-8)进行描述，并且存在与靶生物无关而通常适用的方法(Miller等人，Nature Biotechnol.25，778-785，2007)。

产量相关性状

产量相关性状包括以下一项或多项：产量、生物量、种子产量、早期生长势、绿度指数、增加的生长速率、改善的农艺性状(如改善的水使用效率(WUE)、氮使用效率(NUE)等)。

产量

术语“产量”通常意指经济价值的可测量结果，一般与指定作物、与面积并且与时间段有关。基于其数目、大小和/或重量，独立的植物部分直接对产量作出贡献，或实际产量是某种作物和一年的每平方米产量，这通过总产量(包括收获的产量和评估的产量)除以种植的平方米数而确定。

术语植物的“产量”并且“植物产量”在本文中可互换地使用，并意指营养体生物量如根和/或苗生物量，意指繁殖器官，和/或意指繁殖体，如该植物的种子。

以谷物为例，产量增加可以表现为以下一项或多项：每平方米已建立的植物数目增加、每株植物的谷穗数增加、行数、每行核粒数、核粒重、千粒核重、谷穗长度/直径的增加、种子充实率(其为充实的种子数除以种子总数并乘以100)增加，及其他。以稻为例，产量增加可以自身表现为以下一项或多项的增加：每平方米植物数、每株植物的圆锥花序数、圆锥花序长度、每个圆锥花序的小穗数、每个圆锥花序的花(小花)数、种子充实率(其为充实的种子数除以种子总数并乘以100)增加、千粒重增加，及其他。在稻中，耐涝性也可以导致增加的产量。

早期开花时间

如本文所用的具有“早期开花时间”的植物是比对照植物更早开始开花的植物。因而，该术语指显示较早开始开花的植物。植物的开花时间可以通过计数播种与第一花序出现之间的天数，即，“至开花的时间”，进行评估。可以例如使用如WO 2007/093444中所述的方法确定植物的“开花时间”或“至开花的时间”或“第一花序出现”。

早期生长势

“早期生长势”指活跃、健康、充分平衡的生长，尤其是植物生长早期阶段期间，并且可以因增加的植物适应性所致，其中所述增加的植物适应性原因是例如植物更好地适应其环境(即优化能源的使用和在幼苗与根之间的分配)。具有早期生长势的植物也显示增加的幼苗存活和更好的作物建立，这经常导致高度均一的田块(作物以均匀方式生长，即大多数植物在基本上相同的时间达到各个发育阶段)和往往更好及更高的产量。因而，早期生长势可以通过测量多种因素如千粒核重、萌发百分数、出苗百分数、幼苗生长、幼苗高度、根长度、根和苗生物量和众多其他因素等来确定。

增加的生长速率

增加的生长速率可以专指植物的一个或多个部分(包括种子)，或可以基本上遍及整株植物。具有增加的生长速率的植物可以具备较短的生活周期。植物的生活周期可以意指从干燥成熟种子生长直至植物已经产生与起始材料相似的干燥成熟种子的阶段所需要的时间。这个生活周期可以受诸多因素如萌发速度、早期生长势、生长速率、绿度指数、开花时间和种子成熟速度影响。生长速率的增加可以在植物生活周期的一个或多个阶段或基本上在植物整个生活周期期间发生。在植物生活周期中的早期阶段间，增加的生长速率可以反映增强的生长势。生长速率的增加可以改变植物的收获周期，从而允许植物更晚播种和/或更早收获，而这本来是不可能的(在开花时间更早情况下，可以获得相似的效果)。如果生长速率充分地增加，则可以允许进一步播种相同植物物种的种子(例如播种并收获稻植物，随后播种并收获其他稻植物，全部稻植物均处于一个常规的生长时期内)。类似地，如果生长速率充分地增加，则可以允许进一步播种不同植物物种的种子(例如播种并收获玉米植物，随后例如播种并任选收获大豆、马铃薯或任何其他合适的植物)。在一些作物植物的情况下，从相同砧木收获额外的次数也可以是可能的。改变植物的收获周期可以导致每平方米一年生物量生产的增加(原因在于可以培育并收获任何具体植物的次数(即在一年中)增加)。生长速率的增加也可以允许转基因植物在比野生型对应物更广泛的地理区域内栽培，因为栽培某作物的地域限制往往由栽种时间(早季)或收获时间(晚季)的不利环境条件决定。如果缩短收获周期，则可以避开这类不利条件。生长速率可以通过从生长曲线推算多项参数来确定，此类参数可以是：T-Mid(植物达到其50％最大尺寸所耗费的时间)和T-90(植物达到其90％最大尺寸所耗费的时间)，以及其他参数。

胁迫抗性

与对照植物相比，无论植物处于非胁迫条件下或无论植物暴露于多种胁迫，均出现产量和/或生长速率的增加。植物一般通过生长得更慢而应答暴露于胁迫。在严重胁迫的情况下，植物甚至可能完全停止生长。另一方面，轻度胁迫在本文中定义为植物所暴露的任何胁迫，其不导致植物完全停止生长，但同时不能恢复生长。与非胁迫条件下的对照植物相比，轻度胁迫在本发明的意义下导致受胁迫植物的生长减少小于40％、35％、30％或25％、更优选地小于20％或15％。由于农业实践(灌溉、施肥、杀虫剂处理)的进步，栽培的作物植物中并不经常遭遇严重胁迫。因此，由轻度胁迫诱导的受损生长对农业而言往往是不受欢迎的特征。轻度胁迫是植物所暴露的常见生物胁迫和/或非生物(环境)胁迫。非生物胁迫可以因干旱或过量的水、缺氧胁迫、盐胁迫、化学毒性、氧化胁迫和热、寒冷或冰冻温度所致。

非生物胁迫可以是因水胁迫(尤其因为干旱)、盐胁迫、氧化胁迫或离子胁迫引起的渗透胁迫。生物胁迫一般是由病原体如细菌、病毒、真菌、线虫和昆虫引起的那些胁迫。

“生物胁迫”一般是由病原体如细菌、病毒、真菌、线虫和昆虫引起的那些胁迫。

“非生物胁迫”可以是因水胁迫(尤其归咎于干旱)、盐胁迫或冰冻胁迫引起的渗透胁迫。非生物胁迫也可以是氧化胁迫或寒冷胁迫。“冰冻胁迫”意指归因于冰冻温度(即，可用水冷冻并变成冰的温度)的胁迫。“寒冷胁迫”，也称作“低温胁迫”意指寒冷温度，例如，10°以下或优选地5℃以下的温度，但是在所述温度上水分子不冻结。

如Wang等人(Planta(2003)218：1-14)中所报道，非生物胁迫导致一系列不利影响植物生长及生产力的形态学、生理学、生物化学和分子变化。干旱、盐度、极端温度和氧化胁迫已知是相互联系的，并且可以通过相似的机制引起生长损害及细胞损害。Rabbani等人(Plant Physiol(2003)133：1755-1767)描述了干旱胁迫与高盐度胁迫之间特别高程度的“交互作用”。例如，干旱和/或盐化作用主要表现为渗透胁迫，从而导致细胞内稳态和离子分布的破坏。氧化胁迫，其经常伴随高温或低温、盐度或干旱胁迫，可以造成功能蛋白和结构蛋白变性。因此，这些多样的环境胁迫常常激活相似的细胞信号传导途径和细胞应答，如产生胁迫蛋白、上调抗氧化物质、积累兼容性溶质和生长停滞。如本文中所用的术语“非胁迫”条件是允许植物最佳生长的那些环境条件。本领域技术人员清楚给定地点的正常土壤条件和气候条件。伴有最佳生长条件(在非胁迫条件下培育)的植物一般以增加的优选顺序产生该植物在给定环境中至少97％、95％、92％、90％、87％、85％、83％、80％、77％或75％的平均产量。平均产量可以基于收获量和/或季节计算。本领域技术人员清楚作物的平均生产产量。

尤其，本发明的方法可以在非胁迫条件下或在轻度干旱条件开展以产生相对于对照植物具有增加的产量的植物。如Wang等人(Planta(2003)218：1-14)中所报道，非生物胁迫导致一系列不利影响植物生长及生产力的形态学、生理学、生物化学和分子变化。干旱、盐度、极端温度和氧化胁迫已知是相互联系的，并且可以通过相似的机制引起生长损害及细胞损害。Rabbani等人(Plant Physiol(2003)133：1755-1767)描述了干旱胁迫与高盐度胁迫之间特别高程度的“交互作用”。例如，干旱和/或盐化作用主要表现为渗透胁迫，从而导致细胞内稳态和离子分布的破坏。氧化胁迫，其经常伴随高温或低温、盐度或干旱胁迫，可以造成功能蛋白和结构蛋白变性。因此，这些多样的环境胁迫常常激活相似的细胞信号传导途径和细胞应答，如产生胁迫蛋白、上调抗氧化物质、积累兼容性溶质和生长停滞。如本文中所用的术语“非胁迫”条件是允许植物最佳生长的那些环境条件。本领域技术人员清楚给定地点的正常土壤条件和气候条件。伴有最佳生长条件(在非胁迫条件下培育)的植物一般以增加的优选顺序产生该植物在给定环境中至少97％、95％、92％、90％、87％、85％、83％、80％、77％或75％的平均产量。平均产量可以基于收获量和/或季节计算。本领域技术人员清楚作物的平均生产产量。

尤其，本发明的方法可以在非胁迫条件下实施。在一个实例中，本发明的方法可以在非胁迫条件如轻度干旱下实施以产生相对于对照植物具有增加的产量的植物。

在另一个实施方案中，本发明的方法可以在胁迫条件下实施。

在一个实例中，本发明的方法可以在胁迫条件如干旱下实施以产生相对于对照植物具有增加的产量的植物。

在另一个实例中，本发明的方法可以在胁迫条件如养分缺乏下实施以产生相对于对照植物具有增加的产量的植物。

养分缺乏可以因缺少养分如氮、磷酸盐和其他含磷化合物、钾、钙、镁、锰、铁和硼及其他元素所致。

在又一个实例中，本发明的方法可以在胁迫条件如盐胁迫下实施以产生相对于对照植物具有增加的产量的植物。

术语“盐胁迫”不限于普通盐(NaCl)，不过可以是NaCl、KCl、LiCl、MgCl₂、CaCl₂等中的任意一种或多种。

增加/改善/增强

术语“增加”、“改善”或“增强”是可互换的并且在本申请的含义下应当指与如本文中定义的对照植物相比至少3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％或10％、优选地至少15％或20％、更优选地25％、30％、35％或40％更多的产量和/或生长。

种子产量

增加的种子产量可以本身表现为以下一项或多项：

a)种子生物量(种子总重量)的增加，这可以基于单粒种子和/或每株植物和/或每平方米；

b)每株植物增加的花数；

c)增加的种子数和/或增加的充实种子数；

d)增加的种子充实率(其表述为充实种子数除以种子总数之间的比率)；

e)增加的收获指数，其表述为可收获部分(如种子)的产量除以植物地上部分的总生物量的比率；和

f)增加的千粒核重(TKW)，其从计数的充实种子数及其总重量外推而来。增加的TKW可以因增加的种子尺寸和/或种子重量引起，并且也可以因胚尺寸和/或胚乳尺寸增加引起。

种子产量的增加也可以表现为种子尺寸和/或种子体积的增加。此外，种子产量的增加也可以自身表现为种子面积和/或种子长度和/或种子宽度和/或种子周长的增加。增加的产量也可以产生改良的构造，或可以因改良的构造而出现。

绿度指数

如本文中所用的“绿度指数”从植物的数字图像计算。对于属于该图像上植物目标的每个像素，计算绿色值对红色值的比率(以编码颜色的RGB模式)。绿度指数表述为绿色/红色比超过给定阈值的像素的百分数。在正常生长条件下，在盐胁迫生长条件下和在养分可利用性降低的生长条件下，在开花前的最后成像中测量植物的绿度指数。相反，在干旱胁迫生长条件下，在干旱后的首次成像中测量植物的绿度指数。

生物量

如本文所用的术语“生物量”意指植物的总重量。在生物量的定义范围内，可以在植物的一个或多个部分的生物量之间做出区分，所述的部分可以包括：

-地上(可收获)部分，如但不限于苗生物量、种子生物量、叶生物量等和/或

-地下(可收获)部分，如但不限于根生物量等，和/或

-部分插入地面或与地面接触的可收获部分如但不限于甜菜和植物的其他下胚轴区域、根状茎、匍匐茎或攀爬根茎；

-营养体生物量，如根生物量、苗生物量等，和/或

-繁殖器官，和/或

-繁殖体如种子。

标记辅助育种

此类育种计划有时需要通过使用例如EMS诱变法对植物进行诱变处理来导入等位变异；或者，所述计划可以始于一组并非故意造成的所谓“自然”来源性等位变体开始。随后进行等位变体的鉴定，例如通过PCR法。而后是步骤：选择所讨论序列的并且导致产量增加的优异等位变体。一般通过监测含有所讨论序列的不同等位变体的植物的生长性能实施选择。可以在温室中或在田间监测生长性能。其他任选的步骤包括将其中鉴定到优异等位变体的植物与另一株植物杂交。这可能用来例如产生感兴趣的表型特征的组合。

用作(基因作图)中的探针

编码目的蛋白的核酸用于对基因进行遗传和物理作图的用途仅需至少15个核苷酸长度的核酸序列。这些核酸可以用作限制性片段长度多态性(RFLP)标记。限制性消化的植物基因组DNA的DNA印迹物(Sambrook J，Fritsch EF和Maniatis T(1989)Molecular Cloning，A Laboratory Manual)可以用编码目的蛋白的核酸探测。所得的带型随后可以使用计算机程序如MapMaker(Lander等人(1987)Genomics 1：174-181)，进行遗传分析以构建遗传图。此外，所述核酸可以用来探测含有一组个体的限制性核酸内切酶处理的基因组DNA的DNA印迹物，其中所述的一组个体代表确定的遗传杂交的亲本和子代。DNA多态性的分离是明显的并且用来计算编码目的蛋白的核酸在先前使用这个群体所获得的遗传图中的位置(Botstein等人(1980)Am.J.Hum.Genet.32：314-331)。

在Bernatzky和Tanksley(1986)Plant Mol.Biol.Reporter 4：37-41中描述了植物基因来源的探针的产生及其在遗传作图中的用途。许多出版物描述了使用上文概述的方法学或其变型对特定cDNA克隆的遗传作图。例如，F2互交群、回交群、随机交配群、邻近纯合系和其他个体群体可以用于作图。此类方法学是本领域技术人员熟知的。

这些核酸探针也可以用于物理作图(即序列在物理图上的排列；见Hoheisel等人，引自：Non-mammalian Genomic Analyasis：A PracticalGuide，Academic press 1996，第319-346页及其中引用的参考文献)。

在另一个实施方案中，所述核酸探针可以用于直接荧光原位杂交(FISH)作图中(Trask(1991)Trends Genet.7：149-154)。尽管现有的FISH作图法支持大克隆(几个kb至几百个kb；见Laan等人(1995)Genome Res.5：13-20)的使用，然而灵敏度的改善可以允许使用更短探针进行FISH作图。

多种基于核酸扩增的用于遗传作图及物理作图的方法可以使用所述核酸实施。实例包括等位基因特异性扩增法(Kazazian(1989)J.Lab.Clin.Med 11：95-96)、PCR扩增片段的多态性(CAPS；Sheffield等人(1993)Genomics 16：325-332)、等位基因特异性连接(Landegren等人(1988)Science 241：1077-1080)、核苷酸延伸反应(Sokolov(1990)Nucleic Acid Res.18：3671)、放射杂交作图(Walter等人(1997)Nat.Genet.7：22-28)和Happy作图法(Dear和Cook(1989)Nucleic Acid Res.17：6795-6807)。对于这些方法，将核酸的序列用来设计并且产生在扩增反应或在引物延伸反应中所使用的引物对。此类引物的设计是本领域技术人员熟知的。在使用基于PCR的遗传作图方法中，可能需要鉴定在对应于本发明核酸序列的区域内作图交叉的亲本之间的DNA序列差异。然而，对作图法而言，这通常不是必需的。

植物

如本文中所用的术语“植物”包含整株植物、植物的祖先及子代和植物部分，包括种子、枝条、茎、叶、根(包括块茎)、花和组织及器官，其中每个所提及的对象包含目的基因/核酸。术语“植物”也包括植物细胞、悬浮培养物、愈伤组织、胚、分生组织区、配子体、孢子体、花粉和小孢子，再次地，其中提及的每种对象均包含目的基因/核酸。

在本发明方法中特别有用的植物包括属于植物界(Viridiplantae)超家族、尤其单子叶和双子叶植物的全部植物，包括饲用或饲料豆科植物、观赏植物、粮食作物、树或灌木，其中所述植物选自包含以下物种的名单：槭树属物种(Acer spp.)、猕猴桃属物种(Actinidia spp.)、秋葵属物种(Abelmoschus spp.)、剑麻(Agave sisalana)、冰草属物种(Agropyron spp.)、匍匐剪股颖(Agrostis stolonifera)、葱属物种(Allium spp.)、苋属物种(Amaranthus spp.)、欧洲海滨草(Ammophila arenaria)、凤梨(Ananascomosus)、番荔枝属物种(Annona spp.)、旱芹(Apium graveolens)、蜘蛛兰属物种(Arachis spp.)、木波罗属物种(Artocarpus spp.)、石刁柏(Asparagusofficinalis)、燕麦属物种(Avena spp.)(例如燕麦(Avena sativa)、野燕麦(Avena fatua)、比赞燕麦(Avena byzantina)、野燕麦原变种(Avena fatua var.sativa)、杂种燕麦(Avena hybrida)、阳桃(Averrhoa carambola)、箣竹属(Bambusa sp.)、冬瓜(Benincasa hispida)、巴西栗(Bertholletia excelsea)、甜菜(Beta vulgaris)、芸苔属物种(Brassica spp.)(例如欧洲油菜(Brassicanapus)、芜青物种(Brassica rapa ssp.)[卡诺拉油菜、油籽油菜(oilseed rape)、蔓青(turnip rape)])、Cadaba farinosa、茶(Camellia sinensis)、美人蕉(Cannaindica)、大麻(Cannabis sativa)、辣椒属物种(Capsicum spp.)、Carex elata、番木瓜(Carica papaya)、大果假虎刺(Carissa macrocarpa)、山核桃属物种(Carya spp.)、红花(Carthamus tinctorius)、栗属物种(Castanea spp.)、美洲木棉(Ceiba pentandra)、苦苣(Cichorium endivia)、樟属物种(Cinnamomum spp.)、西瓜(Citrullus lanatus)、柑桔属物种(Citrus spp.)、椰子属物种(Cocos spp.)、咖啡属物种(Coffea spp.)、芋头(Colocasiaesculenta)、非洲梧桐属物种(Cola spp.)、黄麻属(Corchorus sp.)、芫荽(Coriandrum sativum)、榛属物种(Corylus spp.)、山楂属物种(Crataegusspp.)、番红花(Crocus sativus)、南瓜属物种(Cucurbita spp.)、香瓜属物种(Cucumis spp.)、菜蓟属物种(Cynara spp.)、胡萝卜、山马蝗属物种(Desmodium spp.)、龙眼(Dimocarpus longan)、薯蓣属物种(Dioscoreaspp.)、柿树属物种(Diospyros spp.)、稗属物种(Echinochloa spp.)、油棕属(Elaeis)(例如油棕(Elaeis guineensis)、美洲油棕(Elaeis oleifera))、穇子(Eleusine coracana)、埃塞俄比亚画眉草(Eragrostis tef)、蔗茅属物种(Erianthus sp.)、枇杷(Eriobotrya japonica)、桉属物种(Eucalyptus sp.)、红仔果(Eugenia uniflora)、荞麦属物种(Fagopyrum spp.)、水青冈属物种(Fagus spp.)、苇状羊茅(Festuca arundinacea)、无花果(Ficus carica)、金桔属物种(Fortunella spp.)、草莓属物种(Fragaria spp.)、银杏(Ginkgo biloba)、大豆属(Glycine spp.)(例如大豆(Glycine max)、大豆(Soja hispida)或大豆(Soja max))、陆地棉(Gossypium hirstum)、向日葵属物种(Helianthusspp.)(例如向日葵(Helianthus annuus))、长管萱草(Hemerocallis fulva)、木槿属物种(Hibiscus spp.)、大麦属(Hordeum spp.)(例如大麦(Hordeumvulgare))、甘薯(Ipomoea batatas)、核桃属物种(Juglans spp.)、莴苣(Lactucasativa)、山黧豆属物种(Lathyrus spp.)、兵豆(Lens culinari)、亚麻(Linumusitatissimum)、荔枝(Litchi chinensis)、百脉根属物种(Lotus spp.)、棱角丝瓜(Luffa acutangula)、羽扇豆属物种(Lupinus spp.)、Luzula sylvatica、番茄属物种(Lycopersicon spp.)(例如番茄(Lycopersicon esculentum、Lycopersicon lycopersicum、Lycopersicon pyriforme))、硬皮豆属物种(Macrotyloma spp.)、苹果属物种(Malus spp.)、凹缘金虎尾(Malpighiaemarginata)、牛油果(Mammea americana)、芒果(Mangifera indica)、木薯属物种(Manihot spp.)、人心果(Manilkara zapota)、苜蓿(Medicagosativa)、草木樨属物种(Melilotus spp.)、薄荷属物种(Mentha spp.)、芒(Miscanthus sinensis)、苦瓜属物种(Momordica spp.)、黑桑(Morus nigra)、芭蕉属物种(Musa spp.)、烟草属物种(Nicotiana spp.)、木犀榄属物种(Oleaspp.)、仙人掌属物种(Opuntia spp.)、鸟足豆属物种(Ornithopus spp.)、稻属(Oryza spp.)(例如稻、阔叶稻(Oryza latifolia))、稷(Panicum miliaceum)、柳枝稷(Panicum virgatum)、鸡蛋果(Passiflora edulis)、欧防风(Pastinacasativa)、狼尾草属物种(Pennisetum sp.)、鳄梨属物种(Persea spp.)、欧芹(Petroselinum crispum)、虉草(Phalaris arundinacea)、菜豆属物种(Phaseolus spp.)、猫尾草(Phleum pratense)、刺葵属物种(Phoenix spp.)、南方芦苇(Phragmites australis)、酸浆属物种(Physalis spp.)、松属物种(Pinus spp.)、阿月浑子(Pistacia vera)、豌豆属物种(Pisum spp.)、早熟禾属物种(Poa spp.)、杨属物种(Populus spp.)、牧豆草属物种(Prosopis spp.)、李属物种(Prunus spp.)、番石榴属物种(Psidium spp.)、石榴(Punicagranatum)、西洋梨(Pyrus communis)、栎属物种(Quercus spp.)、萝卜(Raphanus sativus)、波叶大黄(Rheum rhabarbarum)、茶藨子属物种(Ribesspp.)、蓖麻(Ricinus communis)、悬钩子属物种(Rubus spp.)、甘蔗属物种(Saccharum spp.)、柳属物种(Salix sp.)、接骨木属物种(Sambucus spp.)、黑麦(Secale cereale)、胡麻属物种(Sesamum spp.)、白芥属物种(Sinapis sp.)、茄属(Solanum spp.)(例如马铃薯(Solanum tuberosum)、红茄(Solanumintegrifolium)或番茄)、两色蜀黍(Sorghum bicolor)、菠菜属物种(Spinaciaspp.)、蒲桃属物种(Syzygium spp.)、万寿菊属物种(Tagetes spp.)、酸豆(Tamarindus indica)、可可树(Theobroma cacao)、车轴草属物种(Trifoliumspp.)、鸭茅状摩擦禾(Tripsacum dactyloides)、Triticosecale rimpaui、小麦属(Triticum spp.)(例如普通小麦(Triticum aestivum)、硬粒小麦(Triticumdurum)、圆柱小麦(Triticum turgidum)、Triticum hybernum、马卡小麦(Triticum macha)、普通小麦(Triticum sativum)或普通小麦(Triticumvulgare))、小金莲花(Tropaeolum minus)、金莲花(Tropaeolum majus)、越桔属物种(Vaccinium spp.)、野碗豆属物种(Vicia spp.)、豇豆属物种(Vignaspp.)、香堇(Viola odorata)、葡萄属物种(Vitis spp.)、玉米(Zea mays)、Zizania palustris、枣属物种(Ziziphus spp.)及其他。

就本发明的序列而言，植物源的核酸或多肽序列分别具有以下特征：密码子选择为植物中表达进行优化和使用植物中常见的氨基酸和调节位点。植物来源可以是任何植物，但是优选地是如前述段落中所述的那些植物。

对照植物

合适的对照植物的选择是实验设计的例行部分，并且可以包括相应的野生型植物或无目的基因的相应植物。对照植物一般是相同的植物物种或甚至是与待评估植物相同的品种。对照植物也可以是待评估植物的失效合子。失效合子，也称作失效对照植物，是因分离而丢失转基因的个体。另外，已经将对照植物在与本发明植物的培育条件相同的培育条件下培育。一般而言，对照植物在相同的培育条件下并且因此在本发明植物附近并且在相同时间培育。如本文中所用的“对照植物”不仅指完整植物，也指植物部分，包括种子和种子部分。

发明详述

2型CLE多肽

出人意料地，现在已经发现，调节植物中编码2型CLE多肽的核酸表达产生了相对于对照植物具有增强的产量相关性状的植物。根据第一实施方案，本发明提供了用于相对于对照植物增强植物中产量相关性状的方法，包括调节植物中编码2型CLE多肽的核酸表达或者/和任选地选择具有增强的产量相关性状的植物。

用于调节(优选地增加)编码2型CLE多肽的核酸表达的优选方法是在植物中导入并且表达编码2型CLE多肽的核酸。

下文任何对“在本发明方法中有用的蛋白质”的称谓意指如本文中定义的2型CLE多肽。下文对“本发明方法中有用的核酸”的任何称谓意指能够编码这种2型CLE多肽的核酸。待导入植物(并且因而在实施本发明方法中有用)的核酸是编码现在将描述的蛋白质类型的任意核酸，下文也称作“2型CLE核酸”或“2型CLE基因”。

如本文定义的“2型CLE多肽”指包含至少(如Oelkers，K.等人(2008)-Bioinformatic analysis of the CLE signaling peptide family(CLE信号传导肽家族的生物信息学分析).BMC Plant Biol 2008，8：1.(doi：10.1186/1471-2229-8-1)所定义的)来自组2的CLE结构域的任何多肽，所述CLE结构域靠近C端或在C端带有由基序1代表的一个保守的12氨基酸片段。一般而言，2型CLE多肽是参与信号传导的植物特异性肽，小于15kDa并且在N端中包含分泌信号。

优选地，2型CLE多肽的CLE多肽结构域以增加的优选顺序与SEQID NO：2具有至少49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％或更多的序列同一性。

额外地和/或备选地，本发明方法中有用的2型CLE多肽包含这样的序列基序，其以增加的优选顺序具有与基序1的序列相比4个或更少的错配、与基序1的序列相比3个或更少的错配、与基序1的序列相比2个或更少的错配、与基序1的序列相比1个错配或无错配和/或以增加的优选顺序与基序1：RXSPGGP[ND]PXHH(SEQ ID NO：23)具有至少49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％或更大的序列同一性。本文在方括号中所示的氨基酸代表特定位置的备选氨基酸，X可以是任何氨基酸。基序1一般存在于任何2型CLE多肽中。优选地，基序1是R(R/L/F/V)SPG GP(D/N)P(Q/R)HH(SEQID NO：24)。更优选地，基序1之前没有赖氨酸残基。

在本发明的一个最优选实施方案中，本发明方法中有用的2型CLE多肽包含这样的序列基序，其以增加的优选顺序具有与基序2的序列相比4个或更少的错配、与基序2的序列相比3个或更少的错配、与基序2的序列相比2个或更少的错配、与基序2的序列相比1个错配或无错配和/或以增加的优选顺序与基序2：RLSPGGPDPQHH(SEQ ID NO：25)具有至少49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％或更大的序列同一性。

应当理解如本文提到的基序1代表2型CLE多肽(如表A中所述的那些)中存在的基序的共有序列。然而，还应当理解如本文定义的基序1不限于其相应序列，但是它还包含如在任何2型CLE多肽中存在的相应基序。这些基序源自Oelkers等人(2008)中所显示的序列分析。

额外地和/或备选地，2型CLE蛋白的同源物以增加的优选顺序与SEQID NO：2所代表的氨基酸具有至少25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％整体序列同一性，条件是该同源蛋白包含如上文所概括的保守基序中的任何一种或多种基序。使用总体比对算法，如程序GAP(GCG Wisconsin Package，Accelrys)中的Needleman Wunsch算法，优选地采用默认参数并且优选地采用成熟蛋白质的序列(即不考虑分泌信号或转运肽)，可以确定整体序列同一性。与整体序列同一性相比，仅考虑保守的结构域或基序时，所述序列同一性通常会更高。优选地，2型CLE多肽中的基序以增加的优选顺序与SEQ ID NO：23和SEQ ID NO：25所代表的基序(基序1和2)具有至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性。

术语“结构域”、“标签”和“基序”在本文“定义”部分中定义。

另外，2型CLE多肽(至少以其天然形式)一般具有信号传导活性。用于测量信号传导活性的工具和技术是本领域熟知的，见例如Whitford等人Proc Natl Acad Sci USA，105(47)：18625-30，2008。在实施例4中提供进一步的细节。

另外，2型CLE多肽，当根据本发明方法如实施例7和8中所概述那样在稻中表达时，产生具有增加的产量相关性状、尤其改善的根和苗生物量、花数和花序数的植物。

本发明通过用SEQ ID NO：1所代表的核酸序列转化植物进行说明，其中所述核酸序列编码SEQ ID NO：2的多肽序列。然而，本发明的实施不限于这些序列；本发明的方法可以有利地使用如本文定义的任何编码2型CLE的核酸或2型CLE多肽实施。

编码2型CLE多肽的核酸的实例在本文实施例部分的表A中给出。此类核酸用于实施本发明的方法。在实施例部分的表A中给出的氨基酸序列是由SEQ ID NO：2所代表的2型CLE多肽的直向同源物和旁系同源物的实例序列，术语“直向同源物”和“旁系同源物”如本文中定义。可以通过执行如定义部分中所述的所谓交互性blast检索轻易地鉴定其他直向同源物和旁系同源物；其中查询序列是SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2，第二BLAST(反向BLAST)将针对拟南芥序列。

核酸变体也可以用于实施本发明的方法。此类变体的例子包括编码在实施例部分的表A中给出的任一个氨基酸序列的同源物和衍生物的核酸，术语“同源物”和“衍生物”如本文中定义。在本发明方法中有用的还是这样的核酸，其编码在实施例部分的表A中给出的任一氨基酸序列的直向同源物或旁系同源物的同源物和衍生物。在本发明方法中有用的同源物和衍生物与衍生它们的非修饰蛋白质具有基本上相同的生物学活性和功能活性。在实施本发明方法中有用的其他变体是其中优化了密码子选择或其中去除miRNA靶位点的变体。

在实施本发明方法中有用的其他核酸变体包括编码2型CLE多肽的核酸的部分、与编码2型CLE多肽的核酸杂交的核酸、编码2型CLE多肽的核酸的剪接变体、编码2型CLE多肽的核酸的等位变体和通过基因改组获得的编码2型CLE多肽的核酸的变体。术语“杂交序列”、“剪接变体”、“等位变体”和“基因改组”如本文所述。

编码2型CLE多肽的核酸不需要是全长核酸，因为本发明方法的实施不依赖于使用全长核酸序列。根据本发明，提供了用于增强植物中产量相关性状的方法，所述方法包括在植物中导入并且表达在实施例部分的表A中给出的任一个核酸序列的一部分或编码在实施例部分表A中给出的任一氨基酸序列的直向同源物、旁系同源物或同源物的核酸的一部分。

核酸的一部分可以例如通过对所述核酸产生一个或多个缺失而制备。所述部分可以以分离的形式使用或它们可以与其他编码(或非编码)序列融合，例如旨在产生组合有几种活性的蛋白质。与其他编码序列融合时，翻译时产生的所得多肽可以比对该蛋白质部分所预测的多肽更大。

在本发明方法中有用的部分编码如本文中定义的2型CLE多肽，并且基本上具有如实施例部分的表A中给出的氨基酸序列相同的生物学活性。优选地，该部分是在实施例部分表A中给出的任一核酸的一部分，或是编码在实施例部分表A中给出的任一氨基酸序列的直向同源物或旁系同源物的核酸的一部分。优选地，该部分具有至少50、75、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、400、450、500个连续核苷酸长度，所述连续核苷酸属于在实施例部分表A中给出的任一核酸序列或属于编码在实施例部分表A中给出的任一氨基酸序列的直向同源物或旁系同源物的核酸。最优选地，该部分是SEQ ID NO：1的核酸的一部分。

在本发明方法中有用的另一种核酸变体是能够在降低的严格条件下、优选在严格条件下与如本文中定义的编码2型CLE多肽的核酸或与如本文中定义的部分杂交的核酸。

根据本发明，提供了用于增强植物中产量相关性状的方法，包括在植物中导入并表达能够与实施例部分的表A中给出的任一种核酸杂交的核酸，或包括在植物中导入并表达这样的核酸，所述核酸能够与编码在实施例部分的表A中给出的任意核酸序列的直向同源物、旁系同源物或同源物的核酸杂交。

在本发明方法中有用的杂交序列编码了如本文定义的2型CLE多肽，所述的2型CLE多肽基本上具有与实施例部分的表A中给出的氨基酸序列相同的生物学活性。优选地，该杂交序列能够与实施例部分的表A中给出的任一核酸的互补核酸或与这些序列中任一者的一部分杂交，所述的一部分如上文定义，或该杂交序列能够与下述核酸的互补核酸杂交，所述核酸编码在实施例部分的表A中给出的任一氨基酸序列的直向同源物或旁系同源物。最优选地，该杂交序列能够与如SEQ ID NO：1所代表的核酸的互补核酸或与其一部分杂交。

在本发明方法中有用的另一种核酸变体是编码如上文所定义的2型CLE多肽的剪接变体，剪接变体如本文中定义。

根据本发明，提供了用于增强植物中产量相关性状的方法，所述方法包括在植物中导入并且表达在实施例部分的表A中给出的任一核酸序列的剪接变体或编码在实施例部分的表A中给出的任一氨基酸序列的直向同源物、旁系同源物或同源物的核酸的剪接变体。

在实施本发明方法中有用的另一种核酸变体是编码如上文所定义的2型CLE多肽的核酸的等位变体，等位变体如本文中定义。

根据本发明，提供用于增强植物中产量相关性状的方法，所述方法包括在植物中导入并且表达在实施例部分的表A中给出的任一核酸的等位变体，或包括在植物中导入并且表达下述核酸的等位变体，其中所述核酸编码在实施例部分的表A中给出的任一氨基酸序列的直向同源物、旁系同源物或同源物。

由本发明方法中有用的等位变体编码的多肽基本上具有与SEQ IDNO：2的2型CLE多肽和实施例部分的表A中所述的任一氨基酸相同的生物学活性。等位变体存在于自然界中，并且在本发明的方法中包括使用这些天然的等位基因。

基因改组或定向进化也可以用来产生编码如上文定义的2型CLE多肽的核酸的变体；术语“基因改组”如本文定义。

根据本发明，提供了用于增强植物中产量相关性状的方法，所述方法包括在植物中导入并且表达在实施例部分的表A中给出的任一核酸序列的变体，或包括在植物中导入并且表达下述核酸的变体，所述的核酸编码在实施例部分的表A中给出的任一氨基酸序列的直向同源物、旁系同源物或同源物，其中所述的变体核酸通过基因改组获得。

另外，核酸变体也可以通过位点定向诱变获得。几种方法可用于实现位点定向诱变，最常见方法是基于PCR的方法(Current Protocols inMolecular Biology.Wiley编著)。

编码2型CLE多肽的核酸可以源自任何天然或人工来源。该核酸可以通过人类有意操作，在组成和/或基因组环境方面从其天然形式修改而来。

优选地，编码2型CLE多肽的核酸来自植物，进一步优选地来自双子叶植物，更优选地来自十字花科，最优选地，该核酸来自拟南芥。

本发明方法的实施产生了具有增强的产量相关性状的植物。尤其，本发明方法的实施产生了相对于对照植物具有增加的产量、特别是增加的种子产量的植物。术语“产量”和“种子产量”在本文的“定义”部分中更详细地描述。

本文对增强的产量相关性状的称谓意指早期生长势和/或植物的一个或多个部分的生物量(重量)的增加，所述的部分可以包括地上(可收获)部分和/或地下(可收获)部分。尤其，此类可收获部分指生物量，并且本发明方法的实施产生了相对于对照植物的生物量产量具有增加的苗及根生物量和增加的花数和花序数的植物。

本发明提供了用于相对于对照植物增加植物的产量、尤其生物量产量的方法，所述方法包括调节植物中编码如本文中定义的2型CLE多肽的核酸表达。

由于本发明的转基因植物具有增加的产量，故这些植物有可能在其生活周期的相应阶段(在其生活周期的至少部分期间)相对于对照植物的生长速率表现增加的生长速率。

根据本发明的优选特征，本发明方法的实施产生了相对于对照植物具有增加的生长速率的植物。因此，根据本发明，提供了用于增加植物生长速率的方法，所述方法包括调节植物中编码如本文中定义的2型CLE多肽的核酸表达。

相对于可比较条件下培育的对照植物，本发明方法的实施给予在非胁迫条件下或在轻度干旱条件下培育的植物增加的产量。因此，根据本发明，提供了用于增加非胁迫条件下或在轻度干旱条件下培育的植物中产量的方法，所述方法包括调节植物中编码2型CLE多肽的核酸表达。

在一个优选实施方案中，相对于可比较条件下培育的对照植物，本发明方法的实施给予在养分缺乏条件下、尤其缺氮条件下培育的植物增加的产量。因此，根据本发明，提供了用于增加养分缺乏下培育的植物中产量的方法，所述方法包括调节植物中编码2型CLE多肽的核酸表达。

相对于可比较条件下培育的对照植物，本发明方法的实施给予盐胁迫条件下培育的植物增加的产量。因此，根据本发明，提供了用于增加盐胁迫下培育的植物中产量的方法，所述方法包括调节植物中编码2型CLE多肽的核酸表达。

本发明也提供基因构建体和载体以促进植物中导入和/或表达编码2型CLE多肽的核酸。所述基因构建体可以插入适于转化至植物中并且适于在转化细胞中表达目的基因的载体，所述载体可以是市售的。本发明也提供如本文中定义的基因构建体在本发明方法中的用途。

更具体地，本发明提供构建体，其包含：

(a)编码如上文定义的2型CLE多肽的核酸；

(b)能够驱动(a)的核酸序列表达的一个或多个控制序列；和任选地

(1)转录终止序列。

优选地，编码2型CLE多肽的核酸如上文定义。术语“控制序列”和“终止序列”如本文中定义。

植物用包含上述任一核酸的载体转化。技术人员非常清楚必须在所述载体上存在以便成功转化、选择和增殖含有目的序列的宿主细胞的遗传元件。目的序列与一个或多个控制序列(至少与启动子)有效地连接。

有利地，任意类型的启动子，无论是天然的或人工的，均可以用来驱动该核酸序列表达，不过优选地，该启动子是植物源的。组成型启动子特别用于所述方法中。优选地，这种组成型启动子是中等强度的遍在组成型启动子。对于多种启动子类型的定义，见本文的“定义”部分。

应当明白本发明的适用性不限于由SEQ ID NO：1代表的编码2型CLE多肽的核酸，本发明的适用性也不限于编码2型CLE多肽的核酸受组成型启动子驱动时的表达。

这种组成型启动子优选地是中等强度启动子。更优选地，它是源自植物的启动子，如GOS2启动子或具有基本上相同强度和具有基本上相同表达模式的启动子(功能上等同的启动子)，更优选地，这种启动子是来自稻的GOS2启动子。还优选地，这种组成型启动子由基本上与SEQ ID NO：26相似的核酸序列代表，最优选地，这种组成型启动子是如SEQ ID NO：26所代表的那样。对于组成型启动子的其他例子，见本文的“定义”部分。

任选地，可以在导入植物的构建体中使用一个或多个终止子序列。优选地，构建体包含这样的表达盒，其包含基本上与SEQ ID NO：26相似的GOS2启动子和编码2型CLE多肽的核酸。另外，编码选择标记的一个或多个序列可以存在于导入植物的构建体上。

根据本发明的优选特征，受调节的表达是增加的表达。本领域中充分记录了用于增加核酸或者基因或基因产物表达的方法并且在定义部分中提供了实例。

如上文提到，用于调节编码2型CLE多肽的核酸表达的优选方法是通过在植物中导入并表达编码2型CLE多肽的核酸；然而，使用其他熟知的技术，包括但不限于T-DNA激活标签法、TILLING、同源重组，也可以实现实施本方法的效果，即增强产量相关性状。在定义部分中提供对这些技术的描述。

本发明也提供了用于产生相对于对照植物具有增强的产量相关性状的转基因植物的方法，所述方法包括在植物中导入并且表达编码如上文所定义的2型CLE多肽的任意核酸。

更具体地，本发明提供了用于产生转基因植物的方法，所述转基因植物具有增强的产量相关性状、特别是增加的生物量，所述方法包括：

(i)在植物或植物细胞中导入并且表达编码2型CLE多肽的核酸；

(ii)在促进植物生长和发育的条件下培育植物细胞。

(i)的核酸可以是能够编码如本文中定义的2型CLE多肽的任意核酸。

可以将这种核酸直接导入植物细胞或导入植物自身中(包括导入组织、器官或植物的任何其他部分)。根据本发明的优选特征，这种核酸优选地通过转化作用导入植物中。术语“转化”在本文的“定义”部分中更详细地描述。

在一个实施方案中，本发明明确地扩展至通过本文所述任意方法产生的任意植物细胞或植物，并扩展至全部植物部分及其繁殖体。本发明包括通过本发明方法可获得的植物或其部分(包括种子)。植物或其部分包含编码如上文定义的2型CLE多肽的核酸转基因。本发明进一步扩展以包括已经通过前述任意方法产生的原代转化或转染细胞、组织、器官或完整植物的子代，唯一要求是子代展示出与本发明方法中由亲本产生的那些相同的基因型和/或表型特征。

在另一个实施方案中，本发明还扩展至包含在植物表达盒或植物表达构建体中的本发明核酸分子的转基因植物细胞和种子。

在又一个实施方案中，本发明的种子重组地包含本发明的表达盒、本发明的(表达)构建体、上文描述的核酸和/或由如上文所述的核酸编码的蛋白质。

本发明的又一个实施方案扩展至包含在重组植物表达盒中如上文所述的核酸的植物细胞。

在又一个实施方案中，本发明的植物细胞是非繁殖性细胞，例如，不能使用这些细胞来从这种细胞中总体上利用标准细胞培养技术再生出完整植物，这意指细胞培养方法但是不包括体外胞核、细胞器或染色体转移方法。尽管植物细胞通常具有全能性特征，但是一些植物细胞不能用来从所述细胞再生或繁殖出完整植物。在本发明的一个实施方案中，本发明的植物细胞是此类细胞。

在另一个实施方案中，本发明的植物细胞是不能借助光合作用通过从此类无机物质如水、二氧化碳和无机盐合成糖类和蛋白质自我维持的植物细胞，即，它们可以被视为非植物品种。在又一个实施方案中，本发明的植物细胞不是植物品种并且是非繁殖性的。

本发明也包括宿主细胞，其含有编码如上文定义的2型CLE多肽的分离的核酸。本发明的宿主细胞可以是选自细菌细胞(如大肠杆菌或农杆菌物种细胞)、酵母细胞、真菌、藻类或蓝细菌(Cyanobacteria)细胞或植物细胞的任何细胞。在一个实施方案中，本发明的宿主细胞是植物细胞、酵母、细菌或真菌。对于本发明方法中所用的核酸或载体、表达盒或构建体或载体，宿主植物原则上有利地是能够合成本发明方法中所用多肽的全部植物。

在一个实施方案中，本发明的植物细胞过量表达本发明的核酸分子。

本发明也包括用于生产产品的方法，包括a)培育本发明的植物并且b)从或借助本发明的植物或这些植物的部分(包括种子)生产所述产品。在又一个实施方案中，所述方法包括步骤a)培育本发明的植物，b)从这些植物中取下如上文定义的可收获部分和c)从或借助本发明的可收获部分生产所述产品。

此类方法的实例将是培育本发明的谷物植物、收获谷物穗和取下核粒。这些可以用作为饲料或加工成淀粉和油作为农产品。

产品可以在培育有这种植物的地点生产，或者植物或其部分可以从培育有植物的地点移出以产生产品。一般而言，将植物培育，从植物取下所需的可收获部分，如果可行的话，以重复循环进行，并且从植物的可收获部分产生产品。培育植物的步骤可以每次在实施本发明的方法时仅进行仅一次，同时允许产品生产步骤重复多次，例如，通过反复取下本发明植物的可收获部分并且如果需要进一步加工这些部分以获得产品。还可以重复培育本发明植物的步骤并且贮藏植物或可收获部分直至随后对积累的植物或植物部分一次性进行产品生产。另外，培育植物和生产产品的步骤可以在时间上重叠地、甚至很大程度上同时地或依次地进行。通常，植物在生产产品之前培育一些时间。

有利地，本发明方法比已知的方法更高效，原因是与可比较方法中使用的对照植物相比，本发明的植物具有增加的产量和/或增加的环境胁迫耐受性。

在一个实施方案中，由本发明方法产生的产品是植物产物，如但不限于食品、饲料、食品补充物、饲料补充物、纤维、化妆品或药物。将食品视为用于营养或用于补充营养的组合物。将动物饲料并且尤其动物饲料补充物视为食品。

在另一个实施方案中，用于生产的本发明方法用产生农产品，如但不限于植物提取物、蛋白质、氨基酸、糖、脂肪、油、聚合物、维生素等。

可能的是植物产物大程度地由一种或多种农产品组成。

在又一个实施方案中，农产品中包含本发明的多核苷酸序列或多肽序列。

在又一个实施方案中，本发明的核酸序列和蛋白质可以用作产品标记，例如用于由本发明方法所产生的农产品。这种标记可以用来鉴定已经由有利方法产生的产品，其中所述的有利方法不仅导致该方法的更高效率，还导致改进的产品质量，原因在于该方法中所用的植物材料和可收获部分的品质提高。可以通过本领域已知的多种方法检测此类标记，例如，但不限于基于PCR的用于核酸检测的方法或基于抗体的用于蛋白质检测的方法。

本发明的方法有利地适用于任意植物。在本发明方法中特别有用的植物包括属于植物界超家族、尤其单子叶和双子叶植物的全部植物，包括饲用或饲料豆科植物、观赏植物、粮食作物、树或灌木。根据本发明的优选实施方案，植物是作物植物。作物植物的实例包括大豆、甜菜、糖甜菜、向日葵、卡诺拉油菜、苜蓿、油籽油菜、菊苣、胡萝卜、木薯、三叶草(trefoil)、亚麻、棉花、番茄、马铃薯和烟草。更优选地，该植物是单子叶植物。单子叶植物的实例包括甘蔗。更优选地，该植物是谷类。谷类的实例包括稻、玉米、小麦、大麦、粟、黑麦、黑小麦属、高粱、二粒小麦、斯卑尔脱小麦、黑麦草(secale)、单粒小麦、埃塞俄比亚画眉草(teff)、蜀黍(milo)和燕麦。

在一个实施方案中，在本发明方法中所用的植物选自玉米、小麦、稻、大豆、棉花、油籽油菜(包括卡诺拉油菜)、甘蔗、甜菜和苜蓿。

在本发明的另一个实施方案中，本发明的植物和在本发明方法中所用的植物是甜菜的生物量增加和/或糖含量增加的糖甜菜植物。

本发明也扩展至植物的可收获部分，如但不限于种子、叶、果实、花、茎、根、根状茎、块茎和球茎，所述可收获部分包含编码2型CLE多肽的重组核酸。本发明还涉及源自或产自、优选直接源自或产自这种植物的可收获部分中的产品，如干燥颗粒或粉末、油、脂肪和脂肪酸、淀粉或蛋白质。

本发明也包括编码如本文中所述的2型CLE多肽的核酸的用途，和这些2型CLE多肽的用途，用于增强植物中任意的前述产量相关性状。例如，编码本文中所述的2型CLE多肽的核酸或2型CLE多肽自身可以用于育种计划中，在所述育种计划中鉴定到可以遗传地与编码2型CLE多肽的基因连锁的DNA标记。这些核酸/基因或2型CLE多肽自身可以用来限定分子标记。这种DNA或蛋白质标记随后可以用于育种计划中以选择具有如上文在本发明方法中所定义的增强的产量相关性状的植物。另外，编码2型CLE多肽的核酸/基因的等位变体也可以用于标记辅助的育种程序中。编码2型CLE多肽的核酸也可以用作探针以遗传地或物理地绘制这些核酸作为其部分的基因并且用作与这些基因连锁的性状的标记。此类信息可能用于植物育种中旨在开发具有所希望表型的品系。

Bax抑制物-1(BI-1)多肽

出人意料地，现在已经发现，调节植物中编码如本文中提供的Bax抑制物-1(BI-1)多肽或如本文中提供的其同源物的核酸的表达产生了相对于对照植物具有增强的产量相关性状的植物。

根据第一实施方案，本发明提供了用于相对于对照植物增强植物中产量相关性状的方法，包括调节植物中编码如本文中提供的Bax抑制物-1(BI-1)多肽或如本文中提供的其同源物的核酸表达和任选地选择具有增强的产量相关性状的植物。优选地，提供了一种用于相对于对照植物增强植物中产量相关性状的方法，所述方法包括调节植物中编码Bax抑制物-1(BI-1)多肽或其同源物的核酸的表达，其中所述Bax抑制物-1(BI-1)多肽或其同源物包含Bax抑制物相关结构域。

用于调节编码如本文中提供的Bax抑制物-1(BI-1)多肽或如本文中提供的其同源物的核酸表达、并且优选增加其表达的优选方法是在植物中导入并且表达编码所述Bax抑制物-1(BI-1)多肽或所述同源物的核酸。

在一个实施方案中，提供一种方法，其中所述增强的产量相关性状相对于对照植物包括增加的产量，并且相对于对照植物优选地包括增加的种子产量和/或增加的生物量。

在一个实施方案中，提供一种方法，其中所述增强的产量相关性状在非胁迫条件下获得。

在另一个实施方案中，提供一种方法，其中所述增强的产量相关性状在渗透胁迫(如例如干旱胁迫)、寒冷胁迫和/或盐胁迫的条件下或在缺氮的条件下获得。

下文对“本发明方法中有用的蛋白质”的任何称谓意指如本文定义的Bax抑制物-1(BI-1)多肽或如本文定义的其同源物。下文对“本发明方法中有用的核酸”的任何称谓意指能够编码这种Bax抑制物-1(BI-1)多肽或其同源物的核酸。待导入植物中并且因而在实施本发明方法中有用的核酸，是编码现在将描述的蛋白质类型的任意核酸，下文也称作“Bax抑制物-1基因”或“BI-1基因”。

如本文定义的“Bax抑制物-1多肽”或“BI-1多肽”指一种含有多个跨膜区段的进化上保守的蛋白质并且是优势地定位于胞内膜。更具体地，Bax抑制物-1蛋白(BI-1)是内质网(ER)和核被膜中带有6至7个跨膜结构域和一个胞质C末端的跨膜蛋白。它们以往被描述为细胞死亡途径的调节物。如本文所用的术语“Bax抑制物-1多肽”或“BI-1多肽”还意在包括如本文在“Bax抑制物-1多肽”下定义的同源物。

在一个优选实施方案中，如本文中所应用的Bax抑制物-1(BI-1)多肽包含Bax抑制物相关结构域。在一个优选实施方案中，Bax抑制物相关结构域对应于Pfam PF01027。

术语“结构域”、“标签”和“基序”如在本文“定义”部分中定义。

在一个优选实施方案中，BI-1多肽包含一个或多个以下基序：

i)基序3a：[DN]TQxxxE[KR][AC]xxGxxDY[VIL]xx[STA](SEQ IDNO：131)。优选地，所述基序是DTQ[ED]IIE[KR]AH[LH]GD[LRM]DY[VI]KH[SA](基序3b；SEQ ID NO：132)。

ii)基序4a：xxxxxISPx[VS]xx[HYR][LI][QRK]x[VFN][YN]xx[LT](SEQ ID NO：133)。优选地，所述基序是KNFRQISP[AV]VQ[TNS]HLK[LRQ]VYL[TS]L(基序4b；SEQ ID NO：134)；

iii)基序5a：FxxFxxAxxxxxRRxx[LMF][YF][LH]x(SEQ ID NO：135)。优选地，所述基序是F[GA]CFS[AG]AA[ML][LV]A[RK]RREYLYLG(基序5b；SEQ ID NO：136)。

在一个优选实施方案中，BI-1多肽还包含一个或多个以下基序：

i)基序6a：DTQxI[VI]E[KR]AHxGDxDYVKHx(SEQ ID NO：137)。优选地，所述基序是：DTQ[ED]IIE[KR]AH[LF]GD[LR]DYVKHA(基序6b；SEQ ID NO：138)；

ii)基序7a：x[QE]ISPxVQxHLK[QK]VY[FL]xLC[FC](SEQ ID NO：139)。优选地，所述基序是：[RH]QISP[VL]VQ[TN]HLKQVYL[TS]LCC(基序7b；SEQ ID NO：140)；

iii)基序8a：F[AG]CF[SP][AG]AA[ML][VL][AG]RRREYLYL[AG]G(SEQ ID NO：141)。优选地，所述基序是：F[GA]CFS[AG]AA[ML][VL]ARRREYLYLGG(基序8b；SEQ ID NO：142)；

iv)基序9：[IF]E[VL]Y[FL]GLL[VL]F[VM]GY[VIM][IV][VYF](SEQID NO：143)；

v)基序10：[MFL][LV]SSG[VLI]SxLxW[LV][HQ][FL]ASxIFGG(SEQID NO：144)；

vi)基序11：H[ILV][LIM][FLW][NH][VI]GG[FTL]LT[AVT]x[GA]xx[GA]xxxW[LM][LM](SEQ ID NO：145)；

vii)基序12：Rx[AST][LI]L[ML][GAV]xx[LVF][FL][EKQ]GA[STY]IGPL[IV](SEQ ID NO：146)。

这些额外的基序6至12基本上存在于如本文所述的RA/BI-1组多肽的BI-1多肽中。

在又一个优选实施方案中，BI-1多肽还包含一个或多个以下基序：

i)基序13a：DTQx[IVM][IV]E[KR][AC]xxGxxDxx[KRQ]Hx(SEQ IDNO：147)。优选地，所述基序是：DTQEIIE[RK]AH[HL]GDMDY[IV]KH[AS](基序13b；SEQ ID NO：148)；

ii)基序14：E[LVT]Y[GLF]GLx[VLI][VF]xGY[MVI][LVI]x(SEQ IDNO：149)；

iii)基序15：KN[FL]RQISPAVQ[SN]HLK[RL]VYLT(SEQ ID NO：150)；

iv)基序16a：Fx[CS]F[ST]xA[AS]xx[AS]xRR[ESH][YFW]x[FY][LH][GS][GA]xL(SEQ ID NO：151)。优选地，所述基序是：F[AGV]CF[ST][GCA]AA[ILM][LVI]A[KR]RREYL[YF]LG(基序16b；SEQ ID NO：152)。

这些额外的基序11至14基本上存在于如本文所述的EC/BI-1组多肽的BI-1多肽中。

使用MEME算法(Bailey和Elkan，Proceedings of the SecondInternational Conference on Intelligent Systems for Molecular Biology(第二届分子生物学智能系统国际会议文集)，第28-36页，AAAI Press，MenloPark，California，1994)推导上文给出的基序3b、4b、5b、6a、7b、8b、13b、15和16b。在MEME基序内部的每个位置，显示在查询序列集合中以高于0.2的频率存在的残基。上文给出的其他基序基本上基于序列比对结果推导。方括号内的残基代表备选残基。

在一个优选实施方案中，如本文中应用的BI-1多肽以增加的优选顺序包含选自包含如上文给出的基序3a、4a、5a、6a、7a、8a、9、10、11和12的组中的至少2种、至少3种、至少4种、至少5种、至少6种、至少7种、至少8种、至少9个或全部10种基序。备选地或额外地，在另一个优选实施方案中，如本文中应用的BI-1多肽包含选自包含如上文给出的基序3b、4b、5b、6b、7b和8b的组中的至少2种、至少3种、至少4种、至少5种或全部6种基序。

在另一个优选实施方案中，如本文中应用的BI-1多肽以增加的优选顺序包含选自包含如上文给出的基序3a、4a、5a、13a、14、15和16a的组中的至少2种、至少3种、至少4种、至少5种、至少6种或全部7种基序。备选地或额外地，在另一个优选实施方案中，如本文中应用的BI-1多肽包含选自包含如上文给出的基序3b、4b、5b、13b和16b的组中的至少2种、至少3种、至少4种或全部5种基序。

额外地或备选地，BI-1蛋白的同源物以增加的优选顺序与SEQ ID NO：30所代表的氨基酸具有至少20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％整体序列同一性，条件是该同源蛋白包含如上文所概括的保守基序3至保守基序5中的任何一种或多种基序。使用总体比对算法，如程序GAP(GCG Wisconsin Package，Accelrys)中的Needleman Wunsch算法，优选地采用默认参数并且优选地采用成熟蛋白质的序列(即不考虑分泌信号或转运肽)，确定整体序列同一性。与整体序列同一性相比，仅考虑保守的结构域或基序时，所述序列同一性通常会更高。优选地，BI-1多肽中的基序以增加的优选顺序与SEQ IDNO：131至SEQ ID NO：136所代表的基序(基序3a、b、4a、4b、5a和5b)中任何一个或多个具有至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性。

进化系统分析导致建立一个显示两组BI-1相关蛋白的进化系统树(图8)：

-第一组包含来自种子植物(包括单子叶植物和双子叶植物)和非种子植物(包括蕨和苔藓)的BI-1。这个组的成员似乎是进化上保守的并且可能源自共同祖先。这个组在本文中也称作EC/BI-1组或称作进化保守BI-1多肽组。独立的进化系统分析显示，它们与酵母和细菌共有共同祖先，因此提示了共同起源。

-第二组包含对于两大类真双子叶植物：菊亚纲(Asteridae)和蔷薇亚纲(Rosidae)更特有的BI-1蛋白。这个组在本文中也称作RA/BI-1组或称作蔷薇亚纲和菊亚纲(RA)相关BI-1多肽组。令人感兴趣的是，这个组中的一些物种(例如，大豆(Glycine max)和毛果杨(Populus trichocarpa))已经在进化期间经历基因组重复，这可能在特定组的BI-1相关蛋白起源时发生。

在一个实施方案中，当用于构建进化系统树(如图8中所绘制的进化系统树)时，这种多肽序列与包含如SEQ ID NO：30所代表的氨基酸序列的蔷薇亚纲和菊亚纲(RA)/BI-1多肽组聚类，而不与任何其他组聚类。

在另一个实施方案中，当用于构建进化系统树(如图8中所绘制的进化系统树)时，这种多肽序列与包含如SEQ ID NO：37所代表的氨基酸序列的进化保守(EC)/BI-1多肽组聚类，而不与任何其他组聚类。

在一个优选实施方案中，本发明提供一种用于相对于对照植物增强植物中产量相关性状的方法，所述方法包括调节植物中编码与SEQ ID NO：34和35对应的BI-1多肽的核酸的表达。

在另一个实施方案中，本发明提供一种用于相对于对照植物增强植物中产量相关性状的方法，所述方法包括调节植物中编码与SEQ ID NO：32对应的BI-1多肽的核酸的表达。

另外，已经将BI-1多肽(至少在它们的天然形式下)描述为程序性细胞死亡的调节物，已经将它们更具体地描述为ER胁迫介导的程序性细胞死亡的调节物，并且甚至更具体地，它们能够在酵母中或在细胞培养物中抑制Bax诱导的细胞死亡，例如由Chae等人(2009，Gene 323，101-13)所述。BI-1多肽还对衣霉素处理显示降低的敏感性(Watanabe和Lam，(2007，J.Biol.Chem.283(6)：3200-10)。还进一步显示，BI-1多肽与AtCb5相互作用(Nagano等人2009)。用于测量程序性细胞死亡调节物(如BI-1蛋白)的活性的工具和技术是本领域熟知的。在实施例14中提供其实例。

另外，BI-1多肽，当根据本发明方法如实施例15、16、17和19中所概述那样在稻中表达时，产生具有增加的产量相关性状、尤其增加的种子产量和/或增加的生物量的植物。BI-1多肽，当根据本发明方法如实施例20中所概述那样在拟南芥中表达时，产生具有增加的产量相关性状、尤其增加的生物量的植物。

在一个实施方案中，本发明通过用SEQ ID NO：29所代表的核酸序列转化植物进行说明，其中所述核酸序列编码SEQ ID NO：30的多肽序列。在另一个实施方案中，本发明通过用SEQ ID NO：31所代表的核酸序列转化植物进行说明，其中所述核酸序列编码SEQ ID NO：32的多肽序列。然而，本发明的实施不限于这些序列；本发明的方法可以有利地使用如本文定义的任何编码BI-1的核酸或BI-1多肽实施。

在本文实施例部分的表C中给出编码BI-1多肽的核酸的其他实例。此类核酸用于实施本发明的方法。在实施例部分的表C中给出的氨基酸序列是由SEQ ID NO：30所代表的BI-1多肽的直向同源物和旁系同源物的实例序列，术语“直向同源物”和“旁系同源物”如本文中定义。可以通过执行如定义部分中所述的所谓交互性blast检索轻易地鉴定其他直向同源物和旁系同源物，其中查询序列是SEQ ID NO：29或SEQ ID NO：30，第二BLAST(反向BLAST)将针对杨序列。

本发明还提供了编码迄今未知的BI1的核酸和BI-1多肽，其用于相对于对照植物在植物中赋予增强的产量相关性状。

根据本发明的又一个实施方案，因而提供分离的核酸分子，其选自：

i)由SEQ ID NO：43代表的核酸；

ii)由SEQ ID NO：43代表的核酸的互补核酸；

iii)编码BI-1多肽的核酸，所述BI-1多肽以增加的优选顺序与SEQ IDNO：44所代表的氨基酸序列具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性并且额外地或备选地包含一个或多个基序，所述基序以增加的优选顺序与SEQ ID NO：131至SEQ ID NO：136中所给出基序(基序3a、3b、4a、4b、5a和5b)中的任何一个或多个具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多的序列同一性，并且还优选地相对于对照植物赋予增强的产量相关性状。

iv)与(i)至(iii)的核酸分子在高严格杂交条件下杂交并且相对于对照植物赋予增强的产量相关性状的核酸分子。

根据本发明的又一个实施方案，还提供分离的多肽，其选自：

i)由SEQ ID NO：44代表的氨基酸序列；

ii)氨基酸序列，其以增加的优选顺序与SEQ ID NO：44所代表的氨基酸序列具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性并且额外地或备选地包含一个或多个基序，所述基序以增加的优选顺序与SEQ IDNO：131至SEQ ID NO：136中所给出基序(基序3a、3b、4a、4b、5a和5b)中的任何一个或多个具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多的序列同一性，并且还优选地相对于对照植物赋予增强的产量相关性状；

iii)以上(i)或(ii)中给出的任一氨基酸序列的衍生物。

根据本发明的又一个实施方案，因而提供分离的核酸分子，其选自：

i)由SEQ ID NO：89代表的核酸；

ii)由SEQ ID NO：89代表的核酸的互补核酸；

iii)编码BI-1多肽的核酸，所述BI-1多肽以增加的优选顺序与SEQ IDNO：90所代表的氨基酸序列具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性并且额外地或备选地包含一个或多个基序，所述基序以增加的优选顺序与SEQ ID NO：131至SEQ ID NO：136中所给出基序(基序3a、3b、4a、4b、5a和5b)中的任何一个或多个具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多的序列同一性，并且还优选地相对于对照植物赋予增强的产量相关性状。

iv)与(i)至(iii)的核酸分子在高严格杂交条件下杂交并且相对于对照植物赋予增强的产量相关性状的核酸分子。

根据本发明的又一个实施方案，还提供分离的多肽，其选自：

i)由SEQ ID NO：90代表的氨基酸序列；

ii)氨基酸序列，其以增加的优选顺序与SEQ ID NO：90所代表的氨基酸序列具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性并且额外地或备选地包含一个或多个基序，所述基序以增加的优选顺序与SEQ IDNO：131至SEQ ID NO：136中所给出基序(基序3a、3b、4a、4b、5a和5b)中的任何一个或多个具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多的序列同一性，并且还优选地相对于对照植物赋予增强的产量相关性状；

iii)以上(i)或(ii)中给出的任一氨基酸序列的衍生物。

核酸变体也可以用于实施本发明的方法。此类变体的例子包括编码在实施例部分的表C中所给出的任一个氨基酸序列的同源物和衍生物的核酸，术语“同源物”和“衍生物”如本文中定义。在本发明方法中有用的还是这样的核酸，其编码在实施例部分的表C中给出的任一氨基酸序列的直向同源物或旁系同源物的同源物和衍生物。在本发明方法中有用的同源物和衍生物与衍生它们的非修饰蛋白质具有基本上相同的生物学活性和功能活性。在实施本发明方法中有用的其他变体是其中优化了密码子选择或其中去除miRNA靶位点的变体。

在实施本发明方法中有用的其他核酸变体包括编码BI-1多肽的核酸的部分、与编码BI-1多肽的核酸杂交的核酸、编码BI-1多肽的核酸的剪接变体、编码BI-1多肽的核酸的等位变体和通过基因改组获得的编码BI-1多肽的核酸的变体。术语“杂交序列”、“剪接变体”、“等位变体”和“基因改组”如本文所述。

编码BI-1多肽的核酸不需要是全长核酸，因为本发明方法的实施不依赖于使用全长核酸序列。根据本发明，提供了用于增强植物中产量相关性状的方法，所述方法包括在植物中导入并且表达在实施例部分的表C中给出的任一个核酸序列的一部分或编码在实施例部分表C中给出的任一氨基酸序列的直向同源物、旁系同源物或同源物的核酸的一部分。

核酸的一部分可以例如通过对所述核酸产生一个或多个缺失而制备。所述部分可以以分离的形式使用或它们可以与其他编码(或非编码)序列融合，例如旨在产生组合有几种活性的蛋白质。与其他编码序列融合时，翻译时产生的所得多肽可以比对该蛋白质部分所预测的多肽更大。

在本发明方法中有用的部分编码如本文中定义的BI-1多肽，并且基本上具有如实施例部分的表C中给出的氨基酸序列相同的生物学活性。优选地，该部分是在实施例部分的表C中给出的任一核酸的一部分，或是编码在实施例部分的表C中给出的任一氨基酸序列的直向同源物或旁系同源物的核酸的一部分。优选地，该部分具有至少650、700、750、800、850、900个连续核苷酸长度，所述连续核苷酸属于在实施例部分的表C中给出的任一核酸序列或属于编码在实施例部分的表C中给出的任一氨基酸序列的直向同源物或旁系同源物的核酸。

在一个优选实施方案中，该部分是SEQ ID NO：29的核酸的一部分。优选地，该部分编码下述氨基酸序列的片段，其中当用于构建进化系统树(如图8所绘制的进化系统树)时，所述氨基酸序列与包含由SEQ ID NO：30所代表的氨基酸序列的RA/BI-1组多肽聚类，而不与任何其他组聚类，和/或包含选自包含如上文给出的基序3a、4a、5a、6a、7a、8a、9、10、11和12的组中的至少2种、至少3种、至少4种、至少5种、至少6种、至少7种、至少8种、至少9个或全部10种基序，和/或包含选自包含如上文给出的基序3b、4b、5b、6b、7b和8b的组中的至少2种、至少3种、至少4种、至少5种或全部6种基序。

在另一个优选实施方案中，该部分是SEQ ID NO：31的核酸的一部分。优选地，该部分编码下述氨基酸序列的片段，其中当用于构建进化系统树(如图8所绘制的进化系统树)时，所述氨基酸序列与包含由SEQ ID NO：32所代表的氨基酸序列的EC/BI-1组多肽聚类，而不与任何其他组聚类，和/或包含选自包含如上文给出的基序3a、4a、5a、13a、14、15和16a的组中的至少2种、至少3种、至少4种、至少5种、至少6种或全部7种基序，和/或包含选自包含如上文给出的基序3b、4b、5b、13b和16b的组中的至少2种、至少3种、至少4种或全部5种基序。

在本发明方法中有用的另一种核酸变体是能够在降低的严格条件下、优选在严格条件下与如本文中定义的编码BI-1多肽的核酸或与如本文中定义的部分杂交的核酸。

根据本发明，提供了用于增强植物中产量相关性状的方法，包括在植物中导入并表达能够与实施例部分的表C中给出的任一种核酸杂交的核酸，或包括在植物中导入并表达这样的核酸，所述核酸能够与编码在实施例部分的表C中给出的任意核酸序列的直向同源物、旁系同源物或同源物的核酸杂交。

在本发明方法中有用的杂交序列编码如本文中定义的BI-1多肽，并且基本上具有如实施例部分的表C中给出的氨基酸序列相同的生物学活性。优选地，该杂交序列能够与实施例部分的表C中给出的任一核酸的互补核酸或与这些序列中任一者的一部分杂交，所述的一部分如上文定义，或该杂交序列能够与下述核酸的互补核酸杂交，所述核酸编码在实施例部分的表C中给出的任一氨基酸序列的直向同源物或旁系同源物。最优选地，该杂交序列能够与如SEQ ID NO：29所代表的核酸的互补核酸或与其一部分杂交。在另一个优选实施方案中，该杂交序列能够与如SEQ ID NO：31所代表的核酸的互补核酸或与其一部分杂交。

优选地，该杂交序列编码具有下述氨基酸序列的多肽，其中当为全长并且用于构建进化系统树(如图8所绘制的进化系统树)时，所述氨基酸序列与包含由SEQ ID NO：30所代表的氨基酸序列的RA/BI-1组多肽聚类，而不与任何其他组聚类，和/或包含选自包含如上文给出的基序3a、4a、5a、6a、7a、8a、9、10、11和12的组中的至少2种、至少3种、至少4种、至少5种、至少6种、至少7种、至少8种、至少9个或全部10种基序，和/或包含选自包含如上文给出的基序3b、4b、5b、6b、7b和8b的组中的至少2种、至少3种、至少4种、至少5种或全部6种基序。

在另一个优选实施方案中，该杂交序列编码具有下述氨基酸序列的多肽，其中当为全长并且用于构建进化系统树(如图8所绘制的进化系统树)时，所述氨基酸序列与包含由SEQ ID NO：32所代表的氨基酸序列的EC/BI-1组多肽聚类，而不与任何其他组聚类，和/或包含选自包含如上文给出的基序3a、4a、5a、13a、14、15和16a的组中的至少2种、至少3种、至少4种、至少5种、至少6种或全部7种基序，和/或包含选自包含如上文给出的基序3b、4b、5b、13b和16b的组中的至少2种、至少3种、至少4种或全部5种基序。

在本发明方法中有用的另一种核酸变体是编码如上文所定义的BI-1多肽的剪接变体，剪接变体如本文中定义。

根据本发明，提供了用于增强植物中产量相关性状的方法，所述方法包括在植物中导入并且表达在实施例部分的表C中给出的任一核酸序列的剪接变体或编码在实施例部分的表C中给出的任一氨基酸序列的直向同源物、旁系同源物或同源物的核酸的剪接变体。

在一个实施方案中，优选的剪接变体是由SEQ ID NO：29所代表的核酸的剪接变体，或是编码SEQ ID NO：30的直向同源物或旁系同源物的核酸的剪接变体。优选地，由剪接变体编码的氨基酸序列，在用于构建进化系统树(如图8所绘制的进化系统树)时，与包含由SEQ ID NO：30所代表的氨基酸序列的RA/BI-1组多肽聚类，而不与任何其他组聚类，和/或包含选自包含如上文给出的基序3a、4a、5a、6a、7a、8a、9、10、11和12的组中的至少2种、至少3种、至少4种、至少5种、至少6种、至少7种、至少8种、至少9个或全部10种基序，和/或包含选自包含如上文给出的基序3b、4b、5b、6b、7b和8b的组中的至少2种、至少3种、至少4种、至少5种或全部6种基序。

在另一个实施方案中，优选的剪接变体是由SEQ ID NO：31所代表的核酸的剪接变体，或是编码SEQ ID NO：32的直向同源物或旁系同源物的核酸的剪接变体。优选地，由剪接变体编码的氨基酸序列，在用于构建进化系统树(如图8所绘制的进化系统树)时，与包含由SEQ ID NO：32所代表的氨基酸序列的EC/BI-1组多肽聚类，而不与任何其他组聚类，和/或包含选自包含如上文给出的基序3a、4a、5a、13a、14、15和16a的组中的至少2种、至少3种、至少4种、至少5种、至少6种或全部7种基序，和/或包含选自包含如上文给出的基序3b、4b、5b、13b和16b的组中的至少2种、至少3种、至少4种或全部5种基序。

在实施本发明方法中有用的另一种核酸变体是编码如上文所定义的BI-1多肽的核酸的等位变体，等位变体如本文中定义。

根据本发明，提供用于增强植物中产量相关性状的方法，所述方法包括在植物中导入并且表达在实施例部分的表C中给出的任一核酸的等位变体，或包括在植物中导入并且表达下述核酸的等位变体，其中所述核酸编码在实施例部分的表C中给出的任一氨基酸序列的直向同源物、旁系同源物或同源物。

由本发明方法中有用的等位变体编码的多肽基本上具有与SEQ IDNO：30的BI-1多肽和实施例部分的表C中所述的任一氨基酸相同的生物学活性。等位变体存在于自然界中，并且在本发明的方法中包括使用这些天然的等位基因。优选地，该等位变体是SEQ ID NO：29的等位变体或编码SEQ ID NO：30的直向同源物或旁系同源物的核酸的等位变体。优选地，由该等位变体编码的氨基酸序列，在用于构建进化系统树(如图8所绘制的进化系统树)时，与包含由SEQ ID NO：30所代表的氨基酸序列的RA/BI-1组多肽聚类，而不与任何其他组聚类，和/或包含选自包含如上文给出的基序3a、4a、5a、6a、7a、8a、9、10、11和12的组中的至少2种、至少3种、至少4种、至少5种、至少6种、至少7种、至少8种、至少9个或全部10种基序，和/或包含选自包含如上文给出的基序3b、4b、5b、6b、7b和8b的组中的至少2种、至少3种、至少4种、至少5种或全部6种基序。

在另一个优选实施方案中，该等位变体是SEQ ID NO：31的等位变体或编码SEQ ID NO：32的直向同源物或旁系同源物的核酸的等位变体。优选地，由该等位变体编码的氨基酸序列，在用于构建进化系统树(如图8所绘制的进化系统树)时，与包含由SEQ ID NO：32所代表的氨基酸序列的EC/BI-1组多肽聚类，而不与任何其他组聚类，和/或包含选自包含如上文给出的基序3a、4a、5a、13a、14、15和16a的组中的至少2种、至少3种、至少4种、至少5种、至少6种或全部7种基序，和/或包含选自包含如上文给出的基序3b、4b、5b、13b和16b的组中的至少2种、至少3种、至少4种或全部5种基序。

基因改组或定向进化也可以用来产生编码如上文定义的BI-1多肽的核酸的变体；术语“基因改组”如本文定义。

根据本发明，提供了用于增强植物中产量相关性状的方法，所述方法包括在植物中导入并且表达在实施例部分的表C中给出的任一核酸序列的变体，或包括在植物中导入并且表达下述核酸的变体，所述的核酸编码在实施例部分的表C中给出的任一氨基酸序列的直向同源物、旁系同源物或同源物，其中所述的变体核酸通过基因改组获得。

优选地，由借助基因改组所获得的变体核酸编码的氨基酸序列，在用于构建进化系统树(如图8所绘制的进化系统树)时，与包含由SEQ ID NO：30所代表的氨基酸序列的RA/BI-1组多肽聚类，而不与任何其他组聚类，和/或包含选自包含如上文给出的基序3a、4a、5a、6a、7a、8a、9、10、11和12的组中的至少2种、至少3种、至少4种、至少5种、至少6种、至少7种、至少8种、至少9个或全部10种基序，和/或包含选自包含如上文给出的基序3b、4b、5b、6b、7b和8b的组中的至少2种、至少3种、至少4种、至少5种或全部6种基序。

在另一个优选实施方案中，由借助基因改组所获得的变体核酸编码的氨基酸序列，在用于构建进化系统树(如图8所绘制的进化系统树)时，与包含由SEQ ID NO：32所代表的氨基酸序列的EC/BI-1组多肽聚类，而不与任何其他组聚类，和/或包含选自包含如上文给出的基序3a、4a、5a、13a、14、15和16a的组中的至少2种、至少3种、至少4种、至少5种、至少6种或全部7种基序，和/或包含选自包含如上文给出的基序3b、4b、5b、13b和16b的组中的至少2种、至少3种、至少4种或全部5种基序。

另外，核酸变体也可以通过位点定向诱变获得。几种方法可用于实现位点定向诱变，最常见方法是基于PCR的方法(Current Protocols inMolecular Biology.Wiley编著)。

编码BI-1多肽的核酸可以源自任何天然或人工来源。该核酸可以通过人类有意操作，在组成和/或基因组环境方面从其天然形式修改而来。在一个实施方案中，编码BI-1多肽或其同源物的核酸优选地是植物来源的。

在一个实施方案中，编码Bax抑制物-1(BI-1)多肽或其同源物的核酸来自双子叶植物。在实例中，编码Bax抑制物-1(BI-1)多肽或其同源物的核酸来自十字花科，更优选地来自拟南芥属，最优选地来自拟南芥。在另一个实例中，编码Bax抑制物-1(BI-1)多肽或其同源物的核酸来自杨柳科(Salicaceae)，更优选地来自杨属，最优选地来自毛果杨。

在一个实施方案中，编码Bax抑制物-1(BI-1)多肽或其同源物的核酸来自单子叶植物，优选地来自禾本科，更优选地来自稻属，最优选地来自稻。

本发明方法的实施产生了具有增强的产量相关性状的植物。尤其，本发明方法的实施产生了相对于对照植物具有增加的产量、特别是增加的种子产量的植物。术语“产量”和“种子产量”在本文的“定义”部分中更详细地描述。

因此，在本发明的一个优选实施方案中，提供了具有增强的产量相关性状的植物，其中所述增强的产量相关性状包括相对于对照植物增加的产量。优选地，与对照植物相比在本发明植物中提供的增加的产量包含选自以下组的参数，所述组包含增加的种子产量和/或增加的生物量。在一个实施方案中，本文中对“增强的产量相关性状”的称谓意指产量增加，包括种子产量增加和/或植物的一个或多个部分的生物量(重量)增加，所述部分可以包括地上(可收获的)部分和/或(可收获的)地下部分。尤其，此类可收获部分包括或者是种子，并且本发明方法的实施产生相对于对照植物的种子产量，具有增加的种子产量的植物。

本发明提供了用于相对于对照植物增加植物的产量相关性状的方法，和尤其用于相对于对照植物增加产量的方法，以及更具体地用于相对于对照植物增加种子产量和/或用于增加生物量的方法，所述方法包括调节植物中编码如本文定义的BI-1多肽的核酸表达。

根据本发明的另一个优选特征，本发明方法的实施产生了相对于对照植物具有增加的生长速率的植物。因此，根据本发明，提供了用于增加植物生长速率的方法，所述方法包括调节植物中编码如本文中定义的BI-1多肽的核酸表达。

相对于可比较条件下培育的对照植物，本发明方法的实施给予在非胁迫条件下或在胁迫条件下如在轻度干旱条件下培育的植物增加的产量。因此，根据本发明，提供了用于增加非胁迫条件下或在胁迫条件下(如在轻度干旱条件下)培育的植物中产量的方法，所述方法包括调节植物中编码如本文定义的BI-1多肽的核酸表达。

相对于可比较条件下生长的对照植物，本发明方法的实施给予在养分缺乏条件下、尤其缺氮条件下培育的植物增加的产量。因此，根据本发明，提供了用于增加养分缺乏下培育的植物中产量的方法，所述方法包括调节植物中编码如本文定义的BI-1多肽的核酸表达。

相对于可比较条件下培育的对照植物，本发明方法的实施给予盐胁迫条件下培育的植物增加的产量。因此，根据本发明，提供了用于增加盐胁迫下培育的植物中产量的方法，所述方法包括调节植物中编码如本文定义的BI-1多肽的核酸表达。

本发明也提供基因构建体和载体以促进在植物中导入和/或表达编码如本文定义的BI-1多肽的核酸。所述基因构建体可以插入适于转化至植物中并且适于在转化细胞中表达目的基因的载体，所述载体可以是市售的。本发明也提供如本文中定义的基因构建体在本发明方法中的用途。

更具体地，本发明提供构建体，其包含：

(a)编码如上文定义的BI-1多肽的核酸；

(b)能够驱动(a)的核酸序列表达的一个或多个控制序列；和任选地

(c)转录终止序列。

优选地，编码BI-1多肽的核酸如上文定义。术语“控制序列”和“终止序列”如本文中定义。

本发明进一步提供用如上文所述的构建体转化的植物。具体而言，本发明提供用如上文所述的构建体转化的植物。所述植物具有如本文所述的增加的产量相关性状。

植物用包含上述任一核酸的载体转化。技术人员非常清楚必须在所述载体上存在以便成功转化、选择和增殖含有目的序列的宿主细胞的遗传元件。目的序列与一个或多个控制序列(至少与启动子)有效地连接。

有利地，任意类型的启动子，无论是天然的或合成的，均可以用来驱动该核酸序列表达，不过优选地，该启动子是植物源的。组成型启动子特别用于所述方法中。优选地，这种组成型启动子是遍在组成型启动子。在一个优选实施方案中，这种组成型启动子是中等强度的遍在组成型启动子。对于多种启动子类型的定义，见本文的“定义”部分。

应当明白本发明的应用不限于由SEQ ID NO：29代表的编码BI-1多肽的核酸，本发明的应用也不限于编码BI-1多肽的核酸在受组成型启动子驱动时的表达。对于组成型启动子的其他例子，见本文的“定义”部分。

这种组成型启动子优选地是中等强度启动子。更优选地，它是源自植物的启动子，如GOS2启动子或具有基本上相同强度和具有基本上相同表达模式的启动子(功能上等同的启动子)。

可以根据本发明使用的植物源启动子的另一个实例是例如源自欧芹的遍在蛋白启动子。

在一个优选实施方案中，这种启动子是来自稻的GOS2启动子。进一步优选地，这种组成型启动子由基本上与SEQ ID NO：153相似的核酸序列代表；最优选地，这种组成型启动子是如SEQ ID NO：153所代表那样。

任选地，可以在导入植物的构建体中使用一个或多个终止子序列。

在一个优选实施方案中，构建体包含这样的表达盒，其包含基本上与SEQ ID NO：153相似的GOS2启动子和编码BI-1多肽的核酸。在另一个实例中，构建体包含这样的表达盒，其包含遍在蛋白启动子和编码BI-1多肽的核酸。另外，编码选择标记的一个或多个序列可以存在于导入植物的构建体上。

根据本发明的优选特征，受调节的表达是增加的表达。本领域中充分记录了用于增加核酸或者基因或基因产物表达的方法并且在定义部分中提供了实例。

如上文提到，用于调节编码BI-1多肽的核酸表达的优选方法是通过在植物中导入并且表达编码BI-1多肽的核酸；然而，使用其他熟知的技术，包括但不限于T-DNA激活标签法、TILLING、同源重组，也可以实现实施本方法的效果，即增强产量相关性状。在定义部分中提供对这些技术的描述。

本发明也提供用于产生转基因植物的方法，所述转基因植物相对于对照植物具有增强的产量相关性状，其中所述方法包括在植物中导入并且表达编码如上文所定义的BI-1多肽的任意核酸。

更具体地，本发明提供用于产生转基因植物的方法，所述转基因植物相对于对照植物具有增强的产量相关性状，并且更优选地相对于对照植物具有增加的种子产量和/或增加的生物量，所述方法包括：

(i)在植物细胞或植物中导入并且表达编码如本文定义的Bax抑制物-1多肽的核酸或如本文定义的基因构建体，所述基因构建体包含了编码如本文定义的Bax抑制物-1多肽的核酸；和

(ii)在促进植物生长和发育的条件下培育所述植物细胞或植物。

(i)的核酸可以是能够编码如本文中定义的BI-1多肽的任意核酸。

可以将这种核酸直接导入植物细胞或导入植物自身中(包括导入组织、器官或植物的任何其他部分)。根据本发明的优选特征，这种核酸优选地通过转化作用导入植物中。术语“转化”在本文的“定义”部分中更详细地描述。

本发明明确地扩展至通过本文所述任意方法产生的任意植物细胞或植物，并扩展至全部植物部分及其繁殖体。本发明包括通过本发明方法可获得的植物或其部分(包括种子)。这些植物或其部分包含编码如上文定义的多肽的核酸转基因。本发明进一步扩展以包括已经通过前述任意方法产生的原代转化或转染细胞、组织、器官或完整植物的子代，唯一要求是子代展示出与本发明方法中由亲本产生的那些相同的基因型和/或表型特征。

本发明也包括宿主细胞，其含有编码如上文定义的BI-1多肽的分离的核酸。本发明的优选宿主细胞是植物细胞。对于本发明方法中所用的核酸或载体、表达盒或构建体或载体，宿主植物原则上有利地是能够合成本发明方法中所用多肽的全部植物。

在一个实施方案中，本发明还提供转基因植物，其因编码如本文定义的Bax抑制物-1多肽的核酸的受调节表达而相对于对照植物具有增强的产量相关性状，优选地相对于对照植物具有增加的产量并且更优选地增加的种子产量和/或增加的生物量，或源自所述转基因植物的转基因植物细胞。换而言之，本发明还涉及转基因植物，其相对于对照植物具有增强的产量相关性状，优选地相对于对照植物具有增加的产量并且更优选地增加的种子产量和/或增加的生物量，其中所述转基因植物具有编码如本文定义的Bax抑制物-1多肽的核酸的受调节表达。

本发明的方法有利地适用于任意植物，尤其适用于如本文定义的任何植物。在本发明方法中特别有用的植物包括属于植物界超家族、尤其单子叶和双子叶植物的全部植物，包括饲用或饲料豆科植物、观赏植物、粮食作物、树或灌木。

根据本发明的实施方案，植物是作物植物。作物植物的实例包括但不限于菊苣、胡萝卜、木薯、百脉根、大豆、甜菜、甜菜、向日葵、卡诺拉油菜、苜蓿、油籽油菜、亚麻、棉花、番茄、马铃薯和烟草。

根据本发明的另一个实施方案，植物是单子叶植物。单子叶植物的实例包括甘蔗。

根据本发明的另一个实施方案，植物是谷类植物。谷类的实例包括稻、玉米、小麦、大麦、粟、黑麦、黑小麦属、高粱、二粒小麦、斯卑尔脱小麦、黑麦草(secale)、单粒小麦、埃塞俄比亚画眉草(teff)、蜀黍(milo)和燕麦。

本发明也扩展至植物的可收获部分如，但不限于种子、叶、果实、花、茎、根、根状茎、块茎和球茎，所述可收获部分包含编码BI-1多肽的重组核酸。本发明进一步涉及源自、优选直接源自这种植物的可收获部分中的产品，如干燥颗粒或粉末、油、脂肪和脂肪酸、淀粉或蛋白质。

本发明也包括编码如本文中所述的BI-1多肽的核酸的用途，和这些BI-1多肽的用途，用于增强植物中任意的前述产量相关性状。例如，编码本文中所述的BI-1多肽的核酸或BI-1多肽自身可以用于育种计划中，在所述育种计划中鉴定到可以遗传地与编码BI-1多肽的基因连锁的DNA标记。这些核酸/基因或BI-1多肽自身可以用来限定分子标记。这种DNA或蛋白质标记随后可以用于育种计划中以选择具有如上文在本发明方法中所定义的增强的产量相关性状的植物。另外，编码BI-1多肽的核酸/基因的等位变体也可以用于标记辅助的育种程序中。编码BI-1多肽的核酸也可以用作探针以遗传地或物理地绘制这些核酸作为其部分的基因并且用作与这些基因连锁的性状的标记。此类信息可能用于植物育种中旨在开发具有所希望表型的品系。

SEC22多肽

出人意料地，现在已经发现：调节植物中编码SEC22多肽的核酸表达产生了相对于对照植物具有增强的产量相关性状的植物。根据第一实施方案，本发明提供用于相对于对照植物增强植物中产量相关性状的方法，包括调节植物中编码SEC22多肽的核酸表达并且任选地选择具有增强的产量相关性状的植物。

用于调节(优选地增加)编码SEC22多肽的核酸表达的优选方法是在植物中导入并表达编码SEC22多肽的核酸。

下文对“本发明方法中有用的蛋白质”的任何称谓意”意指如本文定义的SEC22多肽。下文对“本发明方法中有用的核酸”的任何称谓意指能够编码这种SEC22多肽的核酸。待导入植物(并且因此在实施本发明的方法中有用)的核酸是编码现在将加以描述的蛋白质类型的任意核酸，下文也称作“SEC22核酸”或“SEC22基因”。

如本文定义的“SEC22多肽”指包含与Interpro数据库项IPR101012对应的长蛋白样结构域和任选地与INTERPRO数据库项IPR001388对应的小突触泡蛋白结构域的任何多肽，所述Interpro数据库项在如Hunter等人2009描述的2010年2月10日25.0发布中(Hunter等人InterPro：theintegrative protein signature database(Interpro：集成蛋白质特征标识数据库)(2009).Nucleic Acids Res.37(Database Issue)：D224-228)。

优选地，在本发明方法中有用的SEC22多肽包含以增加的优选顺序与以下长蛋白样结构域具有至少25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的长蛋白样结构域：

(i)SEQ ID NO：156中如位于SEQ ID NO：156的氨基酸1和131之间的序列所代表的长蛋白样结构域(SEQ ID NO：221)；

(ii)SEQ ID NO：158中如位于SEQ ID NO：158的氨基酸1和131之间的序列所代表的长蛋白样结构域(SEQ ID NO：222)。

备选地和优选地，在本发明方法中有用的SEC22多肽包含具有SEQID NO：221或SEQ ID NO：222代表的序列的长蛋白样结构域，其中以递减的优选性，至少0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15直至30个氨基酸由通过任何其他氨基酸、优选地由半保守氨基酸、更优选地由保守氨基酸置换。

优选地，包含于本发明方法中有用的SEC22多肽内的小突触泡蛋白结构域以增加的优选顺序与SEQ ID NO：223(SEQ ID NO：156的小突触泡蛋白结构域)具有至少25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。

备选地和优选地，在本发明方法中有用的SEC22多肽包含具有SEQID NO：223代表的序列的小突触泡蛋白结构域，其中以递减的优选性，至少0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15直至30个氨基酸由通过任何其他氨基酸、优选地由半保守氨基酸、更优选地由保守氨基酸置换。

进一步优选地，在本发明方法中有用的SEC22多肽包含长蛋白样结构域和小突触泡蛋白结构域，甚至更优选地，这种SEC22多肽包含长蛋白样结构域并且缺少小突触泡蛋白结构域。

长蛋白样结构域和小突触泡蛋白蛋白质结构域如上文描述。另外，此类结构域是本领域熟知的(长蛋白样结构域：Rossi等人2004.Trends inBiochemical Sciences第29卷，第682-688页；小突触泡蛋白结构域：Sacher等人，The Journal of Biological Chemistry，272，17134-17138)并且在蛋白质结构域数据库如Interpro和/或Pfam中记录(Hunter等人，2009；Finn等人，Nucleic Acids Res(2010)Database Issue 38：D211-222)。Pfam中的小突触泡蛋白条目参考编号(Pfam 24.0(2009年10月，11912个家族)是PF00957。鉴定长蛋白样结构域或小突触泡蛋白结构域的工具也是本领域熟知的，例如InterproScan允许在其序列已知的蛋白质中检索此类结构域的存在(Zdobnov E.M.和Apweiler R.Bioinformatics，2001，17(9)：第847-8页)。备选地，查询蛋白质的序列与表A的蛋白质的比较允许确定长蛋白样结构域或小突触泡蛋白结构域的存在。在实施例部分给出其他细节。

备选地或额外地，本发明方法中有用的SEC22多肽或其同源物以增加的优选顺序与表A的任一种多肽所代表、优选地由SEQ ID NO：156或SEQID NO：158所代表的氨基酸具有至少25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％整体序列同一性，条件是这种多肽包含如上文概括的保守结构域。使用总体比对算法，如程序GAP(GCG WisconsinPackage，Accelrys)中的Needleman Wunsch算法，优选地采用默认参数并且优选地采用成熟蛋白质的序列(即不考虑分泌信号或转运肽)，确定整体序列同一性。与整体序列同一性相比，仅考虑保守的结构域或基序时，所述序列同一性通常会更高。

术语“结构域”、“标签”和“基序”在本文“定义”部分中定义。

在一个优选实施方案中，本发明方法中有用的SEC22核酸和/或多肽是天然来源的，更优选地是植物源来源的，最优选地是双子叶植物或单子叶植物来源的，如分别来自番茄或稻。

备选地或额外地，当用于构建进化系统树(如在Uemura等人，2004(CSF，Cell Structure and Function第29卷(2004)，第2期，第49-65页；该文献通过引用方式并入本文)的图12中所绘制的进化系统树)时，在本发明方法中有用的SEC22多肽序列与R-SNAREs-VAPM组聚类、最优选地与AtSEC22和/或包含AtSEC22的AtYKT61和AtYKT62(SEQ ID NO：156和SEQ ID NO：158的直向同源蛋白)聚类。在本文图13中给出Uemura等人，2004年的图12。

备选或额外地，在本发明方法中有用的SEC22多肽序列，在基于表H中的蛋白质与SEQ ID NO：220的多重比对结果构建进化系统树中使用时，与番茄_XXXXXXXXXXX_153(SEQ  ID  NO：156)或与稻_XXXXXXXXXXXXXXXXX_75(SEQ ID NO：158)聚类。在实施例部分中进一步详述合适的多重比对方法及进化树构建方法的实例。

另外，SEC22多肽(至少以其天然形式，即，当包含长蛋白结构域和小泡蛋白结构域时)一般具有由小泡介导的蛋白质运输活性，优选地在内质网和高尔基体之间运输。用于测量由小泡介导的蛋白质运输活性的工具和技术是本领域熟知的。例如，可以通过显微镜追踪与报道分子如GFP(绿色荧光蛋白)融合的SEC22蛋白在植物细胞上的位置(Chatre等人Plant Physiol.第139卷，2005，1244-1254)。可以备选地或额外地使用报道在细胞分泌系统的不同区室之间运输的特定标记。

优选地，在植物细胞中表达时，本发明方法中有用的SEC22多肽定位于膜，更优选地定位于内质网膜或高尔基体膜。

另外或备选地，当根据本发明方法如本文实施例部分中所概述那样在稻中表达时，SEC22多肽产生这样的植物，与对照植物相比，所述植物在干旱胁迫下或在缺氮条件下培育时具有增加的产量相关性状，尤其具有种子产量、收获指数、花数、叶生物量中任一项或多项的增加。在实施例部分中提供关于这些条件的进一步细节。

本发明通过用SEQ ID NO：155所代表的核酸序列转化植物进行说明，其中所述核酸序列编码SEQ ID NO：156的多肽序列。然而，本发明的实施不限于这些序列；本发明的方法可以有利地使用SEQ ID NO：157(编码SEQ ID NO：158的多肽序列)或如本文定义的任何编码SEC22的核酸或SEC22多肽、优选地使用表H中提供的任一种进行。

在本文实施例部分的表H中给出编码SEC22多肽的核酸的实例。此类核酸用于实施本发明的方法。在实施例部分的表H中给出的氨基酸序列是由SEQ ID NO：156所代表的SEC22多肽的直向同源物和旁系同源物的实例序列，术语“直向同源物”和“旁系同源物”如本文中定义。可以通过执行如定义部分中所述的所谓交互性blast检索轻易地鉴定其他直向同源物和旁系同源物；其中查询序列是SEQ ID NO：155或SEQ ID NO：156，第二BLAST(反向BLAST)将针对番茄序列。

本发明还提供了编码迄今未知的SEC22的核酸和SEC22多肽，其用于相对于对照植物在植物中赋予增强的产量相关性状。

根据本发明的又一个实施方案，因而提供分离的核酸分子，其选自：

(i)由SEQ ID NO：155、157、159、161、163直至219代表的核酸；

(ii)由SEQ ID NO：155、157、159、161、163直至219代表的核酸的互补核酸；

(iii)编码SEC22多肽的核酸，所述SEC22多肽以增加的优选顺序与SEQ ID NO：156、158、160、162、164直至220所代表的氨基酸序列具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性并且额外地或备选地包含一个或多个基序，所述基序以增加的优选顺序与SEQ ID NO：221至SEQ ID NO：222中所给出的基序的任何一个或多个具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多的序列同一性，并且还优选地相对于对照植物赋予增强的产量相关性状。

(iv)与(i)至(iii)的核酸分子在高严格杂交条件下杂交并且相对于对照植物赋予增强的产量相关性状的核酸分子。

根据本发明的又一个实施方案，还提供分离的多肽，其选自：

(i)由SEQ ID NO：156、158、160、162、164直至220代表的氨基酸序列；

(ii)氨基酸序列，其以增加的优选顺序与SEQ ID NO：156、158、160、162、164直至220所代表的氨基酸序列具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性并且额外地或备选地包含一个或多个基序，所述基序以增加的优选顺序与SEQ ID NO：221至SEQ ID NO：222中所给出的基序的任何一个或多个具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多的序列同一性，并且还优选地相对于对照植物赋予增强的产量相关性状；

(iii)以上(i)或(ii)中给出的任一氨基酸序列的衍生物。

核酸变体也可以用于实施本发明的方法。此类变体的例子包括编码在实施例部分的表A中给出的任一个氨基酸序列的同源物和衍生物的核酸，术语“同源物”和“衍生物”如本文中定义。在本发明方法中有用的还是这样的核酸，其编码在实施例部分的表H中给出的任一氨基酸序列的直向同源物或旁系同源物的同源物和衍生物。在本发明方法中有用的同源物和衍生物与衍生它们的非修饰蛋白质具有基本上相同的生物学活性和功能活性。在实施本发明方法中有用的其他变体是其中优化了密码子选择或其中去除miRNA靶位点的变体。

在实施本发明方法中有用的其他核酸变体包括编码SEC22多肽的核酸的部分、与编码SEC22多肽的核酸杂交的核酸、编码SEC22多肽的核酸的剪接变体、编码SEC22多肽的核酸的等位变体和通过基因改组获得的编码SEC22多肽的核酸的变体。术语“杂交序列”、“剪接变体”、“等位变体”和“基因改组”如本文所述。

编码SEC22多肽的核酸不需要是全长核酸，因为本发明方法的实施不依赖于使用全长核酸序列。根据本发明，提供了用于增强植物中产量相关性状的方法，所述方法包括在植物中导入并且表达在实施例部分的表H中给出的任一个核酸序列的一部分或编码在实施例部分表H中给出的任一氨基酸序列的直向同源物、旁系同源物或同源物的核酸的一部分。

核酸的一部分可以例如通过对所述核酸产生一个或多个缺失而制备。所述部分可以以分离的形式使用或它们可以与其他编码(或非编码)序列融合，例如旨在产生组合有几种活性的蛋白质。与其他编码序列融合时，翻译时产生的所得多肽可以比对该蛋白质部分所预测的多肽更大。

在本发明方法中有用的部分编码了如本文定义的SEC22多肽，并且基本上具有与实施例部分的表H中给出的氨基酸序列相同的生物学活性。优选地，该部分是在实施例部分的表H中给出的任一核酸的一部分，或是编码在实施例部分的表H中给出的任一氨基酸序列的直向同源物或旁系同源物的核酸的一部分。优选地，该部分具有至少100、200、300、400、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000个连续核苷酸长度，所述连续核苷酸属于在实施例部分表H中给出的任一核酸序列或属于编码在实施例部分表H中给出的任一氨基酸序列的直向同源物或旁系同源物的核酸。最优选地，该部分是SEQ ID NO：155的核酸的一部分。优选地，该部分编码氨基酸序列片段，其中用于构建进化系统树(如Uemura等人，2004的图155中所绘制的进化系统树)时，所述氨基酸序列片段与AtSEC22和/或AtYKT61和/或AtYKT62多肽组聚类。

在本发明方法中有用的另一种核酸变体是能够在降低的严格条件下、优选在严格条件下与如本文中定义的编码SEC22多肽的核酸或与如本文中定义的部分杂交的核酸。

根据本发明，提供了用于增强植物中产量相关性状的方法，包括在植物中导入并表达能够与实施例部分的表H中给出的任一种核酸杂交的核酸，或包括在植物中导入并表达这样的核酸，所述核酸能够与编码在实施例部分的表H中给出的任意核酸序列的直向同源物、旁系同源物或同源物的核酸杂交。

在本发明方法中有用的杂交序列编码了如本文定义的SEC22多肽，所述的SEC22多肽基本上具有与实施例部分的表H中给出的氨基酸序列相同的生物学活性。优选地，该杂交序列能够与实施例部分的表H中给出的任一核酸的互补核酸或与这些序列中任一者的一部分杂交，所述的一部分如上文定义，或该杂交序列能够与下述核酸的互补核酸杂交，所述核酸编码在实施例部分的表H中给出的任一氨基酸序列的直向同源物或旁系同源物。最优选地，该杂交序列能够与如SEQ ID NO：155所代表的核酸的互补核酸或与其一部分杂交。

优选地，该杂交序列编码具有下述氨基酸序列的多肽，其中，当为全长并且用于构建进化系统树(如Uemura等人，2004的图155中所绘制的进化系统树)时，所述氨基酸序列与AtSEC22和/或AtYKT61和/或AtYKT62多肽组聚类。

在本发明方法中有用的另一种核酸变体是编码如上文所定义的SEC22多肽的剪接变体，剪接变体如本文中定义。

根据本发明，提供了用于增强植物中产量相关性状的方法，所述方法包括在植物中导入并且表达在实施例部分的表H中给出的任一核酸序列的剪接变体或编码在实施例部分的表H中给出的任一氨基酸序列的直向同源物、旁系同源物或同源物的核酸的剪接变体。

优选的剪接变体是由SEQ ID NO：155所代表的核酸的剪接变体，或是编码SEQ ID NO：156的直向同源物或旁系同源物的核酸的剪接变体。优选地，由该剪接变体编码的氨基酸序列，在用于构建进化系统树(如Uemura等人，2004的图12中所绘制的进化系统树)时，与AtSEC22和/或AtYKT61和/或AtYKT62多肽组聚类。

在实施本发明方法中有用的另一种核酸变体是编码如上文所定义的SEC22多肽的核酸的等位变体，等位变体如本文中定义。

根据本发明，提供用于增强植物中产量相关性状的方法，所述方法包括在植物中导入并且表达在实施例部分的表H中给出的任一核酸的等位变体，或包括在植物中导入并且表达下述核酸的等位变体，其中所述核酸编码在实施例部分的表H中给出的任一氨基酸序列的直向同源物、旁系同源物或同源物。

由本发明方法中有用的等位变体编码的多肽基本上具有与SEQ IDNO：156的SEC22多肽和在实施例部分的表H中描述的任一氨基酸相同的生物学活性。等位变体存在于自然界中，并且在本发明的方法中包括使用这些天然的等位基因。优选地，该等位变体是SEQ ID NO：155的等位变体或编码SEQ ID NO：156的直向同源物或旁系同源物的核酸的等位变体。优选地，由该等位变体编码的氨基酸序列，在用于构建进化系统树(如Uemura等人，2004的图12中所绘制的进化系统树)时，与AtSEC22和/或AtYKT61和/或AtYKT62多肽组聚类。

基因改组或定向进化也可以用来产生编码如上文定义的SEC22多肽的核酸的变体；术语“基因改组”如本文定义。

根据本发明，提供了用于增强植物中产量相关性状的方法，所述方法包括在植物中导入并且表达在实施例部分的表H中给出的任一核酸序列的变体，或包括在植物中导入并且表达下述核酸的变体，所述的核酸编码在实施例部分的表H中给出的任一氨基酸序列的直向同源物、旁系同源物或同源物，其中所述的变体核酸通过基因改组获得。

优选地，由借助基因改组所获得的变体核酸编码的氨基酸序列，在用于构建进化系统树(如Uemura等人，2004的图12中所绘制的进化系统树)时，与AtSEC22和/或AtYKT61和/或AtYKT62多肽组聚类。

另外，核酸变体也可以通过位点定向诱变获得。几种方法可用于实现位点定向诱变，最常见方法是基于PCR的方法(Current Protocols inMolecular Biology.Wiley编著)。

编码SEC22多肽的核酸可以源自任何天然或人工来源。该核酸可以通过人类有意操作，在组成和/或基因组环境方面从其天然形式修改而来。优选地，编码SEC22多肽的核酸来自植物，进一步优选地来自双子叶植物或单子叶植物，更优选来自茄科或禾本科(Poaceae)，最优选地，该核酸分别来自番茄(Solanum lycopersicum)或稻(Oryza sativa)。

本发明方法的实施产生了具有增强的产量相关性状的植物。尤其，本发明方法的实施产生了相对于对照植物具有增加的产量、特别是增加的种子产量的植物。术语“产量”和“种子产量”在本文的“定义”部分中更详细地描述。

本文对增强的产量相关性状的称谓意指早期生长势和/或植物的一个或多个部分的生物量(重量)的增加，所述的部分可以包括地上(可收获)部分和/或地下(可收获)部分。尤其，此类可收获部分是种子，并且本发明方法的实施产生了相对于对照植物的种子产量而言，具有增加的种子产量的植物。

本发明提供了用于相对于对照植物增加植物的产量相关性状、尤其种子产量的方法，所述方法包括调节植物中编码如本文定义的SEC22多肽的核酸表达。

由于本发明的转基因植物具有增加的产量相关性状，故这些植物有可能(在其生活周期的至少部分期间)相对于对照植物在其生活周期的相应阶段的生长速率表现出增加的生长速率。

根据本发明的优选特征，本发明方法的实施产生了相对于对照植物具有增加的生长速率的植物。因此，根据本发明，提供了用于增加植物生长速率的方法，所述方法包括在植物中调节编码如本文中定义的SEC22多肽的核酸表达。

相对于可比较条件下培育的对照植物，本发明方法的实施给予在非胁迫条件下或在轻度干旱条件下培育的植物增加的产量。因此，根据本发明，提供了用于增加非胁迫条件下或在轻度干旱条件下培育的植物中产量的方法，所述方法包括调节植物中编码SEC22多肽的核酸表达。

相对于可比较条件下生长的对照植物，本发明方法的实施给予在养分缺乏条件下、尤其缺氮条件下培育的植物增加的产量。因此，根据本发明，提供了用于增加养分缺乏下培育的植物中产量的方法，所述方法包括调节植物中编码SEC22多肽的核酸表达。

相对于可比较条件下培育的对照植物，本发明方法的实施给予盐胁迫条件下培育的植物增加的产量。因此，根据本发明，提供了用于增加盐胁迫下培育的植物中产量的方法，所述方法包括调节植物中编码SEC22多肽的核酸表达。

相对于可比较条件下培育的对照植物，本发明方法的实施给予干旱胁迫条件下培育的植物增加的产量。因此，根据本发明，提供了用于增加干旱胁迫下培育的植物中产量的方法，所述方法包括调节植物中编码SEC22多肽的核酸表达。

本发明也提供基因构建体和载体以促进在植物中导入和/或表达编码SEC22多肽的核酸。所述基因构建体可以插入适于转化至植物中并且适于在转化细胞中表达目的基因的载体，所述载体可以是市售的。本发明也提供如本文中定义的基因构建体在本发明方法中的用途。

更具体地，本发明提供构建体，其包含：

(a)编码如上文定义SEC22多肽的核酸；

(b)能够驱动(a)的核酸序列表达的一个或多个控制序列；和任选地

(c)转录终止序列。

优选地，编码SEC22多肽的核酸如上文定义。术语“控制序列”和“终止序列”如本文中定义。

甚至更优选地，(a)的核酸是SEQ ID NO：155或SEQ ID NO：157并且(b)的控制序列是稻GOS2组成型启动子。

植物用包含上述任一核酸的载体转化。技术人员非常清楚必须在所述载体上存在以便成功转化、选择和增殖含有目的序列的宿主细胞的遗传元件。目的序列与一个或多个控制序列(至少与启动子)有效地连接。

有利地，任意类型的启动子，无论是天然的或合成的，均可以用来驱动该核酸序列表达，不过优选地，该启动子是植物源的。组成型启动子特别用于所述方法中。优选地，这种组成型启动子是中等强度的遍在组成型启动子。对于多种启动子类型的定义，见本文的“定义”部分。

应当明白本发明的适用性不限于由SEQ ID NO：155或SEQ ID NO：157代表的编码SEC22多肽的核酸，本发明的适用性也不限于编码SEC22多肽的核酸受组成型启动子驱动时的表达。

这种组成型启动子优选地是中等强度的启动子，更优选地选自源于植物的启动子，如GOS2启动子；更优选地，该启动子是来自稻的GOS2启动子。进一步优选地，该组成型启动子由基本上与SEQ ID NO：224相似的核酸序列代表；最优选地，该组成型启动子是如SEQ ID NO：224所代表那样。对于组成型启动子的其他例子，见本文的“定义”部分。

如上文提到，用于调节编码SEC22多肽的核酸表达的优选方法是通过在植物中导入并表达编码SEC22多肽的核酸；然而，使用其他熟知的技术，包括但不限于T-DNA激活标签法、TILLING、同源重组，也可以实现实施本方法的效果，即增强产量相关性状。在定义部分中提供对这些技术的描述。

本发明也提供用于产生转基因植物的方法，所述转基因植物相对于对照植物具有增强的产量相关性状，其中所述方法包括在植物中导入并且表达编码如上文所定义的SEC22多肽的任意核酸。

更具体地，本发明提供了用于产生转基因植物的方法，所述转基因植物具有增强的产量相关性状、特别是增加的种子产量，所述方法包括：

(i)在植物或植物细胞中导入并且表达编码SEC22多肽的核酸；和

(ii)在促进植物生长和发育的条件下培育植物细胞。

(i)的核酸可以是能够编码如本文中定义的SEC22多肽的任意核酸。

可以将这种核酸直接导入植物细胞或导入植物自身中(包括导入组织、器官或植物的任何其他部分)。根据本发明的优选特征，这种核酸优选地通过转化作用导入植物中。术语“转化”在本文的“定义”部分中更详细地描述。

本发明明确地扩展至通过本文所述任意方法产生的任意植物细胞或植物，并扩展至全部植物部分及其繁殖体。本发明包括通过本发明方法可获得的植物或其部分(包括种子)。这些植物或其部分包含编码如上文定义的SEC22多肽的核酸转基因。本发明进一步扩展以包括已经通过前述任意方法产生的原代转化或转染细胞、组织、器官或完整植物的子代，唯一要求是子代展示出与本发明方法中由亲本产生的那些相同的基因型和/或表型特征。

本发明也包括宿主细胞，其含有编码如上文定义的SEC22多肽的分离的核酸。本发明的优选宿主细胞是植物细胞。对于本发明方法中所用的核酸或载体、表达盒或构建体或载体，宿主植物原则上有利地是能够合成本发明方法中所用多肽的全部植物。

本发明的方法有利地适用于任意植物。在本发明方法中特别有用的植物包括属于植物界超家族、尤其单子叶和双子叶植物的全部植物，包括饲用或饲料豆科植物、观赏植物、粮食作物、树或灌木。根据本发明的优选实施方案，植物是作物植物。作物植物的实例包括大豆、向日葵、卡诺拉油菜、苜蓿、油籽油菜、亚麻、棉花、番茄、马铃薯和烟草。更优选地，该植物是单子叶植物。单子叶植物的实例包括甘蔗。更优选地，该植物是谷类。谷类的实例包括稻、玉米、小麦、大麦、粟、黑麦、黑小麦属、高粱、二粒小麦、斯卑尔脱小麦、黑麦草(secale)、单粒小麦、埃塞俄比亚画眉草(teff)、蜀黍(milo)和燕麦。

本发明也扩展至植物的可收获部分如，但不限于种子、叶、果实、花、茎、根、根状茎、块茎和球茎，所述可收获部分包含编码SEC22多肽的重组核酸。本发明进一步涉及源自、优选直接源自这种植物的可收获部分中的产品，如干燥颗粒或粉末、油、脂肪和脂肪酸、淀粉或蛋白质。

本发明也包括编码如本文中所述的SEC22多肽的核酸的用途，和这些SEC22多肽的用途，用于增强植物中任意的前述产量相关性状。例如，编码本文中所述的SEC22多肽的核酸或SEC22多肽自身可以用于育种计划中，在所述育种计划中鉴定到可以遗传地与编码SEC22多肽的基因连锁的DNA标记。这些核酸/基因或SEC22多肽自身可以用来定义分子标记。这种DNA或蛋白质标记随后可以用于育种计划中以选择具有如上文在本发明方法中所定义的增强的产量相关性状的植物。另外，编码SEC22多肽的核酸/基因的等位变体也可以用于标记辅助的育种程序中。编码SEC22多肽的核酸也可以用作探针以遗传地或物理地绘制这些核酸作为其部分的基因并且用作与这些基因连锁的性状的标记。此类信息可能用于植物育种中旨在开发具有所希望表型的品系。

项目

本发明优选地提供以下项。

1.用于相对于对照植物增强植物中产量相关性状的方法，所述方法包括调节植物中编码包含SEQ ID NO：23(基序1)的2型CLE多肽的核酸的表达。

2.根据项1所述的方法，其中基序是R(R/L/F/V)SPGGP(D/N)P(Q/R)HH(SEQ ID NO：24)。

3.根据项1或2所述的方法，其中所述受调节的表达通过在植物中导入并且表达编码2型CLE多肽的核酸实现。

4.根据项1至3中任一项所述的方法，其中所述编码2型CLE多肽的核酸编码在表A中所列的任一种蛋白质或是这种核酸的一部分或是能够与该核酸杂交的核酸。

5.根据项1至4中任一项所述的方法，其中所述核酸序列编码在表A中给出的任一蛋白质的直向同源物或旁系同源物。

6.根据前面任一项所述的方法，其中所述增强的产量相关性状包括相对于对照植物增加的产量、优选地增加的生物量和/或增加的种子产量。

7.根据项1至6中任一项所述的方法，其中所述增强的产量相关性状在缺氮的条件下获得。

8.根据项3至7中任一项所述的方法，其中所述的核酸与组成型启动子、优选地与GOS2启动子、最优选地与来自稻的GOS2启动子有效连接。

9.根据项1至8中任一项所述的方法，其中所述编码2型CLE多肽的核酸是植物来源的，优选地来自双子叶植物，进一步优选地来自十字花科(Brassicaceae)，更优选地来自拟南芥属(Arabidopsis)，最优选地来自拟南芥(Arabidopsis thaliana)。

10.通过根据项1至9任一项所述的方法可获得的植物或其部分，包括种子，其中所述的植物或其部分包含编码2型CLE多肽的重组核酸。

11.构建体，其包含：

(i)编码如项1或2中定义的2型CLE多肽的核酸；

(ii)能够驱动(a)的核酸序列表达的一个或多个控制序列；和任选地

(iii)转录终止序列。

12.根据项11所述的构建体，其中所述控制序列之一是组成型启动子，优选地是GOS2启动子，最优选地是来自稻的GOS2启动子。

13.根据项11或12所述的构建体在用于制备植物的方法中的用途，所述植物相对于对照植物具有增加的产量，尤其增加的生物量和/或增加的种子产量。

14.用根据项11或12所述的构建体转化的植物、植物部分或植物细胞。

15.用于产生转基因植物的方法，所述转基因植物相对于对照植物具有增加的产量、尤其增加的生物量和/或增加的种子产量，所述方法包括：

(i)在植物中导入并且表达编码如项1或2中定义的2型CLE多肽的核酸；和

(ii)在促进植物生长和发育的条件下培育植物细胞。

16.转基因植物，其因编码如项1或2中定义的2型CLE多肽的核酸的受调节表达而相对于对照植物具有增加的产量、尤其增加的生物量和/或增加的种子产量，或源自所述转基因植物的转基因植物细胞。

17.根据项10、14或16所述的转基因植物或源自其的转基因植物细胞，其中所述植物是作物植物，如甜菜或糖甜菜，或单子叶植物或谷物，如稻、玉米、小麦、大麦、粟、黑麦、黑小麦属、高粱、二粒小麦、斯卑尔脱小麦、黑麦草、单粒小麦、埃塞俄比亚画眉草、蜀黍和燕麦。

18.根据项17所述的植物的可收获部分，其中所述的可收获部分优选地是苗生物量、根生物量和/或种子。

19.产物，源自根据项17所述的植物和/或源自根据项19所述的植物的可收获部分。

20.编码2型CLE多肽的核酸在植物中相对于对照植物增加产量、尤其增加种子产量、苗生物量和/或根生物量的用途。

21.用于相对于对照植物增强植物中产量相关性状的方法，所述方法包括调节植物中编码Bax抑制物-1(BI-1)多肽的核酸的表达，其中所述Bax抑制物-1多肽包含Bax抑制物相关结构域(PF01027)。

22.根据项21的方法，其中所述受调节的表达通过在植物中导入和表达编码所述Bax抑制物-1多肽的所述核酸实施。

23.根据项21或22所述的方法，其中所述增强的产量相关性状相对于对照植物包括增加的产量，并且相对于对照植物优选地包括增加的种子产量和/或增加的生物量。

24.根据项21至23中任一项所述的方法，其中所述增强的产量相关性状在非胁迫条件下获得。

25.根据项21至23中任一项所述的方法，其中所述增强的产量相关性状在渗透胁迫或缺氮的条件下获得。

26.根据项21至25中任一项所述的方法，其中所述Bax抑制物-1多肽包含一个或多个以下基序：

i)基序3a：[DN]TQxxxE[KR][AC]xxGxxDY[VIL]xx[STA](SEQ IDNO：131)，

ii)基序4a：xxxxxISPx[VS]xx[HYR][LI][QRK]x[VFN][YN]xx[LT](SEQ ID NO：133)，

iii)基序5a：FxxFxxAxxxxxRRxx[LMF][YF][LH]x(SEQ ID NO：135)。

27.根据项26所述的方法，其中所述Bax抑制物-1多肽额外地包含一个或多个以下基序：

i)基序6a：DTQxI[VI]E[KR]AHxGDxDYVKHx(SEQ ID NO：137)；

ii)基序7a：x[QE]ISPxVQxHLK[QK]VY[FL]xLC[FC](SEQ ID NO：139)；

iii)基序8a：F[AG]CF[SP][AG]AA[ML][VL][AG]RRREYLYL[AG]G(SEQ ID NO：141)；

iv)基序9：[IF]E[VL]Y[FL]GLL[VL]F[VM]GY[VIM][IV][VYF](SEQID NO：143)；

v)基序10：[MFL][LV]SSG[VLI]SxLxW[LV][HQ][FL]ASxIFGG(SEQID NO：144)；

vi)基序11：H[ILV][LIM][FLW][NH][VI]GG[FTL]LT[AVT]x[GA]xx[GA]xxxW[LM][LM](SEQ ID NO：145)；

vii)基序12：Rx[AST][LI]L[ML][GAV]xx[LVF][FL][EKQ]GA[STY]IGPL[IV](SEQ ID NO：146)。

28.根据项26所述的方法，其中所述Bax抑制物-1多肽额外地包含一个或多个以下基序：

i)基序13a：DTQx[IVM][IV]E[KR][AC]xxGxxDxx[KRQ]Hx(SEQ IDNO：147)；

ii)基序14：E[LVT]Y[GLF]GLx[VLI][VF]xGY[MVI][LVI]x(SEQ IDNO：149)；

iii)基序15：KN[FL]RQISPAVQ[SN]HLK[RL]VYLT(SEQ ID NO：150)；

iv)基序16a：

Fx[CS]F[ST]xA[AS]xx[AS]xRR[ESH][YFW]x[FY][LH][GS][GA]xL(SEQID NO：151)。

29根据项21至28中任一项的方法，其中所述编码Bax抑制物-1多肽的核酸是植物来源的。

30.根据项21至29中任一项的方法，其中所述编码Bax抑制物-1多肽的核酸编码在表C中所列的任一种多肽或是这种核酸的一部分或是能够与这种核酸杂交的核酸。

31.根据项21至30中任一项所述的方法，其中所述核酸序列编码在表C中给出的任一多肽的直向同源物或旁系同源物。

32.根据项21至31中任一项的方法，其中所述编码Bax抑制物-1多肽的核酸对应于SEQ ID NO：30。

33.根据项21至32中任一项所述的方法，其中所述的核酸与组成型启动子、优选地与中等强度组成型启动子、优选地与植物启动子、更优选地与GOS2启动子、最优选地与来自稻的GOS2启动子有效连接。

34.通过根据项21至33中任一项所述的方法可获得的植物、其植物部分，包括种子、或植物细胞，其中所述植物、植物部分或植物细胞包含编码如项21和26至32中任一项所定义的Bax抑制物-1多肽的重组核酸。

35.构建体，其包含：

(i)编码如项21和26至32中任一项所定义的Bax抑制物-1多肽的核酸；

(ii)能够驱动(i)的核酸序列表达的一个或多个控制序列；和任选地

(iii)转录终止序列。

36.根据项35所述的构建体，其中所述控制序列之一是组成型启动子，优选地是中等强度组成型启动子，优选地是植物启动子，更优选地是GOS2启动子，最优选地是来自稻的GOS2启动子。

37.根据项35或36所述的构建体在用于制备植物的方法中的用途，所述植物具有增强的产量相关性状，优选地相对于对照植物具有增加的产量，并且更优选地相对于对照植物具有增加的种子产量和/或增加的生物量。

38.用根据项35或36所述的构建体转化的植物、植物部分或植物细胞。

39.用于产生转基因植物的方法，所述转基因植物相对于对照植物具有增强的产量相关性状，优选地相对于对照植物具有增加的产量，并且更优选地相对于对照植物具有增加的种子产量和/或增加的生物量，所述方法包括：

(i)在植物细胞或植物中导入并且表达编码如项21和26至32中任一项所定义的Bax抑制物-1多肽的核酸；和

(ii)在促进植物生长和发育的条件下培育所述植物细胞或植物。

40.转基因植物，其因编码如项21和26至32中任一项所定义的Bax抑制物-1多肽的核酸的受调节表达而相对于对照植物具有增强的产量相关性状，优选地相对于对照植物具有增加的产量并且更优选地增加的种子产量和/或增加的生物量，或源自所述转基因植物的转基因植物细胞。

41.根据项34、38或40所述的转基因植物或源自其的转基因植物细胞，其中所述植物是作物植物，如甜菜、糖甜菜或苜蓿，或单子叶植物如甘蔗；或谷类，如稻、玉米、小麦、大麦、粟、黑麦、黑小麦属、高粱、二粒小麦、斯卑尔脱小麦、黑麦草、单粒小麦、埃塞俄比亚画眉草、蜀黍或燕麦。

42.根据项41所述的植物的可收获部分，其中所述的可收获部分是种子。

43.产物，源自根据项41所述的植物和/或源自根据项42所述的植物的可收获部分。

44.编码如项21和26至32中任一项所定义的Bax抑制物-1多肽的核酸的用途，用于相对于对照植物增强植物中的产量相关性状，优选地用于增加产量，并且更优选地相对于对照植物用于增加植物中的种子产量和/或用于增加生物量。

45.用于相对于对照植物增强植物中产量相关性状的方法，所述方法包括调节植物中编码SEC22多肽的核酸的表达，其中所述的SEC22多肽包含长蛋白样结构域。

46.根据项45所述的方法，其中所述长蛋白样结构域以增加的优选顺序与以下结构域具有至少25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性：

(i)SEQ ID NO：156中如位于SEQ ID NO：156的氨基酸1和131之间的序列所代表的长蛋白样结构域(SEQ ID NO：221)；

(ii)SEQ ID NO：158中如位于SEQ ID NO：158的氨基酸1和131之间的序列所代表的长蛋白样结构域(SEQ ID NO：222)。

47.根据项45或46所述的方法，其中所述的受调节表达通过在植物中导入并且表达编码SEC22多肽的核酸实现。

48.根据项45至47中任一项所述的方法，其中编码SEC22多肽的所述核酸编码在表H中所列的任一种蛋白质或是这种核酸的一部分或是能够与这种核酸杂交的核酸。

49.根据项45至48中任一项所述的方法，其中所述核酸序列编码在表H中给出的任一蛋白质的直向同源物或旁系同源物。

50.根据前面任一项所述的方法，其中所述的增强的产量相关性状包括相对于对照植物增加的种子产量、优选地增加的充实种子数。

51.根据项45至50中任一项所述的方法，其中所述增强的产量相关性状在干旱胁迫下获得。

52.根据项45至50中任一项所述的方法，其中所述增强的产量相关性状在非胁迫条件下或在胁迫如盐胁迫或缺氮的条件下获得。

53.根据项47至52中任一项所述的方法，其中所述的核酸与组成型启动子、优选地与GOS2启动子、最优选地与来自稻的GOS2启动子有效连接。

54.根据项45至53中任一项所述的方法，其中编码SEC22多肽的所述核酸是植物来源的，优选地来自双子叶植物，进一步优选地来自茄科(Solanaceae)，更优选地来自茄属(Solanum)，最优选地来自番茄(Solanumlycopersicum)。

55.通过根据项45至54中任一项所述的方法可获得的植物或其部分，包括种子，其中所述的植物或其部分包含编码SEC22多肽的重组核酸。

56.构建体，其包含：

(i)编码如项45或46中定义的SEC22多肽的核酸；

(ii)能够驱动(a)的核酸序列表达的一个或多个控制序列；和任选地

(iii)转录终止序列。

57.根据项56所述的构建体，其中所述控制序列之一是组成型启动子，优选地是GOS2启动子，最优选地是来自稻的GOS2启动子。

58.根据项56或57所述的构建体在用于制备植物的方法中的用途，所述植物相对于对照植物具有增加的产量，尤其增加的生物量和/或增加的种子产量。

59.用根据项56或57所述的构建体转化的植物、植物部分或植物细胞。

60.用于产生转基因植物的方法，所述转基因植物相对于对照植物具有增加的产量、尤其增加的生物量和/或增加的种子产量，所述方法包括：

(i)在植物中导入并且表达编码如项45或46中定义的SEC22多肽的核酸；和

(ii)在促进植物生长和发育的条件下培育植物细胞。

61.转基因植物，其因编码如项45或46中定义的SEC22多肽的核酸的受调节表达而相对于对照植物具有增加的产量、尤其增加的生物量和/或增加的种子产量，或从所述转基因植物衍生的转基因植物细胞。

62.根据项55、59或61所述的转基因植物或从中衍生的转基因植物细胞，其中所述植物是作物植物或单子叶植物或谷物，如稻、玉米、小麦、大麦、粟、黑麦、黑小麦属、高粱、二粒小麦、斯卑尔脱小麦、黑麦草、单粒小麦、埃塞俄比亚画眉草、蜀黍和燕麦。

63.根据项62所述的植物的可收获部分，其中所述的可收获部分优选地是苗生物量和/或种子。

64.产物，源自根据项62所述的植物和/或源自根据项63所述的植物的可收获部分。

65.编码SEC22多肽的核酸在相对于对照植物增加植物中产量、尤其增加种子产量和/或苗生物量的用途。

附图简述

本发明现在将参考以下图进行描述，其中：

图1代表SEQ ID NO：2和其他2型CLE多肽的多重比对结果。基序1以粗体显示，SEQ ID NO：2表述为AT4G18510。

图2显示每组中整个蛋白质家族的残基保守模式的weblogo示意图，取自Oelker等人(2008)。12个氨基酸长度的主要CLE基序以黑色框标注。以黑色标注多个组中的组特异性残基。不变的残基在最底部徽记中以黑色标注。保守的残基标注为灰色。字母的大小指示这个残基在这个组中和在这个位置的频率。在组1、2、8和13中主要CLE基序上游约50个氨基酸处鉴定到次要基序。在C端和N端识别该基序的延长部分。带括号的数字表示划分至相应组的序列数目。

图3代表用于在稻GOS2启动子(pGOS2)控制下增加编码2型CLE多肽的核酸在稻中表达的双元载体。

图4是拟南芥和稻2型CLE多肽的MATGAT表。

图5代表SEQ ID NO：30的结构域结构，其中标出Bax抑制物相关结构域的位置(如通过Pfam(PF 01027)鉴定，粗体加下划线)并且标出基序3a、4a、5a、6a、7a、8a、9、10、11a和12的位置。

图6和图7代表属于RA/BI-1组(小图a)和EC/BI-1组(小图b)的多种BI-1多肽的多重比对结果。星号表示在多个蛋白质序列之间相同的氨基酸，冒号代表高度保守的氨基酸置换，并且点号代表保守性较小的氨基酸置换；在其余位置内不存在序列保守性。当使用保守氨基酸时，这些比对结果可以用于定义其他基序。

图8显示BI-1多肽的进化系统树。使用MUSCLE(Edgar(2004)，Nucleic Acids Res 32(5)：1792-97)比对这些蛋白质。使用QuickTree1.1(Howe等人(2002).Bioinformatics 18(11)：1546-7)计算邻接树。使用Dendroscope2.0.1绘制环状倾斜的进化支图(Hudson等人(2007).Bioinformatics 8(1)：460)。在e＝1e-40时，回收全部3个拟南芥BI-1相关基因。使用每个聚类的代表性成员产生该树。

图9显示MATGAT表(实施例12)。

图10代表用于在稻GOS2启动子(pGOS2)控制下增加编码BI-1的核酸在稻中表达的双元载体。

图11代表用于克隆在遍在蛋白启动子控制下的编码BI-1的核酸的双元载体(pUBI)，所述双元载体在载体主链中包含以下元件：大肠杆菌中的复制起点；农杆菌中的复制起点；用于DNA复制的复制蛋白质；农杆菌中复制起点的稳定性区域；和在细菌中赋予卡那霉素耐药性的选择标记。

图12代表多种SEC22多肽的多重比对结果。保守的氨基酸在几种SEC22多肽中的等同位置存在。当确定保守的氨基酸时，这些比对结果可以用于定义其他基序。

图13显示基于Uemura等人2004的图12的SEC22多肽进化系统树。

图14代表用于在稻GOS2启动子(pGOS2)控制下增加编码SEC22的核酸在稻中表达的双元载体。

实施例

本发明现在参考如下实施例进行描述，所述实施例仅是说明性的。以下实施例不意图完全限定或限制本发明的范围。

DNA操作：除非另外说明，重组DNA技术根据(Sambrook(2001)Molecular Cloning：a laboratory manual，第3版Cold Spring HarborLaboratory Press，CSH，New York)或Ausubel等人(1994)，CurrentProtocols in Molecular Biology，Current Protocols第1卷和第2卷中所述的标准方案进行。在BIOS科学出版有限责任公司(BIOS ScientificPublications Ltd(英国))和Blackwell科学出版社(Blackwell ScientificPublications)(英国)出版的R.D.D.Cray的Plant Molecular BiologyLabfax(1993)中描述了用于植物分子研究工作的标准材料和方法。

实施例1：鉴定与SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2相关的序列

使用数据库序列搜索工具，如基本局部比对工具(BLAST)(Altschul等人(1990)J.Mol.Biol.215：403-410；和Altschul等人(1997)Nucleic AcidsRes.25：3389-3402)，在国家生物技术信息中心(NCBI)的Entrez核苷酸数据库中维护的那些序列中鉴定了与SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2相关的(全长cDNA、EST或基因组)序列。该程序用来通过将核酸序列或多肽序列与序列数据库比较并且计算匹配的统计显著性来找到序列之间的局部相似区域。例如，将SEQ ID NO：1的核酸所编码的多肽用于TBLASTN算法中，采用默认设置和过滤程序以忽略低复杂性序列抵消。该分析的输出结果通过逐对比较进行检验，并根据概率评分(E-值)评级，其中所述的评分反映特定比对结果偶然发生的概率(E-值越低，命中的显著性越高)。除E-值外，比较也可以由同一性百分数评定。同一性百分数指所比较的两个核酸(或多肽)序列之间在特定长度范围内的相同核苷酸(或氨基酸)的数目。在一些情况下，可以调整默认参数以调节搜索的严格性。例如，可以增加E-值以显示较不严格的匹配。以这种方式，可以鉴定到几乎精确的短匹配。

表A提供了与SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2相关的一系列核酸序列。

表A：2型CLE核酸和多肽的实例：

序列已经由研究机构如基因组研究所(TIGR；始于TA)初步地组装并且公开披露。真核生物基因直向同源物(EGO)数据库可以用来通过关键词检索或通过使用BLAST算法以目的核酸序列或多肽序列鉴定此类相关序列。已经为特定生物创建了专有核酸序列数据库，如由联合基因组研究所(Joint Genome Institute)创建。另外，登录专利数据库已经允许鉴定新的核酸序列和多肽序列。

实施例2：2型CLE多肽序列的比对结果

在标准设置(缓慢比对，相似性矩阵：Gonnet，空位开口罚分：10，空位延伸罚分：0.2)下，使用累进比对ClustalW 2.0算法(Thompson等人(1997)Nucleic Acids Res 25：4876-4882；Chenna等人(2003).Nucleic AcidsRes 31：3497-3500)进行多肽序列的比对。进行少许手工编辑以进一步优化该比对。在图1中比对2型CLE多肽。

实施例3：计算多肽序列之间的总体同一性百分数

使用现有技术领域可获得的方法之一，即MatGAT(矩阵总体比对工具)软件(BMC Bioinformatics.20034：29.MatGAT：an application thatgenerates similarity/identity matrices using protein or DNAsequences(MatGAT：使用蛋白质序列或DNA序列产生相似性/同一性矩阵的一项应用)，Campanella JJ，Bitincka L，Smalley J；该软件由LedionBitincka维护)，确定在实施本发明方法中有用的全长多肽序列之间的总体相似性和同一性百分数。MatGAT软件产生DNA序列或蛋白质序列的相似性/同一性矩阵，无需数据的预先比对。该程序使用Myers和Miller总体比对算法(空位开口罚分12和空位延伸罚分2)执行一系列配对比对，使用例如Blosum 62(用于多肽)计算相似性和同一性，并且随后将结果置于距离矩阵中。

图4中显示在所述多肽序列的全长范围内总体相似性和同一性的分析结果。序列相似性在分割线下半部分显示，并且序列同一性在对角分割线的上半部分显示。比较中使用的参数是：评分矩阵：Blosum62，第一空位：12，延伸空位：2。与SEQ ID NO：2相比，在实施本发明方法中有用的2型CLE多肽序列之间的序列同一性(以％计)可以低至23.6％。

实施例4：2型CLE多肽的功能测定法

可以在Whitford等人(2008)-Plant CLE peptides from two distinctfunctional classes synergistically induce division of vascular cells(来自两个不同功能类别的植物2型CLE多肽协同诱导维管细胞的分裂).PNAS，第105卷，第47期，第18625-18630页(2008年11月25日)中找到2型CLE多肽功能测定法。源自由SEQ ID NO：2代表的2型CLE多肽的合成肽显示使根生长停滞。

实施例5：克隆编码2型CLE的核酸序列

使用定制的拟南芥幼苗cDNA文库(在pCMV Sport 6.0中；Invitrogen，Paisley，UK)作为模板通过PCR扩增这种核酸序列。使用在50μl PCR混合物中的200ng模板，在标准条件下使用Hifi Taq DNA聚合酶进行PCR。所用的引物是prm14832(SEQ ID NO：27；有义，起始密码子为粗体字)：5’-ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggcttaaacaatggctaagttaagcttcact-3’和prm14833(SEQ ID NO：28；反向互补物)：5’-ggggaccactttgtacaagaaagctgggtta aacatgtcgaagaaattga-3’，其中所述引物包括用于Gateway重组的AttB位点。还使用标准方法纯化扩增的PCR片段。随后，进行Gateway方法的第一步骤，即BP反应，在此期间，所述PCR片段与pDONR201质粒在体内重组以产生根据Gateway命名法的“进入克隆”，pCLE 2型。作为

技术的部分，质粒pDONR201从Invitrogen购买。

包含SEQ ID NO：1的进入克隆随后在LR反应中与用于稻转化的目的载体一起使用。这种载体在T-DNA边界内部含有以下作为功能性元件：植物选择标记、筛选标记表达盒和意在与已经克隆于这个进入克隆中的目的核酸序列发生LR体内重组的Gateway盒。用于组成型特异性表达的稻GOS2启动子(SEQ ID NO：26)位于这个Gateway盒上游。

在LR重组步骤后，将所得的表达载体pGOS2::2型CLE(图3)根据本领域熟知的方法转化至农杆菌菌株LBA4044内。

实施例6：植物转化

稻转化

含有表达载体的农杆菌用来转化稻植物。将粳稻栽培品种Nipponbare的成熟干燥种子脱壳。通过在70％乙醇中孵育1分钟，随后在0.2％HgCl2中孵育30分钟，随后用无菌蒸馏水洗涤6次15分钟而实施消毒。消毒的种子随后在含有2，4-D的培养基(愈伤组织诱导培养基)上萌发。在黑暗中孵育4周后，将盾片衍生的胚发生性愈伤组织切下并在同一种培养基上增殖。2周后，将愈伤组织通过在同一种培养基上传代培养另外2周进行繁殖或增殖。胚发生性愈伤组织片在新鲜培养基上传代培养3日，之后共培育(以增强细胞分裂活性)。

将含有所述表达载体的农杆菌菌株LBA4404用于共培育。将农杆菌接种在含有适宜抗生素的AB培养基上并在28℃培养3日。随后将细菌收集并且在液体共培育培养基中悬浮至密度(OD₆₀₀)约1。随后将混悬液转移至培养皿内，并且将所述愈伤组织浸入该混悬液中15分钟。将愈伤组织随后在滤纸上吸干并转移至固化的共培育培养基上并且在黑暗中于25℃孵育3日。共培育的愈伤组织在黑暗于28℃下在选择剂存在下于含2，4-D的培养基上培育4周。在此期间，迅速生长的抗性愈伤组织团发育。在这种材料转移至再生培养基并在光照下孵育后，胚发生潜能释放并且幼苗在随后4至5周内发育。将苗从愈伤组织切下并且在含有植物生长素的培养基上孵育2至3周，其中将苗从所述培养基转移至土壤。硬化的苗在温室中在高湿度和短日照下培育。

对于一个构建体，产生大约35个独立的T0稻转化体。将原代转化体从组织培养箱转移至温室。在定量PCR分析以验证T-DNA插入物的拷贝数后，仅保留对选择剂表现耐受性的单拷贝转基因植物用于收获T1种子。种子随后在移植后3至5个月收获。该方法以超过50％的比例产生单基因座转化体(Aldemita和Hodges 1996，Chan等人，1993，Hiei等人，1994)。

实施例7：其他作物的转化

谷物转化

玉米(Zea mays)的转化根据对Ishida等人，(1996)，Nature Biotech14(6)：745-50)所述方法的修改形式进行。在谷物中，转化是基因型依赖的并且仅特定基因型可操作用于转化和再生。近交系A188(明尼苏达大学)或以A188作为亲本的杂种是用于转化的供体材料的良好来源，不过其他基因型也可以成功地使用。谷穗从授粉后大约11日(DAP)的谷物植物收获，此时不成熟的胚的长度是大约1至1.2mm。将不成熟的胚与含有所述表达载体的根癌农杆菌共培育，并且转基因植物通过器官发生恢复。将切下的胚在愈伤组织诱导培养基上、随后在玉米再生培养基上培育，其中所述的再生培养基含有选择剂(例如咪唑啉酮，但可以使用多种选择标记)。培养平板在25℃于光照下培养2-3周，或直至苗发育。将绿色苗从每个胚转移至玉米生根培养基并在25℃培养2-3周，直至根发育。将生根的苗移栽至温室中的土壤。从表现选择剂耐受性并且含有单拷贝T-DNA插入物的植物中产生T1种子。

小麦转化

小麦的转化用Ishida等人(1996)Nature Biotech 14(6)：745-50描述的方法进行。通常在转化中使用(从墨西哥CIMMYT可获得的)栽培品种Bobwhite。将不成熟的胚与含有所述表达载体的根癌农杆菌共培育，并且通过器官发生过程回收转基因植物。与农杆菌温育后，将胚在愈伤组织诱导培养基上、随后在再生培养基上体外培育，其中所述的再生培养基含有选择剂(例如咪唑啉酮，但可以使用多种选择标记)。培养平板在25℃于光照下培养2-3周，或直至苗发育。将绿色苗从每个胚转移至生根培养基并在25℃培养2-3周，直至根发育。将生根的苗移栽至温室中的土壤。从表现选择剂耐受性并且含有单拷贝T-DNA插入物的植物中产生T1种子。

大豆转化

根据Texas A&M美国专利5,164,310中描述的改良方法转化大豆。几个商业大豆品种对于通过这种方法的转化是可行的。栽培品种Jack(从Illinois种子基金会可获得)通常用于转化。对大豆种子消毒以便体外播种。从7日龄幼苗中切下下胚轴、胚根和一片子叶。进一步培育上胚轴和余下的子叶以发育腋生结节。将这些腋生结节切下并与含有表达载体的根癌农杆菌孵育。在共培育处理之后，将外植体洗涤并转移至选择培养基。将再生的苗切下并置于苗伸长培养基上。将长度不超过1cm的苗置于生根培养基上直至根发育。将生根的苗移栽至温室中的土壤。从表现选择剂耐受性并且含有单拷贝T-DNA插入物的植物中产生T1种子。

油籽油菜/卡诺拉油菜转化

使用5-6日龄年幼幼苗的子叶柄和下胚轴作为组织培养用外植体并且根据Babic等人(1998，Plant Cell Rep 17：183-188)进行转化。商业栽培品种Westar(Agriculture Canada)是用于转化的标准品种，不过也可以使用其他品种。对卡诺拉油菜种子作表面消毒以便体外播种。从体外幼苗中切下具有附着子叶的子叶柄外植体，并以(含有表达载体的)农杆菌通过叶柄外植体的切口端浸入细菌混悬液而接种。外植体随后在23℃，16小时光照下于含有3mg/l BAP、3％蔗糖、0.7％植物琼脂的MSBAP-3培养基上培养2日。与农杆菌共培育2日后，将叶柄外植体转移至含有3mg/l BAP、头孢噻肟、羧苄青霉素或特美汀(300mg/l)的MSBAP-3培养基上培养7日，并且随后在含有头孢噻肟、羧苄青霉素或特美汀和选择剂的MSBAP-3培养基上培养，直至苗再生。当苗具有5-10mm长度时，将苗切下并且转移至苗伸长培养基(含0.5mg/l BAP的MSBAP-0.5)。将长度大约2cm的苗转移至用于根诱导的生根培养基(MS0)。将生根的苗移栽至温室中的土壤。从表现选择剂耐受性并且含有单拷贝T-DNA插入物的植物中产生T1种子。

苜蓿转化

使用(McKersie等，1999Plant Physiol 119：839-847)的方法转化苜蓿的再生性克隆。苜蓿的再生和转化是基因型依赖性的并且因而需要再生性植物。已经描述了获得再生性植物的方法。例如，这些再生性植物可以选自栽培品种Rangelander(Agriculture Canada)或如Brown DCW与AAtanassov(1985.Plant Cell Tissue Culture 4：111-112)描述的任何其它商业苜蓿品种。备选地，已经选择RA3品种(威斯康星大学)用于组织培养(Walker等人，1978Am J Bot 65：654-659)。将叶柄外植体与含有表达载体的根癌农杆菌C58C1pMP90(McKersie等人，1999Plant Physiol119：839-847)或LBA4404的过夜培养物共培育。外植体在黑暗下于含有288mg/L Pro、53mg/L硫代脯氨酸、4.35g/L K2SO4和100μm乙酰丁香酮的SH诱导培养基上共培育3日。将外植体在半浓度的Murashige-Skoog培养基(Murashige和Skoog，1962)中洗涤并且铺种在不含乙酰丁香酮而含有抑制农杆菌生长的合适选择剂和合适抗生素的相同SH诱导培养基上。几周后，将体细胞胚转移至不含生长调节剂、不含抗生素和含有50g/L蔗糖的BOi2Y发育培养基。体细胞胚随后在半浓度的Murashige-Skoog培养基上萌发。将生根的幼苗移植入盆钵并且在温室中培育。从表现选择剂耐受性并且含有单拷贝T-DNA插入物的植物中产生T1种子。

棉花转化

使用根癌农杆菌，根据US 5,159,135中所述的方法转化棉花。将棉花种子在3％次氯酸钠溶液中表面消毒20分钟并且在含500μg/ml头孢噻肟的蒸馏水中洗涤。将种子随后转移至含有50μg/ml苯菌灵的SH培养基用于萌发。将4至6日龄幼苗的下胚轴取下，切成0.5cm小片并且置于0.8％琼脂上。农杆菌悬液(每毫升大约108个细胞，从含有用目的基因和合适选择标记转化的过夜培养物中稀释)用于接种下胚轴外植体。在室温和光照下3日后，将组织转移至固体培养基(1.6g/l脱乙酰吉兰糖胶)，所述固体培养基含有带维生素B5的Murashige和Skoog盐(Gamborg等人，Exp.Cell Res.50：151-158(1968))、0.1mg/l 2，4-D、0.1mg/l 6-呋喃甲基氨基嘌呤和750μg/ml MgCL2以及杀死残余细菌的50至100μg/ml头孢噻肟和400-500μg/ml羧苄青霉素。各个细胞系在2至3个月(每隔4至6周传代培养)后分离并且在用于组织增殖的选择培养基上进一步培育(30℃，16小时光周期)。转化的组织随后在非选择培养基上进一步培育持续2至3个月以产生体细胞胚。将至少4mm长度的外观健康胚转移至含有细蛭石中SH培养基的管中，所述SH培养基补充有0.1mg/l吲哚乙酸、6-呋喃甲基氨基嘌嘌呤和赤霉酸。在30℃以16小时光周期培育胚，并且将处于2至3叶期的小植物转移至具有蛭石和养分的盆钵。使植物硬化并随后移至温室以进一步培育。

糖甜菜转化

将糖甜菜(甜菜(Beta vulgaris L.))的种子在70％乙醇中消毒1分钟，随后在20％次氯酸盐漂白粉(例如

常规漂白粉(从Clorox，1221Broadway，Oakland，CA 94612，USA可商业获得))中摇动20分钟。将种子用无菌水淋洗并且晾干，随后铺种到萌发培养基(基于Murashige和Skoog(MS)的培养基(见Murashige，T.和Skoog，1962.A revised mediumfor rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures(用于快速培育和生物测定烟草组织培养物的改进培养基).Physiol.Plant，第15卷，473-497)上，所述培养基包含B5维生素(Gamborg等人；Nutrientrequirements of suspension cultures of soybean root cells(大豆根细胞悬浮培养的养分要求).Exp.Cell Res，第50卷，151-8)，补充有10g/l蔗糖和0.8％琼脂)。将下胚轴组织根据Hussey和Hepher基本上用于苗培养的启动(Hussey，G.和Hepher，A.，1978.Clonal propagation of sugarbeet plantsand the formation of polylpoids by tissue culture(通过组织培养克隆性增殖糖甜菜植物和形成多倍体).Annals of Botany，42，477-9)并且在pH 5.8的基于MS的培养基上在23-25℃以16小时光周期维持，所述培养基补充有30g/l蔗糖外加0.25mg/L苄氨基嘌呤和0.75％琼脂。

在转化实验中使用携带双元质粒的根癌农杆菌菌株，所述双元质粒载有选择标记基因例如nptII。在转化之前1日，将包含抗生素的液体LB培养物在摇床上培育(28℃，150转/分钟)直至600nm处的光密度(O.D.)达到约1。将过夜培育的细菌培养物离心并且重悬于pH 5.5的包含乙酰丁香酮的接种培养基(O.D.约1)中。

将苗基组织切成小片(大约1.0cmx1.0cmx2.0mm)。将组织浸入细菌液体接种培养基中30秒。通过滤纸吸干除去多余的液体。在含有30g/l蔗糖的基于MS的培养基上的共培育进行24-72小时，随后是一个无选择时期，包括在含有30g/l蔗糖的基于MS的培养基上孵育，所述培养基含有诱导苗发育的1mg/L BAP和用于消除农杆菌的头孢噻肟。在3-10日后，将外植体转移至含有例如卡那霉素或G418(依赖基因型，50-100mg/L)的相似选择培养基。

将组织每2-3周转移至新鲜培养基以维持选择压力。非常快的苗启动(在3-4日后)表示现存分生组织的再生，而非新发育的转基因分生组织的器官发生。在几轮传代培养后，将小苗转移至含有5mg/L NAA和卡那霉素或G418的根诱导培养基。采取额外的步骤以减少产生嵌合(部分转基因的)转化植物的可能性。来自再生苗的组织样品用于DNA分析。

用于糖甜菜的其他转化方法是本领域已知的，例如Linsey和Gallois的那些方法(Linsey，K.和Gallois，P.，1990.Transformation of sugarbeet(Beta vulgaris)by Agrobacterium tumefaciens(通过根癌农杆菌转化糖甜菜(Beta vulgaris)).Journal of Experimental Botany；第41卷，第226期：529-36)或在作为WO9623891A公开的国际申请中所公布的方法。

甘蔗转化

纺锤体(Spindle)从6月龄田间培育的甘蔗植物分离(见Arencibia A.等人，1998.An efficient protocol for sugarcane(Saccharum spp.L.)transformation mediated by Agrobacterium tumefaciens(根癌农杆菌介导的甘蔗转化高效操作方案).Transgenic Research，第7卷，213-22；Enriquez-Obregon G.等人，1998.Herbicide-resistant sugarcane(Saccharum officinarum L.)plants by Agrabacterium-mediatedtransformation(通过农杆菌介导转化所致的抗除草剂甘蔗植物).Planta，第206卷，20-27)。通过在20％次氯酸盐漂白粉(例如

常规漂白粉(从Clorox，1221Broadway，Oakland，CA 94612，USA可商业获得))中浸泡，将材料消毒。将约0.5cm的横断切片以顶朝上的方向置于培养基上。植物材料在基于MS(Murashige，T.和Skoog，1962.A revised medium for rapidgrowth and bioassays with tobacco tissue cultures(用于快速培育和生物测定烟草组织培养物的改进培养基).Physiol.Plant，第15卷，473-497)的培养基上在23℃于黑暗下培育4周，所述培养基包含B5维生素(Gamborg，O.等人，1968，Nutrient requirements of suspension cultures of soybean rootcells(大豆根细胞悬浮培养的养分要求).Exp.Cell Res，第50卷，151-8)，补充有20g/l蔗糖、500mg/L酪蛋白水解物、0.8％琼脂和5mg/L 2，4-D。在4周后，将培养物转移到相同的新鲜培养基上。

在转化实验中使用携带双元质粒的根癌农杆菌菌株，所述双元质粒载有选择标记基因例如hpt。在转化之前1日，将包含抗生素的液体LB培养物在摇床上培育(28℃，150转/分钟)直至600nm处的光密度(O.D.)达到约0.6。将过夜培育的细菌培养物离心并且重悬于pH 5.5的包含乙酰丁香酮的基于MS的接种培养基(O.D.约0.4)中。

基于形态学特征如致密结构和黄颜色，将甘蔗胚发生性愈伤组织片(2-4mm)分离并且在层流罩(flow hood)干燥20分钟，随后浸入细菌接种液体培养基中10-20分钟。通过滤纸吸干除去多余的液体。共培育于黑暗下在滤纸上进行3-5日，其中所述滤纸置于包含B5维生素的含有1mg/L2，4-D的基于MS的培养基顶部。在共培育后，愈伤组织用无菌水淋洗，随后是在相似培养基上的一个无选择时期，所述培养基含有消除农杆菌的头孢噻肟。在3-10日后，将外植体转移至包含B5维生素的基于MS的选择培养基持续另外3周，所述选择培养基含有1mg/L 2，4-D，载有25mg/L潮霉素(依赖于基因型)。全部处理在23℃在黑暗条件下进行。

抗性愈伤组织进一步在缺少2，4-D的包含1mg/L BA和25mg/L潮霉素的培养基上以16小时光周期培育，导致苗结构的发育。将苗分离并且在选择性生根培养基(基于MS，包含20g/l蔗糖、20mg/L潮霉素和500mg/L头孢噻肟)上培育。

来自再生苗的组织样品用于DNA分析。

用于甘蔗的其他转化方法是本领域已知的，例如来自作为WO2010/151634A公布的国际申请和授权的欧洲专利EP1831378。

实施例8：表型评价方法

8.1评价建立

产生大约35个独立的T0稻转化体。将原代转化体从组织培养室转移至温室以培育并且收获T1种子。留下6个事件，其中所述T1子代以3∶1比例对所述转基因的存在/不存在分离。对于这些事件中的每一个，通过监测目视标记表达选出大约10株含有该转基因的T1籽苗(杂合子和纯合子)和大约10株缺少该转基因的T1籽苗(失效合子)。以随机位置并排培育转基因植物和相应的失效合子。温室条件是短日照(12小时光照)，光照下28℃和黑暗下22℃，和70％相对湿度。

使植物从播种期至成熟期数次通过数字成像室。在每个时间点上，从至少6个不同角度拍摄每株植物的数字图像(2048x1536像素，1600万颜色)。

干旱筛选

在盆栽土壤中在正常条件下培育来自T2种子的植物直至它们达到抽穗期。随后将它们转移至不予灌溉的“干燥”地段。将湿度探针插入随机选择的盆钵内，以监测土壤水含量(SWC)。当SWC下降低于某些阈值时，自动地对所述植物连续地再灌溉直至再次达到正常水平。随后将植物再次转移至正常条件。剩余的培养(植物成熟、种子收获)与不在非生物胁迫条件下培育的植物相同。如正常条件下生长所详述那样，记录生长和产量参数。

氮使用效率筛选

除营养溶液之外，在正常条件下在盆栽土壤中培育源自T1种子的稻植物。从移植至成熟期间用含有降低的、通常7至8倍之间更少的氮(N)含量的特定营养液浇灌盆钵。栽培过程的剩余部分(植物成熟、种子收获)与不在非生物胁迫下培育的植物相同。如正常条件下生长所详述那样，记录生长和产量参数。

盐胁迫筛选

植物在椰子纤维和Argex(3∶1比率)组成的基质上培育。在温室中移植小植物后，在头两周期间使用正常营养液。在头两周后，添加25mM盐(NaCl)至所述营养液，直至收获植物。随后测量种子相关参数。

8.2统计分析：F-检验

使用两因素ANOVA(方差分析)作为总体评价植物表型特征的统计模型。对用本发明基因转化的全部事件的全部植物的全部所测量参数实施F检验。实施F检验以检查该基因对全部转化事件的影响并验证该基因的整体作用(又称作总体基因作用)。对于F检验而言，真实总体基因作用的显著性的阈值设在5％概率水平上。显著性F检验值指出基因作用，这意味不仅是仅基因的存在或位置才造成表型上的差异。

8.3测量的参数

生物量相关的参数测量

使植物从播种期至成熟期数次通过数字成像室。在每个时间点上，从至少6个不同角度拍摄每株植物的数字图像(2048x1536像素，1600万颜色)。

植物地上部分面积(或叶生物量)通过计数来自植物地上部分的数字图像上与背景区别的像素总数而确定。这个值对相同时间点上从不同角度拍摄的画面进行平均化并且通过校正过程换算成以平方mm表述的物理表面值(physical surface value)。实验显示以这种方式测量的地上部分植物面积与地上植物部分的生物量相关。地上部分面积是在植物已经实现其最大叶生物量的时间点上所测量的面积。早期生长势是萌发后3周的植物(幼苗)地上部分面积。根生物量的增加表述为根总生物量增加(度量为在植物生命期间观察到的最大根生物量)；或表述为根/苗指数增加(度量为根和苗的活跃生长时期中根质量与苗质量之间的比例)。

通过计数来自植物部分中与背景区别的像素总数确定早期生长势。这个值对相同时间点上从不同角度拍摄的画面进行平均化并且通过校正过程换算成以平方mm表述的物理表面值(physical surface value)。

种子相关的参数测量值

将成熟的原发穗收获、计数、装袋、加条形码标记并且随后在干燥箱内于37℃干燥3日。随后将穗脱粒，并且收集和计数全部种子。使用鼓风装置，将充实粒与空粒分开。弃去空粒并且再次计数剩余部分。充实粒在分析天平上称重。通过计数分离步骤后仍留下的充实粒数目确定充实种子数。通过称量从一株植物收获的全部充实粒测量种子总产量。通过计数从一株植物收获的籽粒数测得每株植物的种子总数。从计数的充实种子数及它们的总重量外推出千粒重(TKW)。本发明中的收获指数(HI)定义为种子总产量与地上部分面积(mm²)之间的比率，乘以系数10⁶。如本发明中定义的每花序总花数是种子总数与成熟原发花序数目之间的比率。如本发明中定义的种子充实率是充实种子数对种子(或小花)总数的比例(表述为％)。

实施例9：转基因植物的表型评价结果

下文(表B)呈现了在氮限制条件下评价转基因稻植物的结果，所述转基因稻植物表达编码SEQ ID NO：2的多肽的核酸。关于产生所述转基因植物的细节，见前述实施例。

观察到地上生物量(AreaMax)、根总生物量(RootMax)、植物小花数(nrtotalseed)、开花前植物绿度(GNbfFlow)、初次绽出的花序数(firstpan)、每个花序的花数(flowerperpan)、植物高度(GravityYMax)、细根量(ThinMax)增加至少5％。

表B：转基因稻植物的数据总结；显示总体增加百分数并且对于每个参数，p-值＜0.05并且高于5％阈值。

参数	总体增加
		地上生物量	15.1
根总生物量	13.4
		植物小花数	30.8
开花前植物绿度	5.0
		初次绽出的花序数	15.4
每个花序的花数	11.8
		植物高度	3.8
细根量	5.3

实施例10：鉴定与SEQ ID NO：29和SEQ ID NO：30相关的序列

使用数据库序列搜索工具，如基本局部比对工具(BLAST)(Altschul等人(1990)J.Mol.Biol.215：403-410；和Altschul等人(1997)Nucleic AcidsRes.25：3389-3402)，在国家生物技术信息中心(NCBI)的Entrez核苷酸数据库中维护的那些序列中鉴定了与SEQ ID NO：29和SEQ ID NO：30相关的(全长cDNA、EST或基因组)序列。该程序用来通过将核酸序列或多肽序列与序列数据库比较并且计算匹配的统计显著性来找到序列之间的局部相似区域。例如，将SEQ ID NO：29的核酸编码的多肽用于TBLASTN算法中，采用默认设置和过滤程序以忽略低复杂性序列抵消。该分析的输出结果通过逐对比较进行检验，并根据概率评分(E-值)评级，其中所述的评分反映特定比对结果偶然发生的概率(E-值越低，命中的显著性越高)。除E-值外，比较也可以由同一性百分数评定。同一性百分数指所比较的两个核酸(或多肽)序列之间在特定长度范围内的相同核苷酸(或氨基酸)的数目。在一些情况下，可以调整默认参数以调节搜索的严格性。例如，可以增加E-值以显示较不严格的匹配。以这种方式，可以鉴定到几乎精确的短匹配。

表C提供一系列Bax抑制物-1核酸和多肽。

表C：Bax抑制物-1核酸和多肽的实例：

序列已经由研究机构如基因组研究所(TIGR；始于TA)初步地组装并且公开披露。真核生物基因直向同源物(EGO)数据库可以用来通过关键词检索或通过使用BLAST算法以目的核酸序列或多肽序列鉴定此类相关序列。已经为特定生物创建了专有核酸序列数据库，如由联合基因组研究所(Joint Genome Institute)创建。另外，登录专利数据库已经允许鉴定新的核酸序列和多肽序列。

实施例11：BI-1多肽序列的比对

使用来自MUSCLE 3.7程序(Edgar，Nucleic Acids Res 32，1792-1797，2004)进行多肽序列的比对。空位开口罚分的默认值是10，空位延伸罚分是0.1并且所选的权重矩阵是Blosum 62(如果比对多肽)。进行少许手工编辑以进一步优化该比对。在图6和图7中比对BI-1多肽。图6代表属于RA/BI-1组的多种BI-1多肽的多重比对结果，并且图7代表属于EC/BI-1组的多种BI-1多肽的多重比对结果。

构建了BI-1多肽的进化系统树(图8)。使用MUSCLE(Edgar(2004)，Nucleic Acids Res 32(5)：1792-97)比对这些蛋白质。使用QuickTree(Howe等人(2002).Bioinformatics 18(11)：1546-7)，计算邻接树。使用Dendroscope2.0.1绘制环状倾斜的进化支图(Hudson等人(2007).Bioinformatics 8(1)：460)。在e＝1e-40时，回收全部3个拟南芥BI-1相关基因。使用每个聚类的代表性成员产生该树。

实施例12：计算多肽序列之间的总体同一性百分数

使用现有技术领域可获得的方法之一，即MatGAT(矩阵总体比对工具)软件(BMC Bioinformatics.20034：29.MatGAT：an application thatgenerates similarity/identity matrices using protein or DNAsequences(MatGAT：使用蛋白质序列或DNA序列产生相似性/同一性矩阵的一项应用)，Campanella JJ，Bitincka L，Smalley J；该软件由LedionBitincka维护)，确定在实施本发明方法中有用的全长多肽序列之间的总体相似性和同一性百分数。MatGAT软件产生DNA序列或蛋白质序列的相似性/同一性矩阵，无需数据的预先比对。该程序使用Myers和Miller总体比对算法(空位开口罚分12和空位延伸罚分2)执行一系列配对比对，使用例如Blosum 62(用于多肽)计算相似性和同一性，并且随后将结果置于距离矩阵中。

表9中显示在这些多肽序列的全长范围内总体相似性和同一性的软件分析结果。序列相似性在分割线下半部分显示，并且序列同一性在对角分割线的上半部分显示。比较中使用的参数是：评分矩阵：Blosum62，第一空位：12，延伸空位：2.与SEQ ID NO：30相比，在实施本发明方法中有用的BI-1多肽序列之间的序列同一性(以％计)通常高于36％并且可以达到85％。

参考图9，所示的ID编号对应于以下序列：

实施例13：鉴定在实施本发明方法中有用的多肽序列中所包含的结构域

蛋白质家族、结构域和位点的集成资源(InterPro)数据库是针对基于文本及基于序列的搜索法的常用特征标识数据库的集成界面。InterPro数据库合并了这些数据库，所述数据库使用不同的方法学及有关充分表征的蛋白质的程度各异的生物学信息以获得蛋白质特征标识(proteinsignatures)。合作数据库包括SWISS-PROT、PROSITE、TrEMBL、PRINTS、ProDom和Pfam、Smart和TIGRFAM。Pfam是覆盖众多常见蛋白质结构域和家族的多重序列比对结果和隐匿马尔科夫模型(HMM)的庞大集合。Pfam在英国Sanger研究所服务器上维护。Interpro在英国欧洲生物信息学研究所维护。

在表D中呈现如SEQ ID NO：30所代表的多肽序列的InterPro扫描结果。

表D：如SEQ ID NO：30所代表的多肽序列的InterPro扫描结果(主要登录号)

实施例14：BI-1多肽的功能测定法

已经由Nagano等人(2009Plant J.，58(1)：122-134)证实BI-1多肽与AtCb5相互作用。Nagano等人通过用分裂遍在蛋白(split-ubiquitin)酵母双杂交(suY2H)系统筛选拟南芥cDNA文库将拟南芥细胞色素b(5)(AtCb5)鉴定为拟南芥BI-1(AtBI-1)的相互作用物。Cb5是主要定位于ER膜中的电子传递蛋白。此外，双分子荧光互补(BiFC)测定法和荧光共振能量转移(FRET)分析证实，AtBI-1在植物中与AtCb5相互作用。Nagano等人还显示酵母中AtBI-1介导对细胞死亡的抑制需要在N端具有Cb5样结构域并且与AtBI-1相互作用的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)脂肪酸羟化酶1(ScFAH1)。ScFAH1是定位于ER膜中的鞘脂脂肪酸2-羟化酶。相反，作为拟南芥中ScFAH1功能性同源物的AtFAH1和AtFAH2，没有Cb5样结构域，并且取而代之的是，在植物中与AtCb5相互作用。Nagano等人进一步公开AtBI-1在植物细胞中通过AtCb5与AtFAH相互作用。

实施例15：克隆编码BI-1的核酸序列

15.1实施例1

在这个实施例中，使用定制的毛果杨幼苗cDNA文库(在pCMV Sport6.0中；Invitrogen，Paisley，UK)作为模板，通过PCR扩增核酸序列。使用在50μl PCR混合物中的200ng模板，在标准条件下使用Hifi Taq DNA聚合酶进行PCR。所用的引物是prm12053(SEQ ID NO：125；有义)：5’-ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggcttaaacaatggaatcgttcgcttcc-3’和prm12054(SEQ ID NO：126；反向互补物)：5’-ggggaccactttgtacaagaaagctgggtcgagcacatagtcagtcttcc-3’，其中所述引物包括用于Gateway重组的AttB位点。还使用标准方法纯化扩增的PCR片段。随后，进行Gateway方法的第一步骤，即BP反应，在此期间，PCR片段与pDONR201质粒在体内重组以产生根据Gateway命名法的“进入克隆”，pBI-1。作为

技术的部分，质粒pDONR201从Invitrogen购买。

包含SEQ ID NO：29的进入克隆随后在LR反应中与用于稻转化的目的载体一起使用。这种载体在T-DNA边界内部含有以下作为功能性元件：植物选择标记、筛选标记表达盒和意在与已经克隆于这个进入克隆中的目的核酸序列发生LR体内重组的Gateway盒。用于组成型特异性表达的稻GOS2启动子(SEQ ID NO：153)位于这个Gateway盒上游。

在LR重组步骤后，将所得的表达载体pGOS2::BI-1(图10)根据本领域熟知的方法转化至农杆菌菌株LBA4044中。

15.2实施例2

在这个实施例中，使用定制的稻幼苗cDNA文库(在pCMV Sport 6.0中；Invitrogen，Paisley，UK)作为模板，通过PCR扩增核酸序列。使用在50μl PCR混合物中的200ng模板，在标准条件下使用Hifi Taq DNA聚合酶进行PCR。所用的引物是prm14082(SEQ ID NO：127；有义)：5’-ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggcttaaacaatggacgccttctactcgac-3’和prm14083(SEQ ID NO：128；反向互补物)：5’-ggggaccactttgtacaagaaagctgggtcgggaagagaag ctctcaag-3’，其中所述引物包括用于Gateway重组的AttB位点。还使用标准方法纯化扩增的PCR片段。随后，进行Gateway方法的第一步骤，即BP反应，在此期间，PCR片段与pDONR201质粒在体内重组以产生根据Gateway命名法的“进入克隆”，pBI-Io。作为

技术的部分，质粒pDONR201从Invitrogen购买。

包含SEQ ID NO：31的进入克隆随后在LR反应中与用于稻转化的目的载体一起使用。这种载体在T-DNA边界内部含有以下作为功能性元件：植物选择标记、筛选标记表达盒和意在与已经克隆于这个进入克隆中的目的核酸序列发生LR体内重组的Gateway盒。用于组成型特异性表达的稻GOS2启动子(SEQ ID NO：153)位于这个Gateway盒上游。

在LR重组步骤后，将所得的表达载体pGOS2：BI-1o根据本领域熟知的方法转化至农杆菌菌株LBA4044内。该载体与如图5中所示的载体相似，除了核酸序列编码BI-1多肽之外。

实施例16：植物转化

稻转化

含有表达载体(见实施例15.1和15.2)的农杆菌用来转化稻植物。将粳稻栽培品种Nipponbare的成熟干燥种子脱壳。通过在70％乙醇中孵育1分钟，随后在0.2％HgCl₂中孵育30分钟，随后用无菌蒸馏水洗涤6次15分钟而实施消毒。消毒的种子随后在含有2，4-D的培养基(愈伤组织诱导培养基)上萌发。在黑暗中孵育4周后，将盾片衍生的胚发生性愈伤组织切下并在同一种培养基上增殖。2周后，将愈伤组织通过在同一种培养基上传代培养另外2周进行繁殖或增殖。胚发生性愈伤组织片在新鲜培养基上传代培养3日，之后共培育(以增强细胞分裂活性)。

将含有所述表达载体的农杆菌菌株LBA4404用于共培育。将农杆菌接种在含有适宜抗生素的AB培养基上并在28℃培养3日。随后将细菌收集并且在液体共培育培养基中悬浮至密度(OD₆₀₀)约1。随后将混悬液转移至培养皿内，并且将所述愈伤组织浸入该混悬液中15分钟。将愈伤组织随后在滤纸上吸干并转移至固化的共培育培养基上并且在黑暗中于25℃孵育3日。共培育的愈伤组织在黑暗于28℃下在选择剂存在下于含2，4-D的培养基上培育4周。在此时段期间，形成迅速生长的抗性愈伤组织岛。在这种材料转移至再生培养基并在光照下孵育后，胚发生潜能释放并且幼苗在随后4至5周内发育。将苗从愈伤组织切下并且在含有植物生长素的培养基上孵育2至3周，其中将苗从所述培养基转移至土壤。硬化的苗在温室中在高湿度和短日照下培育。

对于一个构建体，产生大约35个独立的T0稻转化体。将原代转化体从组织培养箱转移至温室。在定量PCR分析以验证T-DNA插入物的拷贝数后，仅保留对选择剂表现耐受性的单拷贝转基因植物用于收获T1种子。种子随后在移植后3至5个月收获。该方法以超过50％的比例产生单基因座转化体(Aldemita和Hodges 1996，Chan等人，1993，Hiei等人，1994)。

实施例17：其他作物的转化

谷物转化

玉米(Zea mays)的转化根据对Ishida等人，(1996)，Nature Biotech14(6)：745-50)所述方法的修改形式进行。在谷物中，转化是基因型依赖的并且仅特定基因型可操作用于转化和再生。近交系A188(明尼苏达大学)或以A188作为亲本的杂种是用于转化的供体材料的良好来源，不过其他基因型也可以成功地使用。谷穗从授粉后大约11日(DAP)的谷物植物收获，此时不成熟的胚的长度是大约1至1.2mm。将不成熟的胚与含有表达载体的根癌农杆菌共培育，并且通过器官发生回收转基因植物。将切下的胚在愈伤组织诱导培养基上、随后在玉米再生培养基上培育，其中所述的再生培养基含有选择剂(例如咪唑啉酮，但可以使用多种选择标记)。培养平板在25℃于光照下培养2-3周，或直至苗发育。将绿色苗从每个胚转移至玉米生根培养基并在25℃培养2-3周，直至根发育。将生根的苗移栽至温室中的土壤。从表现选择剂耐受性并且含有单拷贝T-DNA插入物的植物中产生T1种子。

小麦转化

小麦的转化用Ishida等人(1996)Nature Biotech 14(6)：745-50描述的方法进行。通常在转化中使用(从墨西哥CIMMYT可获得的)栽培品种Bobwhite。将不成熟的胚与含有所述表达载体的根癌农杆菌共培育，并且通过器官发生过程回收转基因植物。与农杆菌温育后，将胚在愈伤组织诱导培养基上、随后在再生培养基上体外培育，其中所述的再生培养基含有选择剂(例如咪唑啉酮，但可以使用多种选择标记)。培养平板在25℃于光照下培养2-3周，或直至苗发育。将绿色苗从每个胚转移至生根培养基并在25℃培养2-3周，直至根发育。将生根的苗移栽至温室中的土壤。从表现选择剂耐受性并且含有单拷贝T-DNA插入物的植物中产生T1种子。

大豆转化

根据Texas A&M美国专利5,164,310中描述的改良方法转化大豆。几个商业大豆品种对于通过这种方法的转化是可行的。栽培品种Jack(从Illinois种子基金会可获得)通常用于转化。对大豆种子消毒以便体外播种。从7日龄幼苗中切下下胚轴、胚根和一片子叶。进一步培育上胚轴和余下的子叶以发育腋生结节。将这些腋生结节切下并与含有表达载体的根癌农杆菌孵育。在共培育处理之后，将外植体洗涤并转移至选择培养基。将再生的苗切下并置于苗伸长培养基上。将长度不超过1cm的苗置于生根培养基上直至根发育。将生根的苗移栽至温室中的土壤。从表现选择剂耐受性并且含有单拷贝T-DNA插入物的植物中产生T1种子。

油籽油菜/卡诺拉油菜转化

使用5-6日龄年幼幼苗的子叶柄和下胚轴作为组织培养用外植体并且根据Babic等人(1998，Plant Cell Rep 17：183-188)进行转化。商业栽培品种Westar(Agriculture Canada)是用于转化的标准品种，不过也可以使用其他品种。对卡诺拉油菜种子作表面消毒以便体外播种。从体外幼苗中切下具有附着子叶的子叶柄外植体，并以(含有表达载体的)农杆菌通过叶柄外植体的切口端浸入细菌混悬液而接种。外植体随后在23℃，16小时光照下于含有3mg/l BAP、3％蔗糖、0.7％植物琼脂的MSBAP-3培养基上培养2日。与农杆菌共培育2日后，将叶柄外植体转移至含有3mg/l BAP、头孢噻肟、羧苄青霉素或特美汀(300mg/l)的MSBAP-3培养基上培养7日，并且随后在含有头孢噻肟、羧苄青霉素或特美汀和选择剂的MSBAP-3培养基上培养，直至苗再生。当苗具有5-10mm长度时，将苗切下并且转移至苗伸长培养基(含0.5mg/l BAP的MSBAP-0.5)。将长度大约2cm的苗转移至用于根诱导的生根培养基(MS0)。将生根的苗移栽至温室中的土壤。从表现选择剂耐受性并且含有单拷贝T-DNA插入物的植物中产生T1种子。

苜蓿转化

使用(McKersie等，1999Plant Physiol 119：839-847)的方法转化苜蓿的再生性克隆。苜蓿的再生和转化是基因型依赖性的并且因而需要再生性植物。已经描述了获得再生性植物的方法。例如，这些再生性植物可以选自栽培品种Rangelander(Agriculture Canada)或如Brown DCW和AAtanassov(1985.Plant Cell Tissue Culture 4：111-112)所述的任何其他商业苜蓿品种。备选地，已经选择RA3品种(威斯康星大学)用于组织培养(Walker等人，1978Am J Bot 65：654-659)。将叶柄外植体与含有表达载体的根癌农杆菌C58C1pMP90(McKersie等人，1999Plant Physiol119：839-847)或LBA4404的过夜培养物共培育。外植体在黑暗下于含有288mg/L Pro、53mg/L硫代脯氨酸、4.35g/L K2SO4和100μm乙酰丁香酮的SH诱导培养基上共培育3日。将外植体在半浓度的Murashige-Skoog培养基(Murashige和Skoog，1962)中洗涤并且铺种在不含乙酰丁香酮而含有抑制农杆菌生长的合适选择剂和合适抗生素的相同SH诱导培养基上。几周后，将体细胞胚转移至不含生长调节剂、不含抗生素和含有50g/L蔗糖的BOi2Y发育培养基。体细胞胚随后在半浓度的Murashige-Skoog培养基上萌发。将生根的幼苗移植入盆钵并且在温室中培育。从表现选择剂耐受性并且含有单拷贝T-DNA插入物的植物中产生T1种子。

棉花转化

使用根癌农杆菌，根据US 5,159,135中所述的方法转化棉花。将棉花种子在3％次氯酸钠溶液中表面消毒20分钟并且在含500μg/ml头孢噻肟的蒸馏水中洗涤。将种子随后转移至含有50μg/ml苯菌灵的SH培养基用于萌发。将4至6日龄幼苗的下胚轴取下，切成0.5cm小片并且置于0.8％琼脂上。农杆菌悬液(每毫升大约108个细胞，从含有用目的基因和合适选择标记转化的过夜培养物中稀释)用于接种下胚轴外植体。在室温和光照下3日后，将组织转移至固体培养基(1.6g/l脱乙酰吉兰糖胶)，所述固体培养基含有带维生素B5的Murashige和Skoog盐(Gamborg等人，Exp.Cell Res.50：151-158(1968))、0.1mg/l 2，4-D、0.1mg/l 6-呋喃甲基氨基嘌呤和750μg/ml MgCL2以及杀死残余细菌的50至100μg/ml头孢噻肟和400-500μg/ml羧苄青霉素。各个细胞系在2至3个月(每隔4至6周传代培养)后分离并且在用于组织增殖的选择培养基上进一步培育(30℃，16小时光周期)。转化的组织随后在非选择培养基上进一步培育持续2至3个月以产生体细胞胚。将至少4mm长度的外观健康胚转移至含有细蛭石中SH培养基的管中，所述SH培养基补充有0.1mg/l吲哚乙酸、6-呋喃甲基氨基嘌嘌呤和赤霉酸。在30℃以16小时光周期培育胚，并且将处于2至3叶期的小植物转移至具有蛭石和养分的盆钵。使植物硬化并随后移至温室以进一步培育。

实施例18：稻植物的表型评价方法

18.1评价建立

产生大约35个独立的T0稻转化体。将原代转化体从组织培养室转移至温室以培育并且收获T1种子。留下6个事件，其中所述T1子代以3∶1比例对所述转基因的存在/不存在分离。对于这些事件中的每一个，通过监测目视标记表达选出大约10株含有该转基因的T1籽苗(杂合子和纯合子)和大约10株缺少该转基因的T1籽苗(失效合子)。以随机位置并排培育转基因植物和相应的失效合子。温室条件是短日照(12小时光照)，光照下28℃和黑暗下22℃，和70％相对湿度。在非胁迫条件下培育的植物以规律的间隔期浇水，以确保水和养分不是限制性的并且确保满足植物需要。

干旱筛选

在盆栽土壤中在正常条件下培育来自T2种子的植物直至它们达到抽穗期。随后将它们转移至不予灌溉的“干燥”地段。将湿度探针插入随机选择的盆钵内，以监测土壤水含量(SWC)。当SWC下降低于某些阈值时，自动地对所述植物连续地再灌溉直至再次达到正常水平。随后将植物再次转移至正常条件。剩余的培养(植物成熟、种子收获)与不在非生物胁迫条件下培育的植物相同。如正常条件下生长所详述那样，记录生长和产量参数。

氮使用效率筛选

在除营养液之外的正常条件下在盆栽土壤中培育来自T2种子的稻植物。从移植至成熟期间，盆钵用含有降低的、通常降低7至8倍之间的氮(N)含量的特定营养液浇灌。剩余的培养(植物成熟、种子收获)与不在非生物胁迫下培育的植物相同。如正常条件下生长所详述那样，记录生长和产量参数。

盐胁迫筛选

植物在椰子纤维和Argex(3∶1比率)组成的基质上培育。在温室中移植小植物后，在头两周期间使用正常营养液。在头两周后，添加25mM盐(NaCl)至所述营养液，直至收获植物。随后测量种子相关参数。

18.2统计分析：F-检验

使用两因素ANOVA(方差分析)作为总体评价植物表型特征的统计模型。对用本发明基因转化的全部事件的全部植物的全部所测量参数实施F检验。实施F检验以检查该基因对全部转化事件的影响并验证该基因的整体作用(又称作总体基因作用)。对于F检验而言，真实总体基因作用的显著性的阈值设在5％概率水平上。显著性F检验值指出基因作用，这意味不仅是仅基因的存在或位置才造成表型上的差异。

18.3测量的参数

使植物从播种期至成熟期数次通过数字成像室。在每个时间点上，从至少6个不同角度拍摄每株植物的数字图像(2048x1536像素，1600万颜色)。

生物量相关的参数测量

植物地上部分面积(或叶生物量)通过计数来自植物地上部分的数字图像上与背景区别的像素总数而确定。这个值对相同时间点上从不同角度拍摄的画面进行平均化并且通过校正过程换算成以平方mm表述的物理表面值(physical surface value)。实验显示以这种方式测量的地上部分植物面积与地上植物部分的生物量相关。地上部分面积是在植物已经实现其最大叶生物量的时间点上所测量的面积。根生物量的增加表述为根总生物量增加(度量为在植物生命期间观察到的最大根生物量)；或表述为在植物寿命期间观察到的具有超过某个阈值的厚度时根的最大生物量(RootThickMax)；或表述为根/苗指数增加(度量为根和苗的活跃生长时期中根质量与苗质量之间的比例)。

与发育时间相关的参数

早期生长势是萌发后3周的植物(幼苗)地上部分面积。通过计数来自植物部分中与背景区别的像素总数确定早期生长势。这个值对相同时间点上从不同角度拍摄的画面进行平均化并且通过校正过程换算成以平方mm表述的物理表面值(physical surface value)。

可以使用如WO 2007/093444中所述的方法确定植物的“开花时间”。

种子相关的参数测量值

将成熟的原发穗收获、计数、装袋、加条形码标记并且随后在干燥箱内于37℃干燥3日。随后将穗脱粒，并且收集和计数全部种子。使用鼓风装置，将充实粒与空粒分开。弃去空粒并且再次计数剩余部分。充实粒在分析天平上称重。通过计数分离步骤后仍留下的充实粒数目确定充实种子数。通过称量从一株植物收获的全部充实粒测量种子总产量。通过计数从一株植物收获的籽粒数测得每株植物的种子总数。从计数的充实种子数及它们的总重量外推出千粒重(TKW)。本发明中的收获指数(HI)定义为种子总产量与地上部分面积(mm²)之间的比率，乘以系数10⁶。如本发明中定义的每花序总花数是种子总数与成熟原发花序数目之间的比率。如本发明中定义的种子充实率是充实种子数对种子(或小花)总数的比例(表述为％)。

实施例19：转基因稻植物的表型评价结果

19.1实施例1

下文在表E中呈现非胁迫条件下转基因稻植物的评价结果，所述转基因稻植物处于T2世代并且表达了编码SEQ ID NO：30的BI-1多肽的核酸(见实施例15.1)。在非胁迫条件下培育时，观察到根生物量(RootThickMax)增加至少5％，并且观察到如种子总重量、充实种子数、充实率、收获指数所示的种子产量增加至少5％。

表E：转基因稻植物的数据总结；对于每个参数，显示总体增加百分比用于证实(T2世代)，对于每个参数，p-值＜0.05。

参数	总体增加
		种子总重量	18.9
充实种子数	14.0
		充实率	27.4

收获指数	19.7
		根生物量	7.9

此外，表达所述BI-1核酸的植物显示早期生长势并且显示增加的千粒核重。

19.2实施例2

下文在表F中呈现非胁迫条件下转基因稻植物的另一个评价结果，所述转基因稻植物处于T2世代并且表达了编码SEQ ID NO：32的BI-1多肽的核酸(见实施例15.2)。在非胁迫条件下培育时，观察到如种子总重量、充实率、收获指数所示的种子产量增加至少5％。

表F：转基因稻植物的数据总结；对于每个参数，显示总体增加百分比用于证实(T2世代)，对于每个参数，p-值＜0.05。

参数	总体增加
		种子总重量	10.7
充实率	5.4
		收获指数	10.0

此外，表达所述BI-1核酸的植物显示早期生长势并且显示增加的千粒核重和增加的充实种子数。

实施例20：表达编码BI-1的核酸序列的转基因拟南芥植物

实施例20.1构建体的制备

通过如PfuUltraDNA聚合酶(Stratagene)技术方案中所述的PCR扩增来自毛果杨的SEQ ID NO：30。PfuUltra DNA聚合酶的操作方案的组成如下：1x PCR缓冲液，0.2mM每种dNTP，5ng含有SEQ ID NO：30的质粒pBI-1(见实施例15.1)，50pmol正向引物，50pmol反向引物，含有或不含1M甜菜碱，2.5U PfuUltra DNA聚合酶。

扩增循环如下：以94℃30秒，61℃30秒，72℃15分钟进行1个循环，随后以94℃30秒，60℃30秒，72℃15分钟进行2个循环，随后以94℃30秒，59℃30秒，72℃15分钟进行3个循环，随后以94℃30秒，58℃30秒，72℃15分钟进行4个循环，随后以94℃30秒，57℃30秒，72℃15分钟进行25个循环，随后以72℃10分钟进行1个循环，随后最终保持4-16℃。

为了扩增和克隆SEQ ID NO：30，使用以下引物：引物1(正向引物)：5’-TTGCTCTTCCATGGAATCGTTCGCTTCCTTC-3’(SEQ ID NO：129)，其由衔接子序列(加下划线部分)和ORF特异性序列组成；和引物2(反向引物)：5’-TTGCTCTTCGTCAATCTCTTCTTTTCTTCTTC-3’(SEQID NO：130)，其由衔接子序列(加下划线部分)和ORF特异性序列组成。衔接子序列允许将ORF克隆至含有Colic衔接子的多种载体中。

随后，构建了用于蛋白质非靶向表达的双元载体。在这种语境下，“非靶向”表达意指无额外的靶向序列添加至待表达的ORF。对于非靶向表达，用于克隆的双元载体是如图11中所示的pUBI。这种载体在T-DNA边界内部含有植物选择标记作为功能性元件。该载体还含有来自欧芹的遍在蛋白启动子用于组成型表达，优选地在绿色组织中的组成型表达。

为克隆SEQ ID NO：30，将载体DNA用限制性酶PacI和NcoI按照标准方案(MBI Fermentas)处理。在全部情况下，通过在70℃灭活20分钟终止反应并且将其在QIAq uick或NucleoSpin Extract II柱上，按照标准方案(Qiagen或Macherey-Nagel)纯化。

随后，代表带有相应衔接子序列的经扩增ORF的PCR产物和载体DNA用T4DNA聚合酶根据标准操作方案(MBI Fermentas)处理以产生单链突出端，用于载体的参数是：1单位T4DNA聚合酶在37℃持续2-10分钟，并且用于包含SEQ ID NO：30的PCR产物的参数是：1-2单位T4DNA聚合酶在15-17℃持续10-60分钟。通过添加高盐缓冲液终止反应并且将其在QIAquick或NucleoSpin Extract II柱上按照标准方案(Qiagen或Macherey-Nagel)纯化。

将大约30-60ng制备的载体和定义量的制备的扩增物混合并且在65℃杂交15分钟，随后0.1℃/1秒降至37℃，随后在37℃杂交10分钟，随后0.1℃/1秒降温，然后4-10℃。

通过以下方式在相同的反应容器中转化连接的构建体：添加感受态大肠杆菌细胞(菌株DH5α)并且在1℃孵育20分钟，随后在42℃热休克90秒并且冷却至1-4℃。随后，添加完全培养基(SOC)并且将混合物在37℃孵育45分钟。随后将整个混合物涂布到含有0.05mg/ml卡那霉素的琼脂平板上并且在37℃孵育过夜。

通过借助引物扩增验证克隆步骤的结果，其中所述引物在整合位点上有和下游结合，因此允许插入物的扩增。扩增如TaqDNA聚合酶的操作方案(Gibco-BRL)中所述那样实施。扩增循环如下：1个循环1-5分钟94℃；随后以下35个循环，每个循环中15-60秒94℃，15-60秒50-66℃和5-15分钟72℃；随后1循环10分钟72℃，然后4-16℃。

将一部分阳性菌落转移至填充了完全培养基(LB)的反应容器中并且在37℃孵育过夜，其中所述完全培养基补充有卡那霉素。

质粒制备如Qiaprep或NucleoSpin Multi-96Plus标准方案(Qiagen或Macherey-Nagel)中详述那样实施。

包含与BI-1基因融合的遍在蛋白启动子(含有内含子)的基因盒的序列由SEQ ID NO：154代表。

实施例20.2拟南芥转化

这个实施例显示表达SEQ ID NO：30的转基因植物的产生。

通过电穿孔或转化法将分离的质粒DNA 1-5ng转化至根癌农杆菌GV 3101pMP90菌株的感受态细胞中(Koncz和Schell，Mol.Gen.Gent.204，383(1986))。随后，添加完全培养基(YEP)并且将该混合物转移至一个新的反应容器在28℃持续3小时。随后，将全部混合物在补充有相应的抗生素例如利福平(0.1mg/ml)、庆大霉素(0.025mg/ml和卡那霉素(0.05mg/ml)的YEP琼脂平板上涂布并且在28℃孵育48小时。

随后将含有质粒构建体的农杆菌用于植物的转化。借助移液器吸头，从该琼脂平板挑取菌落并将其分散在3ml液体TB培养基中，所述培养基也含有如上所述的合适抗生素。该预培养物在28℃和120转/分钟培育48小时。

将400ml含有与上文相同的抗生素的LB培养基用于主培养物。将预培养物转移至主培养物中。主培养物在28℃和120转/分钟培育18小时。在4000转/分钟离心后，沉淀物重悬于渗入培养基(MS培养基，10％蔗糖))中。

为了培育用于转化的植物，将培养皿(Piki Saat 80，绿色，具备筛底，30x20x4.5cm，来自Wiesauplast，Kunststofftechnik，德国)以GS 90基质(标准土壤，Werkverband E.V.，德国)半充满。培养皿用0.05％Proplant溶液(Chimac-Apriphar，Belgium)浇灌过夜。拟南芥C24种子(诺丁汉拟南芥保藏中心，UK；NASC Stock N906)散播在培养皿上，每个培养皿大约1,000粒种子。培养皿用罩子覆盖并且置于层积催芽设施中(8小时，110μmol/m²s¹，22℃；16小时，黑暗，6℃)。在5日后，将培养皿置于短日照受控环境室(8小时，130μmol/m²s¹，22℃；16小时，黑暗，20℃)，在那里它们维持大约10日直至第一片真叶已经形成。

将幼苗移入含有相同基质的盆钵(Teku钵，7cm，LC系列，由

GmbH & Co制造，德国)。每个盆钵挑入5株植物。随后，将盆钵返回短日照受控环境室以便植物继续生长。

10日后，将植物转移至温室(补充性照明，16小时，340μE/m²s，22℃；8小时，黑暗，20℃)，在那里允许这些植物生长另外17日。

为了转化，将刚开始开花的6周龄拟南芥植物浸入已经事先用10μlSilwett L77(Crompton S.A.，Osi Specialties，Switzerland)处理过的上述农杆菌悬液中10秒。所讨论的方法由Clough J.C.和Bent A.F.(Plant J.16，735(1998))描述。

随后将植物置于湿室中18小时。此后，将盆钵返回温室以便植物继续生长。植物在温室中停留另外10周，直至准备收获种子。根据用于选择转化植物的耐受性标记，将收获的种子在温室中种植并且进行喷洒选择，或首先进行消毒并且随后在补充有相应选择剂的琼脂平板上培育。由于载体含有bar基因作为耐受性标记，故而用0.02％

以2至3日间隔喷洒小植物4次并且允许转化的植物结种。将转基因拟南芥植物的种子贮存于冰箱中(在-20℃)。

实施例20.3用于氮供应量受限条件下的植物筛选

每个转基因的构建体测试4-7个独立的转基因系(＝事件)(每种构建体21-28株植物)。在含有养分耗尽土壤(“Einheitserde Typ 0”，30％粘土，Tantau，Wansdorf德国)、砂和蛭石的1∶0.45∶0.45(v∶v∶v)混合物的盆钵中播种拟南芥种子。根据每批次养分耗尽土壤的氮含量，将除氮之外的大分子养分添加至土壤混合物以在预施肥的土壤中获得与充分施肥的土壤可比较的养分。与充分施肥的土壤相比，添加氮至约15％的含量。在表G中表述大分子养分在充分施肥的土壤和氮耗尽土壤中的中位数浓度。

表G.

通过在4℃于黑暗下的4日时间诱导萌发。将植物在标准生长条件下(光周期：16小时光照和8小时黑夜，20℃，60％相对湿度和200μE光子流密度)。将植物培育和培养，尤其每2日用去离子水对它们浇水。在9至10日后，将植物分成单株。在总时间28至31日后，收获植物并且按照植物的地上部分的鲜重分级。将生物量增加测量为相应转基因植物与非转基因野生型植物的空中部分(地上部分)的鲜重比率。

通过对植物莲座丛称重，测量在氮供应量受限条件下培育的转基因拟南芥的生物量生产。将生物量增加计算为转基因植物的平均重量与来自相同实验的野生型对照植物平均重量相比较的比率。转基因构建体的平均生物量增加是1.57(显著性值＜0.3和生物量增加＞5％(比率＞1.05))，这表明与对照植物相比，生物量存在57％的增加。

实施例21：鉴定与SEQ ID NO：155和SEQ ID NO：156相关的序列

使用数据库序列搜索工具，如基本局部比对工具(BLAST)(Altschul等人(1990)J.Mol.Biol.215：403-410；和Altschul等人(1997)Nucleic AcidsRes.25：3389-3402)，在其他序列当中并且大多在国家生物技术信息中心(NCBI)的Entrez核苷酸数据库中维护的那些序列中鉴定了与SEQ ID NO：155和SEQ ID NO：156相关的(全长cDNA、EST或基因组)序列。该程序用来通过将核酸序列或多肽序列与序列数据库比较并且计算匹配的统计显著性来找到序列之间的局部相似区域。例如，将SEQ ID NO：155的核酸编码的多肽用于TBLASTN算法中，采用默认设置和过滤程序以忽略低复杂性序列抵消。该分析的输出结果通过逐对比较进行检验，并根据概率评分(E-值)评级，其中所述的评分反映特定比对结果偶然发生的概率(E-值越低，命中的显著性越高)。除E-值外，比较也可以由同一性百分数评定。同一性百分数指所比较的两个核酸(或多肽)序列之间在特定长度范围内的相同核苷酸(或氨基酸)的数目。在一些情况下，可以调整默认参数以调节搜索的严格性。例如，可以增加E-值以显示较不严格的匹配。以这种方式，可以鉴定到几乎精确的短匹配。

表H提供一系列与SEQ ID NO：155和SEQ ID NO：156相关的核酸序列。

表H：SEC22核酸和多肽的实例：

序列已经由研究机构如基因组研究所(TIGR；始于TA)初步地组装并且公开披露。真核生物基因直向同源物(EGO)数据库可以用来通过关键词检索或通过使用BLAST算法以目的核酸序列或多肽序列鉴定此类相关序列。已经为特定生物创建了专有核酸序列数据库，如由联合基因组研究所(Joint Genome Institute)创建。另外，登录专利数据库已经允许鉴定新的核酸序列和多肽序列。

实施例22：SEC22多肽序列的比对

在标准设置(缓慢比对，相似性矩阵：Blosum 62(可以备选地使用Gonnet)，空位开口罚分：10，空位延伸罚分：0.2)下，使用累进比对ClustalW2.0算法(Thompson等人(1997)Nucleic Acids Res 25：4876-4882；Chenna等人(2003).Nucleic Acids Res 31：3497-3500)进行多肽序列的比对。进行少许手工编辑以进一步优化该比对。在图12中比对SEC22多肽。

从Uemura等人2004复制SEC22多肽的进化系统树，带有少量修改。备选地，可以使用如Vector NTI(Invitrogen)的AlignX程序中所提供的邻接法聚类算法。

实施例23：计算多肽序列之间的总体同一性百分数

使用现有技术领域可获得的方法之一，即MatGAT(矩阵总体比对工具)软件(BMC Bioinformatics.20034：29.MatGAT：an application thatgenerates similarity/identity matrices using protein or DNAsequences(MatGAT：使用蛋白质序列或DNA序列产生相似性/同一性矩阵的一项应用)，Campanella JJ，Bitincka L，Smalley J；该软件由LedionBitincka维护)，确定在实施本发明方法中有用的全长多肽序列之间的总体相似性和同一性百分数。MatGAT软件产生DNA序列或蛋白质序列的相似性/同一性矩阵，无需数据的预先比对。该程序使用Myers和Miller总体比对算法(空位开口罚分12和空位延伸罚分2)执行一系列配对比对，使用例如Blosum 62(用于多肽)计算相似性和同一性，并且随后将结果置于距离矩阵中。

用于这个比较中的参数是：评分矩阵：Blosum62，第一空位：12，延伸空位：2.

实施例24：鉴定在实施本发明方法中有用的多肽序列中所包含的结构域

蛋白质家族、结构域和位点的集成资源(InterPro)数据库是针对基于文本及基于序列的搜索法的常用特征标识数据库的集成界面。InterPro数据库合并了这些数据库，所述数据库使用不同的方法学及有关充分表征的蛋白质的程度各异的生物学信息以获得蛋白质特征标识(proteinsignatures)。合作数据库包括SWISS-PROT、PROSITE、TrEMBL、PRINTS、ProDom和Pfam、Smart和TIGRFAM。Pfam是覆盖众多常见蛋白质结构域和家族的多重序列比对结果和隐匿马尔科夫模型(HMM)的庞大集合。Pfam在英国Sanger研究所服务器上维护。Interpro在英国欧洲生物信息学研究所维护。使用wuery SEC22多肽的多肽序列，在PFam中执行检索。借助InterProScan工具查询INTERPRO数据库。在SEC22多肽中检测到长蛋白和/或小突触泡蛋白结构域。

实施例25：SEC22多肽序列的拓扑结构预测

TargetP 1.1预测真核蛋白的亚细胞定位。基于任何N端前序列：叶绿体转运肽(cTP)、线粒体靶向肽(mTP)或分泌途径信号肽(SP)的预测存在进行定位指派。作为最终预测基础的评分并不真正是概率，并且它们不是必须相加在一起。然而，根据TargetP，具有最高评分的定位是最可能的，并且评分之间的关系(可靠性级别)可以指示该预测具有多大确定性。可靠性级别(RC)范围从1至5，其中1表示最可靠的预测。在丹麦技术大学(Technical University of Denmark)的服务器上维护TargetP。

对于预测含有N端前序列的序列而言，也可以预测潜在的切割位点。

备选地，众多的其他算法可以用来执行此类分析，它们包括：

·在丹麦技术大学服务器上维护的ChloroP 1.1；

·在澳大利亚布里斯班昆士兰大学分子生物科学研究所的服务器上维护的Protein Prowler亚细胞定位预测者1.2版；

·在加拿大阿伯特省埃德蒙顿市阿尔伯塔大学的服务器上维护的PENCE蛋白组分析专家PA-GOSUB 2.5；

·在丹麦技术大学服务器上维护的TMHMM。

·PSORT(URL：psort.org)

·PLOC(Park和Kanehisa，Bioinformatics，19，1656-1663，2003)。

实施例26：克隆编码SEC22的核酸序列

使用定制的番茄幼苗cDNA文库(在pCMV Sport 6.0中；Invitrogen，Paisley，UK)作为模板，通过PCR扩增核酸序列。使用在50μl PCR混合物中的200ng模板，在标准条件下使用Hifi Taq DNA聚合酶进行PCR。所用的引物是如SEQ ID NO：225(有义)和SEQ ID NO：226(反义，互补)所代表那样，它们包含用于Gateway重组的AttB位点。还使用标准方法纯化扩增的PCR片段。随后进行Gateway方法的第一步骤，即BP反应，在此期间PCR片段与pDONR201质粒在体内重组以产生根据Gateway术语学的“进入克隆”，pSEC22。作为

技术的部分，质粒pDONR201从Invitrogen购买。

在使用编码SEQ ID NO：157的核酸的第二实验中，使用定制的稻籽苗cDNA文库作为模板，通过PCR扩增这种核酸序列。如上文所述，还使用Hifi Taq聚合酶进行PCR。为了克隆编码SEQ ID NO：157的核酸，使用如SEQ ID NO：227和228所代表的引物。

包含SEQ ID NO：155的进入克隆随后在LR反应中与用于稻转化的目的载体一起使用。这种载体在T-DNA边界内部含有以下作为功能性元件：植物选择标记、筛选标记表达盒和意在与已经克隆于这个进入克隆中的目的核酸序列发生LR体内重组的Gateway盒。用于组成型特异性表达的稻GOS2启动子(SEQ ID NO：224)位于这个Gateway盒上游。

在LR重组步骤后，将所得的表达载体pGOS2：SEC22(图157)根据本领域熟知的方法转化至农杆菌菌株LBA4044内。为构建包含SEQ ID NO：157的表达载体，进行相似的LR反应以产生PGOS2::SEQIDNO：157。

实施例27：植物转化

稻转化

含有表达载体的农杆菌用来转化稻植物。将粳稻栽培品种Nipponbare的成熟干燥种子脱壳。通过在70％乙醇中孵育1分钟，随后在0.2％HgCl2中孵育30分钟，随后用无菌蒸馏水洗涤6次15分钟而实施消毒。消毒的种子随后在含有2，4-D的培养基(愈伤组织诱导培养基)上萌发。在黑暗中孵育4周后，将盾片衍生的胚发生性愈伤组织切下并在同一种培养基上增殖。2周后，将愈伤组织通过在同一种培养基上传代培养另外2周进行繁殖或增殖。胚发生性愈伤组织片在新鲜培养基上传代培养3日，之后共培育(以增强细胞分裂活性)。

将含有所述表达载体的农杆菌菌株LBA4404用于共培育。将农杆菌接种在含有适宜抗生素的AB培养基上并在28℃培养3日。随后将细菌收集并且在液体共培育培养基中悬浮至密度(OD₆₀₀)约1。随后将混悬液转移至培养皿内，并且将愈伤组织浸入混悬液中15分钟。将愈伤组织随后在滤纸上吸干并转移至固化的共培育培养基上并且在黑暗中于25℃孵育3日。共培育的愈伤组织在黑暗于28℃下在选择剂存在下于含2，4-D的培养基上培育4周。在此时段期间，形成迅速生长的抗性愈伤组织岛。在这种材料转移至再生培养基并在光照下孵育后，胚发生潜能释放并且幼苗在随后4至5周内发育。将苗从愈伤组织切下并且在含有植物生长素的培养基上孵育2至3周，其中将苗从所述培养基转移至土壤。硬化的苗在温室中在高湿度和短日照下培育。

对于一个构建体，产生大约35个独立的T0稻转化体。将原代转化体从组织培养箱转移至温室。在定量PCR分析以验证T-DNA插入物的拷贝数后，仅保留对选择剂表现耐受性的单拷贝转基因植物用于收获T1种子。种子随后在移植后3至5个月收获。该方法以超过50％的比例产生单基因座转化体(Aldemita和Hodges 1996，Chan等人，1993，Hiei等人，1994)。

实施例28：其他作物的转化

谷物转化

玉米(Zea mays)的转化根据对Ishida等人，(1996)，Nature Biotech14(6)：745-50)所述方法的修改形式进行。在谷物中，转化是基因型依赖的并且仅特定基因型可操作用于转化和再生。近交系A188(明尼苏达大学)或以A188作为亲本的杂种是用于转化的供体材料的良好来源，不过其他基因型也可以成功地使用。谷穗从授粉后大约11日(DAP)的谷物植物收获，此时不成熟的胚的长度是大约1至1.2mm。将不成熟的胚与含有表达载体的根癌农杆菌共培育，并且通过器官发生回收转基因植物。将切下的胚在愈伤组织诱导培养基上、随后在玉米再生培养基上培育，其中所述的再生培养基含有选择剂(例如咪唑啉酮，但可以使用多种选择标记)。培养平板在25℃于光照下培养2-3周，或直至苗发育。将绿色苗从每个胚转移至玉米生根培养基并在25℃培养2-3周，直至根发育。将生根的苗移栽至温室中的土壤。从表现选择剂耐受性并且含有单拷贝T-DNA插入物的植物中产生T1种子。

小麦转化

小麦的转化用Ishida等人(1996)Nature Biotech 14(6)：745-50描述的方法进行。通常在转化中使用(从墨西哥CIMMYT可获得的)栽培品种Bobwhite。将不成熟的胚与含有所述表达载体的根癌农杆菌共培育，并且通过器官发生过程回收转基因植物。与农杆菌温育后，将胚在愈伤组织诱导培养基上、随后在再生培养基上体外培育，其中所述的再生培养基含有选择剂(例如咪唑啉酮，但可以使用多种选择标记)。培养平板在25℃于光照下培养2-3周，或直至苗发育。将绿色苗从每个胚转移至生根培养基并在25℃培养2-3周，直至根发育。将生根的苗移栽至温室中的土壤。从表现选择剂耐受性并且含有单拷贝T-DNA插入物的植物中产生T1种子。

大豆转化

根据Texas A&M美国专利5,164,310中描述的改良方法转化大豆。几个商业大豆品种对于通过这种方法的转化是可行的。栽培品种Jack(从Illinois种子基金会可获得)通常用于转化。对大豆种子消毒以便体外播种。从7日龄幼苗中切下下胚轴、胚根和一片子叶。进一步培育上胚轴和余下的子叶以发育腋生结节。将这些腋生结节切下并与含有表达载体的根癌农杆菌孵育。在共培育处理之后，将外植体洗涤并转移至选择培养基。将再生的苗切下并置于苗伸长培养基上。将长度不超过1cm的苗置于生根培养基上直至根发育。将生根的苗移栽至温室中的土壤。从表现选择剂耐受性并且含有单拷贝T-DNA插入物的植物中产生T1种子。

油籽油菜/卡诺拉油菜转化

使用5-6日龄年幼幼苗的子叶柄和下胚轴作为组织培养用外植体并且根据Babic等人(1998，Plant Cell Rep 17：183-188)进行转化。商业栽培品种Westar(Agriculture Canada)是用于转化的标准品种，不过也可以使用其他品种。对卡诺拉油菜种子作表面消毒以便体外播种。从体外幼苗中切下具有附着子叶的子叶柄外植体，并以(含有表达载体的)农杆菌通过叶柄外植体的切口端浸入细菌混悬液而接种。外植体随后在23℃，16小时光照下于含有3mg/l BAP、3％蔗糖、0.7％植物琼脂的MSBAP-3培养基上培养2日。与农杆菌共培育2日后，将所述叶柄外植体转移至含有3mg/lBAP、头孢噻肟、羧苄青霉素或特美汀(300mg/l)的MSBAP-3培养基上培养7日，并且随后在含有头孢噻肟、羧苄青霉素或特美汀和选择剂的MSBAP-3培养基上培养，直至苗再生。当苗具有5-10mm长度时，将苗切下并且转移至苗伸长培养基(含0.5mg/l BAP的MSBAP-0.5)。将长度大约2cm的苗转移至用于根诱导的生根培养基(MS0)。将生根的苗移栽至温室中的土壤。从表现选择剂耐受性并且含有单拷贝T-DNA插入物的植物中产生T1种子。

苜蓿转化

使用(McKersie等，1999Plant Physiol 119：839-847)的方法转化苜蓿的再生性克隆。苜蓿的再生和转化是基因型依赖性的并且因而需要再生性植物。已经描述了获得再生性植物的方法。例如，这些再生性植物可以选自栽培品种Rangelander(Agriculture Canada)或如Brown DCW与AAtanassov(1985.Plant Cell Tissue Culture 4：111-112)描述的任何其它商业苜蓿品种。备选地，已经选择RA3品种(威斯康星大学)用于组织培养(Walker等人，1978Am J Bot 65：654-659)。将叶柄外植体与含有表达载体的根癌农杆菌C58C1 pMP90(McKersie等人，1999Plant Physiol119：839-847)或LBA4404的过夜培养物共培育。外植体在黑暗下于含有288mg/L Pro、53mg/L硫代脯氨酸、4.35g/L K2SO4和100μm乙酰丁香酮的SH诱导培养基上共培育3日。将外植体在半浓度的Murashige-Skoog培养基(Murashige和Skoog，1962)中洗涤并且铺种在不含乙酰丁香酮而含有抑制农杆菌生长的合适选择剂和合适抗生素的相同SH诱导培养基上。几周后，将体细胞胚转移至不含生长调节剂、不含抗生素和含有50g/L蔗糖的BOi2Y发育培养基。体细胞胚随后在半浓度的Murashige-Skoog培养基上萌发。将生根的幼苗移植入盆钵并且在温室中培育。从表现选择剂耐受性并且含有单拷贝T-DNA插入物的植物中产生T1种子。

棉花转化

使用根癌农杆菌，根据US 5,159,135中所述的方法转化棉花。将棉花种子在3％次氯酸钠溶液中表面消毒20分钟并且在含500μg/ml头孢噻肟的蒸馏水中洗涤。将种子随后转移至含有50μg/ml苯菌灵的SH培养基用于萌发。将4至6日龄幼苗的下胚轴取下，切成0.5cm小片并且置于0.8％琼脂上。农杆菌悬液(每毫升大约108个细胞，从含有用目的基因和合适选择标记转化的过夜培养物中稀释)用于接种下胚轴外植体。在室温和光照下3日后，将组织转移至固体培养基(1.6g/l脱乙酰吉兰糖胶)，所述固体培养基含有带维生素B5的Murashige和Skoog盐(Gamborg等人，Exp.Cell Res.50：151-158(1968))、0.1mg/l 2，4-D、0.1mg/l 6-呋喃甲基氨基嘌呤和750μg/ml MgCL2以及杀死残余细菌的50至100μg/ml头孢噻肟和400-500μg/ml羧苄青霉素。各个细胞系在2至3个月(每隔4至6周传代培养)后分离并且在用于组织增殖的选择培养基上进一步培育(30℃，16小时光周期)。将转化的组织随后在非选择培养基上进一步培育持续2至3个月以产生体细胞胚。将至少4mm长度的外观健康胚转移至含有细蛭石中SH培养基的管中，所述SH培养基补充有0.1mg/l吲哚乙酸、6-呋喃甲基氨基嘌嘌呤和赤霉酸。在30℃以16小时光周期培育胚，并且将处于2至3叶期的小植物转移至具有蛭石和养分的盆钵。使植物硬化并随后移至温室以进一步培育。

实施例29：表型评价方法

29.1评价设置

产生大约35个独立的T0稻转化体。将原代转化体从组织培养室转移至温室以培育并且收获T1种子。留下其中T1子代以3∶1比例对转基因的存在/不存在发生分离的事件。对于这些事件中的每一个，通过监测目视标记表达选出大约10株含有该转基因的T1籽苗(杂合子和纯合子)和大约10株缺少该转基因的T1籽苗(失效合子)。以随机位置并排培育转基因植物和相应的失效合子。温室条件是短日照(12小时光照)，光照下28℃和黑暗下22℃，和70％相对湿度。在非胁迫条件下培育的植物以规律的间隔期浇水，以确保水和养分不是限制性的并且确保满足植物需要以完成生长和发育。

T1事件在T2世代中按照如对T1世代相同的评价方法进一步评估，但是每个事件采用更多个体。使植物从播种期至成熟期数次通过数字成像室。在每个时间点上，从至少6个不同角度拍摄每株植物的数字图像(2048x1536像素，1600万颜色)。

干旱筛选

在盆栽土壤中在正常条件下培育来自T1种子的植物直至它们达到抽穗期。随后将它们转移至不予灌溉的“干燥”地段。将湿度探针插入随机选择的盆钵内，以监测土壤含水量(SWC)。当SWC下降低于某个阈值时，自动对所述植物连续再浇水直至再次达到正常水平。随后将植物再转移至正常条件。栽培过程的剩余部分(植物成熟、种子收获)与不在非生物胁迫条件下培育的植物相同。如正常条件下生长所详述那样，记录生长和产量参数。

氮使用效率筛选

在除营养液之外的正常条件下在盆栽土壤中培育来自T2种子的稻植物。从移植至成熟期间用含有降低的、通常7至8倍之间更少的氮(N)含量的特定营养液浇灌盆钵。栽培过程的剩余部分(植物成熟、种子收获)与不在非生物胁迫下培育的植物相同。如正常条件下生长所详述那样，记录生长和产量参数。

盐胁迫筛选

植物在椰子纤维和Argex(3∶1比率)组成的基质上培育。在温室中移植小植物后，在头两周期间使用正常营养液。在头两周后，添加25mM盐(NaCl)至所述营养液，直至收获植物。随后测量种子相关参数。

29.2统计分析：F-检验

使用两因素ANOVA(方差分析)作为总体评价植物表型特征的统计模型。对用本发明基因转化的全部事件的全部植物的全部所测量参数实施F检验。实施F检验以检查该基因对全部转化事件的影响并验证该基因的整体作用(又称作总体基因作用)。对于F检验而言，真实总体基因作用的显著性的阈值设在5％概率水平上。显著性F检验值指出基因作用，这意味不仅是仅基因的存在或位置才造成表型上的差异。

因为实施带有重叠事件的两个实验用于氮利用效率筛选，故进行联合分析。这用于对这两个实验检验所述作用的一致性，并且如果一致，则用于从两个实验积累证据以提高结论的置信度。所用的方法是考虑数据的多水平结构的混合模型法(即，实验-事件-分离子)。通过比较似然比检验与卡方分布(chi square distribution)获得P-值。

29.3测量的参数

生物量相关的参数测量

使植物从播种期至成熟期数次通过数字成像室。在每个时间点上，从至少6个不同角度拍摄每株植物的数字图像(2048x1536像素，1600万颜色)。

植物地上面积(或叶生物量)通过计数来自植物地上部分的数字图像上与背景区别的像素总数而确定。这个值对相同时间点上从不同角度拍摄的画面进行平均化并且通过校正过程换算成以平方mm表述的物理表面值(physical surface value)。实验显示以这种方式测量的地上部分植物面积与地上植物部分的生物量相关。地上部分面积是在植物已经实现其最大叶生物量的时间点上所测量的面积。早期生长势是萌发后3周的植物(幼苗)地上部分面积。根生物量的增加表述为根总生物量增加(度量为在植物生命期间观察到的最大根生物量)；或表述为根/苗指数增加(度量为根和苗的活跃生长时期中根质量与苗质量之间的比例)。

通过计数来自植物部分中与背景区别的像素总数确定早期生长势。这个值对相同时间点上从不同角度拍摄的画面进行平均化并且通过校正过程换算成以平方mm表述的物理表面值(physical surface value)。下述结果针对萌发后3周的植物。

种子相关的参数测量值

将成熟的原发花序收获、计数、装袋、加条形码标记并且随后在干燥箱内于37℃干燥3日。随后将花序脱粒，并且收集和计数全部种子。使用鼓风装置，将充实粒与空粒分开。弃去空粒并且再次计数剩余部分。充实粒在分析天平上称重。通过计数分离步骤后仍留下的充实粒数目确定充实种子数。通过称量从一株植物收获的全部充实粒测量种子总产量。通过计数从一株植物收获的籽粒数测得每株植物的种子总数。从计数的充实种子数及它们的总重量外推出千粒重(TKW)。本发明中的收获指数(HI)定义为种子总产量与地上部分面积(mm²)之间的比率，乘以系数10⁶。如本发明中定义的每花序总花数是种子总数与成熟原发花序数目之间的比率。如本发明中定义的种子充实率是充实种子数对种子(或小花)总数的比例(表述为％)。

实施例30：转基因植物的表型评价结果

下文呈现在先前实施例的干旱胁迫条件下转基因稻植物的评价结果，所述的转基因稻植物处于T1世代并且表达包含SEQ ID NO：155中最长可读框的核酸。关于产生所述转基因植物的细节，见前述实施例。

下文呈现在干旱条件下转基因稻植物的评价结果。观察到种子总产量(totalwgseeds)、充实种子数(nrfilledseed)、充实率(fillrate)和收获指数(harvestindex)增加至少5％。

下文呈现在先前实施例的氮减少条件下转基因稻植物的评价结果，所述的转基因稻植物处于T1和T2世代并且表达包含SEQ ID NO：157中最长可读框的核酸。关于产生所述转基因植物的细节，见前述实施例。

下文呈现在氮减少条件下处于T1世代的转基因稻植物的评价结果。观察到植物寿命期中由叶生物量覆盖的面积最大值(AreaMax)、种子总产量(totalwgseeds)、充实种子数(nrfilledseed)、充实率(fillrate)、开花前绿度(GNBfFlow)和植物叶生物量的重心高度(GravityYMax)增加至少5％。

下文呈现在氮减少条件下处于T2世代的转基因稻植物的评价结果。观察到种子总产量(totalwgseeds)、每个花序的小花数(flowerperpan)、充实率(fillrate)和充实种子数(nrfilledseed)增加至少5％。

Claims (65)

1.用于相对于对照植物增强植物中产量相关性状的方法，所述方法包括调节植物中编码包含SEQ ID NO：23(基序1)的2型CLE多肽的核酸的表达。

2.根据权利要求1所述的方法，其中基序是R(R/L/F/V)SPGGP(D/N)P(Q/R)HH(SEQ ID NO：24)。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述受调节的表达通过在植物中导入并且表达编码2型CLE多肽的核酸实现。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述编码2型CLE多肽的核酸编码在表A中所列的任一种蛋白质或是这种核酸的一部分或是能够与该核酸杂交的核酸。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述的核酸序列编码在表A中给出的任一蛋白质的直向同源物或旁系同源物。

6.根据前面任一权利要求所述的方法，其中所述增强的产量相关性状包括相对于对照植物增加的产量、优选地增加的生物量和/或增加的种子产量。

7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述增强的产量相关性状在缺氮的条件下获得。

8.根据权利要求3至7任一项所述的方法，其中所述核酸与组成型启动子、优选地与GOS2启动子、最优选地与来自稻的GOS2启动子有效连接。

9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中所述编码2型CLE多肽的核酸是植物来源的，优选地来自双子叶植物，进一步优选地来自十字花科(Brassicaceae)，更优选地来自拟南芥属(Arabidopsis)，最优选地来自拟南芥(Arabidopsis thaliana)。

10.通过根据权利要求1至9任一项所述的方法可获得的植物或其部分，包括种子，其中所述的植物或其部分包含编码2型CLE多肽的重组核酸。

11.构建体，其包含：

(i)编码权利要求1或2中所定义的2型CLE多肽的核酸；

(ii)能够驱动(a)的核酸序列表达的一个或多个控制序列；和任选地

(iii)转录终止序列。

12.根据权利要求11所述的构建体，其中所述控制序列之一是组成型启动子，优选地是GOS2启动子，最优选地是来自稻的GOS2启动子。

13.根据权利要求11或12所述的构建体在用于制备植物的方法中的用途，所述植物相对于对照植物具有增加的产量，尤其增加的生物量和/或增加的种子产量。

14.用根据权利要求11或12所述的构建体转化的植物、植物部分或植物细胞。

15.用于产生转基因植物的方法，所述转基因植物相对于对照植物具有增加的产量、尤其增加的生物量和/或增加的种子产量，所述方法包括：

(i)在植物中导入并且表达编码权利要求1或2中所定义的2型CLE多肽的核酸；和

(ii)在促进植物生长和发育的条件下培育植物细胞。

16.转基因植物，其因编码权利要求1或2中定义的2型CLE多肽的核酸的受调节表达而相对于对照植物具有增加的产量、尤其增加的生物量和/或增加的种子产量，或源自所述转基因植物的转基因植物细胞。

17.根据权利要求10、14或16所述的转基因植物或源自其的转基因植物细胞，其中所述植物是作物植物，如甜菜或糖甜菜，或单子叶植物或谷物，如稻、玉米、小麦、大麦、粟、黑麦、黑小麦、高粱、二粒小麦、斯卑尔脱小麦、黑麦草、单粒小麦、埃塞俄比亚画眉草、蜀黍和燕麦。

18.根据权利要求17所述的植物的可收获部分，其中所述的可收获部分优选地是苗生物量、根生物量和/或种子。

19.产物，源自根据权利要求17的植物和/或源自根据权利要求19的植物的可收获部分。

20.编码2型CLE多肽的核酸在植物中相对于对照植物增加产量、尤其增加种子产量、苗生物量和/或根生物量的用途。

21.用于相对于对照植物增强植物中产量相关性状的方法，所述方法包括调节植物中编码Bax抑制物-1(BI-1)多肽的核酸的表达，其中所述Bax抑制物-1多肽包含Bax抑制物相关结构域(PF 01027)。

22.根据权利要求21的方法，其中所述受调节的表达通过在植物中导入和表达编码所述Bax抑制物-1多肽的所述核酸实施。

23.根据权利要求21或22所述的方法，其中所述增强的产量相关性状相对于对照植物包括增加的产量，并且相对于对照植物优选地包括增加的种子产量和/或增加的生物量。

24.根据权利要求21至23中任一项所述的方法，其中所述增强的产量相关性状在非胁迫条件下获得。

25.根据权利要求21至23中任一项所述的方法，其中所述增强的产量相关性状在渗透胁迫或缺氮的条件下获得。

26.根据权利要求21至25中任一项所述的方法，其中所述Bax抑制物-1多肽包含一个或多个以下基序：

(i)基序3a：[DN]TQxxxE[KR][AC]xxGxxDY[VIL]xx[STA](SEQ IDNO：131)，

(ii)基序4a：xxxxxISPx[VS]xx[HYR][LI][QRK]x[VFN][YN]xx[LT](SEQ ID NO：133)，

(iii)基序5a：FxxFxxAxxxxxRRxx[LMF][YF][LH]x(SEQ ID NO：135)。

27.根据权利要求26所述的方法，其中所述Bax抑制物-1多肽额外地包含一个或多个以下基序：

i)基序6a：DTQxI[VI]E[KR]AHxGDxDYVKHx(SEQ ID NO：137)；

ii)基序7a：x[QE]ISPxVQxHLK[QK]VY[FL]xLC[FC](SEQ ID NO：139)；

iii)基序8a：F[AG]CF[SP][AG]AA[ML][VL][AG]RRREYLYL[AG]G(SEQ ID NO：141)；

iv)基序9：[IF]E[VL]Y[FL]GLL[VL]F[VM]GY[VIM][IV][VYF](SEQID NO：143)；

v)基序10：[MFL][LV]SSG[VLI]SxLxW[LV[[HQ][FL]ASxIFGG(SEQID NO：144)；

vi)基序11：H[ILV][LIM][FLW][NH][VI]GG[FTL]LT[AVT]x[GA]xx[GA]xxxW[LM][LM](SEQ ID NO：145)；

Vii)基序12：Rx[AST][LI]L[ML][GAV]xx[LVF][FL][EKQ]GA[STY]IGPL[IV](SEQ ID NO：146)。

28.根据权利要求26所述的方法，其中所述Bax抑制物-1多肽额外地包含一个或多个以下基序：

i)基序13a：DTQx[IVM][IV]E[KR][AC]xxGxxDxx[KRQ]Hx(SEQ IDNO：147)；

ii)基序14：E[LVT]Y[GLF]GLx[VLI][VF]xGY[MVI][LVI]x(SEQ IDNO：149)；

iii)基序15：KN[FL]RQISPAVQ[SN]HLK[RL]VYLT(SEQ ID NO：150)；

iv)基序16a：Fx[CS]F[ST]xA[AS]xx[AS]xRR[ESH][YFW]x[FY][LH][GS][GA]xL(SEQ ID NO：151)。

29.根据权利要求21至28中任一项的方法，其中所述编码Bax抑制物-1多肽的核酸是植物来源的。

30.根据权利要求21至29中任一项的方法，其中所述编码Bax抑制物-1多肽的核酸编码在表C中所列的任一种多肽或是这种核酸的一部分或是能够与这种核酸杂交的核酸。

31.根据权利要求21至30中任一项所述的方法，其中所述核酸序列编码在表C中给出的任一多肽的直向同源物或旁系同源物。

32.根据权利要求21至31中任一项的方法，其中所述编码Bax抑制物-1多肽的核酸对应于SEQ ID NO：30。

33.根据权利要求21至32中任一项所述的方法，其中所述的核酸与组成型启动子、优选地与中等强度组成型启动子、优选地与植物启动子、更优选地与GOS2启动子、最优选地与来自稻的GOS2启动子有效连接。

34.通过根据权利要求21至33中任一项所述的方法可获得的植物、其植物部分，包括种子、或植物细胞，其中所述植物、植物部分或植物细胞包含编码权利要求21和26至32中任一项所定义的Bax抑制物-1多肽的重组核酸。

35.构建体，其包含：

(i)编码权利要求21和26至32中任一项所定义的Bax抑制物-1多肽的核酸；

(ii)能够驱动(i)的核酸序列表达的一个或多个控制序列；和任选地

(iii)转录终止序列。

36.根据权利要求35所述的构建体，其中所述控制序列之一是组成型启动子，优选地是中等强度组成型启动子，优选地是植物启动子，更优选地是GOS2启动子，最优选地是来自稻的GOS2启动子。

37.根据权利要求35或36所述的构建体在用于制备植物的方法中的用途，所述植物具有增强的产量相关性状，优选地相对于对照植物具有增加的产量，并且更优选地相对于对照植物具有增加的种子产量和/或增加的生物量。

38.用根据权利要求35或36所述的构建体转化的植物、植物部分或植物细胞。

39.用于产生转基因植物的方法，所述转基因植物相对于对照植物具有增强的产量相关性状，优选地相对于对照植物具有增加的产量，并且更优选地相对于对照植物具有增加的种子产量和/或增加的生物量，所述方法包括：

(i)在植物细胞或植物中导入并且表达编码权利要求21和26至32中任一项所定义的Bax抑制物-1多肽的核酸；和

(ii)在促进植物生长和发育的条件下培育所述植物细胞或植物。

40.转基因植物，其因编码权利要求21和26至32中任一项所定义的Bax抑制物-1多肽的核酸的受调节表达而相对于对照植物具有增强的产量相关性状，优选地相对于对照植物具有增加的产量并且更优选地增加的种子产量和/或增加的生物量，或源自所述转基因植物的转基因植物细胞。

41.根据权利要求34、38或40所述的转基因植物或源自其的转基因植物细胞，其中所述植物是作物植物，如甜菜、糖甜菜或苜蓿，或单子叶植物如甘蔗；或谷类，如稻、玉米、小麦、大麦、粟、黑麦、黑小麦、高粱、二粒小麦、斯卑尔脱小麦、黑麦草、单粒小麦、埃塞俄比亚画眉草、蜀黍或燕麦。

42.根据权利要求41所述的植物的可收获部分，其中所述的可收获部分是种子。

43.产物，源自根据权利要求41的植物和/或源自根据权利要求42的植物的可收获部分。

44.编码权利要求21和26至32中任一项所定义的Bax抑制物-1多肽的核酸的用途，用于相对于对照植物增强植物中的产量相关性状，优选地用于增加产量，并且更优选地相对于对照植物用于增加植物中的种子产量和/或用于增加生物量。

45.用于相对于对照植物增强植物中产量相关性状的方法，所述方法包括调节植物中编码SEC22多肽的核酸的表达，其中所述的SEC22多肽包含长蛋白样结构域。

46.根据权利要求45所述的方法，其中所述长蛋白样结构域以增加的优选顺序与以下结构域具有至少25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性：

(i)SEQ ID NO：156中位于SEQ ID NO：156的氨基酸1和131之间的序列所代表的长蛋白样结构域(SEQ ID NO：221)；

(ii)SEQ ID NO：158中位于SEQ ID NO：158的氨基酸1和131之间的序列所代表的长蛋白样结构域(SEQ ID NO：222)。

47.根据权利要求45或46所述的方法，其中所述受调节的表达通过在植物中导入并且表达编码SEC22多肽的核酸实现。

48.根据权利要求45至47中任一项所述的方法，其中编码SEC22多肽的所述核酸编码在表H中所列的任一种蛋白质或是这种核酸的一部分或是能够与这种核酸杂交的核酸。

49.根据权利要求45至48任一项所述的方法，其中所述核酸序列编码在表H中给出的任一蛋白质的直向同源物或旁系同源物。

50.根据前面任一项权利要求所述的方法，其中所述的增强的产量相关性状包括相对于对照植物增加的种子产量、优选地增加的充实种子数。

51.根据权利要求45至50中任一项所述的方法，其中所述增强的产量相关性状在干旱胁迫下获得。

52.根据权利要求45至50中任一项所述的方法，其中所述增强的产量相关性状在非胁迫条件下或在胁迫如盐胁迫或缺氮的条件下获得。

53.根据权利要求47至52中任一项所述的方法，其中所述的核酸与组成型启动子、优选地与GOS2启动子、最优选地与来自稻的GOS2启动子有效连接。

54.根据权利要求45至53中任一项所述的方法，其中编码SEC22多肽的所述核酸是植物来源的，优选地来自双子叶植物，进一步优选地来自茄科(Solanaceae)，更优选地来自茄属(Solanum)，最优选地来自番茄(Solanum lycopersicum)。

55.通过根据权利要求45至54中任一项所述的方法可获得的植物或其部分，包括种子，其中所述的植物或其部分包含编码SEC22多肽的重组核酸。

56.构建体，其包含：

(i)编码权利要求45或46中所定义的SEC22多肽的核酸；

(ii)能够驱动(a)的核酸序列表达的一个或多个控制序列；和任选地

(iii)转录终止序列。

57.根据权利要求56所述的构建体，其中所述的控制序列之一是组成型启动子，优选地是GOS2启动子，最优选地是来自稻的GOS2启动子。

58.根据权利要求56或57所述的构建体在用于制备植物的方法中的用途，所述植物相对于对照植物具有增加的产量，尤其增加的生物量和/或增加的种子产量。

59.用根据权利要求56或57所述的构建体转化的植物、植物部分或植物细胞。

60.用于产生转基因植物的方法，所述转基因植物相对于对照植物具有增加的产量、尤其增加的生物量和/或增加的种子产量，所述方法包括：

(i)在植物中导入并且表达编码权利要求45或46中所定义的SEC22多肽的核酸；

(ii)在促进植物生长和发育的条件下培育植物细胞。

61.转基因植物，其因编码权利要求45或46中定义的SEC22多肽的核酸的受调节表达而相对于对照植物具有增加的产量、尤其增加的生物量和/或增加的种子产量，或源自所述转基因植物的转基因植物细胞。

62.根据权利要求55、59或61所述的转基因植物或源自其的转基因植物细胞，其中所述植物是作物植物或单子叶植物或谷物植物，如稻、玉米、小麦、大麦、粟、黑麦、黑小麦、高粱、二粒小麦、斯卑尔脱小麦、黑麦草、单粒小麦、埃塞俄比亚画眉草、蜀黍和燕麦。

63.根据权利要求62所述的植物的可收获部分，其中所述的可收获部分优选地是苗生物量和/或种子。

64.产物，源自根据权利要求62的植物和/或源自根据权利要求63的植物的可收获部分。

65.编码SEC22多肽的核酸在相对于对照植物增加植物中产量、尤其增加种子产量和/或苗生物量的用途。

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