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CN119256227A - 用于检测样品中泛素羧基末端水解酶l1和/或胶质纤维酸性蛋白的存在或测量其量的侧向流方法、测定和装置 - Google Patents

用于检测样品中泛素羧基末端水解酶l1和/或胶质纤维酸性蛋白的存在或测量其量的侧向流方法、测定和装置 Download PDF

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CN119256227A
CN119256227A CN202380028150.0A CN202380028150A CN119256227A CN 119256227 A CN119256227 A CN 119256227A CN 202380028150 A CN202380028150 A CN 202380028150A CN 119256227 A CN119256227 A CN 119256227A
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CN
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uch
gfap
antibody
sample
antibodies
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CN202380028150.0A
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J·贝克内尔
S·德特维勒
S·P·胡斯
B·麦奎斯顿
J·加里蒂
E·麦考密克
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Abbott Laboratories
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Abbott Laboratories
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Abstract

本公开涉及一种方法和装置，其用于对获自受试者的生物样品进行至少一种侧向流测定，以确定单独泛素羧基末端水解酶L1(UCH‑L1)的量或存在、或者UCH‑L1的量或存在和胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的量或存在。

Description

用于检测样品中泛素羧基末端水解酶L1和/或胶质纤维酸性 蛋白的存在或测量其量的侧向流方法、测定和装置
相关申请信息
本申请要求于2022年2月4日提交的美国申请号63/306,788、于2022年12月29日提交的美国申请号63/435,834和于2023年2月2日提交的美国申请号63/482,808的优先权，其各自内容都以引用的方式并入本文。
通过引用并入电子提交材料
计算机可读核苷酸/氨基酸序列表以引用的方式整体并入本文，其与本文同时提交并且识别如下：2023年2月2日创建的一个6,164字节的XML文件，名称为“40222_601_ST26.XML”。
技术领域
本公开涉及用于对获自受试者的生物样品进行至少一种侧向流测定以确定泛素羧基末端水解酶L1(UCH-L1)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的量或存在、或者UCH-L1的量或存在和GFAP的量或存在。
背景技术
仅在美国，每年发生超过500万的轻度创伤性脑损伤(TBI)。目前，没有可用于帮助患者评估的简单、客观、准确的测量。事实上，TBI的评价和诊断中的大多数是基于主观数据。遗憾的是，客观测量诸如头部CT和格拉斯哥昏迷量表(GCS)评分在评价轻度TBI方面并不十分全面或灵敏。此外，头部CT绝大部分时间都无法显示轻度TBI，价格昂贵，并且使患者暴露于不必要的辐射之下。另外，阴性头部CT也并不意味着患者已免于脑震荡；相反，它仅意指某些干预措施(诸如手术)是不能保证的。临床医生和患者需要客观、可靠的信息来准确评价这种病状，以促进适当的分类和恢复。迄今为止，仅有有限的数据可以用于针对使用UCH-L1和GFAP来在急症护理环境中帮助患者评估和管理。迄今为止，仅有有限的数据可以用于针对使用UCH-L1和GFAP来在急症护理环境中帮助患者评估和管理。
轻度TBI或脑震荡更难客观地检测，并且这对全球急救中心来说是一项日常挑战。脑震荡通常不会导致大体病理，诸如出血，并且在对脑的常规计算机断层摄影扫描中不会出现异常，但是会出现在几天到几周内以自发方式消退的快速发作的神经元功能障碍。大约15％的轻度TBI患者罹患持续的认知功能障碍。对于在现场、在急诊室和诊所中、在运动区中和在军事活动(例如，战斗)中检测和评估轻度TBI受害者而言存在尚未满足的需求。
目前用于评估脑损伤的严重程度的算法包括格拉斯哥昏迷量表评分和其他措施。这些措施有时可能足以关联急性严重程度，但对可能导致永久性缺陷的细微病理不够敏感。GCS和其他措施也无法区分损伤类型，并且可能不够充分。因此，进入临床试验被分组到单一GCS水平的患者可能具有严重程度和类型非常不同的损伤。因为结局也因此发生变化，所以不恰当的分类会破坏临床试验的完整性。损伤分类改进将能够在临床试验中更精确地描述TBI患者的疾病严重程度和类型。
另外，目前的脑损伤试验依赖于结局测量诸如扩展的格拉斯哥结局量表，其捕捉了全局现象，但未能评估结局的细微差异。需要灵敏的结局测量来确定患者从脑损伤恢复的情况，以测试治疗剂和预防药。
发明内容
在一个实施方案中，本公开涉及一种方法，其包括：
对获自受试者的生物样品进行至少一种侧向流测定以确定泛素羧基末端水解酶L1(UCH-L1)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的量或存在、或者UCH-L1的量或存在和GFAP的量或存在；以及
显示所述样品中UCH-L1、GFAP、或者UCH-L1和GFAP的量或存在。在上述方法的一些实施方案中，至少一种侧向流测定为侧向流装置的一部分。在上述方法的另外的实施方案中，侧向流装置包括(a)至少一个测试条；或(b)至少两个测试条。
在上述方法的一些实施方案中，(a)针对UCH-L1的侧向流测定包括结合UCH-L1上的表位的第一特异性结合配偶体和包含可检测标记的第二特异性结合配偶体；并且(b)针对GFAP的侧向流测定包括结合GFAP上的表位的第三特异性结合配偶体和包含可检测标记的第四特异性结合配偶体。在另外的实施方案中，第一特异性结合配偶体、第二特异性结合配偶体、第三特异性结合配偶体、第四特异性结合配偶体或其任何组合为抗体或其抗体片段。
在其他实施方案中，所述方法用于帮助诊断和评价已经遭受或可能已经遭受头部损伤的受试者。例如，在其他实施方案中，受试者被诊断为患有创伤性脑损伤。当受试者被诊断为患有创伤性脑损伤时，受试者可以被进一步诊断为患有轻度、中度、重度或中度至重度创伤性脑损伤。
在上述方法的另外的实施方案中，所述方法可以用于确定受试者是否应接受头部计算机断层(CT)扫描、磁共振成像(MRI)扫描、或者头部CT扫描和MRI扫描两者。
在另外的实施方案中，受试者为人类受试者(例如，成人受试者和/或儿科受试者)。
在上述方法的另外的实施方案中，生物样品为选自由以下组成的组的样品：全血样品、尿液样品、脑脊液样品、组织样品、体液样品、唾液样品、口咽样本和鼻咽样本。例如，在一些实施方案中，样品为全血样品。在其他实施方案中，样品为血浆样品。在另外的实施方案中，样品为血清样品。在另外的实施方案中，样品为唾液样品。在另外的实施方案中，样品为尿液样品。在其他实施方案中，样品为口咽样品。在其他实施方案中，样品为全血样品，并且受试者为人类受试者(例如，成人和/或儿科受试者)。在其他实施方案中，样品为血浆样品，并且受试者为人类受试者(例如，成人和/或儿科受试者)。在另外的实施方案中，样品为血清样品，并且受试者为人类受试者(例如，成人和/或儿科受试者)。在另外的实施方案中，样品为唾液样品，并且受试者为人类受试者(例如，成人和/或儿科受试者)。在另外的实施方案中，样品为尿液样品，并且受试者为人类受试者(例如，成人和/或儿科受试者)。在其他实施方案中，样品为口咽样品，并且受试者为人类受试者(例如，成人和/或儿科受试者)。
在上述方法的另外的实施方案中，至少一种针对GFAP的侧向流测定、至少一种针对UCH-L1的侧向流测定、或者至少一种针对GFAP的侧向流测定和至少一种针对UCH-L1的侧向流测定各自在或能够在小于约30分钟、小于约25分钟、小于约20分钟、小于约18分钟或小于约15分钟内进行。在上述方法的另外的实施方案中，至少一种针对GFAP的侧向流测定、至少一种针对UCH-L1的侧向流测定、或者至少一种针对GFAP的侧向流测定和至少一种针对UCH-L1的侧向流测定各自在或能够在范围为约4至约20分钟、约10至约15分钟或约15至约18分钟的时间内进行。
在另一个实施方案中，本公开涉及一种用于进行上述方法的试剂盒。试剂盒可以包括：(a)用于检测样品中泛素羧基末端水解酶L1(UCH-L1)的存在的第一侧向流装置；(b)用于检测样品中胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的存在的第二侧向流装置；以及(c)用于检测样品中UCH-L1和GFAP的存在的说明。
在另一个实施方案中，本公开涉及一种用于进行上述方法的试剂盒。试剂盒可以包括：(a)用于检测样品中泛素羧基末端水解酶L1(UCH-L1)和胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的存在的侧向流装置；以及(b)用于检测样品中UCH-L1和GFAP的存在的说明。
在另一个实施方案中，本公开涉及一种方法，其包括：
对获自受试者的生物样品进行至少一种侧向流测定，以确定泛素羧基末端水解酶L1(UCH-L1)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、或者UCH-L1和GFAP两者的量或存在；以及
使在样品中确定的UCH-L1、GFAP、UCH-L1和GFAP的量或存在可视化，
其中测定不需要读取UCH-L1、GFAP或者UCH-L1和GFAP的量或存在的装置(例如，读取器或读取装置)。
在上述方法的一些实施方案中，(a)针对UCH-L1的侧向流测定包括结合UCH-L1上的表位的第一特异性结合配偶体和包含可检测标记的第二特异性结合配偶体；并且(b)针对GFAP的侧向流测定包括结合GFAP上的表位的第三特异性结合配偶体和包含可检测标记的第四特异性结合配偶体。在另外的实施方案中，第一特异性结合配偶体、第二特异性结合配偶体、第三特异性结合配偶体、第四特异性结合配偶体或其任何组合为抗体或其抗体片段。
在其他实施方案中，所述方法用于帮助诊断和评价已经遭受或可能已经遭受头部损伤的受试者。例如，在其他实施方案中，受试者被诊断为患有创伤性脑损伤。当受试者被诊断为患有创伤性脑损伤时，受试者可以被进一步诊断为患有轻度、中度、重度或中度至重度创伤性脑损伤。
在上述方法的另外的实施方案中，所述方法可以用于确定受试者是否应接受头部计算机断层(CT)扫描、磁共振成像(MRI)扫描、或者头部CT扫描和MRI扫描两者。
在另外的实施方案中，受试者为人类受试者(例如，成人受试者和/或儿科受试者)。
在上述方法的另外的实施方案中，生物样品为选自由以下组成的组的样品：全血样品、尿液样品、脑脊液样品、组织样品、体液样品、唾液样品、口咽样本和鼻咽样本。例如，在一些实施方案中，样品为全血样品。在其他实施方案中，样品为血浆样品。在另外的实施方案中，样品为血清样品。在另外的实施方案中，样品为唾液样品。在另外的实施方案中，样品为尿液样品。在其他实施方案中，样品为口咽样品。在其他实施方案中，样品为全血样品，并且受试者为人类受试者(例如，成人和/或儿科受试者)。在其他实施方案中，样品为血浆样品，并且受试者为人类受试者(例如，成人和/或儿科受试者)。在另外的实施方案中，样品为血清样品，并且受试者为人类受试者(例如，成人和/或儿科受试者)。在另外的实施方案中，样品为唾液样品，并且受试者为人类受试者(例如，成人和/或儿科受试者)。在另外的实施方案中，样品为尿液样品，并且受试者为人类受试者(例如，成人和/或儿科受试者)。在其他实施方案中，样品为口咽样品，并且受试者为人类受试者(例如，成人和/或儿科受试者)。
在上述方法的另外的实施方案中，至少一种针对GFAP的侧向流测定、至少一种针对UCH-L1的侧向流测定、或者至少一种针对GFAP的侧向流测定和至少一种针对UCH-L1的侧向流测定各自在或能够在小于约30分钟、小于约25分钟、小于约20分钟、小于约18分钟或小于约15分钟内进行。在上述方法的另外的实施方案中，至少一种针对GFAP的侧向流测定、至少一种针对UCH-L1的侧向流测定、或者至少一种针对GFAP的侧向流测定和至少一种针对UCH-L1的侧向流测定各自在或能够在范围为约4至约20分钟、约10至约15分钟或约15至约18分钟的时间内进行。
在另一个实施方案中，本公开涉及一种用于进行上述方法的试剂盒。试剂盒可以包括：(a)用于检测样品中泛素羧基末端水解酶L1(UCH-L1)的存在的第一侧向流装置；(b)用于检测样品中胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的存在的第二侧向流装置；以及(c)用于检测样品中UCH-L1和GFAP的存在的说明。
在另一个实施方案中，本公开涉及一种用于进行上述方法的试剂盒。试剂盒可以包括：(a)用于检测样品中泛素羧基末端水解酶L1(UCH-L1)和胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的存在的侧向流装置；以及(b)用于检测样品中UCH-L1和GFAP的存在的说明。试剂盒中所含的侧向流装置可以含有一个用于检测样品中UCH-L1和GFAP的存在或量的测试条。替代地，侧向流装置可以含有用于确定样品中UCH-L1的存在或量的第一测试条和用于确定样品中GFAP的存在或量的第二测试条。
具体实施方式
本公开涉及用于确定获自受试者的样品中GFAP、UCH-L1、或者GFAP和UCH-L1的存在或量的方法、侧向流测定和装置。在一些实施方案中，所述方法涉及通过进行侧向流测定来检测获自受试者的样品中GFAP、UCH-L1、或者GFAP和UCH-L1的测定。在其他实施方案中，所述方法涉及通过进行侧向流测定来确定获自受试者的样品中GFAP、UCH-L1、或者GFAP和UCH-L1的水平是否升高。
如本部分和本文的整个公开中所使用的部分标题仅出于组织目的，而不意图是限制性的。
1.定义
除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本领域普通技术人员通常所理解的相同的含义。当发生冲突时，以本文件(包括定义)为准。以下描述了优选的方法和材料，但是在实践或测试本公开中可以使用与本文所述的那些类似或等效的方法和材料。本文提到的所有出版物、专利申请、专利以及其他参考文献通过引用整体并入。本文所公开的材料、方法和实施例仅是例示性的，并且不旨在是限制性的。
如本文所用的术语“包含”、“包括”、“具有”、“有”、“可以”、“含有”以及其变化形式旨在不排除另外行为或结构的可能性的开放式连接词、术语或词语。除非上下文另外清楚地说明，否则单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括多个指示物。本公开还涵盖“包括本文所呈现的实施方案或要素”、“由本文所呈现的实施方案或要素组成”以及“基本上由本文所呈现的实施方案或要素组成”的其他实施方案，无论是否明确地提出。
对于本文数值范围的叙述来说，明确地涵盖具有相同精确度的介于其间的每个中间数字。例如，对于6-9的范围，除了6和9外还涵盖数字7和8，并且对于6.0-7.0的范围，明确涵盖了数字6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9以及7.0。
如本文所用，后缀“无-”是指省略了“无-”所附接的词的基本词根的特征的技术的实施方案。即，如本文所用的术语“无X”意指“没有X”，其中X为“无X”技术中省略的技术的特征。例如，“无钙”组合物不包含钙，“无混合”方法不包括混合步骤等。
尽管术语“第一”、“第二”、“第三”等可以在本文用于描述各种步骤、元件、组合物、组分、区域、层和/或部分，但除非另外指示，否则这些步骤、元件、组合物、组分、区域、层和/或部分不应受这些术语的限制。这些术语用于区分一个步骤、元件、组合物、组分、区域、层和/或部分。除非上下文清楚指示，否则术语诸如“第一”、“第二”和其他数字术语当在本文中使用时不暗示顺序或次序。因此，在不脱离技术的情况下，本文讨论的第一步、元件、组合物、组分、区域、层或部分可以被称为第二步、元件、组合物、组分、区域、层或部分。
“亲和力成熟抗体”在本文中用于指在一个或多个CDR中具有一个或多个变化的抗体，所述变化导致所述抗体与不具有所述变化的亲本抗体相比对于靶抗原的亲和力(即KD、kd或ka)提高。示例性亲和力成熟抗体将对于靶抗原具有纳摩尔或甚至皮摩尔的亲和力。本领域中已知多种用于产生亲和力成熟抗体的多种程序，包括对使用生物展示制备的组合抗体文库的筛选。例如，Marks等人,BioTechnology 10:779-783(1992)描述了通过VH和VL结构域改组进行的亲和力成熟。对CDR和/或框架残基的随机诱变描述于Barbas等人,Proc.Nat.Acad.Sci.USA,91:3809-3813(1994)；Schier等人,Gene,169:147-155(1995)；Yelton等人,J.Immunol.,155:1994-2004(1995)；Jackson等人,J.Immunol.,154(7):3310-3319(1995)；以及Hawkins等人,J.Mol.Biol.,226:889-896(1992)。在选择性诱变位置和在接触或超突变位置用活性增强氨基酸残基进行的选择性突变描述于美国专利号6,914,128B1。
如本文所用的“量”是指指定的量(例如，高或低)或数字，例如，数字是水平(诸如，在量或数量的实数或虚数尺度上的位置)或浓度(诸如像，溶液内或特定体积的空间中所含给定物质的相对量，例如，每单位体积溶液中溶质的量)。
如本文所用的“抗体(Antibody和antibodies)”是指单克隆抗体、多特异性抗体、人抗体、人源化抗体(完全或部分人源化的)、动物抗体诸如但不限于鸟(例如，鸭或鹅)、鲨鱼、鲸鱼和哺乳动物(包括非灵长类动物(例如，牛、猪、骆驼、美洲驼、马、山羊、兔子、绵羊、仓鼠、豚鼠、猫、狗、大鼠、小鼠等)或非人灵长类动物(例如，猴子、黑猩猩等))、重组抗体、嵌合抗体、单链Fv(“scFv”)、单链抗体、单结构域抗体、Fab片段、F(ab')片段、F(ab')2片段、二硫键连接的Fv(“sdFv”)和抗独特型(“抗Id”)抗体、双结构域抗体、双可变结构域(DVD)或三可变结构域(TVD)抗体(双可变结构域免疫球蛋白及其制备方法描述于Wu,C等人,NatureBiotechnology,25(11):1290-1297(2007)和PCT国际申请WO 2001/058956，每一篇所述文献的内容通过引用并入本文)，以及任何上述抗体的功能活性的表位结合片段。具体来说，抗体包括免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性片段，即含有分析物结合位点的分子。免疫球蛋白分子可以是任何类型(例如，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、类别(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或亚类。为简单起见，针对分析物的抗体在本文中通常被称为“抗分析物抗体”或仅仅是“分析物抗体”(例如，抗UCH-L1抗体或UCH-L1抗体)。
如本文所用的“抗体片段”是指包含抗原结合位点或可变区的完整抗体的一部分。所述部分不包括完整抗体Fc区的恒定重链结构域(即，CH2、CH3或CH4，其取决于抗体同种型)。抗体片段的实例包括但不限于Fab片段、Fab'片段、Fab'-SH片段、F(ab')2片段、Fd片段、Fv片段、双抗体、单链Fv(scFv)分子、仅含有一条轻链可变结构域的单链多肽、含有轻链可变结构域的三个CDR的单链多肽、仅含有一条重链可变区的单链多肽、以及含有重链可变区的三个CDR的单链多肽。
“结合蛋白”在本文中用于指与结合配偶体结合并与其形成复合物的单体或多聚体蛋白，例如像多肽、抗原、化学化合物或其他分子、或任何种类的底物。结合蛋白特异性结合至结合配偶体。结合蛋白包括抗体，以及其抗原结合片段和其本领域中已知的和下文所述的其他各种形式和衍生物，以及包含一个或多个结合抗原分子或抗原分子上的特定位点(表位)的抗原结合结构域的其他分子。因此，结合蛋白包括但不限于抗体、四聚体免疫球蛋白、IgG分子、IgG1分子、单克隆抗体、嵌合抗体、CDR嫁接抗体、人源化抗体、亲和力成熟抗体和任何此类抗体的保留结合抗原的能力的片段。
“双特异性抗体”在本文中用于指通过以下技术产生的全长抗体：四源杂交瘤技术(参见Milstein等人,Nature,305(5934):537-540(1983))；通过两个不同单克隆抗体的化学缀合(参见Staerz等人,Nature,314(6012):628-631(1985))；或通过在Fc区中引入突变的杵臼法或类似方法(参见Holliger等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90(14):6444-6448(1993))，所述方法产生多种不同免疫球蛋白物质，其中仅一者是功能性双特异性抗体。双特异性抗体在其两个结合臂的一者(一对HC/LC)上结合一种抗原(或表位)，并且在其第二臂(另一对HC/LC)上结合不同的抗原(或表位)。根据这个定义，双特异性抗体具有两个不同的抗原结合臂(在特异性和CDR序列两方面)，并且对于其结合的每种抗原而言是一价的。
“CDR”在本文中用于指在抗体可变序列内的“互补决定区”。重链和轻链的每个可变区中有三个CDR。对于每个可变区，从重链或轻链的N末端开始，这些区域表示为“CDR1”、“CDR2”和“CDR3”。如本文所用的术语“CDR组”是指存在于单一可变区中的结合抗原的三个CDR的组。因此，抗原结合位点可以包括六个CDR，其包含来自重链和轻链可变区各自的CDR组。包含单个CDR(例如，CDR1、CDR2或CDR3)的多肽可以称为“分子识别单元”。抗原-抗体复合物的晶体学分析已经证明CDR的氨基酸残基与结合的抗原形成广泛接触，其中最广泛的抗原接触是与重链CDR3。因此，分子识别单元可能主要负责抗原结合位点的特异性。一般来讲，CDR残基直接地并且最实质性地涉及影响抗原结合。
这些CDR的精确边界已根据不同系统加以不同界定。由Kabat所述的系统(Kabat等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest(National Institutes ofHealth,Bethesda,Md.(1987)和(1991))不仅提供适用于抗体的任何可变区的明确残基编号系统，还提供定义三个CDR的准确残基边界。这些CDR可以称为“Kabat CDR”。Chothia和同事(Chothia和Lesk,J.Mol.Biol.,196:901-917(1987)以及Chothia等人,Nature 342:877-883(1989))发现尽管在氨基酸序列的层面上具有巨大多样性，但Kabat CDR内的某些子部分采用几乎相同的肽骨架构象。这些子部分被指定为“L1”、“L2”和“L3”或“H1”、“H2”和“H3”，其中“L”和“H”分别表示轻链区和重链区。这些区域可以被称为Chothia CDR，它们具有与Kabat CDR重叠的边界。界定与Kabat CDR重叠的CDR的其他边界已由Padlan,FASEBJ.,9:133-139(1995)和MacCallum,J.Mol.Biol,262(5):732-745(1996)描述。仍有其他CDR边界定义可能不严格遵循本文中系统之一，但将仍然与Kabat CDR重叠，但鉴于特定残基或残基群组或甚至整个CDR不会显著影响抗原结合的预测或实验发现而可以将它们缩短或延长。本文所用的方法可以利用根据这些系统中任一个定义的CDR，但某些实施方案使用Kabat或Chothia定义的CDR。
如本文所互换使用的“对照区”或“对照线”是指可以观察到标记位置偏移、出现、颜色改变或消失以指示测定正确进行的测试条区域。根据标记的具体选择，对照区(例如，对照线)的检测或观察可以通过任何方便的手段进行，例如但不限于以可视方式、以荧光方式、通过反射、以放射摄影方式等。在一些实施方案中，根据使用的对照的设计，标记可以或可以不直接应用于对照区。
如本文所用的“CT扫描”是指计算机断层(CT)扫描。CT扫描组合了从不同角度拍摄的一系列X射线图像，并且使用计算机处理来创建您体内骨骼、血管和软组织的横截面图像或切片。CT扫描可以使用X射线CT、正电子发射断层扫描(PET)、单光子发射计算机断层扫描(SPECT)、计算机轴向断层扫描(CAT扫描)或计算机辅助断层扫描。CT扫描可以是常规CT扫描或螺旋式/螺旋型CT扫描。在常规的CT扫描中，逐个切片地进行扫描，并且在每个切片之后扫描停止并向下移动到下一个切片，例如，从腹部的顶部向下移动到骨盆。常规的CT扫描要求患者屏住呼吸以避免运动伪影。螺旋式/螺旋型CT扫描是连续扫描，其以螺旋方式拍摄，并且是其中扫描图像是连续的更快过程。
如本文可互换使用的“使…分散化”、“分散的”或“分散化”在测试的语境下是指在传统医疗环境(例如，医院、医生办公室、独立实验室站点等)之外的一个或多个地方(诸如，急救医疗诊所、零售诊所、药房、杂货店或便利店、住宅(例如，房屋、公寓等)、工作场所和/或政府办公室(例如，美国运输和安全局)等)进行一项或多项医学测试和/或测定。“混合分散化”或“混合分散的”是指受试者或患者在住宅和/或工作场所采集样品并将样品运送到实验室的情况，避开了专业采集站点(诸如，医院、医生办公室或独立样品采集或实验室站点)。
如本文所用的抗体的“衍生物”可以是指与真正或亲本抗体相比具有对其氨基酸序列的一个或多个修饰的抗体并且表现出经修饰的结构域结构。衍生物仍然可以能够采用天然抗体中发现的典型结构域配置，以及能够特异性结合靶标(抗原)的氨基酸序列。抗体衍生物的典型实例是与其他多肽偶联的抗体、经重排的抗体结构域或抗体片段。衍生物还可以包含至少一种另外的化合物，例如蛋白质结构域，所述蛋白质结构域通过共价或非共价键连接。根据本领域中已知的方法，键联可以基于遗传融合。存在于包含抗体的融合蛋白中的另外的结构域可以优选地通过柔性接头、有利地肽接头连接，其中所述肽接头包含多个亲水的肽键合的氨基酸，其长度足以跨越另外的蛋白质结构域的C末端与抗体的N末端之间的距离，反之亦然。抗体可以与效应分子连接，所述效应分子具有适于生物活性或选择性结合例如固体支持物、生物活性物质(例如，细胞因子或生长激素)、化学试剂、肽、蛋白质或药物的构象。
“双重特异性抗体”在本文中用于指可在其两个结合臂(一对HC/LC)的每一个中结合两种不同抗原(或表位)的全长抗体(参见PCT公布WO 02/02773)。因此，双重特异性结合蛋白具有两个具备相同特异性和相同CDR序列的相同抗原结合臂，且对于其结合的每种抗原而言是二价的。
“双重可变结构域”在本文中用于指结合蛋白上的两个或更多个抗原结合位点，所述结合蛋白可以是二价(两个抗原结合位点)、四价(四个抗原结合位点)或多价结合蛋白。DVD可以是单特异性的，即能够结合一种抗原(或一个特异性表位)、或多特异性的，即能够结合两种或更多种抗原(即相同抗原分子的两个或更多个表位或不同靶抗原的两个或更多个表位)。优选的DVD结合蛋白包含两种重链DVD多肽和两种轻链DVD多肽并且被称为“DVD免疫球蛋白”或“DVD-Ig”。这样的DVD-Ig结合蛋白因此是四聚体的并且类似于IgG分子，但提供比IgG分子更多的抗原结合位点。因此，四聚体DVD-Ig分子的每一半都类似于IgG分子的一半，并且包含重链DVD多肽和轻链DVD多肽，但与IgG分子的提供单抗原结合结构域的一对重链和轻链不同，DVD-Ig的一对重链和轻链提供两个或更多个抗原结合位点。
DVD-Ig结合蛋白的每个抗原结合位点可以源自供体(“亲本”)单克隆抗体，因此包含具有每个抗原结合位点均参与抗原结合的总共六个CDR的重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)。因此，结合两个不同表位的DVD-Ig结合蛋白(即，两个不同抗原分子的两个不同表位或相同抗原分子的两个不同表位)包含源自第一亲本单克隆抗体的抗原结合位点和第二亲本单克隆抗体的抗原结合位点。
在PCT公布号WO 2007/024715、美国专利号7,612,181和Wu等人,NatureBiotech.,25:1290-1297(2007)中提供了对DVD-Ig结合分子的设计、表达和表征的描述。此类DVD-Ig分子的优选实例包含含有结构式VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n的重链，其中VD1是第一重链可变结构域，VD2是第二重链可变结构域，C是重链恒定结构域，X1是接头(前提条件是它不是CH1，X2是Fc区)，且n是0或1，但优选1；和含有VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n的轻链，其中VD1是第一轻链可变结构域，VD2是第二轻链可变结构域，C是轻链恒定结构域，X1是接头(前提条件是它不是CH1，且X2不包含Fc区)；且n是0或1，但优选1。这种DVD-Ig可以包含两条这样的重链和两条这样的轻链，其中每条链包含串联连接的可变结构域，而在可变区之间没有干预的恒定区，其中重链和轻链缔合形成串联功能性抗原结合位点，并且一对重链和轻链可以与另一对重链和轻链缔合形成具有四个功能性抗原结合位点的四聚体结合蛋白。在另一个实例中，DVD-Ig分子可以包含这样的重链和轻链，每个所述重链和轻链包含串联连接的三个可变结构域(VD1、VD2、VD3)，而在可变结构域之间没有干预的恒定区，其中一对重链和轻链可以缔合形成三个抗原结合位点，并且其中一对重链和轻链可与另一对重链和轻链缔合形成具有六个抗原结合位点的四聚体结合蛋白。
在优选的实施方案中，DVD-Ig结合蛋白不仅结合与其亲本单克隆抗体结合的相同靶分子，而且具有一种或多种其亲本单克隆抗体中的一种或多种的所需特性。优选地，这种另外的特性是亲本单克隆抗体中的一者或多者的抗体参数。可能对来自一种或多种亲本单克隆抗体的DVD-Ig结合蛋白有贡献的抗体参数包括但不限于抗原特异性、抗原亲和力、效力、生物学功能、表位识别、蛋白质稳定性、蛋白质溶解度、生产效率、免疫原性、药代动力学、生物利用度、组织交叉反应性和直系同源抗原结合。
DVD-Ig结合蛋白结合UCH-L1、GFAP或者UCH-L1和GFAP的至少一个表位。DVD-Ig结合蛋白的非限制性实例包括(1)结合UCH-L1的一个或多个表位的DVD-Ig结合蛋白、结合人类UCH-L1的表位和另一物种(例如，小鼠)的UCH-L1的表位的DVD-Ig结合蛋白以及结合人类UCH-L1的表位和另一靶分子的表位的DVD-Ig结合蛋白；(2)结合GFAP的一个或多个表位的DVD-Ig结合蛋白结合人类GFAP的表位和另一物种(例如，小鼠)的GFAP的表位的DVD-Ig结合蛋白以及结合人类GFAP的表位和另一靶分子的表位的DVD-Ig结合蛋白；或(3)结合UCH-L1和GFAP的一个或多个表位的DVD-Ig结合蛋白、结合人类UCH-L1、人类GFAP的表位和另一物种(例如，小鼠)的UCH-L1的表位的DVD-Ig结合蛋白以及结合人类UCH-L1、人类GFAP的表位和另一靶分子的表位的DVD-Ig结合蛋白。
“一个表位”或“多个表位”或“感兴趣表位”是指任何分子上被识别并且可以结合其特异性结合配偶体上的互补位点的位点。分子和特异性结合配偶体是特异性结合对的一部分。例如，表位可以是在多肽、蛋白质、半抗原、糖类抗原(诸如但不限于糖脂、糖蛋白或脂多糖)或多糖。其特异性结合配偶体可以是但不限于抗体。
如本文所用的“片段抗原结合片段”或“Fab片段”是指结合抗原并且包含一个抗原结合位点、一条完整的轻链和一条重链的一部分的抗体片段。Fab是由VL、VH、CL和CH1结构域组成的一价片段。Fab由重链和轻链各自的一个恒定结构域和一个可变结构域构成。可变结构域在单体的氨基末端包含互补位(抗原结合位点)，其包含一组互补决定区。Y的每个臂因此结合抗原上的表位。可以产生Fab片段，诸如本领域中描述的那样，例如使用木瓜蛋白酶，其可以用于将免疫球蛋白单体切割成两个Fab片段和Fc片段，或者可以通过重组方式产生。
如本文所用的“F(ab')2片段”是指通过胃蛋白酶消化整个IgG抗体以除去大部分Fc区，同时使一些铰链区完整而产生的抗体。F(ab')2片段具有通过二硫键连接在一起的两个抗原结合F(ab)部分，并且因此是二价的，分子量为约110kDa。二价抗体片段(F(ab')2片段)比完整的IgG分子小，并且能够更好地渗透到组织中，因此在免疫组织化学中促进更好的抗原识别。F(ab')2片段的使用还避免了与活细胞上的Fc受体或蛋白A/G的非特异性结合。F(ab')2片段可以结合和沉淀抗原。
如本文所用的“框架”(FR)或“框架序列”可以意指可变区减去CDR的剩余序列。因为CDR序列的确切定义可以通过不同的系统(例如，见上文)确定，所以框架序列的含义对应地受到不同的解释。六个CDR(轻链的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3以及重链的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3)也将轻链和重链上的框架区分成各链上的四个子区域(FR1、FR2、FR3和FR4)，其中CDR1位于FR1与FR2之间，CDR2位于FR2与FR3之间，并且CDR3位于FR3与FR4之间。在不将特定子区指定为FR1、FR2、FR3或FR4的情况下，如其他所提及的框架区表示单一天然存在的免疫球蛋白链的可变区内的组合FR。如本文所用，FR表示四个子区域中的一个，并且FRs表示构成框架区的四个子区域中的两个或更多个。
人重链和轻链FR序列在本领域是已知的，其可被用作重链和轻链“接受者”框架序列(或者简单的说是“接受者”序列)以通过使用本领域已知的技术来人源化非人抗体。在一个实施方案中，人重链和轻链接受者序列选自在公众可获得的数据库诸如V-base(hypertext transfer protocol://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/)或国际信息系统(hypertext transfer protocol://imgt.cines.fr/texts/IMGTrepertoire/LocusGenes/)中列出的框架序列。
如本文所用的“功能性抗原结合位点”可以意指结合蛋白(例如，抗体)上能够结合靶抗原的位点。抗原结合位点的抗原结合亲和力可以不如与抗原结合位点所源自的亲本结合蛋白，例如亲本抗体一样强，但结合抗原的能力必须是可使用已知用于评价蛋白质，例如抗体与抗原结合的多种方法中的任一者测量。此外，本文中的多价蛋白质，例如多价抗体的每个抗原结合位点的抗原结合亲和力无需在数量上相同。
“GFAP”在本文中用于描述胶质细胞原纤维酸性蛋白。GFAP是由人类中的GFAP基因和其他物种中的GFAP基因对应物编码并且可以产生(例如，通过重组方式，在其他物种中)的蛋白质。
“GFAP状态”可以意指在某个时间点的GFAP的水平或量(诸如，使用GFAP的单个测量值)、与监测相关的GFAP的水平或量(诸如，对受试者进行重复测试以鉴定GFAP量的增加或减少)、与创伤性脑损伤(无论是原发性脑损伤和/或继发性脑损伤)的治疗相关的GFAP的水平或量或其组合。
如本文所用的“格拉斯哥昏迷量表”或“GCS”是指一种15分量表(例如，1974年Graham Teasdale和Bryan Jennett,Lancet 1974；2:81-4中描述)，其提供用于评定患有脑损伤的患者的意识水平损伤的实用方法。该测试使用以下值测量最佳运动反应、言语反应和睁眼反应：I.最佳运动反应(6-服从2部分要求；5-针对头颈部的刺激将手放到锁骨上方；4-迅速弯曲手臂于肘部，但特征不主要异常；3-弯曲手臂于肘部，特征明显主要异常；2-伸展手臂于肘部；1-手臂/腿部没有运动，没有干扰因素；NT-瘫痪或其他限制性因素)；II.言语反应(5-正确说出姓名、地点和日期；4-没有取向，但交流连贯；3-可理解的单字；2-只有呻吟/叹息；1-无可听见的反应，无干扰因素；NT-有干扰交流的因素)；以及III.睁眼(4-刺激前睁眼；3-说话或喊话要求后；2-指尖刺激后；1-任何时候都不睁眼，无干扰因素；NT-因局部因素而闭眼)。通过添加I+II+III的值来确定最终评分。如果GCS评分为13-15，则认为受试者患有轻度TBI。如果GCS评分为9-12，则认为受试者患有中度TBI。如果GCS评分为8或更低，通常为3-8，则认为受试者患有重度TBI。
如本文所用的“格拉斯哥结果量表”是指用于功能性结果的全球量表，其将患者状态评定为以下五个类别之一：死亡、植物人状态、重度失能、中度失能或恢复良好。如本文可互换使用的“扩展的格拉斯哥结局量表”或“GOSE”通过将重度失能、中度失能和良好恢复的类别细分为低级类别和高级类别来提供更详细的八种分类，如表1中所示。
表1
术语“人源化抗体”在本文中用于描述包含来自非人物种(例如，小鼠)的重链和轻链可变区序列但其中VH和/或VL序列中的至少一部分已变得更“类人”，即与人生殖系可变序列更相似的抗体。“人源化抗体”为抗体或其变体、衍生物、类似物或片段，其免疫特异性地结合感兴趣的抗原且包含基本上具有人抗体的氨基酸序列的框架(FR)区和基本上具有非人抗体的氨基酸序列的互补决定区(CDR)。如本文所用，在CDR的情境下的术语“基本上”是指氨基酸序列与非人抗体CDR的氨基酸序列至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％相同的CDR。人源化抗体包含至少一个且通常两个可变结构域的基本上全部(Fab、Fab'、F(ab')2、FabC、Fv)，其中全部或基本上全部CDR区对应于非人免疫球蛋白(即供体抗体)的那些CDR区并且全部或基本上全部框架区是人免疫球蛋白共有序列的那些。在一个实施方案中，人源化抗体还包含免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分，通常是人免疫球蛋白的至少一部分。在一些实施方案中，人源化抗体含有轻链以及至少重链的可变结构域。抗体也可以包括重链的CH1、铰链、CH2、CH3和CH4区。在一些实施方案中，人源化抗体仅含有人源化轻链。在一些实施方案中，人源化抗体仅含有人源化重链。在特定实施方案中，人源化抗体仅含有轻链和/或人源化重链的人源化可变结构域。
人源化抗体可以选自免疫球蛋白的任何类别，包括IgM、IgG、IgD、IgA和IgE，以及任何同种型，包括但不限于IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。人源化抗体可以包含来自多于一种类别或同种型的序列，并且可以使用本领域中熟知的技术选择特定的恒定结构域以优化所需的效应子功能。
人源化抗体的框架区和CDR无需精确对应于亲本序列，例如可以通过取代、插入或/或缺失至少一个氨基酸残基来对供体抗体CDR或共有框架进行诱变以使所述位点处的CDR或框架残基不对应于供体抗体或共有框架。然而，在优选的实施方案中，此类突变将不是广泛的。通常，至少80％、优选至少85％、更优选至少90％、且最优选至少95％的人源化抗体残基将对应于亲本FR和CDR序列的那些。如本文所用，术语“共有框架”是指共有免疫球蛋白序列中的框架区。如本文所用，术语“共有免疫球蛋白序列”是指由相关免疫球蛋白序列家族中最常出现的氨基酸(或核苷酸)形成的序列(参见，例如Winnaker,From Genes toClones(Verlagsgesellschaft,Weinheim,1987))。因此，“共有免疫球蛋白序列”可以包含“共有框架区”和/或“共有CDR”。在免疫球蛋白家族中，共有序列中的每个位置由家族中最常出现在那个位置的氨基酸占据。如果两种氨基酸出现的频率相同，则任一种氨基酸都可以纳入共有序列中。
如本文在两种或更多种多肽或多核苷酸序列的情境下所使用的“相同的”或“同一性”可意指序列在指定区域上具有指定百分比的相同残基。可以通过以下方式来计算百分比：最佳地比对两个序列、在指定区域上比较两个序列、确定在两个序列中出现相同的残基的位置的数量以产生匹配位置的数量、以匹配位置的数量除以在指定区域内的位置的总数量，并且将结果乘以100以产生序列同一性的百分比。在两个序列具有不同长度或比对产生一个或多个交错末端并且比较的指定区仅包含单个序列的情况下，单个序列的残基包括于计算的分母而不是分子中。
如本文所用的术语“免疫测定”是指通过使用抗体或抗原测量溶液中大分子或小分子的存在或浓度的生化测试。可以使用任何合适的免疫测定，并且多种免疫测定类型、配置和形式是本领域中已知的并且在本公开的范围内。合适的免疫测定类型包括但不限于酶联免疫吸附测定(ELISA)、侧向流测定、竞争性抑制免疫测定(例如，正向和反向)、放射性免疫测定(RIA)、荧光免疫测定(FIA)、化学发光免疫测定(CLIA)、计数免疫测定(CIA)、酶扩大免疫测定技术(EMIT)、一步抗体检测测定、均相测定、异相测定、实时捕获测定(capture onthe fly assay)、单分子检测测定等。此类方法公开于例如美国专利号6,143,576、6,113,855、6,019,944、5,985,579、5,947,124、5,939,272、5,922,615、5,885,527、5,851,776、5,824,799、5,679,526、5,525,524和5,480,792；国际专利申请公布WO 2016/161402和WO2016/161400；和Adamczyk等人,Anal.Chim.Acta,579(1):61-67(2006)。
免疫测定形式可以是“直接”或“间接”“夹心”的。夹心形式涉及使用捕获和检测抗原来固定和检测样品中的抗原。具体而言，将固体支持物(例如，ELISA板，珠子等)的表面涂布捕获抗体或其抗原结合片段，所述捕获抗体与施加到其上的样品中存在的靶抗原结合并使其固定。然后添加检测抗体或使其与复合物接触。检测抗体可以直接用抗体标记(“直接夹心免疫测定”)，以实现抗原的检测和量化。替代地，如果检测抗体未标记，则可以使用二抗酶缀合的检测抗体(“间接夹心测定”)。
因此，所公开的方法还可以包括将样品与包含第二抗体的缀合物接触，其中第二抗体或其抗原结合片段(缀合物的一部分)特异性地结合靶抗原(例如，来自GFAP、UCH-L1的蛋白质或其片段或表位)，从而导致缀合物与捕获的分析物键联并形成免疫夹心(本文还称为“免疫夹心复合物”)。应当理解，在夹心免疫测定形式中，第一抗体和第二抗体识别靶分析物/抗原上两个不同的非重叠表位。
如本文所用，术语“免疫色谱测试”(ICT)是指这样的测定或测试，其包括盒或条(通常是一次性和/或用完即丢弃的)，所述盒或条产生可检测的(例如像有色的)最终产物，所述最终产物可以被解释为阳性或阴性。免疫色谱测试通常依赖于从生物样本中捕获靶分析物(例如抗原和/或抗体)。所述测定或测试利用安装在测试条上的第一特异性结合成员(例如，抗原和/或抗体)作为固定的捕获特异性结合成员(测试区域)。使用毛细管流动来移动经可检测标记的第二特异性结合成员缀合物，所述缀合物移动至固定相中的第一捕获特异性结合成员时，结合移动相中的靶分析物。通过在测试区域中的第一固定的特异性结合捕获移动标记的第二特异性结合成员复合物，并且形成有色线或图案，产生阳性测试。ICT的一个实例为侧向流测定。
如本文可互换使用的“对头部的损伤”或“头部损伤”是指对头皮、颅骨或大脑的任何创伤。此类损伤可能包括头部上的仅轻微的撞击或可能是严重的脑损伤。此类损伤包括大脑的原发性损伤和/或大脑的继发性损伤。原发性脑损伤发生在最初的侵害期间，并且由大脑的物理结构的移位引起。更具体地说，原发性脑损伤为在创伤事件期间发生的对实质(组织、血管)的物理伤害，导致周围脑组织的剪切和压缩。继发性脑损伤发生在原发性损伤之后，并且可能涉及一系列细胞过程。更具体地，继发性脑损伤是指在原发性脑损伤后的一段时间(从数小时到数天)内发展出的变化。它包括促成进一步破坏脑组织的大脑中细胞、化学、组织或血管变化的整个级联。
头部损伤可以是闭合性的或开放性的(穿透性的)。闭合性头部损伤是指其中颅骨没有被撞击物体穿透的头皮、颅骨或大脑的创伤。开放性头部损伤是指其中颅骨被撞击物体穿透的头皮、颅骨或大脑的创伤。头部损伤可以是由人的身体摇动、由导致闭合性或开放性头部创伤的外部机械或其他力(例如，诸如汽车、飞机、火车等情况下的交通事故；诸如用棒球棒或来自枪械的头部猛击)产生的钝性冲击、脑血管意外(例如中风)、一次或多次跌倒(例如，如运动或其他活动)、爆炸或冲击波(统称为“冲击波伤”)以及由其他类型的钝力创伤引起的。替代地，头部损伤可能由摄入和/或暴露于化学品、毒素或化学品和毒素的组合引起。此类化学品和/或毒素的示例包括火、霉菌、石棉、杀虫剂和杀昆虫剂、有机溶剂、油漆、胶水、气体(诸如一氧化碳、硫化氢和氰化物)、有机金属(诸如甲基汞、四乙基铅和有机锡)和/或一种或多种滥用药物。可替代地，头部损伤可能是由于受试者罹患自身免疫疾病、代谢紊乱、脑肿瘤、缺氧、病毒感染(例如，SARS-CoV-2)、真菌感染、细菌感染、脑膜炎、脑积水或其任何组合。在一些情况下，无法确定是否发生过任何此类事件或损伤。例如，患者或受试者可能没有病史，受试者可能无法说话，受试者可能知道他们所经历的事件等等。此类情况在本文中描述为受试者“可能已遭受头部损伤”或作为“怀疑损伤”。在本文的某些实施方案中，闭合性头部损伤不包括并且特别地排除脑血管意外，诸如中风。
如本文所用的“分离的多核苷酸”可以意指多核苷酸(例如基因组、cDNA或合成来源或其组合的多核苷酸)，根据其来源，所述多核苷酸不与“分离的聚核苷酸”见于自然界中所处的多核苷酸的全部或一部分缔合；可操作地连接至其在自然界中不连接的多核苷酸；或不作为较大序列的一部分存在于自然界中。
如本文所用的“标记”和“可检测标记”是指附接至抗体或分析物以使抗体与分析物之间的反应可检测的部分，并且如此标记的抗体或分析物被称为“可检测地标记的”。标记可以产生可通过视觉或仪器手段检测到的信号。各种标记包括产生信号的物质，诸如发色团、荧光化合物、化学发光化合物、放射性化合物等。标记的代表性实例包括产生光的部分例如吖啶化合物，以及产生荧光的部分例如荧光素。本文描述了其他标记。就这一点而言，部分本身可能是不可检测的，但可能在与另一部分反应后变成可检测的。使用术语“可检测标记”旨在涵盖此类标记。可以使用本领域中已知的任何合适的可检测标记。
如本文可互换使用的“侧向流装置”或“测试装置”是指允许使用特定结合剂对固定在基底(例如，测试条、膜、吸收垫(例如，芯吸垫)等)上的生物标志物进行侧向流检测的装置。本文描述了示例性侧向流装置和使用此类装置的方法，其允许使用特定结合剂(例如，抗GFAP抗体、抗UCH-L1抗体或者抗GFAP和抗UCH-L1抗体)对固定在基底上的GFAP、UCH-L1和/或GFAP和UCH-L1进行有效的侧向流检测。
“连接序列”或“连接肽序列”是指与一种或多种感兴趣多肽序列(例如，全长、片段等)连接的天然或人工多肽序列。术语“连接的”是指连接序列与感兴趣的多肽序列的接合。此类多肽序列优选地通过一个或多个肽键接合。连接序列可以具有约4至约50个氨基酸的长度。优选地，连接序列的长度为约6至约30个氨基酸。可以通过氨基酸取代、添加或缺失来修饰天然连接序列以产生人工连接序列。连接序列可用于许多目的，包括用于重组Fab中。示例性连接序列包括但不限于：(i)组氨酸(His)标签，诸如6X His标签，其具有HHHHHH(SEQID NO:3)的氨基酸序列，可用作连接序列以有利于分离和纯化感兴趣的多肽和抗体；(ii)肠激酶裂解位点，如His标签，用于分离和纯化感兴趣的蛋白质和抗体。通常，将肠激酶裂解位点与His标签一起用于分离和纯化感兴趣的蛋白质和抗体。各种肠激酶裂解位点在本领域中是已知的。肠激酶裂解位点的实例包括但不限于DDDDK(SEQ ID NO:4)的氨基酸序列及其衍生物(例如，ADDDDK(SEQ ID NO:5)等)；(iii)杂项序列可以用于连接(link)或连接(connect)单链可变区片段的轻链和/或重链可变区。其他连接序列的实例可以见于Bird等人,Science 242:423-426(1988)；Huston等人,PNAS USA 85:5879-5883(1988)；和McCafferty等人,Nature 348:552-554(1990)中。还可以修饰连接序列以用于另外的功能，诸如药物的附接或附接于固体支持物。在本公开的上下文中，单克隆抗体例如可以含有连接序列，诸如His标签、肠激酶裂解位点或两者。
如本文所用的“单克隆抗体”是指自基本上均质抗体的群体获得的抗体，即除可以少量存在的可能天然存在的突变之外，构成所述群体的个别抗体是相同的。单克隆抗体具有高度特异性，其针对单一抗原(例如，尽管可能存在交叉反应性或共享反应性)。此外，与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂不同，每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。本文的单克隆抗体具体地包括“嵌合”抗体，其中重链和/或轻链的一部分与源自特定物种或属于特定抗体类别或亚类的抗体中的对应序列相同或同源，而所述链的剩余部分与源自另一物种或属于另一抗体类别或亚类的抗体以及这类抗体的片段中的对应序列相同或同源，只要它们表现出所需的生物性。
如本文可互换使用的“磁共振成像”或“MRI”是指在放射学中使用的医学成像技术，以形成人体在健康和疾病中的解剖结构和生理过程的图片(例如，在本文可互换地称为“MRI”、“MRI程序”或“MRI扫描”)。MRI为一种医学成像形式，其在将身体组织放置于强磁场中时测量其原子核对高频无线电波的相应，并且产生内脏器官的图像。基于核磁共振(NMR)科学的MRI扫描仪使用强磁场、无线电波和场梯度来产生人体内部图像。
“多价结合蛋白”在本文中用于指包含两个或更多个抗原结合位点(在本文中也称为“抗原结合结构域”)的结合蛋白。多价结合蛋白优选地被工程化以具有三个或更多个抗原结合位点，并且一般来讲不是天然存在的抗体。术语“多特异性结合蛋白”是指可以结合两个或更多个相关或不相关靶标的结合蛋白，包括能够结合相同靶分子的两个或更多个不同表位的结合蛋白。
如本文所用，“近侧端部”是指测试装置或测试条的端部，其包括测试装置的样品应用开孔和/或测试条的样品应用区。
“一种重组抗体”和“多种重组抗体”是指通过一个或多个步骤制备的抗体，包括通过重组技术将编码一种或多种单克隆抗体的全部或部分的核酸序列克隆到适当的表达载体中，并随后在适当的宿主细胞中表达抗体。所述术语包括但不限于重组产生的单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体(全部或部分人源化)、由抗体片段形成的多特性或多价结构、双功能抗体、异型缀合Ab、和如本文(i)中描述的其他抗体。(双可变结构域免疫球蛋白及其制备方法描述于Wu,C等人,Nature Biotechnology,25:1290-1297(2007)中)。如本文中使用的术语“双功能抗体”是指包括对一个抗原位点具有特异性的第一臂和对不同抗原位点具有特异性的第二臂的抗体，即，双功能抗体具有双重特异性。
如本文所用的“结果”是指通过进行测定所获得的信息项目。在一个实施方案中，结果为测试样品中生物标志物(例如，UCH-L1、GFAP或其任何组合)的量。在另一个实施方案中，结果为鉴定样品中生物标志物(例如，UCH-L1、GFAP或其任何组合)的存在。在一些实施方案中，结果显示为数值，例如，使用读取装置或读取器完成。在其他实施方案中，结果可视地显示(例如，呈彩色线)。
如本文所用的对受试者(例如，患者)的“风险评估”、“风险分类”、“风险鉴定”或“风险分层”是指评价包括生物标志物的因素，以预测包括疾病发作或疾病进展的未来事件发生的风险，以便可以在更加知情的基础上做出关于受试者的治疗决策。
如本文所用的“样品”、“测试样品”、“样本”、“来自受试者的样品”和“患者样品”可以互换使用，并且可以是血液(诸如全血(包括例如毛细血管血、静脉血、静脉和毛细血管血的混合样品、毛细血管血和间质液的混合样品、干血斑等))、组织、尿液、精液、血清、血浆、唾液、汗液、痰、粘液、泪液、淋巴液、羊水、下呼吸道样本(诸如但不限于痰、气管内抽吸物或支气管肺泡灌洗液)、脑脊液、胎盘细胞或组织、内皮细胞、白细胞或单核细胞的样品。样品可以如从患者获得地直接使用，或者可预处理，诸如通过过滤、稀释、提取、浓缩、离心、对干扰组分进行灭活、添加试剂等，从而以本文中讨论的或其他本领域已知的一些方式来修饰样品的特征。
可以利用多种细胞类型、组织或体液来获得样品。此类细胞类型、组织和流体可以包括组织切片(诸如活检和尸检样品)、口咽样本、鼻咽样本、鼻粘液样本、为组织学目的取得的冷冻切片、血液(诸如全血、毛细管血、静脉血、静脉血和毛细管血的混合样品、毛细管血和间质液的混合样品、干血点等)、血浆、血清、红细胞、血小板、肛门样品(诸如肛拭样本)、间质液、脑脊髓液等。细胞类型和组织还可以包括淋巴液、脑脊液或任何通过抽吸收集的流体。组织或细胞类型可以通过从人类和非人类动物中取出细胞样品来提供，但也可以通过使用先前分离的细胞(例如，由另一个人、在另一个时间和/或出于另一个目的分离)来完成。也可以使用归档组织，例如具有治疗或结局史的那些。可能不需要蛋白质或核苷酸分离和/或纯化。在一些实施方案中，样品为全血样品。在一些实施方案中，样品为毛细血管血样品。在一些实施方案中，样品为干血斑。在一些实施方案中，样品为血清样品。在其他实施方案中，样品为血浆样品。在一些实施方案中，样品为口咽样本。在其他实施方案中，样品为鼻咽样本。在其他实施方案中，样品为痰。在其他实施方案中，样品为气管内抽出物。在其他实施方案中，样品为支气管肺泡灌洗液。在其他实施方案中，样品为粘液。在其他实施方案中，样品为唾液。在另外的实施方案中，样品为尿液。
如本文所用的“样品应用开孔”是指测试装置的一部分，其中测试装置中的开口提供通向测试条的样品应用区的通道。
“样品应用区”为测试条的应用样品的部分。在一些实施方案中，“样品垫”包括样品应用区。
“敏感性”是指结局为阳性的受试者被正确鉴定为阳性的比例(例如，正确地鉴定出患有所测试的疾病或医学病状的那些受试者)。例如，这可能包括将受试者正确鉴定为患有TBI(与未患有TBI的受试者不同)，将受试者正确鉴定为患有中度、重度或中度至重度TBI(与患有轻度TBI的受试者不同)，将受试者鉴定为患有轻度TBI(与患有中度、重度或中度至重度TBI的受试者不同)，将受试者正确鉴定为患有中度、重度或中度至重度TBI(与未患有TBI的受试者不同)或者将受试者正确鉴定为患有轻度TBI(与未患有TBI的受试者不同)等。
如本文所用，测定的“特异性”是指结局为阴性的受试者被正确地鉴定为阴性的比例(例如，正确地鉴定出未患有所测试的疾病或医学病状的那些受试者)。例如，这可能包括正确鉴定出患有TBI的受试者(与未患有TBI的受试者不同)，正确鉴定出未患有中度、重度或中度至重度TBI的受试者(与患有轻度TBI的受试者不同)，将受试者正确鉴定为未患有轻度TBI(与患有中度、重度或中度至重度TBI的受试者不同)，或将受试者正确鉴定为未患有任何TBI，或将受试者鉴定未患有轻度TBI(与未患有TBI的受试者不同)等。
如本文所用的“特异性结合”或“特异性地结合”可以是指抗体、蛋白质或者肽与第二化学品的相互作用，其中相互作用依赖于化学品上具体结构(例如，抗原决定簇或表位)的存在；例如，抗体识别并结合特定的蛋白质结构，而不是广泛结合蛋白质。如果抗体对表位“A”是特异性的，则在含被标记的“A”和抗体的反应中，含表位A的分子(或者游离的未标记A)的存在将会降低与抗体结合的被标记的A的量。
“特异性结合配偶体”是特异性结合对的成员。特异性结合对包含两个不同分子，其通过化学或物理方式彼此特异性结合。因此，除常见免疫测定的抗原与抗体特异性结合对之外，其他特异性结合对可以包括生物素与抗生物素蛋白(或链霉抗生物素蛋白)；碳水化合物与凝集素；互补核苷酸序列；效应分子与受体分子；辅因子与酶；酶和酶抑制剂等。此外，特异性结合对可包括是原始特异性结合成员的类似物的成员，例如分析物-类似物。免疫反应性特异性结合成员包括分离的或重组产生的抗原、抗原片段和抗体，包括单克隆和多克隆抗体以及其复合物和片段。
如本文所用的“统计学显著”是指两个或多个变量之间的关系由除随机机会之外的因素引起的可能性。将统计假设检验用于确定数据集的结果是否具有统计学上的显著性。在统计假设检验中，每当观察到的检验统计值的p值小于研究定义的显著性水平，就会获得统计学显著的结果。p值是获得至少与观察到的结果一样极端的结果的概率，前提是零假设为真。统计假设分析的示例包括Wilcoxon符号秩检验、t检验、卡方检验或Fisher精确检验。如本文所用，“显著”是指尚未确定为统计学显著的变化(例如，它可能尚未经过统计假设检验)。
如本文可互换使用的“受试者”和“患者”是指任何脊椎动物，包括但不限于哺乳动物(例如，牛、猪、骆驼、美洲驼、马、山羊、兔、绵羊、仓鼠、豚鼠、猫、狗、大鼠和小鼠，非人类灵长类动物(例如，猴子，诸如食蟹猴或恒河猴、黑猩猩等)和人类)。在一些实施方案中，受试者可以为人或非人。在一些实施方案中，受试者是人。受试者或患者可以正在接受其他形式的治疗。在一些实施方案中，受试者为可能正在接受其他形式的治疗的人。在一些实施方案中，受试者是人类帮助受试者，例如，马、狗或帮助人类执行其日常任务(例如，伴侣动物)或职业(例如，服务性动物)的其他物种。
如本文所用的“测试条”可以包括一种或多种吸水或非吸水材料。如果测试条包括多于一种材料，则一种或多种材料优选地流体连通。测试条的一种材料可以覆盖在测试条的另一种材料上，诸如像滤纸覆盖在硝化纤维素上。替代地或另外，测试条可以包括包含一种或多种材料的区域，随后是包含一种或多种不同材料的区域。在这种情况下，这些区域是流体连通的并且可以或可以不彼此部分重叠。测试条的合适材料包括但不限于来源于纤维素的材料，诸如滤纸、色谱纸、硝化纤维素和乙酸纤维素，以及由玻璃纤维、尼龙、聚对苯二甲酸乙二醇酯(例如，DACRON牌聚合物)、PVC、聚丙烯酰胺、交联葡聚糖、琼脂糖、聚丙烯酸酯、陶瓷材料等制成的材料。可以任选地对测试条的一种或多种材料进行处理以改变它们的毛细管流动特征或所施加样品的特征。例如，可以用缓冲液处理测试条的样品施加区域以校正所施加样品的pH、盐浓度或比重，从而优化测试条件。
一种或多种材料可以是单一结构，诸如切割成条的薄片，或者它可以是粘合至诸如在薄层色谱法中发现的支持物或固体表面的多个条状或微粒材料，并且可以具有吸收垫可以作为整体部分或与液体接触。材料还可以是其上具有泳道的片材，其能够点样以促使泳道形成，其中可以在每个泳道中进行单独的测定。材料可以具有矩形、圆形、椭圆形、三角形或其他形状，只要有至少一个测试溶液通过毛细管迁移而行进的方向即可。可能出现其他的行进方向，诸如在中心与测试溶液接触的椭圆形或圆形片。然而，主要的考虑是有至少一个流向预定部位的方向。
在支持物为需要或必要时，测试条的支持物通常是不溶于水的，常常是无孔且刚性的，但也可以是有弹性的，通常是疏水且多孔的，并且通常具有与测试条相同的长度和宽度，但可以更大或更小。支持材料可以是透明的，并且当组装本公开的测试装置时，透明的支持材料可以在测试条的可被使用者查看的侧面，使得透明支持材料在测试条可能暴露于外部环境的位置(诸如通过测试装置前面的开孔)上方形成保护层。可以采用多种不可移动和不可移动的材料，均是天然的和合成的，及其组合，只要支持物不干扰一种或多种材料、或非特异性结合测定部件的毛细管作用或干扰信号产生系统即可。例示性聚合物包括聚乙烯、聚丙烯、聚(4-甲基丁烯)、聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸酯、聚(对苯二甲酸乙二醇酯)、尼龙、聚(丁酸乙烯酯)、玻璃、陶瓷、金属等。弹性支持物可由聚氨酯、氯丁橡胶、乳胶、硅橡胶等制成。
“治疗(Treat/treating/treatment)”各自在本文中可互换用于描述逆转、减轻或抑制这种术语所适用的疾病和/或损伤的进展，或这种疾病的一种或多种症状。根据受试者的病状，所述术语还是指预防疾病，并且包括预防疾病的发作或预防与疾病相关的症状。治疗可以以急性或慢性方式进行。所述术语还是指在受疾病折磨之前降低与这种疾病相关的疾病或症状的严重程度。在折磨之前的这种预防疾病或降低疾病严重程度是指不在受疾病折磨的施用时间将药物组合物施用至受试者。“预防”还是指预防疾病或与这种疾病相关的一种或多种症状的复发。“治疗”和“治疗性地”是指治疗的行为，正如“治疗”如上所定义的。
如本文可互换使用的“创伤性脑损伤”或“TBI”是指具有广谱症状和失能的复杂损伤。TBI很多时候是类似于其他损伤的急性事件。TBI可以分为“轻度”、“中度”、“中度至重度”或“重度”。TBI的原因是多种多样的，并且包括例如人的身体摇动、车祸、枪械损伤、脑血管意外(例如中风)、跌倒、爆炸或冲击波以及其他类型的钝力创伤。TBI的其他原因包括摄入和/或暴露于一种或多种火、化学品或毒素(诸如霉菌、石棉、杀虫剂和杀昆虫剂、有机溶剂、油漆、胶水、气体(诸如一氧化碳、硫化氢和氰化物)、有机金属(诸如甲基汞、四乙基铅和有机锡)、一种或多种滥用药物或其组合)。替代地，TBI可能发生在患有自身免疫疾病、代谢紊乱、脑肿瘤、缺氧、病毒感染(例如，SARS-CoV-2、脑膜炎等)、真菌感染、细菌感染(例如，脑膜炎)、脑积水或其任何组合的受试者中。青年人和老年人是TBI风险最高的年龄组。在本文的某些实施方案中，创伤性脑损伤或TBI不包括并且特别地排除脑血管意外，诸如中风。
如本文所用的“轻度TBI”是指受试者可能或可能不经历意识丧失的头部损伤。对于经历意识丧失的受试者，它通常是短暂的，通常只持续几秒钟或几分钟。轻度TBI也被称为脑震荡、轻微头部创伤、轻微TBI、轻微脑损伤和轻微头部损伤。虽然MRI和CT扫描常常是正常的，但患有轻度TBI的个体可能具有认知问题，诸如头痛、思维困难、记忆问题、注意力缺陷、情绪波动和沮丧。
轻度TBI是最普遍的TBI，并且在初始损伤时常常被遗漏。通常，受试者具有在13-15之间(诸如13-15或14-15)的格拉斯哥昏迷量表分数。百分之十五(15％)的轻度TBI患者的症状持续3个月或更长时间。轻度TBI的常见症状包括疲劳、头痛、视力障碍、记忆力丧失、注意力/集中力差、睡眠障碍、头晕/失去平衡、应激性情绪障碍、抑郁情感和癫痫。与轻度TBI相关的其他症状包括恶心、嗅觉丧失、对光和声音的敏感性、情绪变化、迷茫或混乱、和/或思维迟钝。
如本文所用的“中度TBI”是指脑损伤，其中意识丧失和/或混乱和定向障碍在1与24小时之间并且受试者具有9-13(诸如9-12或9-13)之间的格拉斯哥昏迷量表评分。患有中度TBI的个体可能具有异常的脑成像结果。
如本文所用的“重度TBI”是指脑损伤，其中意识丧失超过24小时并且在损伤或穿透性颅骨损伤后记忆丧失长过24小时并且受试者具有3-8之间的格拉斯哥昏迷量表分数。缺陷的范围为从较高水平的认知功能损害到昏迷状态。幸存者可能具有有限的手臂或腿部功能、言语或语言异常、思维能力丧失或情绪问题。具有重度损伤的个体可能会长期处于无反应状态。对于许多患有重度TBI的人来说，通常需要长期康复以最大限度地发挥功能和独立性。
如本文所用的“中度至重度”TBI是指一系列脑损伤，其包括随时间从中度到重度TBI的变化，并且因此包括(例如，时间上)单独中度TBI、单独重度TBI和组合的中度至重度TBI。例如，在一些临床情况下，受试者可能最初被诊断为患有中度TBI，但随着时间的推移(几分钟、几小时或几天)，进展为患有重度TBI(例如，在当有脑出血的情况下)。替代地，在一些临床情况下，受试者最初可能被诊断为患有重度TBI，但随着时间的推移(数分钟、数小时或数天)，进展为患有中度TBI。此类受试者将是可归类为“中度至重度”的患者的示例。中度至重度TBI的常见症状包括认知缺陷，包括注意力、集中力、注意力分散性、记忆力、运算速度方面的困难、混乱、持续言语、冲动、语言处理和/或“执行功能”、不理解口语词(感觉性失语症)、说话和被理解困难(表达性失语症)、言语不清、说话速度很快或很慢、阅读问题、写作问题、解释触摸、温度、运动、肢体位置和精细辨别困难、将感觉印象整合或模式化成对心理有意义的数据、部分或全部视力丧失、眼肌无力和双视(复视)、视力模糊、判断距离的问题、不自主的眼球运动(眼球震颤)、不耐受光(畏光)、听力问题(诸如听力减弱或丧失、耳中有鸣声(耳鸣)、对声音的敏感性增加)、嗅觉丧失或减弱(嗅觉缺失症)、味觉丧失或减弱、与癫痫相关的惊厥，所述惊厥可能是几种类型并且可能涉及意识、感官知觉或运动肌移动、对肠和膀胱的控制问题、失眠、耐力丧失、食欲改变、体温调节问题、月经困难、依赖行为、情绪能力或稳定性问题、缺乏动力、易怒、攻击性、抑郁、去抑制或拒绝/缺乏意识。患有中度至重度TBI的受试者可能具有3-12的格拉斯哥昏迷量表评分(其包括中度TBI的9-12范围和重度TBI的3-8范围)。
如本文可互换使用的“泛素羧基末端水解酶L1”或“UCH-L1”是指由人体内的UCH-L1基因和其他物种中的UCH-L1基因对应物编码的去泛素化酶。UCH-L1(也称为泛素羧基末端酯酶L1和泛素硫酯酶)是产物水解泛素的小C-末端加合物以产生泛素单体的基因家族的成员。
“UCH-L1状态”可以意指在某个时间点的UCH-L1的水平或量(诸如，使用UCH-L1的单个测量值)、与监测相关的UCH-L1的水平或量(诸如，对受试者进行重复测试以鉴定UCH-L1量的增加或减少)、与创伤性脑损伤(无论是原发性脑损伤和/或继发性脑损伤)的治疗相关的UCH-L1的水平或量或其组合。
“变体”在本文中用于描述因氨基酸的插入、缺失或保守性取代而在氨基酸序列方面不同，但保留至少一种生物活性的肽或多肽。“生物活性”的代表性实例包括被特异性抗体结合或促进免疫反应的能力。变体还在本文中用于描述具有与参考蛋白基本上相同的氨基酸序列的蛋白质，所述参考蛋白具有保留至少一种生物活性的氨基酸序列。氨基酸的保守性取代，即以相似特性(例如，亲水性、带电区的程度和分布)的不同氨基酸来，替换氨基酸，在本领域中被公认为通常涉及微小变化。如本领域中所理解的，这些微小变化可以部分通过考虑氨基酸的亲疏水性指数来鉴定。Kyte等人,J.Mol.Biol.157:105-132(1982)。氨基酸的亲水指数是基于其疏水性和电荷的考虑。本领域中已知的是具有相似亲水指数的氨基酸可以被取代并仍然保留蛋白质功能。在一个实施方案中，亲水性指数为±2的氨基酸被取代。氨基酸的亲水性还可用于揭示将产生保留生物功能的蛋白质的取代。在肽的情境下考虑氨基酸的亲水性允许计算所述肽最大的局部平均亲水性，其是一种已经被报道与抗原性和免疫原性良好关联的有用量度。美国专利号4,554,101以引用的方式全部并入本文。如本领域中所了解的，具有相似亲水性值的氨基酸的取代可以产生保留生物活性(例如免疫原性)的肽。可以用具有彼此在±2内的亲水性值的氨基酸进行取代。氨基酸的疏水性指数和亲水性值两者都受所述氨基酸的特定侧链影响。与观察结果一致的是，与生物功能相容的氨基酸取代被理解为取决于氨基酸、并且特别是那些氨基酸的侧链的相对相似性，如通过疏水性、亲水性、电荷、大小以及其他特性所揭示的。“变体”也可用于指抗UCH-L1抗体的抗原反应性片段，其在氨基酸序列方面与抗UCH-L1抗体的相应片段不同，但仍具有抗原反应性并且可以与用于与UCH-L1结合的抗UCH-L1抗体的相应片段竞争。“变体”也可以用于描述已经差别地加工(诸如通过蛋白水解、磷酸化或其他翻译后修饰)，但仍保留它的抗原反应性的多肽或其片段。
“载体”在本文中用于描述可以转运其已连接的另一核酸的核酸分子。一种类型的载体是“质粒”，所述质粒是指可以将额外的DNA区段连接到其中的环状双链DNA环。另一种类型的载体是病毒载体，其中额外的DNA区段可以被连接到病毒基因组中。某些载体可以在它们被引入的宿主细胞中自主复制(例如，包含细菌复制起点的细菌载体和附加型哺乳动物载体)。其他载体(例如，非附加型哺乳动物载体)可以在被引入宿主细胞中之后整合至宿主细胞的基因组中，并由此与宿主基因组一起复制。此外，某些载体能够指导它们所可操作地连接的基因的表达。此类载体在本文中被称为“重组表达载体”(或者简单地，“表达载体”)。一般来讲，在重组DNA技术中有用的表达载体通常呈质粒的形式。“质粒”和“载体”可互换使用，因为质粒是最常用的载体形式。然而，可以使用起等同功能的其他形式的表达载体，诸如病毒载体(例如复制缺陷型逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)。就这一点而言，载体的RNA型式(包括RNA病毒载体)也可以用于本公开的上下文中。
如本文所用，“区”是指测试条上的区。在一些实施方案中，区可以是“试剂区”。如本文所用的“试剂区”是指测试条的提供试剂的区域。试剂区可以在试剂垫上，即测试条上所包括的吸水或非吸水材料的单独区段，或者它可以是测试条的还包括其他区(诸如分析物检测区)的吸水或非吸水材料的区域。试剂区可以携带可检测标记，其可以是直接标记或间接标记。优选地，试剂以在干燥状态下固定而在潮湿状态下移动的形式提供。试剂可以是特异性结合成员、分析物或分析物类似物、酶、底物、指示剂、信号产生系统的组分、化学品或化合物诸如缓冲剂、还原剂、螯合剂、表面活性剂等，其有助于测试条测定的功能。
在其他实施方案中，区可以为测试结果区。本文所用的“测试结果区”是指测试条的提供指示分析物的存在的可检测信号的区域。测试结果区可以包括对分析物具有特异性的经固定的结合试剂(“特异性结合成员”)和/或与分析物反应的酶。测试结果区可以包括一个或多个分析物检测区，例如“测试线”。还可以在测试结果区中提供可以允许或增强分析物检测的其他物质，诸如底物、缓冲液、盐。信号产生系统的一种或多种成员可以直接或间接地与检测区结合。测试结果区可以任选地包括一个或多个对照区(例如，“对照线”)，其指示测试已正确进行。
除非本文另外定义，否则结合本公开使用的科学和技术术语将具有由本领域普通技术人员通常所理解的含义。例如，结合本文中描述的细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学和蛋白质及核酸化学以及杂交使用的任何命名法以及其技术是本领域中熟知并且常用的那些。术语的含义和范围应为清晰的；然而，如果存在任何隐含歧义，则本文中所提供的定义优先于任何字典或外来定义。此外，除非上下文另外要求，否则单数术语应包括复数并且复数术语应包括单数。
2.用于检测获自受试者的样品中GFAP、UCH-L1、或者UCH-L1和GFAP两者的存在或量的侧向流测定、装置和方法
在一个实施方案中，本公开涉及侧向流测定。侧向流测定一般来讲作为侧向流装置或测试装置的一部分提供，其包括侧向流测试条(例如，硝化纤维素或滤纸)、样品应用区域(例如，样品垫)、测试结果区域(例如，显示结果的区域(例如，呈测试线或呈数值))、任选的对照结果区域(例如，对照线)以及与可检测标记结合的分析物特异性结合配偶体(例如，有色粒子或酶检测系统)。参见例如美国专利号6,485,982、6,187,598、5,622,871、6,548,309、6,565,808和6,809,687以及美国专利公布号2004/0184954，其各自以引用的方式并入本文。
在一些实施方案中，进行侧向流测定以确定样品中GFAP的存在(例如，定性确定)或量(例如，定量确定)(例如像，通过使用至少一种特异性结合搭配物，诸如抗GFAP抗体)。例如，可以使用侧向流测定以通过使用至少一种特异性结合配偶体和第二特异性结合配偶体来确定样品中GFAP的存在或量，所述至少一种特异性结合配偶体特异性结合GFAP上的表位，所述第二特异性结合配偶体包含可检测标记并且特异性结合GFAP上与第一特异性结合配偶体相比不同的表位。在其他实施方案中，可以使用侧向流测定以确定样品中UCH-L1的存在(例如，定性确定)或量(例如，定量确定)(例如像，通过使用至少一种特异性结合配偶体，诸如抗UCH-L1抗体)。例如，侧向流测定通过使用至少一种特异性结合配偶体和第二特异性结合配偶体来确定样品中UCH-L1的存在或量，所述至少一种特异性结合配偶体特异性结合UCH-L1上的表位，所述第二特异性结合配偶包含可检测标记并且特异性结合UCH-L1上与第一特异性结合配偶体相比不同的表位。在另外的实施方案中，使用侧向流测定确定样品中GFAP和UCH-L1中的每一种的存在或量。在一些实施方案中，使用至少两种单独的侧向流测定以确定样品中GFAP和UCH-L1的存在或量(例如像，通过使用至少一种针对GFAP的第一特异性结合配偶体，诸如抗GFAP抗体，和至少一种针对UCH-L1的第二特异性结合配偶体，诸如抗UCH-L1抗体)。如果使用至少两种单独的侧向流测定来确定样品中GFAP和UCH-L1的存在或量，则可以同时或以任何次序依序进行测定。在其他实施方案中，可以使用单一侧向流测定来确定样品中GFAP和UCH-L1的存在或量。例如，可以使用单一侧向流测定来确定样品中GFAP上的至少一个表位(例如像，通过使用至少一种针对GFAP的第一特异性结合配偶体)和UCH-L1上的至少一个表位(例如像，使用至少一种针对UCH-L1的第二特异性结合配偶体)的存在或量，如本文先前所述。在其他实施方案中，侧向流测定检测样品中的GFAP和UCH-L1。
在一些实施方案中，本公开涉及一种测试装置，其包括提供特异性结合测定(例如免疫测定)的浸渍了试剂的测试条。在一些实施方案中，将样品应用至测试条的一部分并且使其渗透通过条材料，通常借助于洗脱溶剂诸如水和/或合适的缓冲液。在另外的实施方案中，条材料还可以包含去污剂。样品前进至测试条中的检测区中或通过检测区，在检测区中固定了怀疑在样品中的针对分析物(例如，GFAP、UCH-L1、或者GFAP和UCH-L1)的至少一种特异性结合配偶体(例如，至少一种抗体)或其片段或变体。样品中存在的任何分析物(例如，GFAP、UCH-L1、或者GFAP和UCH-L1)可以在检测区内变成结合的。分析物(例如，GFAP、UCH-L1、或者GFAP和UCH-L1)在所述区中变成结合的程度可以借助于经标记的试剂(例如，用可检测标记标记的特异性结合配偶体，诸如像，经标记的抗GFAP抗体和/或经标记的抗UCH-L1抗体)确定，所述经标记的试剂同样可以并入在测试条中或随后应用于测试条。更具体地，在一些实施方案中，侧向流装置包括单个条带，其含有针对UCH-L1的特异性结合配偶体(例如，至少一种抗体)和至少一种针对GFAP的特异性结合配偶体(例如，至少一种抗体)。样品中存在的任何UCH-L1和/或GFAP都可以在测试条中的检测区中变成结合的，如前文所讨论。在其他实施方案中，侧向流装置包括至少两个单一条，含有针对UCH-L1的特定结合配偶体(例如，至少一种抗体)的第一条和含有针对GFAP的特定结合配偶体(例如，至少一种抗体)的第二条。样品中存在的任何UCH-L1和/或GFAP都可以在每个相应条中的检测区中变成结合的。
在一些实施方案中，分析测试装置包括由湿气不可透的固体材料构成的中空壳体，所述壳体含有干燥的多孔载体，所述载体直接或间接地与壳体的外部连通，使得可以将液体测试样品应用至多孔载体。在一些实施方案中，装置还包括分析物的标记的特异性结合配偶体，并且当处于潮湿状态时，标记的特异性结合配偶体在多孔载体内自由移动。在一些实施方案中，装置包括相同分析物的未标记特异性结合配偶体，并且未标记试剂永久固定在载体材料上的检测区中，因此在潮湿状态下不可移动。经标记的试剂和检测区的相对定位使得应用于测试装置的液体样品可以拾取经标记的试剂并随后渗透到检测区中，并且测试装置提供经标记的试剂进入待观测的检测区中的程度(如果有的话)。
本公开的另一个实施方案涉及一种测试装置，其包括多孔固相材料，所述多孔固相材料在第一区中携带经标记的试剂，所述经标记的试剂在多孔材料处于干燥状态时保留在第一区中，但当多孔材料例如通过应用怀疑含有分析物的水性液体样品而润湿时自由迁移通过多孔材料。在一些实施方案中，多孔材料在空间上与第一区不同的第二区中包括未标记特异性结合配偶体(例如，重组抗原和/或抗体)，其对分析物具有特异性并且能够与标记的试剂一起参与“三明治”或“竞争”反应。未标记特异性结合配偶体牢固地固定在多孔材料上，使得当多孔材料处于潮湿状态时它不自由迁移。
在其他实施方案中，本公开还提供一种方法，其中使本文所述的测试装置与怀疑含有分析物的水性液体样品接触，使得样品通过毛细管作用经由第一区渗透通过多孔固相材料到第二区中，并且经标记的试剂随即从第一区迁移到第二区，通过观察经标记的试剂在第二区中变成结合的程度(如果有的话)确定样品中分析物的存在。
在一些实施方案中，经标记的试剂为针对分析物(例如，GFAP和/或UCH-L1)的特定结合配偶体。经标记的试剂、分析物(当存在时)和经固定的未标记特定结合配偶体共同完成“夹心”反应。如果样品中存在分析物，则这样导致经标记的试剂在第二区中被结合。在夹心形式中，两种结合试剂对分析物上的不同表位具有特异性(例如，特异性地结合至不同的表位)。
在一些实施方案中，经标记的试剂为针对分析物的抗体(例如，用可检测标记标记的抗GFAP抗体和/或用可检测标记标记的抗UCH-L1抗体)、分析物本身(例如，与可检测标记缀合的GFAP和/或与可检测标记物缀合的UCH-L1)或其片段或变体。在一些实施方案中，经标记的抗体或经标记的分析物或者其片段或变体通过多孔固相材料迁移至第二区中，并且与经固化的试剂结合。样品中存在的分析物(例如，GFAP和/或UCH-L1)在此结合反应中与经标记的实际竞争。这种竞争导致在第二区中结合的经标记的试剂的量减少，并且在第二区中观察到的信号强度与在样品中不存在分析物的情况下观察的信号相比随之降低。
在一些实施方案中，测试条(例如，载体材料)包含硝化纤维素。这相比于一些其他条材料(诸如纸)具有相当大的优势，因为它具有天然的结合蛋白质，而无需事先敏化的能力。特异性结合配偶体，诸如抗体(诸如抗GFAP抗体、抗UCH-L1抗体或者抗GFAP抗体和抗UCH-L1抗体)，可以直接应用于硝化纤维素并固定在其上。不需要化学处理，其可能干扰试剂基本的特异性结合活性。然后可以使用简单的材料(诸如聚乙烯醇)封闭硝化纤维素上未使用的结合位点。此外，硝化纤维素有多种孔径，并且这有利于选择适合特殊要求诸如样品流速的载体材料。
在一些实施方案中，本公开包括使用一种或多种附接至特异性结合配偶体之一的直接标记。在一些实施方案中，所述技术使用包括以下的标记，例如，胶体金属(例如，金或银粒子(例如，金纳米粒子、银纳米粒子等)的溶胶或胶体悬浮液)、胶体非金属(例如，硒或碲粒子在流体(通常为水或水性缓冲液)中的溶胶或胶体悬浮液)、颜色或染料(例如，染料溶胶)、乳胶粒子(包括有色或无色乳胶粒子)或其任何组合。在一些实施方案中，标记产生即时的分析结果，而无需添加另外的试剂以使可检测信号显现。此外，这种标记是肉眼可见的，例如，不需要使用读取UCH-L1、GFAP或者UCH-L1和GFAP的量的装置(例如，读取器或读取装置)。它们稳固且稳定，并且因此可以容易地在干燥状态下储存的分析测试装置中使用。例如，可以通过使用可溶性釉料来调节它们与水性样品接触时的释放。
在一些实施方案中，本文所述的测试装置的开发涉及技术特征的选择，所述技术特征使直接经标记的特异性结合配偶体能够在基于载体的分析测试装置(例如，基于条形式的装置)中使用，以得到快速且清晰的结果。在一些实施方案中，测定结果以视觉方式显示(例如，可用眼睛辨别)，并且为了有利于这一点，直接标记必须集中在检测区中。为实现此目的，直接经标记的试剂应可容易且快速地通过显影液运输。此外，优选的是，将整个显影样品液导向相对较小的检测区，以便增加获得的可观察的结果的概率。在其他实施方案中，测定结果呈数值显示。在这些实施方案中，在结果为数值形式的情况下，可以任选地使用读取器或读取装置，例如，以产生显示的值。
在一些实施方案中，本公开包括在包含硝化纤维素的载体材料上使用经直接标记的特异性结合配偶体。在一些实施方案中，硝化纤维素的孔径为至少约一微米。在一些实施方案中，硝化纤维素的孔径不大于约20微米。在一些实施方案中，直接标记为球形或近球形的有色乳胶粒子，并且其最大直径不大于约0.5微米。在一些实施方案中，此类粒子的大小范围为约0.05至约0.5微米。
在一些实施方案中，多孔固相材料连接至多孔接收构件，液体样品可以应用至多孔接收构件并且样品可从多孔接收构件渗透到多孔固相材料中。在一些实施方案中，多孔固相材料容纳在湿气不可透的壳体或外壳内，并且与多孔固相材料连接的多孔接收构件延伸出外壳并且可以用作用于允许液体样品进入外壳并渗透多孔固相材料的手段。外壳应设置有使多孔固相材料的第二区(携带经固定的未标记特异性结合配偶体)可从外壳的外部观察到，使得可以观察到测定结果的手段，例如，适当放置的开孔。如果需要，外壳还可以设置有另外的手段，其使多孔固相材料的另一区可从外壳的外部观察到，并且所述另一区并入对照试剂，从而能够指示测定程序是否已经完成。在一些实施方案中，外壳设置有可移除的盖体或护罩，其可以在使用前的储存期间保护突出的多孔接收构件。在一些实施方案中，如果需要，在应用样品之后，可以在进行测定程序的同时将盖体或护罩重新放置在突出的多孔接收构件上方。任选地，可以将经标记的试剂并入在测试装置内的其他位置，例如，在吸水样品收集构件中。
在一些实施方案中，测试装置呈适合在医院或分散的环境中使用的试剂盒提供。例如，测试装置可以在急救医疗诊所、药房、杂货店或其他便利店、住宅、工作场所和/或政府办公室中使用。在其他实施方案中，测试装置呈适合最终使用者(例如，作为自我测试)使用的试剂盒提供。在一些实施方案中，试剂盒包括多个(例如，两个)测试装置，其单独地包裹在湿气不可透的包装材料中并且连同给使用者的适当说明一起包装。例如，在此实施方案中，试剂盒包括用于检测样品中GFAP的存在或量的第一侧向流装置和/或用于检测样品中UCH-L1的存在或量的第二侧向流装置。在其他实施方案中，试剂盒包括单一测试装置，其单独地包裹在湿气不可透的包装材料中并且与给使用者的适当说明一起包装。例如，在此实施方案中，试剂盒包括侧向流装置，其容纳一个或多个用于检测样品中GFAP和/或UCH-L1的存在或数量的条。
在一些实施方案中，测试装置包括多孔样品接收构件。在一些实施方案中，测试装置包括中空细长壳体，其容纳干燥的多孔硝化纤维素载体，所述多孔硝化纤维素载体经由从壳体突出的吸水样品接收构件与壳体的外部间接连通。在一些实施方案中，多孔样品接收构件由任何能够快速吸收液体的吸水、多孔或纤维材料制成。材料的多孔性可以是单向的(例如，孔隙或纤维完全或主要平行于构件的轴线延伸)或多向的(全向的，使得构件具有无定形海绵样结构)。可以使用多孔塑料材料，诸如聚丙烯、聚乙烯(优选分子量非常高)、聚偏二氟乙烯、乙烯-乙酸乙烯酯、丙烯腈和聚四氟乙烯。在制造期间用表面活性剂对构件进行预处理可以是有利的，例如，其降低构件中任何固有的疏水性，并且因此增强其快速且有效地吸收并递送潮湿样品的能力。多孔样品接收构件还可以由纸或其他纤维素材料(诸如硝化纤维素)制成。现在用于所谓的纤维笔的笔尖的材料是特别合适的，并且此类材料可以被成型或挤压成适合于本发明的情境的各种长度和横截面。在一些实施方案中，选择构成多孔接收构件的材料使得多孔构件可以在大约数秒内被水性液体饱和。优选地，材料在潮湿时保持稳固，并且出于这个原因，在多孔接收构件从外壳突出的任何实施方案中，纸和类似材料不是优选的。然后液体必须从多孔样品接收构件自由渗透到多孔固相材料中。
在一些实施方案中，测试装置包括任选的“对照区”。当存在时，“对照”区可以被设计成向使用者传达测试装置已工作这一无关信号。例如，对照区可以负载将结合来自第一区的经标记的抗体(例如，经标记的兔IgG)的抗体(例如，抗兔IgG)，以确认样品已经渗透测试条。在一些实施方案中，第一区包括与分析物(例如，GFAP和/或UCH-L1)无关并且在对照区处被特异性捕获的抗原和/或抗体。在一些实施方案中，对照区可以含有无水试剂，当其潮湿时，产生颜色变化或形成颜色，例如当通过水性样品潮湿时将变成蓝色的无水硫酸铜。作为另外的替代方案，对照区可以含有经固定的分析物，其与来自第一区的过量经标记的试剂反应。由于对照区的目的是向使用者指示测试已完成的目，对照区应位于记录所需测试结果的第二区的下游。因此，阳性对照指示剂告诉使用者样品已通过测试装置渗透了所需的距离。
标记可以是可以容易检测到存在的任何实体。在一些实施方案中，标记为直接标记，例如，在其自然状态下，可用肉眼或者借助于光学滤光器和/或施加的刺激(例如，促进荧光的UV光)容易地看见的实体。例如，微小的有色粒子(诸如，染料溶胶，金属溶胶(例如，金)和有色乳胶粒子)是非常合适的。标记集中至小区或体积中得到可容易检测的信号，例如颜色强烈的区域。如果需要，这可以通过眼睛或通过仪器来评价。
在其他实施方案中，公开包括使用间接标记。可以使用间接标记，诸如酶，例如碱性磷酸酶和辣根过氧化物酶，但是这些间接标记通常需要添加一种或多种显影试剂(诸如底物)才可以检测到可见信号。可以将此类另外的试剂并入在多孔固相材料中或样品接收构件(如果存在的话)中，使得它们溶解或分散在水性液体样品中。替代地，可以在与多孔材料接触之前将显影试剂添加到样品中，或者可在结合反应发生之后将多孔材料暴露于显影试剂。
可以通过共价键合(如果需要)或通过疏水键合将标记与特异性结合配偶体偶联。
在一些实施方案中，经标记的试剂随着液体样品前进至检测区与液体样品一起迁移。在其他实施方案中，样品流继续超出检测区，并且将足够的样品应用至多孔材料，使得这种情况可以发生，并且来自第一区的任何过量的经标记的试剂(其不参与第二区中的任何结合反应)都通过这种连续的流动冲离检测区。如果需要，可以在载体材料的远侧端部设置吸收“槽”。例如，吸收槽可以包括例如Whatman 3MM色谱纸，以提供足够的吸收容量，允许从检测区洗掉任何未结合的缀合物。作为这种槽的替代方案，具有延伸超出检测区的一定长度的多孔固相材料可以是足够的。
在一些实施方案中，来自在第二区中变成结合的标记的信号的存在或强度提供样品中GFAP、UCH-L1、或者GFAP和UCH-L1的定性(例如，存在)或定量(例如，量)测量结果。还可以使用在多孔固相材料上连续布置的多个检测区(水性液体样品可以逐步通过它们)，以提供GFAP、UCH-L1、或者GFAP和UCH-L1的定量测量结果，或者可以将所述多个检测区单独负载不同的特异性结合剂，以提供多分析物测试。
在一些实施方案中，第二区域中经固定的特异性结合配偶体为特异性结合GFAP、UCH-L1、或者GFAP和UCH-L1的抗体(例如，单克隆抗体)。在涉及夹心反应的技术的实施方案中，经标记的试剂同样为特异性结合GFAP、UCH-L1、或者GFAP和UCH-L1的抗体(例如，单克隆抗体)。经固定的抗体和经标记的抗体应各自与GFAP、UCH-L1、或者GFAP和UCH-L1上的不同表位结合。
在一些实施方案中，载体材料为条或片材的形式，将试剂应用至其空间上不同的区中，并且使液体样品通过片材或条从一侧或端部渗透至另一侧或端部。
在一些实施方案中，本公开的测试装置并入了两个或更多个离散的多孔固相材料的主体，例如单独的条或片材，其各自携带移动和经固定的试剂。这些离散的主体可以平行布置，例如，使得将液体样品单次应用至测试，同时引发离散的主体中的样品流。可以以这种方式确定的单独的分析结果可以用作对照结果。如果在不同的载体上使用不同的试剂，则可以同时测定单个样品中的多种分析物。替代地，可以将多个样品单独地应用至一系列载体并同时分析。
在其他实施方案中，测试装置能够进行两种或更多次侧向流测定。装置中所含的每个侧向流分析可以并入一种或多种固相材料，例如条或片材，其各自携带移动和经固定的试剂。
在一些实施方案中，构成多孔固相的材料为硝化纤维素。这样具有以下优势，即第二区中的抗体可以被牢固地固定，而无需事先进行化学处理。例如，如果多孔固相材料包括纸，则第二区中抗体的固定需要通过化学偶联，例如使用CNBr、羰基二咪唑或三氟乙磺酰氯来进行。
在一些实施方案中，在将抗体应用至检测区之后，可以对多孔固相材料的剩余部分进行处理以封闭其他地方的任何剩余的结合位点。封闭可以例如通过用蛋白质(例如，牛血清白蛋白或乳蛋白)或用聚乙烯醇或乙醇胺，或这些剂的任何组合来实现。然后可以将第一区的经标记的试剂分配到干燥载体上，并且当其处于潮湿状态时，将在载体中移动。在这些不同的工艺步骤(敏化、应用未标记试剂、封闭和应用经标记的试剂)中每一者之间，都对多孔固相材料进行干燥。
在一些实施方案中，将经标记的实际应用至载体作为表面层，而不是浸渍在载体的厚度中，例如以当多孔材料被样品湿润时帮助经标记的试剂的自由移动。这可以使载体材料与经标记的试剂之间的相互作用最小化。在一些实施方案中，在待应用经标记的试剂的区域中用上釉材料预处理载体。例如，可以通过将糖或纤维素(例如蔗糖或乳糖)水溶液沉积在载体的相关部分上，并且干燥来实现上釉。然后可以将经标记的试剂应用至经上釉的部分。在一些实施方案中，载体材料的剩余部分未被上釉。
在一些实施方案中，多孔固相材料为硝化纤维素片材，其孔径为至少约1微米，例如大于约5微米(例如，约8至约12微米)。在其他实施方案中，硝化纤维素片材的标称孔径高达约12微米。
在一些实施方案中，硝化纤维素片材被例如塑料片背衬，以增加其处理强度。这可以通过在背衬材料片材上形成薄的硝化纤维素层来容易地制造。以这种方式背衬的硝化纤维素的实际孔径倾向于低于对应的未背衬材料的实际孔径。在一些实施方案中，经预成形的硝化纤维素片材可以紧密地夹在两个固体材料支撑片材(例如，塑料片材)之间。
在一些实施方案中，水性样品通过多孔固相材料的流速为在未处理的材料中，水性液体在不多于2分钟内以约1cm的速率迁移，但是如果需要，也可以以较慢的流速迁移。在一些实施方案中，选择区之间的空间分离和多孔载体材料的流速特征，以允许足够的反应时间，在此期间可以发生必要的特异性结合，并且允许第一区中经标记的试剂溶解或分散在液体样品中并迁移通过载体。可以通过在样品中掺入粘度调节剂(例如，糖和改性纤维素)减缓试剂迁移，来进一步控制这些参数。
在其他实施方案中，将第二区中经固定的试剂浸渍在第二区中载体的整个厚度内(例如，如果载体为片材或带的形式，则浸渍在片材或条的整个厚度内)。这种浸渍可以增强经固定的试剂可以捕获迁移样品中存在的任何分析物的程度。
试剂可以以多种方式应用于载体材料。可以使用各种“印刷”技术来将液体试剂应用于载体，例如，微量注射器、使用计量泵的笔、直接印刷和喷墨印刷，并且本发明的情景中可以使用这些技术中的任一种。为了有利于制造，可用试剂处理载体(例如，片材)，然后将其细分为更小的部分(例如，各自包括所需含试剂的区的小窄条)，以提供多个相同的载体单元。
因此，本公开的一些实施方案提供了一种测试条。测试条的一个端部为待应用样品的样品点。此样品点包括样品垫，将样品转移至所述样品垫。将经标记的特异性结合配偶体(例如，抗体或抗原)掺入在样品点或样品垫中或样品点的下游，测试样品的经标记的特异性结合配偶体。在本文所提供的本公开的一些实施方案中，测定测试装置包括经标记的抗GFAP抗体、经标记的抗UCH-L1抗体或者经标记的抗GFAP抗体和经标记的抗UCH-L1抗体。
在一些实施方案中，金属溶胶粒子通过将分析物(例如，GFAP、UCH-L1、或者GFAP和UCH-L1)与金粒子上直接偶联来制备。另外，经标记的组分可以通过使用生物素/抗生物素蛋白键联将分析物与粒子偶联来制备。在后者方面，物质可以是生物素酰化的并且含金属的粒子可以包覆有抗生物素蛋白化合物。然后，可以将分析物上的生物素与粒子上的抗生物素蛋白化合物反应，以将物质和粒子偶联在一起。在本发明的另一替代形式中，经标记的组分可以通过将分析物与载体诸如牛血清白蛋白(BSA)、钥孔血蓝蛋白(KLH)或卵清蛋白偶联并且使用这与金属粒子结合来制备。
在一些实施方案中，金属溶胶粒子通过本领域中熟知的方法制备。例如，可以使用如G.Frens,Nature,241,20-22(1973)所公开的金溶胶粒子的制备，其内容以引用的方式并入本文。另外，金属溶胶粒子可以包括金属或金属化合物或者包覆有金属或金属化合物的聚合物核，如美国专利号4,313,734中所述，其内容以引用的方式并入本文中。可以使用本领域中熟知的其他方法将分析物附接到金粒子。这些方法包括但不限于共价偶联和疏水键合。金属溶胶粒子可以由铂、金、银、硒或铜或任何数量的表现出特征颜色的金属化合物制成。
在一些实施方案中，分析物不附接至金属溶胶粒子，而是附接至经染色或经荧光标记的微粒，诸如乳胶、聚苯乙烯、葡聚糖、二氧化硅、聚碳酸酯、甲基丙烯酸甲酯或碳。金属溶胶粒子、经染色的粒子或经荧光标记的微粒应肉眼可见(例如，呈有色线)或能够用适当的仪器或读取装置(例如，读取器)(分光光度计、荧光读取器等)读取。各种实施方案提供了许多将金标记的抗原沉积在条上的方法。例如，在一些实施方案中，将金标记的抗原/抗体沉积在矩形或方形吸收垫上并在其上干燥，并且将吸收垫定位在条上应用样品的位置的下游。在其他实施方案中，分析物附接至微球。这样增加给定区域中反应性位点(表位)的数量。可以通过各种方法将分析物附接至这些交替的固相。在一些实施方案中，蛋白质中的疏水或静电结构域用于被动涂层。将球体悬浮液在超声处理后与在水中或在磷酸盐缓冲溶液中的抗原/抗体混合，然后将它们在室温下孵育10-75分钟。然后将混合物离心，并且将含有抗原/抗体连接的微球的沉淀物在室温下于含有1-5％重量/体积的牛血清白蛋白(BSA)的缓冲液中悬浮1小时。BSA封闭微球上任何未反应的表面。再一次离心之后，将球体重新悬浮在缓冲液(具有5％ BSA的TBS)中，并且在约4℃下储存直至使用。
在一些实施方案中，固相粒子包括已知的水分散性粒子，诸如像美国专利号3,088,875中公开的聚苯乙烯乳胶粒子，所述专利以引用的方式并入本文。这种固相材料仅仅由抗原/抗体能够结合的小的水不溶性的粒子的悬浮液组成。合适的固相粒子还公开于例如美国专利号4,184,849、4,486,530和4,636,479中，每个专利都以引用的方式并入本文。
在一些实施方案中，分析物(例如，GFAP和/或UCH-L1)附接至荧光微球或荧光微粒。特征性地，荧光微球在固体外部基质中或微球内部体积中掺入荧光染料。荧光球通常通过荧光读取装置或读取器检测，荧光读取装置或读取器在一个波长下激发分子并且在另一个波长下检测荧光波的发射。例如，Nile Red粒子在526nm处激发并在574nm处发射，FarRed在680nm处激发并在720nm处发射，并且Blue在365nm处激发并在430nm处发射。在侧向流形式中，荧光微粒的检测涉及使用具有适当激发源(例如，HeNe、氩、钨或二极管激光器)和适当的发射滤波器的反射读取装置或读取器以进行检测。使用二极管激光器允许使用检测高于600nm的使用低成本激光器的检测系统。大多数背景荧光来自发射低于550nm的荧光的分子。
在一些实施方案中，荧光微球包含表面官能团，诸如羧酸酯、硫酸酯或醛基团，使它们适合于与蛋白质和其他含胺生物分子的共价偶联。此外，硫酸酯、羧基和脒微球为疏水粒子，其被动吸收几乎任何蛋白质或凝集素。因此涂层与非荧光微球类似。在一些实施方案中，将荧光球悬浮液在超声处理后与在水中或在磷酸盐缓冲溶液中的抗原/抗体混合，然后将它们在室温下孵育约10至约75分钟。EDAC(可溶性碳二亚胺)、琥珀酰亚胺酯和异硫氰酸酯以及其他交联剂可以用于将蛋白质和凝集素与微球上共价偶联。在蛋白质附接到微粒表面后，将混合物离心，并且将含有与荧光微粒连接的抗原或抗体的沉淀物悬浮在含有1-5％牛血清白蛋白的缓冲液中一小时。再一次离心之后，将球体重新悬浮在缓冲液(具有5％BSA的TBS或其他适当的缓冲液)中，并且在约4℃下储存直至使用。
在一些实施方案中，固相粒子包括例如乳胶粒子或其他支持材料粒子，诸如二氧化硅、琼脂糖、玻璃、聚丙烯酰胺、聚甲基丙烯酸甲酯、羧酸改性乳胶和琼脂糖凝胶。优选地，粒子的大小从约0.2微米变化至约10微米。在一些实施方案中，粒子包覆有以本领域本身已知的方式与其偶联的抗原层包被，以呈现固相组分。
因此，其他实施方案涉及提供怀疑含有GFAP、UCH-L1、或者GFAP和UCH-L1的样品，GFAP、UCH-L1、或者GFAP和UCH-L1在测试条上与第一经标记的抗体(例如，抗GFAP抗体、抗UCH-L1抗体或者抗GFAP抗体和抗UCH-L1抗体)反应以形成第一抗体-GFAP、UCH-L1、或者GFAP和UCH-L1复合物。形成后，第一抗体-GFAP、UCH-L1、或者GFAP和UCH-L1复合物开始沿着测试条前进到测试条的检测区中或通过检测区，检测区含有至少一种结合与第一抗体不同的表位的第二抗体并且形成第一经标记的抗体-GFAP、UCH-L1、或者GFAP和UCH-L1-第二抗体复合物，其被检测。
在其他实施方案中，测试条包括三个结合点。例如，第一结合点结合GFAP或UCH-L1。第二结合点结合UCH-L1或GFAP，取未在第一结合点结合的那个。第三结合点用于对照。更具体地说，每个结合点都呈沿着测试条宽度的条纹线的形式。每个结合位点都包含抗体。通过另一个实例，在一些实施方案中，抗GFAP抗体或抗UCH-L1抗体位于第一结合点，并且抗UCH-L1或抗GFAP抗体位于第二结合点。第一和第二结合点处的一种或两种抗体可以用可检测标记进行标记。在对照点，固定了针对对照物质(例如，经标记的抗体或抗原)的抗体。
因此，本文提供了至少一种针对GFAP的侧向流测定和/或至少一种针对UCH-L1的侧向流测定。在一些实施方案中，至少一种针对GFAP的侧向流测定和/或至少一种针对UCH-L1的侧向流测定各自在或能够在小于约30分钟内进行。在一些其他实施方案中，至少一种针对GFAP的侧向流测定和/或至少一种针对UCH-L1的侧向流测定各自在或能够在小于约25分钟内进行。在另外的实施方案中，至少一种针对GFAP的侧向流测定和/或至少一种针对UCH-L1的测量流测定各自在或能够在小于约20分钟内进行。在其他实施方案中，至少一种针对GFAP的侧向流测定和/或至少一种针对UCH-L1的侧向流测定各自在或能够在小于约18分钟内进行。在其他实施方案中，至少一种针对GFAP的侧向流测定和/或至少一种针对UCH-L1的侧向流测定各自在或能够在小于约15分钟内进行。在其他实施方案中，至少一种针对GFAP的侧向流测定和/或至少一种针对UCH-L1的侧向流测定各自在或能够在范围为约4至约20分钟的时间内，任选地在范围为约10至约15分钟的时间内进行。在另外的实施方案中，至少一种针对GFAP的侧向流测定和/或至少一种针对UCH-L1的侧向流测定各自在或能够在范围为约15至约18分钟的时间内进行。
在一些实施方案中，至少一种针对GFAP的侧向流测定和/或至少一种针对UCH-L1的侧向流测定各自在或能够在约4分钟内进行。在一些实施方案中，至少一种针对GFAP的侧向流测定和至少一种针对UCH-L1的侧向流测定各自在或能够在约5分钟内进行。在一些实施方案中，至少一种针对GFAP的侧向流测定和/或至少一种针对UCH-L1的侧向流测定各自在或能够在约6分钟内进行。在一些实施方案中，至少一种针对GFAP的侧向流测定和/或至少一种针对UCH-L1的侧向流测定各自在或能够在约7分钟内进行。在一些实施方案中，至少一种针对GFAP的侧向流测定和/或至少一种针对UCH-L1的侧向流测定各自在或能够在约8分钟内进行。在一些实施方案中，至少一种针对GFAP的侧向流测定和/或至少一种针对UCH-L1的侧向流测定各自在或能够在约9分钟内进行。在一些实施方案中，至少一种针对GFAP的侧向流测定和/或至少一种针对UCH-L1的侧向流测定各自在或能够在约10分钟内进行。在一些实施方案中，至少一种针对GFAP的侧向流测定和/或至少一种针对UCH-L1的侧向流测定各自在或能够在约11分钟内进行。在一些实施方案中，至少一种针对GFAP的侧向流测定和/或至少一种针对UCH-L1的侧向流测定各自在或能够在约12分钟内进行。在一些实施方案中，至少一种针对GFAP的侧向流测定和/或至少一种针对UCH-L1的侧向流测定各自在或能够在约13分钟内进行。在一些实施方案中，至少一种针对GFAP的侧向流测定和/或至少一种针对UCH-L1的侧向流测定各自在或能够在约14分钟内进行。在一些实施方案中，至少一种针对GFAP的侧向流测定和/或至少一种针对UCH-L1的侧向流测定各自在或能够在约15分钟内进行。在一些实施方案中，至少一种针对GFAP的侧向流测定和/或至少一种针对UCH-L1的侧向流测定各自在或能够在约16分钟内进行。在一些实施方案中，至少一种针对GFAP的侧向流测定和/或至少一种针对UCH-L1的侧向流测定各自在或能够在约17分钟内进行。在一些实施方案中，至少一种针对GFAP的侧向流测定和/或至少一种针对UCH-L1的侧向流测定各自在或能够在约18分钟内进行。在一些实施方案中，至少一种针对GFAP的侧向流测定和/或至少一种针对UCH-L1的侧向流测定各自在或能够在约19分钟内进行。在一些实施方案中，至少一种针对GFAP的侧向流测定和/或至少一种针对UCH-L1的侧向流测定各自在或能够在约20分钟内进行。在一些实施方案中，至少一种针对GFAP的侧向流测定和/或至少一种针对UCH-L1的侧向流测定各自在或能够在约25分钟内进行。在一些实施方案中，至少一种针对GFAP的侧向流测定和/或至少一种针对UCH-L1的侧向流测定各自在或能够在约30分钟内进行。
在另一个实施方案中，本公开涉及一种系统，其包括侧向流装置或测试条、读取装置或读取器、数据分析器和存储器。读取装置或读取器包括用于接收侧向流装置或来自侧向流装置的测试条的端口或开口。当将侧向流装置或来自侧向流装置的测试条装到端口或开口中时，读取装置或读取器获得来自装置或测试条的光强度测量结果。在一些实施方案中，光强度测量结果可以未经过滤，或者相对于至少一个波长和偏振进行过滤。数据分析器根据一个或多个光强度测量结果计算至少一个参数。对测试条进行的测定的结果可以通过读取装置或读取器传达。在其他实施方案中，本文所述的系统不含读取装置或读取器。在此类实施方案中，系统可以包括侧向流装置或测试条和具有存储器的计算机。对测试条进行的测定的结果可以输入到计算机中。
在其他实施方案中，本公开涉及使用本文所述的侧向流测定和侧向流装置以用于确定获自受试者的样品中GFAP、UCH-L1、或者GFAP和UCH-L1的存在或量以评估、确定和/或诊断受试者是否遭受损伤和/或是否患有疾病或其他医学病状的方法。例如，确定GFAP、UCH-L1、或者GFAP和UCH-L1的存在或量可以用于评估和/或确定受试者是否遭受头部损伤(例如像，创伤性脑损伤)，是否患有中风(诸如缺血性中风)，是否患有SARS-CoV-2或是否患有阿尔茨海默病。通过另一个实例，确定GFAP的存在或量可以用于评估、确定和/或诊断受试者是否遭受头部受伤(例如像，创伤性脑损伤)，是否患有中风(诸如缺血性中风)、脑内出血或星形细胞损伤(诸如由SARS-CoV-2引起的损伤)，或者是否患有阿尔茨海默病、亚历山大病、癌症(例如像，神经胶母细胞瘤)或感染(诸如弓蛔虫卵、神经莱姆病(lymeneuroborreliosis)等)。通过另一个实例，确定UCH-L1的存在或量可以用于评估、确定和/或诊断受试者是否遭受头部损伤(例如像，创伤性脑损伤)，是否患有中风(诸如缺血性中风)、神经元凋亡(例如像，由深低温停循环引起的神经元凋亡)，或者是否患有白质病变(皮层下)、帕金森病或阿尔茨海默病。在一些实施方案中，所述方法使用免疫测定进行。免疫测定可以为酶联免疫吸附测定(ELISA)或侧向流免疫测定(LFA)。
在其他实施方案中，本公开涉及用于使用本文所述的侧向流测定和侧向流装置确定获自可能遭受或已经遭受头部损伤的受试者的样品中GFAP、UCH-L1、或者GFAP和UCH-L1的存在或量的方法。在一些实施方案中，侧向流测定为免疫测定。在一些实施方案中，所述方法涉及通过进行侧向流测定来检测获自受试者的样品中GFAP、UCH-L1、或者GFAP和UCH-L1的测定。在一些实施方案中，侧向流测定为免疫测定。在其他实施方案中，所述方法涉及通过进行侧向流测定来确定获自受试者的样品中GFAP、UCH-L1、或者GFAP和UCH-L1的水平是否升高。在一些实施方案中，侧向流测定为免疫测定。在其他实施方案中，确定(1)样品中GFAP、UCH-L1、或者GFAP和UCH-L1的存在；或者(2)受试者的GFAP、UCH-L1、或者GFAP和UCH-L1的水平是否升高，帮助诊断并评价受试者是否已遭受头部损伤。在一些实施方案中，用于确定(1)样品中GFAP、UCH-L1、或者GFAP和UCH-L1的存在；或者(2)受试者的GFAP、UCH-L1、或者GFAP和UCH-L1的水平是否升高的方法，可以帮助确定受试者是否需要另外的诸如通过头部计算机断层(CT)扫描和/或磁共振成像(MRI)程序的评价。
在一些实施方案中，GFAP的视觉检测限(LOD)在约0.5pg/mL至约1250pg/mL、约1pg/mL至约1250pg/mL、约2pg/mL至约1250pg/mL、约3pg/mL至约1250pg/mL、约4pg/mL至约1250pg/mL、约5pg/mL至约1250pg/mL、约6pg/mL至约1250pg/mL、约7pg/mL至约1250pg/mL、约8pg/mL至约1250pg/mL、约9pg/mL至约1250pg/mL、约10pg/mL至约1250pg/mL或约15pg/mL至约1250pg/mL之间，并且/或者UCH-L1的视觉检测限在约0.5pg/mL至约1250pg/mL、约1pg/mL至约1250pg/mL、约2pg/mL至约1250pg/mL、约3pg/mL至约1250pg/mL、约4pg/mL至约1250pg/mL、约5pg/mL至约1250pg/mL、约6pg/mL至约1250pg/mL、约7pg/mL至约1250pg/mL、约8pg/mL至约1250pg/mL、约9pg/mL至约1250pg/mL、约10pg/mL至约1250pg/mL约15pg/mL至约1250pg/mL、约20pg/mL至约1250pg/mL、约25pg/mL至约1250pg/mL、约50pg/mL至约1250pg/mL、约100pg/mL至约1250pg/mL或200pg/mL至约1250pg/mL之间。在一些其他实施方案中，GFAP的视觉检测限在约20pg/mL至约125pg/mL之间，并且/或者UCH-L1的视觉检测限在约250pg/mL至约1250pg/mL之间。在一些其他实施方案中，GFAP的视觉检测限在约25pg/mL至约125pg/mL之间，并且/或者UCH-L1的视觉检测限在约300pg/mL至约1250pg/mL之间。在其他实施方案中，GFAP的视觉检测限在约30pg/mL至约125pg/mL之间，并且UCH-L1的视觉检测限在约300pg/mL至约1250pg/mL之间。在其他实施方案中，GFAP的视觉检测限在约35pg/mL至约125pg/mL之间，并且/或者UCH-L1的视觉检测限在约350pg/mL至约1250pg/mL之间。在另外的实施方案中，GFAP的视觉检测限在约35pg/mL至约100pg/mL之间，并且/或者UCH-L1的检测限在约350pg/mL至约750pg/mL之间。在其他实施方案中，GFAP的视觉检测限在约35pg/mL至约50pg/mL之间，并且/或者UCH-L1的视觉检测限在约35pg/mL至约500pg/mL之间。在另外的实施方案中，在优化(例如，测定、测定组分、视觉显示或数值转化)的情况下，针对GFAP、UCH-L1以及GFAP和UCH-L1的视觉检测限可以进一步降低，诸如灵敏度高5倍、灵敏度高10倍、灵敏度高20倍、灵敏度高25倍、灵敏度高30倍、灵敏度高40倍、灵敏度高50倍、灵敏度高60倍、灵敏度高70倍、灵敏度高80倍、灵敏度高90倍或灵敏度高100倍。
本文所述的方法利用至少一个获自受试者(例如，人类受试者)的样品。在一些实施方案中，样品在实际或怀疑头部损伤之后的约48小时内获得。在其他实施方案中，样品在实际或怀疑头部损伤之后的约24小时内获得。在其他实施方案中，样品在实际或怀疑头部损伤之后的约12小时内获得。在一些实施方案中，样品在实际或怀疑头部损伤的损伤约48小时内从受试者(例如，人类受试者)取得。例如，样品可以在实际或怀疑头部损伤之后的约0分钟、约1分钟、约2分钟、约3分钟、约4分钟、约5分钟、约6分钟、约7分钟、约8分钟、约9分钟、约10分钟、约11分钟、约12分钟、约13分钟、约14分钟、约15分钟、约20分钟、约30分钟、约60分钟、约90分钟内、约2小时内、约3小时内、约4小时内、约5小时内、约6小时内、约7小时内、约8小时内、约9小时内、约10小时内、约11小时内、约12小时内、约13小时内、约14小时内、约15小时内、约16小时内、约17小时内、约18小时内、约19小时内、约20小时内、约21小时内、约22小时内、约23小时内、约24小时内、约25小时内、约26小时内、约27小时内、约28小时内、约29小时内、约30小时内、约31小时内、约32小时内、约33小时内、约34小时内、约35小时内、约36小时内、约37小时内、约38小时内、约39小时内、约40小时内、约41小时内、约42小时内、约43小时内、约44小时内、约45小时内、约46小时内、约47小时内或约48小时内从受试者(例如，人类受试者)取得。
在其他实施方案中，本文所述的方法、测定和侧向流装置还包括当在受试者的样品中检测出GFAP、UCH-L1、或者GFAP和UCH-L1的存在时，对受试者进行头部计算机断层(CT)扫描、磁共振成像(MRI)程序或CT扫描和MRI程序两者。例如，在另外的实施方案中，所述方法还包括当在受试者的样品中检测出GFAP、UCH-L1、或者GFAP和UCH-L1的存在时，对受试者进行头部CT扫描。在另外的实施方案中，所述方法还包括当在受试者的样品中检测出GFAP、UCH-L1、或者GFAP和UCH-L1的存在时，对受试者进行MRI程序。在另外的实施方案中，所述方法还包括当在受试者的样品中检测出GFAP、UCH-L1、或者GFAP和UCH-L1的存在时，对受试者进行头部CT扫描和MRI程序。
在其他实施方案中，本文所述的方法还包括当受试者的GFAP、UCH-L1、或者GFAP和UCH-L1的水平升高时，对受试者进行头部计算机断层(CT)扫描、磁共振成像(MRI)程序或CT扫描和MRI程序两者。例如，在一些实施方案中，所述方法还包括当受试者的GFAP、UCH-L1、或者GFAP和UCH-L1的水平升高时，对受试者进行头部CT扫描。作为另一实例，在一些实施方案中，所述方法还包括当受试者的GFAP、UCH-L1、或者GFAP和UCH-L1的水平升高时，对受试者进行MRI程序。在其他实施方案中，所述方法还包括当受试者的GFAP、UCH-L1、或者GFAP和UCH-L1的水平升高时，对受试者进行头部CT扫描和MRI程序。
在其他实施方案中，所述方法还包括当未检测出样品中GFAP、UCH-L1、或者GFAP和UCH-L1的存在时，不对受试者进行头部计算机断层(CT)扫描、磁共振成像(MRI)程序或头部CT扫描和MRI程序两者。在其他实施方案中，所述方法还包括当受试者的GFAP、UCH-L1、或者GFAP和UCH-L1的水平未升高时，不对受试者进行头部计算机断层(CT)扫描、磁共振成像(MRI)程序或者头部CT扫描和MRI程序两者。换句话讲，所述方法涉及当(1)在样品中未检测出GFAP、UCH-L1、或者GFAP和UCH-L1的存在；或(2)受试者的GFAP、UCH-L1、或者GFAP和UCH-L1水平未升高时，排除对头部CT扫描、MRI程序或两者的需要。
在一些实施方案中，所述方法还包括当(1)在受试者的样品中检测出GFAP、UCH-L1、或者GFAP和UCH-L1的存在；或(2)确定受试者的GFAP、UCH-L1、或者GFAP和UCH-L1的水平升高时，治疗受试者的轻度、中度、中度至重度或重度TBI。例如，在一些实施方案中，所述方法还包括当(1)在受试者的样品中检测出GFAP、UCH-L1、或者GFAP和UCH-L1的存在；或(2)确定受试者的GFAP、UCH-L1、或者GFAP和UCH-L1的水平升高时，治疗受试者的轻度TBI。在一些实施方案中，所述方法还包括当(1)在受试者的样品中检测出GFAP、UCH-L1、或者GFAP和UCH-L1的存在；或(2)确定受试者的GFAP、UCH-L1、或者GFAP和UCH-L1的水平升高时，治疗受试者的中度至重度TBI。在一些实施方案中，所述方法还包括当(1)在受试者的样品中检测出GFAP、UCH-L1、或者GFAP和UCH-L1的存在；或(2)确定受试者的GFAP、UCH-L1、或者GFAP和UCH-L1的水平升高时，治疗受试者的重度TBI。在一些实施方案中，可以通过来自头部CT扫描、MRI程序或两者(如果对受试者进行)的结果促进适当治疗的选择。例如，来自头部CT扫描和/或MRI程序的结果可以有助于进一步区分受试者的轻度、中度至重度或重度TBI。这种区分可以有助于为受试者选择适当治疗。在一些实施方案中，所述方法还包括当受试者的GFAP、UCH-L1、或者GFAP和UCH-L1的水平升高时，监测受试者。
在一些实施方案中，所述方法还包括用创伤性脑损伤治疗来治疗被评估为患有轻度、中度、重度或中度至重度创伤性脑损伤的受试者(例如，人类受试者)，如下所述。在其他实施方案中，所述方法还包括用创伤性脑损伤治疗来治疗被评估为患有轻度创伤性脑损伤的受试者(例如，人类受试者)，如下所述。在其他实施方案中，所述方法还包括用创伤性脑损伤治疗来治疗被评估为患有中度创伤性脑损伤的受试者(例如，人类受试者)，如下所述。在其他实施方案中，所述方法还包括用创伤性脑损伤治疗来治疗被评估为患有重度创伤性脑损伤的受试者。在一些实施方案中，所述方法还包括监测被评估为患有轻度创伤性脑损伤的受试者(例如，人类受试者)，如下所述。在其他实施方案中，所述方法还包括监测被评估为患有中度创伤性脑损伤的受试者(例如，人类受试者)，如下所述。在其他实施方案中，所述方法还包括监测被评估为患有重度创伤性脑损伤的受试者(例如，人类受试者)，如下所述。在其他实施方案中，所述方法还包括监测被评估为患有中度至重度创伤性脑损伤的受试者(例如，人类受试者)。
3.治疗和监测罹患创伤性脑损伤的受试者
当(1)检测出GFAP、UCH-L1、或者GFAP和UCH-L1的存在；或(2)确定GFAP、UCH-L1、或者GFAP和UCH-L1的水平升高时，可以治疗或监测在本文所述的方法、侧向流测定和侧向流装置中鉴定或评估的受数字和(例如，人类受试者)。在一些实施方案中，所述方法还包括在(1)检测出样品中GFAP、UCH-L1、或者GFAP和UCH-L1的存在；或(2)受试者被确定为GFAP、UCH-L1、或者GFAP和UCH-L1的水平升高的情况下，用创伤性脑损伤治疗来治疗受试者(例如，人类受试者)，诸如本领域中已知的任何治疗。例如，创伤性脑损伤的治疗可以根据头部损伤的严重程度采取多种形式。例如，对于患有轻度TBI的受试者，治疗可以包括一次或多次休息，放弃体育锻炼(如运动)，避光或在阳光下戴太阳眼镜，缓解头痛或偏头痛的药物，抗恶心药物等。对患有中度、重度或中度至重度TBI的患者的治疗可能包括施用一种或多种合适的药物(例如利尿药、抗惊厥药物、用于使人镇静并使之陷入药物性昏迷的药物或者其他药学或生物药学药物(已知或未来开发用于TBI的治疗)、一种或多种外科手术(例如血肿切除、颅骨骨折修复、减压颅骨切除术等)、保护气道和一种或多种疗法(例如一种或多种康复、认知行为疗法、愤怒管理、心理咨询等)。在一些实施方案中，所述方法还包括监测受试者(例如，人类受试者)：(1)在样品中检测出GFAP、UCH-L1、或者GFAP和UCH-L1的存在的情况下(例如，其可以指示轻度、中度、重度或中度至重度创伤性脑损伤)；或(2)其被评估为GFAP、UCH-L1、或者GFAP和UCH-L1的水平升高(例如，其可以指示轻度、中度、重度或中度至重度创伤性脑损伤)。例如，监测受试者可以包括用CT扫描和/或MRI程序监测：(1)在样品中检测出GFAP、UCH-L1、或者GFAP和UCH-L1的存在的情况下；或(2)其被评估为GFAP、UCH-L1、或者GFAP和UCH-L1的水平升高。在一些实施方案中，可以用CT扫描和/或MRI监测被鉴定为患有创伤性脑损伤(诸如轻度创伤性脑损伤、中度创伤性脑损伤、重度创伤性脑损伤或中度至重度创伤性脑损伤或轻度创伤性脑损伤、中度创伤性脑损伤、重度创伤性脑损伤或中度至重度创伤性脑损伤)的受试者。
4.用于测量UCH-L1的水平的方法
在上文所述的方法、侧向流测定和侧向流装置中，可以通过任何手段测量UCH-L1水平。在一些实施方案中，测量UCH-L1的存在或量包括使样品与第一特异性结合成员和第二特异性结合成员接触。在一些实施方案中，第一特异性结合成员为捕获抗体，并且第二特异性结合成员为检测抗体。在一些实施方案中，测量UCH-L1的水平包括使样品同时或以任何次序依序与以下接触：(1)与UCH-L1或UCH-L1片段上的表位结合的捕获抗体(例如UCH-L1-捕获抗体)，以形成捕获抗体-UCH-L1抗原复合物(例如UCH-L1捕获抗体-UCH-L1抗原复合物)，以及(2)包括可检测标记并与UCH-L1上未被捕获抗体结合的表位结合的检测抗体(例如UCH-L1检测抗体)，以形成UCH-L1抗原-检测抗体复合物(例如UCH-L1抗原-UCH-L1-检测抗体复合物)，从而形成捕获抗体-UCH-L1抗原-检测抗体复合物(例如UCH-L1-捕获抗体-UCH-L1抗原-UCH-L1-检测抗体复合物)，并基于捕获抗体-UCH-L1抗原-检测抗体复合物中可检测标记产生的信号，测量样品中UCH-L1的量或浓度。
在一些实施方案中，将第一特异性结合成员固定在固体支持物上。在一些实施方案中，将第二特异性结合成员固定在固体支持物上。在一些实施方案中，第一特异性结合成员是如下所述的UCH-L1抗体。
在一些实施方案中，样品为经稀释或未稀释的。在一些实施方案中，样品是约1至约100微升。在一些实施方案中，样品是约10至约90微升。在一些实施方案中，样品为约1微升、约5微升、约10微升、约20微升、约30微升、约40微升、约50微升、约60微升、约70微升、约80微升或约90微升。在一些实施方案中，样品为约1至约85微升、约1至约80微升、约1至约75微升、约1至约65微升、约1至约50微升、约1至约40微升、约1至约30微升、约1至约20微升、约1至约10微升或约1至约5微升。在一些实施方案中，样品为约1微升、约2微升、约3微升、约4微升、约5微升、约6微升、约7微升、约8微升、约9微升、约10微升、约11微升、约12微升、约13微升、约14微升、约15微升、约16微升、约17微升、约18微升、约19微升、约20微升、约21微升、约22微升、约23微升、约24微升、约25微升、约26微升、约27微升、约28微升、约29微升、约30微升、约40微升、约50微升、约60微升、约70微升、约80微升、约90微升或约100微升。在一些实施方案中，样品为约1至约150微升或更少或者约1至约80微升或更少。
5.UCH-L1抗体
本文所述的方法可以使用特异性结合泛素羧基末端水解酶L1(“UCH-L1”)(或其片段)的分离抗体，称为“UCH-L1抗体”。UCH-L1抗体可以用于评估UCH-L1状态作为创伤性脑损伤的量度，检测样品中UCH-L1的存在，定量样品中存在的UCH-L1的量，或检测样品中UCH-L1的存在并定量其量。
a.泛素羧基末端水解酶L1(UCH-L1)
泛素羧基末端酯酶L1(“UCH-L1”)，也称为“泛素C末端水解酶”，为去泛素化酶。UCH-L1为产物水解泛素的小C末端加合物以产生泛素单体的基因家族的成员。UCH-L1的表达对神经元并且对弥漫性神经内分泌系统的细胞及其肿瘤具有高度特异性。它大量存在于所有神经元中(占总脑蛋白的1-2％)，特别在神经元和睾丸/卵巢中表达。UCH-L1的催化三联体含有在90位的半胱氨酸、在176位的天冬氨酸和在161位的组氨酸，它们负责其水解酶活性。
人UCH-L1可以具有以下氨基酸序列：
MQLKPMEINPEMLNKVLSRLGVAGQWRFVDVLGLEEESLGSVPAPACALLLLFPLTAQHENFRKKQIEELKGQEVSPKVYFMKQTIGNSCGTIGLIHAVANNQDKLGFEDGSVLKQFLSETEKMSPEDRAKCFEKNEAIQAAHDAVAQEGQCRVDDKVNFHFILFNNVDGHLYELDGRMPFPVNHGASSEDTLLKDAAKVCREFTEREQGEVRFSAVALCKAA(SEQ ID NO:1)。
人类UCH-L1可以是SEQ ID NO:1的片段或变体。UCH-L1的片段的长度可以在5与225个氨基酸之间、10与225个氨基酸之间、50与225个氨基酸之间、60与225个氨基酸之间、65与225个氨基酸之间、100与225个氨基酸之间、150与225个氨基酸之间、100与175个氨基酸之间或175与225个氨基酸之间。所述片段可以包含来自SEQ ID NO:1的许多连续的氨基酸。
b.UCH-L1识别抗体
抗体是结合UCH-L1、其片段、UCH-L1的表位或其变体的抗体。抗体可以是抗UCH-L1抗体的片段或其变体或衍生物。抗体可以是多克隆或单克隆抗体。抗体可以是嵌合抗体、单链抗体、亲和力成熟抗体、人抗体、人源化抗体、完全人抗体或抗体片段(诸如Fab片段)或其混合物。抗体片段或衍生物可以包括F(ab')2、Fv或scFv片段。抗体衍生物可以由拟肽产生。此外，描述用于生产单链抗体的技术可以适于生产单链抗体。
抗UCH-L1抗体可以是嵌合抗UCH-L1或人源化抗UCH-L1抗体。在一个实施方案中，人源化抗体和嵌合抗体都是一价的。在一个实施方案中，人源化抗体和嵌合抗体均包含与Fc区连接的单个Fab区。
人抗体可以来源于噬菌体展示技术或表达人免疫球蛋白基因的转基因小鼠。人抗体可以作为人体内免疫反应的结果产生并且被分离。参见例如Funaro等人,BMCBiotechnology,2008(8):85。因此，抗体可以是人而不是动物组库的产物。因为它是人源性的，所以可以最小化对自身抗原反应的风险。替代地，可以使用标准酵母展示文库和展示技术来选择和分离人抗UCH-L1抗体。例如，天然人单链可变片段(scFv)的文库可用于选择人抗UCH-L1抗体。可以使用转基因动物表达人抗体。
人源化抗体可以是来自非人类物种抗体的抗体分子，其结合具有来自非人类物种的一个或多个互补决定区(CDR)和来自人类免疫球蛋白分子的框架区的所需抗原。
所述抗体与已知抗体的区别在于，它具有与本领域中已知的生物学功能不同的生物学功能。
(1)表位
抗体可以免疫特异性结合UCH-L1(SEQ ID NO:1)、其片段或其变体。抗体可以免疫特异性识别并结合表位区内的至少三个氨基酸、至少四个氨基酸、至少五个氨基酸、至少六个氨基酸、至少七个氨基酸、至少八个氨基酸、至少九个氨基酸或至少有十个氨基酸。抗体可以免疫特异性识别并结合具有表位区的至少三个连续氨基酸、至少四个连续氨基酸、至少五个连续氨基酸、至少六个连续氨基酸、至少七个连续氨基酸、至少八个氨基酸连续氨基酸、至少九个连续氨基酸或至少十个连续氨基酸的表位。
c.抗体制备/产生
抗体可以通过多种技术，包括本领域技术人员熟知的那些技术中的任何一种制备。通常，抗体可以通过细胞培养技术产生，包括经由常规技术、或经由将抗体基因、重链和/或轻链转染到合适的细菌或哺乳动物细胞宿主中来产生单克隆抗体，以实现抗体的生产，其中抗体可以是重组的。术语“转染”的各种形式旨在涵盖通常用于将外源DNA引入原核或真核宿主细胞中的多种技术，例如电穿孔、磷酸钙沉淀、DEAE-葡聚糖转染等。尽管可以在原核或真核宿主细胞中表达抗体，但是在真核细胞中表达抗体是优选的，并且在哺乳动物宿主细胞中最优选，因为这种真核细胞(特别是哺乳动物细胞)比原核细胞更可能表达组装并分泌适当折叠且具有免疫活性的抗体。
用于表达重组抗体的示例性哺乳动物宿主细胞包括中国仓鼠卵巢(CHO细胞)(包括dhfr-CHO细胞，描述于Urlaub和Chasin,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,77:4216-4220(1980))，其与DHFR选择性标志物一起使用，例如如Kaufman和Sharp,J.Mol.Biol.,159:601-621(1982)中所述；NS0骨髓瘤细胞、COS细胞和SP2细胞。当将编码抗体基因的重组表达载体引入到哺乳动物宿主细胞中时，通过将宿主细胞培养一段足以允许抗体在宿主细胞中表达或者更优选使抗体分泌到宿主细胞所生长的培养基中的时间来产生抗体。可以使用标准蛋白质纯化方法从培养基中回收抗体。
宿主细胞也可以用于产生功能性抗体片段，诸如Fab片段或scFv分子。应当理解，可以对以上程序进行变型。例如，可能希望用编码抗体的轻链和/或重链的功能片段的DNA转染宿主细胞。重组DNA技术还可以用于去除编码与感兴趣的抗原结合不必要的轻链或重链中一个或两个的部分或全部DNA。所述抗体也涵盖由此类截短DNA分子表达的分子。此外，可以通过用标准化学交联方法使抗体与第二抗体交联来产生双功能抗体，其中一条重链和一条轻链是抗体(即结合人类UCH-L1)且另一重链和另一轻链对除人类UCH-L1以外的抗原具有特异性。
在用于抗体或其抗原结合部分的重组表达的优选系统中，通过磷酸钙介导的转染将编码抗体重链和抗体轻链的重组表达载体引入到dhfr-CHO细胞中。在重组表达载体内，使抗体重链和轻链基因各自可操作地连接至CMV增强子/AdMLP启动子调控元件以驱动基因高度转录。重组表达载体还携带DHFR基因，所述基因允许使用甲氨蝶呤的选择/扩增来选择已被所述载体转染的CHO细胞。培养所选择的转化株宿主细胞以便允许表达抗体重链和轻链并且从培养基中回收完整抗体。使用标准分子生物学技术制备重组表达载体，转染宿主细胞，选择转化体，培养宿主细胞，并从培养基中回收抗体。另外，合成重组抗体的方法可以是通过在合适的培养基中培养宿主细胞直到合成重组抗体。所述方法还可以包括从培养基中分离重组抗体。
制备单克隆抗体的方法涉及制备能够产生具有所需特异性的抗体的永生细胞系。此类细胞系可以由从经免疫的动物获得的脾细胞产生。可以用UCH-L1或其片段和/或变体使动物免疫。用于使动物免疫的肽可以包含编码人Fc(例如可结晶片段)或人抗体的尾区的氨基酸。然后可以通过例如与骨髓瘤细胞融合伴侣融合来使脾细胞永生化。可以采用多种融合技术。例如，可以将脾细胞和骨髓瘤细胞与非离子去污剂混合几分钟，然后以低密度铺板在支持杂交细胞而非骨髓瘤细胞的生长的选择性培养基上。一种这样的技术使用次黄嘌呤、氨基蝶呤、胸苷(HAT)选择。另一种技术包括电融合。在足够的时间(通常约1至2周)后，观察到杂种的集落。选择单个集落，并测试其培养上清液对多肽的结合活性。可以使用具有高反应性和特异性的杂交瘤。
可以从生长的杂交瘤集落的上清液中分离单克隆抗体。此外，可以采用各种技术来提高产量，诸如将杂交瘤细胞系注射到合适的脊椎动物宿主(诸如小鼠)的腹膜腔中。然后可以从腹水或血液中收获单克隆抗体。可以通过常规技术，诸如色谱法、凝胶过滤、沉淀和提取，从抗体中去除污染物。亲和色谱法是可以在纯化抗体的过程中使用的方法的实例。
蛋白水解酶木瓜蛋白酶优先切割IgG分子以产生几个片段，其中两个片段(F(ab)片段)各自包含具有完整抗原结合位点的共价异二聚体。胃蛋白酶能够切割IgG分子，以提供多个包含两个抗原结合位点的片段，包括F(ab')2片段。
Fv片段可以优选通过IgM的蛋白水解切割而产生，并且在极少数情况下可以是IgG或IgA免疫球蛋白分子。Fv片段可以使用重组技术衍生。Fv片段包括非共价的VH::VL异二聚体，其包含保留天然抗体分子的许多抗原识别和结合能力的抗原结合位点。
抗体、抗体片段或衍生物可以包含分别插置在重链框架(“FR”)组和轻链框架(“FR”)组之间的重链互补决定区(“CDR”)组和轻链互补决定区(“CDR”)组，所述框架组为CDR提供支撑并限定CDR相对于彼此的空间关系。CDR组可以包含重链或轻链V区的三个高变区。
可以使用产生或分离具有必需特异性的抗体的其他合适方法，包括但不限于从肽或蛋白质文库(例如但不限于噬菌体、核糖体、寡核苷酸、RNA、cDNA、酵母等展示库)中选择重组抗体的方法；例如，如使用本领域中已知的方法可从各种商业供应商诸如CambridgeAntibody Technologies(Cambridgeshire,UK)、MorphoSys(Martinsreid/Planegg,Del.)、Biovation(Aberdeen,Scotland,UK)BioInvent(Lund,Sweden)获得。参见美国专利号4,704,692、5,723,323、5,763,192、5,814,476、5,817,483、5,824,514、5,976,862。替代方法依赖于使能够产生人抗体组库的转基因动物(例如，SCID小鼠，Nguyen等人(1997)Microbiol.Immunol.41:901-907；Sandhu等人(1996)Crit.Rev.Biotechnol.16:95-118；Eren等人(1998)Immunol.93:154-161)免疫，如本领域中已知并且/或者如本文所述。此类技术包括但不限于核糖体展示(Hanes等人(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.USA,94:4937-4942；Hanes等人(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA,95:14130-14135)；单细胞抗体生产技术(例如，选定的淋巴细胞抗体方法(“SLAM”)(美国专利号5,627,052；Wen等人(1987)J.Immunol.17:887-892；Babcook等人(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93:7843-7848)；凝胶微滴和流式细胞术(Powell等人(1990)Biotechnol.8:333-337；One Cell Systems,(Cambridge,Mass).；Gray等人(1995)J.Imm.Meth.182:155-163；Kenny等人(1995)Bio/Technol.13:787-790)；B细胞选择(Steenbakkers等人(1994)Molec.Biol.Reports 19:125-134(1994))。
亲和力成熟的抗体可以通过本领域中已知的多种程序中的任一种产生。例如，参见Marks等人,BioTechnology,10:779-783(1992)描述了通过VH和VL结构域改组进行的亲和力成熟。对CDR和/或框架残基的随机诱变描述于Barbas等人,Proc.Nat.Acad.Sci.USA,91:3809-3813(1994)；Schier等人,Gene,169:147-155(1995)；Yelton等人,J.Immunol.,155:1994-2004(1995)；Jackson等人,J.Immunol.,154(7):3310-3319(1995)；Hawkins等人,J.Mol.Biol.,226:889-896(1992)。在选择性诱变位置和在接触或超突变位置用活性增强氨基酸残基进行的选择性突变描述于美国专利号6,914,128B1。
抗体变体还可以利用以下方式制备：将编码抗体的多核苷酸递送至合适的宿主，诸如以提供在其乳汁中产生此类抗体的转基因动物或哺乳动物，诸如山羊、牛、马、绵羊等来制备。这些方法在本领域中是已知的并且例如描述于美国专利号5,827,690、5,849,992、4,873,316、5,849,992、5,994,616、5,565,362和5,304,489中。
抗体变体还可以通过递送多核苷酸以提供转基因植物和培养的植物细胞(例如但不限于烟草、玉米和浮萍)来制备，所述转基因植物和植物细胞在植物部分或从中培养的细胞中产生此类抗体、特定部分或变体。例如，Cramer等人(1999)Curr.Top.Microbiol.Immunol.240:95-118和其中引用的参考文献描述了例如使用诱导型启动子产生表达大量重组蛋白的转基因烟草叶。转基因玉米已用于以商业生产水平表达哺乳动物蛋白，其生物活性与其他重组系统中产生的或从天然来源纯化的生物活性相同。参见例如Hood等人,Adv.Exp.Med.Biol.(1999)464:127-147和其中引用的参考文献。还已经从转基因植物种子(包括烟草种子和马铃薯块茎)中大量生产抗体变体，包括抗体片段，例如单链抗体(scFv)。参见例如Conrad等人(1998)Plant Mol.Biol.38:101-109和其中引用的参考文献。因此，还可以根据已知方法使用转基因植物产生抗体。
抗体衍生物可以例如通过添加外源序列以修饰免疫原性或减少、增强或修饰结合、亲和力、缔合速率、解离速率、亲合力、特异性、半衰期或任何其他合适的特征来产生。一般来讲，保持部分或全部非人或人CDR序列，而可变区和恒定区的非人序列被人或其他氨基酸替代。
小抗体片段可以是具有两个抗原结合位点的双抗体，其中片段包含与同一条多肽链(VH VL)中的轻链可变结构域(VL)连接的重链可变结构域(VH)。参见例如EP 404,097；WO93/11161；和Hollinger等人,(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448。通过使用太短而不允许同一条链的两个结构域之间的配对的接头，迫使结构域与另一条链的互补结构域配对并产生两个抗原结合位点。还参见Chen等人的美国专利号6,632,926，其据此以引用的方式整体并入，并且公开了具有一个或多个氨基酸插入亲本抗体的高变区中并且对靶抗原的结合亲和力比抗原的亲本抗体的结合亲和力强至少约两倍的抗体变体。
抗体可以是线性抗体。用于制备线性抗体的程序在本领域中是已知的并描述于Zapata等人,(1995)Protein Eng.8(10):1057-1062。简而言之，这些抗体包含一对串联的Fd区段(VH-CH1-VH-CH1)，其形成一对抗原结合区。线性抗体可以是双特异性或单特异性的。
可以通过已知方法从重组细胞培养物中回收和纯化抗体，所述已知方法包括但不限于蛋白A纯化、硫酸铵或乙醇沉淀、酸提取、阴离子或阳离子交换色谱法、磷酸纤维素色谱法、疏水相互作用色谱法、亲和色谱法、羟基磷灰石色谱法和凝集素色谱法。高效液相色谱法(“HPLC”)也可以用于纯化。
可检测地标记抗体可能是有用的。用于将抗体缀合至这些试剂的方法是本领域中已知的。仅出于说明的目的，抗体可以用可检测部分标记，例如放射性原子、发色团或荧光团等。这种经标记的抗体可以用于在体内或在分离的测试样品中的诊断技术。它们可以与细胞因子、配体和另一种抗体连接。用于偶联至抗体以实现抗肿瘤作用的合适的剂包括细胞因子，诸如白介素2(IL-2)和肿瘤坏死因子(TNF)；用于光动力疗法中的光敏剂，包括酞菁四磺酸铝(III)、血卟啉和酞菁；放射性核素，诸如碘-131(131I)、钇-90(90Y)、铋-212(212Bi)、铋-213(213Bi)、锝-99m(99mTc)、铼-186(186Re)和铼-188(188Re)；抗生素，诸如多柔比星、阿霉素、柔红霉素、甲氨蝶呤、道诺霉素、新抑癌素和卡铂；细菌、植物和其他毒素，诸如白喉毒素、假单胞菌外毒素A、葡萄球菌肠毒素A、相思豆毒素蛋白-A毒素、蓖麻毒素A(去糖基化蓖麻毒素A和天然蓖麻毒素A)、TGF-α毒素、来自中华眼镜蛇(眼镜蛇)的细胞毒素和白树毒素(一种植物毒素)；来自植物、细菌和真菌的核糖体失活蛋白，诸如局限曲菌素(一种由局限曲霉产生的核糖体失活蛋白)、皂草素(一种来自石碱草的核糖体失活蛋白)和RNA酶；酪氨酸激酶抑制剂；ly207702(二氟化嘌呤核苷)；含有反囊性剂的脂质体(例如，反义寡核苷酸、编码毒素的质粒、甲氨蝶呤等)；和其他抗体或抗体片段，诸如F(ab)。
经由使用杂交瘤技术、选择的淋巴细胞抗体方法(SLAM)、转基因动物和重组抗体文库进行的抗体产生在下面更详细地描述。
(1)使用杂交瘤技术的抗UCH-L1单克隆抗体
单克隆抗体可以使用本领域中已知的多种技术(包括使用杂交瘤、重组体和噬菌体展示技术或其组合)来制备。例如，可以使用杂交瘤技术产生单克隆抗体，所述杂交瘤技术包括本领域中已知的并且例如在以下文献中教导的那些：Harlow等人,Antibodies:ALaboratory Manual,第二版,(Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold SpringHarbor,1988)；Hammerling等人,Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas,(Elsevier,N.Y.,1981)。还应注意，如本文所用的术语“单克隆抗体”并不限于通过杂交瘤技术产生的抗体。术语“单克隆抗体”是指源自单一克隆的抗体，包括任何真核生物、原核生物或噬菌体克隆，而不是指产生所述抗体的方法。
产生单克隆抗体的方法以及由所述方法产生的抗体可以包括培养分泌本公开抗体的杂交瘤细胞，其中杂交瘤优选通过以下方式产生：将从用UCH-L1免疫的动物，例如大鼠或小鼠分离的脾细胞与骨髓瘤细胞融合，然后筛选由融合产生的杂交瘤中分泌能够结合本公开多肽的抗体的杂交瘤克隆。简而言之，可以用UCH-L1抗原免疫大鼠。在一个优选的实施方案中，UCH-L1抗原与佐剂一起施用以刺激免疫反应。此类佐剂包括完全或不完全弗氏佐剂、RIBI(胞壁酰二肽)或ISCOM(免疫刺激复合物)。此类佐剂可以通过将多肽隔离在局部沉积物中来保护多肽免于快速扩散，或者它们可含有刺激宿主分泌对巨噬细胞和免疫系统其他组分具有趋化性的因子的物质。优选地，如果施用多肽，则免疫方案将涉及两次或更多次施用多肽，在数周内开展；然而，也可以使用多肽的单次施用。
在用UCH-L1抗原使动物免疫后，可以从动物获得抗体和/或产生抗体的细胞。通过放血或处死动物从动物获得含有抗UCH-L1抗体的血清。可以使用从动物获得的血清，可以从血清中获得免疫球蛋白级分，或者可以从血清纯化抗UCH-L1抗体。以这种方式获得的血清或免疫球蛋白是多克隆的，因此具有一系列异质性。
一旦检测到免疫反应，例如，在大鼠血清中检测到对抗原UCH-L1具有特异性的抗体，就收获大鼠脾并分离脾细胞。然后通过熟知的技术使脾细胞与任何适合的骨髓瘤细胞(例如来自可从American Type Culture Collection(ATCC,Manassas,Va.,US))获得的细胞系SP20的细胞)融合。通过有限稀释选择并克隆杂交瘤。然后通过本领域中已知的方法测定杂交瘤克隆的分泌能够结合UCH-L1的抗体的细胞。可以通过用阳性杂交瘤克隆使大鼠免疫来产生一般来讲含有高水平抗体的腹水。
在另一个实施方案中，产生抗体的永生化杂交瘤可以从免疫化动物制备。在免疫之后，将动物处死并且将脾B细胞按本领域熟知的那样融合至永生化骨髓瘤细胞。参见例如Harlow和Lane，同上。在一个优选的实施方案中，骨髓瘤细胞不分泌免疫球蛋白多肽(非分泌型细胞系)。在融合和抗生素选择之后，使用UCH-L1、或其一部分、或表达UCH-L1的细胞筛选杂交瘤。在一个优选的实施方案中，使用酶联免疫吸附测定(ELISA)或放射免疫测定(RIA)，优选ELISA，进行初始筛选。PCT公布号WO 00/37504中提供了ELISA筛选的实例。
选择、克隆产生抗UCH-L1抗体的杂交瘤，并进一步筛选其所需特征，包括稳健的杂交瘤生长、高抗体产量和所需的抗体特征。杂交瘤可以在体内在同系动物中、在缺乏免疫系统的动物(例如，裸小鼠)中或在体外在细胞培养中培养和扩增。选择、克隆和扩增杂交瘤的方法是本领域普通技术人员所熟知的。
在一个优选的实施方案中，杂交瘤是大鼠杂交瘤。在另一个实施方案中，杂交瘤在非人、非大鼠物种诸如小鼠、绵羊、猪、山羊、牛或马中产生。在另一优选的实施方案中，杂交瘤是人杂交瘤，其中人非分泌性骨髓瘤与表达抗UCH-L1抗体的人细胞融合。
可以通过已知技术产生识别特定表位的抗体片段。例如，可以通过使用酶(诸如木瓜蛋白酶(以产生两个相同的Fab片段)或胃蛋白酶(以产生F(ab')2片段))对免疫球蛋白分子进行蛋白水解裂解来产生本公开的Fab和F(ab')2片段。IgG分子的F(ab')2片段保留了较大(“亲本”)IgG分子的两个抗原结合位点，所述IgG分子包括两条轻链(含有可变轻链区和恒定轻链区)、重链的CH1结构域和亲本IgG分子的形成二硫键的铰链区。因此，F(ab')2片段仍然能够像亲本IgG分子一样交联抗原分子。
(2)使用SLAM的抗UCH-L1单克隆抗体
在本公开的另一个实施方案中，使用本领域中称为选择淋巴细胞抗体方法(SLAM)的方法，从单一经分离的淋巴细胞产生重组抗体，如美国专利号5,627,052；PCT公布号WO92/02551；和Babcook等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,93:7843-7848(1996)中所述。在这种方法中，使用抗原特异性溶血空斑测定筛选分泌感兴趣的抗体的单细胞，例如来源于任何一只经免疫的动物的淋巴细胞，其中使用接头(诸如生物素)将抗原UCH-L1、UCH-L1的亚基或其片段与绵羊红细胞偶联，并且将其用于鉴定分泌对UCH-L1具有特异性的抗体的单细胞。在鉴定出感兴趣的抗体分泌细胞后，通过逆转录酶-PCR(RT-PCR)从细胞中拯救重链和轻链可变区cDNA，然后可以在哺乳动物宿主细胞(诸如COS或CHO细胞)中的适当的免疫球蛋白恒定区(例如，人恒定区)中的情况下表达这些可变区。用源自体内选择的淋巴细胞的扩增的免疫球蛋白序列转染的宿主细胞然后可以在体外进行进一步的分析和选择，例如，通过淘选转染的细胞以分离表达针对UCH-L1的抗体的细胞。经扩增的免疫球蛋白序列可进一步在体外操作，诸如通过体外亲和力成熟法。参见例如PCT公布号WO 97/29131和PCT公布号WO 00/56772。
(3)使用转基因动物的抗UCH-L1单克隆抗体
在本公开的另一个实施方案中，通过用UCH-L1抗原免疫包含一些或全部人类免疫球蛋白基因座的非人类动物来产生抗体。在一个实施方案中，非人类动物是转基因小鼠，一种包含人免疫球蛋白基因座的较大片段且缺乏小鼠抗体产生的工程化小鼠品系。参见例如Green等人,Nature Genetics,7:13-21(1994)和美国专利号5,916,771、5,939,598、5,985,615、5,998,209、6,075,181、6,091,001、6,114,598和6,130,364。还参见PCT公布号WO 91/10741、WO 94/02602、WO 96/34096、WO 96/33735、WO98/16654、WO 98/24893、WO 98/50433、WO 99/45031、WO 99/53049、WO 00/09560和WO 00/37504。转基因小鼠产生成人样的完全人抗体组库，并且产生抗原特异性人类单克隆抗体。转基因小鼠通过引入人重链基因座和x轻链基因座的兆碱基大小、种系构型YAC片段，包含大约80％的人抗体组库。参见Mendez等人,NatureGenetics,15:146-156(1997)；Green和Jakobovits,J.Exp.Med.,188:483-495(1998)，其公开以引用的方式并入本文。
(4)使用重组抗体文库的抗UCH-L1单克隆抗体
体外方法也可用于制备本公开抗体，其中筛选抗体文库以鉴定具有所需UCH-L1结合特异性的抗体。重组抗体文库的此类筛选的方法是本领域中熟知的，并且包括以下文献中所述的方法：例如美国专利号5,223,409(Ladner等人)；PCT公布号WO 92/18619(Kang等人)；PCT公布号WO 91/17271(Dower等人)；PCT公布号WO 92/20791(Winter等人)；PCT公布号WO 92/15679(Markland等人)；PCT公布号WO 93/01288(Breitling等人)；PCT公布号WO92/01047(McCafferty等人)；PCT公布号WO 92/09690(Garrard等人)；Fuchs等人,Bio/Technology,9:1369-1372(1991)；Hay等人,Hum.Antibod.Hybridomas,3:81-85(1992)；Huse等人,Science,246:1275-1281(1989)；McCafferty等人,Nature,348:552-554(1990)；Griffiths等人,EMBO J.,12:725-734(1993)；Hawkins等人,J.Mol.Biol.,226:889-896(1992)；Clackson等人,Nature,352:624-628(1991)；Gram等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:3576-3580(1992)；Garrard等人,Bio/Technology,9:1373-1377(1991)；Hoogenboom等人,Nucl.Acids Res.,19:4133-4137(1991)；Barbas等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,88:7978-7982(1991)；美国专利申请公布号2003/0186374；以及PCT公布号WO 97/29131，每一篇所述文献的内容通过引用并入本文。
重组抗体文库可以来自用UCH-L1或UCH-L1的一部分免疫的受试者。替代地，重组抗体文库可以来自初始受试者，即，未用UCH-L1免疫的人，诸如来自未用人UCH-L1免疫的人类受试者的人抗体文库。本公开的抗体是通过用包含人UCH-L1的肽筛选重组抗体文库来选择的，从而选择那些识别UCH-L1的抗体。用于进行这种筛选和选择的方法在本领域中是熟知的，诸如先前段落中的参考文献中所述。为了选择对UCH-L1具有特定结合亲和力的本公开的抗体，诸如以特定Koff速率常数从人UCH-L1解离的那些，可以使用本领域已知的表面等离振子共振方法选择具有所需Koff速率常数的抗体。为了选择对hUCH-L1具有特定中和活性的本公开的抗体，诸如具有特定IC50的那些，可以使用本领域中已知的用于评估UCH-L1活性的抑制的标准方法。
在一个实施方案中，本公开涉及一种结合人UCH-L1的经分离的抗体或其抗原结合部分。优选地，抗体是中和抗体。在各种实施方案中，抗体是重组抗体或单克隆抗体。
例如，还可以使用本领域中已知的各种噬菌体展示方法产生抗体。在噬菌体展示方法中，功能性抗体结构域展示在携带编码它们的多核苷酸序列的噬菌体粒子的表面上。此类噬菌体可以用于展示从组库或组合抗体文库(例如，人或鼠科动物)表达的抗原结合域。表达结合感兴趣抗原的抗原结合结构域的噬菌体可以用抗原来选择或鉴定，例如，使用标记的抗原或结合或捕获到固体表面或珠粒的抗原。这些方法中使用的噬菌体通常是丝状噬菌体，包括从噬菌体表达的fd和M13结合结构域，Fab、Fv或二硫化物稳定的Fv抗体结构域以重组方式与噬菌体基因III或基因VIII蛋白融合。可以用于制备抗体的噬菌体展示方法的实例包括在以下文献中公开的方法：Brinkmann等人,J.Immunol.Methods,182:41-50(1995)；Ames等人,J.Immunol.Methods,184:177-186(1995)；Kettleborough等人,Eur.J.Immunol.,24:952-958(1994)；Persic等人,Gene,187:9-18(1997)；Burton等人,Advances in Immunology,57:191-280(1994)；PCT公布号WO 92/01047；PCT公布号WO 90/02809；WO 91/10737；WO 92/01047；WO 92/18619；WO 93/11236；WO 95/15982；WO 95/20401；以及美国专利号5,698,426、5,223,409、5,403,484、5,580,717、5,427,908、5,750,753、5,821,047、5,571,698、5,427,908、5,516,637、5,780,225、5,658,727、5,733,743和5,969,108。
如以上参考文献中所述，在噬菌体选择之后，可以从噬菌体分离抗体编码区并且将其用于产生完整抗体，包括人抗体或任何其他所需的抗原结合片段，并且在任何所需的宿主中表达，所述宿主包括哺乳动物细胞、昆虫细胞、植物细胞、酵母和细菌，例如如下文所详述。例如，还可以使用本领域中已知的方法来采用重组产生Fab、Fab'和F(ab')2片段的技术，诸如以下文献中所公开的技术：PCT公布号WO 92/22324；Mullinax等人,BioTechniques,12(6):864-869(1992)；Sawai等人,Am.J.Reprod.Immunol.,34:26-34(1995)；和Better等人,Science,240:1041-1043(1988)。可以用于产生单链Fv和抗体的技术的实例包括美国专利号4,946,778和5,258,498；Huston等人,Methods in Enzymology,203:46-88(1991)；Shu等人,Proc.Natl.Acad,Sci.USA,90:7995-7999(1993)；和Skerra等人,Science,240:1038-1041(1988)中所述的技术。
作为通过噬菌体展示来筛选重组抗体文库的替代方案，可以应用本领域中已知用于筛选大型组合文库的其他方法来鉴定本公开的抗体。一种类型的替代表达系统是其中重组抗体文库表达为RNA-蛋白质融合物的系统，如PCT公布号WO 98/31700(Szostak和Roberts)以及Roberts和Szostak,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,94:12297-12302(1997)中所述。在这个系统中，在mRNA与它编码的肽或蛋白质之间，通过体外翻译在其3'末端携带嘌呤霉素(肽基受体抗生素)的合成mRNA，产生了共价融合。因此，可以基于所编码的肽或蛋白质(例如，抗体或其一部分)的特性(诸如抗体或其一部分与双重特异性抗原的结合)，从mRNA的复杂混合物(例如，组合文库)富集特定mRNA。可以通过如上所述的重组手段(例如，在哺乳动物宿主细胞中)表达从筛选这类文库所回收的编码抗体或其一部分的核酸序列，并且另外可以通过对突变已引入到最初选择的序列中的mRNA-肽融合物进行更多轮筛选或通过如上所述的用于重组抗体的体外亲和力成熟的其他方法来经受进一步亲和力成熟。所述方法的优选实例是PROfusion展示技术。
在另一种方法中，还可以使用本领域中已知的酵母展示方法产生抗体。在酵母展示方法中，使用遗传方法将抗体结构域拴系到酵母细胞壁并且将它们展示在酵母表面上。具体来说，这种酵母可以用于展示从组库或组合抗体文库(例如，人或鼠科动物)表达的抗原结合结构域。可以用于制备抗体的酵母展示方法的实例包括美国专利号6,699,658(Wittrup等人)中公开的方法，所述专利以引用的方式并入本文。
d.重组UCH-L1抗体的产生
抗体可以通过本领域中已知的许多技术中的任一种产生。例如，从宿主细胞表达，其中通过标准技术将编码重链和轻链的一种或多种表达载体转染到宿主细胞中。术语“转染”的各种形式旨在涵盖通常用于将外源DNA引入原核或真核宿主细胞中的多种技术，例如电穿孔、磷酸钙沉淀、DEAE-葡聚糖转染等。尽管有可能在原核或真核宿主细胞中表达本公开抗体，但优选在真核细胞且最优选哺乳动物宿主细胞中表达抗体，因为这类真核细胞(且特别是哺乳动物细胞)相比于原核细胞更有可能组装和分泌经过正确折叠且具有免疫学活性的抗体。
用于表达本公开重组抗体的示例性哺乳动物宿主细胞包括中国仓鼠卵巢(CHO细胞)(包括dhfr-CHO细胞，描述于Urlaub和Chasin,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,77:4216-4220(1980))，其与DHFR选择性标志物一起使用，例如如Kaufman和Sharp,J.Mol.Biol.,159:601-621(1982)中所述；NS0骨髓瘤细胞、COS细胞和SP2细胞。当将编码抗体基因的重组表达载体引入到哺乳动物宿主细胞中时，通过将宿主细胞培养一段足以允许抗体在宿主细胞中表达或者更优选使抗体分泌到宿主细胞所生长的培养基中的时间来产生抗体。可以使用标准蛋白质纯化方法从培养基中回收抗体。
宿主细胞也可以用于产生功能性抗体片段，诸如Fab片段或scFv分子。应当理解，可以对以上程序进行变型。例如，可能合乎需要的是用编码本公开抗体的轻链和/或重链的功能性片段的DNA转染宿主细胞。重组DNA技术还可以用于去除编码与感兴趣的抗原结合不必要的轻链或重链中一个或两个的部分或全部DNA。本公开抗体也涵盖由此类截短DNA分子表达的分子。此外，可以通过用标准化学交联方法使本公开的抗体与第二抗体交联来产生双功能抗体，其中一条重链和一条轻链是本公开的抗体(即结合人类UCH-L1)且另一重链和另一轻链对除人类UCH-L1以外的抗原具有特异性。
在用于重组表达本公开抗体、或其抗原结合部分的一个优选系统中，通过磷酸钙介导的转染将编码抗体重链和抗体轻链两者的重组表达载体引入到dhfr-CHO细胞中。在重组表达载体内，使抗体重链和轻链基因各自可操作地连接至CMV增强子/AdMLP启动子调控元件以驱动基因高度转录。重组表达载体还携带DHFR基因，所述基因允许使用甲氨蝶呤的选择/扩增来选择已被所述载体转染的CHO细胞。培养所选择的转化株宿主细胞以便允许表达抗体重链和轻链并且从培养基中回收完整抗体。使用标准分子生物学技术制备重组表达载体，转染宿主细胞，选择转化体，培养宿主细胞，并从培养基中回收抗体。另外，本公开提供一种合成本公开的重组抗体的方法，所述方法通过在适合培养基中培养本公开的宿主细胞，直到合成本公开的重组抗体来进行。所述方法还可以包括从培养基中分离重组抗体。
(1)人源化抗体
人源化抗体可以是抗体或其变体、衍生物、类似物或部分，其免疫特异性地结合感兴趣抗原并且包含基本上具有人抗体的氨基酸序列的框架(FR)区和基本上具有非人抗体的氨基酸序列的互补决定区(CDR)。人源化抗体可以来自非人类物种抗体，其结合具有来自非人类物种的一个或多个互补决定区(CDR)和来自人类免疫球蛋白分子的框架区的所需抗原。
如本文所用，在CDR的情境下的术语“基本上”是指氨基酸序列与非人抗体CDR的氨基酸序列至少90％、至少95％、至少98％或至少99％相同的CDR。人源化抗体包含至少一个且通常两个可变结构域的基本上全部(Fab、Fab'、F(ab')2、FabC、Fv)，其中全部或基本上全部CDR区对应于非人免疫球蛋白(即供体抗体)的那些CDR区并且全部或基本上全部框架区是人免疫球蛋白共有序列的那些。根据一个实施方案，人源化抗体还包含免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分，通常是人免疫球蛋白的至少一部分。在一些实施方案中，人源化抗体含有轻链以及至少重链的可变结构域两者。抗体也可以包括重链的CH1、铰链、CH2、CH3和CH4区。在一些实施方案中，人源化抗体仅含有人源化轻链。在一些实施方案中，人源化抗体仅含有人源化重链。在特定实施方案中，人源化抗体仅含有轻链和/或重链的人源化可变结构域。
人源化抗体可以选自免疫球蛋白的任何类别，包括IgM、IgG、IgD、IgA和IgE，以及任何同种型，包括但不限于IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。人源化抗体可以包含来自多于一种类别或同种型的序列，并且可以使用本领域中熟知的技术选择特定的恒定结构域以优化所需的效应子功能。
人源化抗体的框架区和CDR区无需精确对应于亲本序列，例如可以通过取代、插入或/或缺失至少一个氨基酸残基来对供体抗体CDR或共有框架进行诱变以使所述位点处的CDR或框架残基不对应于供体抗体或共有框架。然而，在一个实施方案中，此类突变将不是广泛的。通常，至少90％、至少95％、至少98％、或至少99％的人源化抗体残基将对应于亲本FR和CDR序列的那些。如本文所用，术语“共有框架”是指共有免疫球蛋白序列中的框架区。如本文所用，术语“共有免疫球蛋白序列”是指由相关免疫球蛋白序列家族中最常出现的氨基酸(或核苷酸)形成的序列(参见例如Winnaker,From Genes to Clones(Verlagsgesellschaft,Weinheim,1987))。在免疫球蛋白家族中，共有序列中的每个位置由家族中最常出现在那个位置的氨基酸占据。如果两种氨基酸出现的频率相同，则任一种氨基酸都可以纳入共有序列中。
人源化抗体可以被设计成最小化对啮齿类动物抗人抗体的不需要的免疫反应，这限制了那些部分在人类接受者中的治疗应用的持续时间和有效性。人源化抗体可具有从非人类来源引入其中的一个或多个氨基酸残基。这些非人类残基通常被称为“输入”残基，通常取自可变结构域。人源化可以通过用高变区序列代替人抗体的对应序列来进行。因此，此类“人源化”抗体是嵌合抗体，其中基本上少于完整的人类可变结构域已被来自非人类物种的对应序列取代。例如，参见美国专利号4,816,567，其内容通过引用并入本文。人源化抗体可以是人抗体，其中一些高变区残基和可能的一些FR残基被啮齿动物抗体中类似位点的残基取代。可以使用任何已知方法进行对本公开抗体的人源化或工程化，诸如但不限于美国专利号5,723,323、5,976,862、5,824,514、5,817,483、5,814,476、5,763,192、5,723,323、5,766,886、5,714,352、6,204,023、6,180,370、5,693,762、5,530,101、5,585,089、5,225,539和4,816,567中所述的那些方法。
人源化抗体可以保留对UCH-L1的高亲和力和其他有利的生物特性。人源化抗体可以通过使用亲本和人源化序列的三维模型分析亲本序列和各种概念性人源化产物的过程来制备。三维免疫球蛋白模型很常见。说明并且展示所选候选免疫球蛋白序列的可能的三维构象结构的计算机程序是可用的。检查这些展示允许分析残基在候选免疫球蛋白序列功能中的可能作用，即，对影响候选免疫球蛋白与其抗原结合的能力的残基的分析。通过这种方式，可以从接受体和输入序列中选择并组合FR残基，以使得实现所需的抗体特征，诸如对UCH-L1的亲和力增加。一般来讲，高变区残基可以直接地并且最实质性地涉及影响抗原结合。
作为人源化的替代方案，可以产生人抗体(在本文中也称为“完全人抗体”)。例如，有可能经由PROfusion和/或酵母相关技术从文库分离出人抗体。还可以产生转基因动物(例如，小鼠)，其能够在免疫后在不存在内源性免疫球蛋白产生的情况下产生人抗体的完全组库。例如，嵌合和种系突变小鼠中抗体重链连接区(JH)基因的纯合缺失导致内源性抗体产生的完全抑制。在这种种系突变小鼠中转移人种系免疫球蛋白基因阵列将导致在抗原挑战后产生人抗体。人源化或完全人抗体可以根据美国专利号5,770,429、5,833,985、5,837,243、5,922,845、6,017,517、6,096,311、6,111,166、6,270,765、6,303,755、6,365,116、6,410,690、6,682,928和6,984,720中所述的方法制备，每一个所述专利的内容通过引用并入本文。
e.抗UCH-L1抗体
可以使用上述技术以及使用本领域中已知的常规技术产生抗UCH-L1抗体。在一些实施方案中，抗UCH-L1抗体可以是未缀合的UCH-L1抗体，诸如可购自以下的UCH-L1：UnitedState Biological(目录号：031320)；Cell Signaling Technology(目录号：3524)；Sigma-Aldrich(目录号：HPA005993)；Santa Cruz Biotechnology,Inc.(目录号：sc-58593或sc-58594)；R&D Systems(目录号：MAB6007)；Novus Biologicals(目录号：NB600-1160)；Biorbyt(目录号：orb33715)；Enzo Life Sciences,Inc.(目录号：ADI-905-520-1)；Bio-Rad(目录号：VMA00004)；BioVision(目录号：6130-50)；Abcam(目录号：ab75275或ab104938)；Invitrogen Antibodies(目录号：480012)；ThermoFisher Scientific(目录号：MA1-46079、MA5-17235、MA1-90008或MA1-83428)；EMD Millipore(目录号：MABN48)；或Sino Biological Inc.(目录号：50690-R011)。抗UCH-L1抗体可以与荧光团缀合，诸如可购自BioVision(目录号：6960-25)或Aviva Systems Biology(目录号OAAF01904-FITC)的经缀合的UCH-L1抗体。
替代地，还可以使用WO 2018/067474、WO2018/081649、美国专利号11,078,298、美国公布号2019/0502127和/或Bazarian等人,“Accuracy of a rapid GFAP/UCH-L1 testfor the prediction of intracranial injuries on head CT after mild traumaticbrain injury”,Acad.Emerg.Med.,(2021年8月6日)中所述的抗体，所述文献的内容以引用的方式并入本文。
6.用于测量GFAP的水平的方法
在上文所述的方法中，可以通过任何手段测量GFAP水平。在一些实施方案中，测量GFAP的水平包括使样品与第一特异性结合成员和第二特异性结合成员接触。在一些实施方案中，第一特异性结合成员为捕获抗体，并且第二特异性结合成员为检测抗体。在一些实施方案中，测量GFAP的水平包括使样品同时或以任何次序依序与以下接触：(1)与GFAP或GFAP片段上的表位结合的捕获抗体(例如GFAP-捕获抗体)，以形成捕获抗体-GFAP抗原复合物(例如GFAP捕获抗体-GFAP抗原复合物)，以及(2)包括可检测标记并与GFAP上未被捕获抗体结合的表位结合的检测抗体(例如GFAP检测抗体)，以形成GFAP抗原-检测抗体复合物(例如GFAP抗原-GFAP-检测抗体复合物)，从而形成捕获抗体-GFAP抗原-检测抗体复合物(例如GFAP-捕获抗体-GFAP抗原-GFAP-检测抗体复合物)，并基于捕获抗体-GFAP抗原-检测抗体复合物中可检测标记产生的信号，测量样品中GFAP的量或浓度。
在一些实施方案中，将第一特异性结合成员固定在固体支持物上。在一些实施方案中，将第二特异性结合成员固定在固体支持物上。在一些实施方案中，第一特异性结合成员是如下所述的GFAP抗体。
在一些实施方案中，样品是经稀释或未稀释的。在一些实施方案中，样品是约1至约100微升。在一些实施方案中，样品是约10至约90微升。在一些实施方案中，样品为约1微升、约5微升、约10微升、约20微升、约30微升、约40微升、约50微升、约60微升、约70微升、约80微升或约90微升。在一些实施方案中，样品为约1至约85微升、约1至约80微升、约1至约75微升、约1至约65微升、约1至约50微升、约1至约40微升、约1至约30微升、约1至约20微升、约1至约10微升或约1至约5微升。在一些实施方案中，样品为约1微升、约2微升、约3微升、约4微升、约5微升、约6微升、约7微升、约8微升、约9微升、约10微升、约11微升、约12微升、约13微升、约14微升、约15微升、约16微升、约17微升、约18微升、约19微升、约20微升、约21微升、约22微升、约23微升、约24微升、约25微升、约26微升、约27微升、约28微升、约29微升、约30微升、约40微升、约50微升、约60微升、约70微升、约80微升、约90微升或约100微升。在一些实施方案中，样品为约1至约150微升或更少或者约1至约80微升或更少。
GFAP抗体
本文所述的方法可以使用特异性结合胶质纤维酸性蛋白(“GFAP”)(或其片段)的分离的抗体，称为“GFAP抗体”。GFAP抗体可以用于评估GFAP状态作为创伤性脑损伤的量度，检测样品中GFAP的存在，定量样品中存在的GFAP的量，或检测样品中GFAP的存在并定量其量。
a.胶质纤维酸性蛋白(GFAP)
胶质纤维酸性蛋白(GFAP)是一种50kDa的胞质内丝状蛋白，其构成星形胶质细胞中细胞骨架的一部分，并且已被证明是星形胶质细胞起源细胞的最具特异性的标志物。GFAP蛋白质由人的GFAP基因编码。GFAP是成熟星形胶质细胞的主要中间丝。在分子的中央棒状结构域中，GFAP与其他中间丝具有相当大的结构同源性。GFAP通过为星形胶质细胞过程提供结构稳定性来参与星形胶质细胞的活动性和形状。胶质纤维酸性蛋白及其分解产物(GFAP-BDP)是作为创伤性脑损伤(TBI)之后的病理生理反应的一部分释放到血液中的脑特异性蛋白质。在创伤、遗传病症或化学品对人CNS造成损伤之后，星形胶质细胞增殖并表现出细胞体和过程的广泛肥大，并且GFAP显著上调。相比之下，随着星形胶质细胞恶性肿瘤递增，GFAP产生逐渐减少。GFAP还可以在雪旺细胞、肠神经胶质细胞、唾液腺肿瘤、转移性肾癌、会厌软骨、垂体细胞、未成熟少突胶质细胞、乳头状脑膜瘤和乳腺肌上皮细胞中检测到。
人GFAP可以具有以下氨基酸序列：
MERRRITSAARRSYVSSGEMMVGGLAPGRRLGPGTRLSLARMPPPLPTRVDFSLAGALNAGFKETRASERAEMMELNDRFASYIEKVRFLEQQNKALAAELNQLRAKEPTKLADVYQAELRELRLRLDQLTANSARLEVERDNLAQDLATVRQKLQDETNLRLEAENNLAAYRQEADEATLARLDLERKIESLEEEIRFLRKIHEEEVRELQEQLARQQVHVELDVAKPDLTAALKEIRTQYEAMASSNMHEAEEWYRSKFADLTDAAARNAELLRQAKHEANDYRRQLQSLTCDLESLRGTNESLERQMREQEERHVREAASYQEALARLEEEGQSLKDEMARHLQEYQDLLNVKLALDIEIATYRKLLEGEENRITIPVQTFSNLQIRETSLDTKSVSEGHLKRNIVVKTVEMRDGEVIKESKQEHKDVM(SEQ ID NO:2)。
人类GFAP可以是SEQ ID NO:2的片段或变体。GFAP的片段的长度可以在5与400个氨基酸之间、10与400个氨基酸之间、50与400个氨基酸之间、60与400个氨基酸之间、65与400个氨基酸之间、100与400个氨基酸之间、150与400个氨基酸之间、100与300个氨基酸之间或200与300个氨基酸之间。所述片段可以包含来自SEQ ID NO:2的许多连续的氨基酸。SEQ ID NO:2的人GFAP片段或变体可以是GFAP分解产物(BDP)。GFAP BDP可以是38kDa、42kDa(较弱41kDa)、47kDa(较弱45kDa)、25kDa(较弱23kDa)、19kDa或20kDa。在一些实施方案中，人GFAP片段或变体可以是包含5至25之间个氨基酸、5至50之间个氨基酸、5至100之间个氨基酸或5至200之间个氨基酸的GFAP BDP。
b.GFAP识别抗体
抗体是与GFAP、其片段、GFAP的表位或其变体结合的抗体。抗体可以是抗GFAP抗体的片段或其变体或衍生物。抗体可以是多克隆或单克隆抗体。抗体可以是嵌合抗体、单链抗体、亲和力成熟抗体、人抗体、人源化抗体、完全人抗体或抗体片段(诸如Fab片段)或其混合物。抗体片段或衍生物可以包括F(ab')2、Fv或scFv片段。抗体衍生物可以由拟肽产生。此外，描述用于生产单链抗体的技术可以适于生产单链抗体。
抗GFAP抗体可以是嵌合抗GFAP或人源化抗GFAP抗体。在一个实施方案中，人源化抗体和嵌合抗体都是一价的。在一个实施方案中，人源化抗体和嵌合抗体均包含与Fc区连接的单个Fab区。
人抗体可以来源于噬菌体展示技术或表达人免疫球蛋白基因的转基因小鼠。人抗体可以作为人体内免疫反应的结果产生并且被分离。参见例如Funaro等人,BMCBiotechnology,2008(8):85。因此，抗体可以是人而不是动物组库的产物。因为它是人源性的，所以可以最小化对自身抗原反应的风险。替代地，可以使用标准的酵母展示文库和展示技术来选择和分离人抗GFAP抗体。例如，可以使用初始人单链可变片段(scFv)的文库选择人抗GFAP抗体。可以使用转基因动物表达人抗体。
人源化抗体可以是来自非人类物种抗体的抗体分子，其结合具有来自非人类物种的一个或多个互补决定区(CDR)和来自人类免疫球蛋白分子的框架区的所需抗原。
所述抗体与已知抗体的区别在于，它具有与本领域中已知的生物学功能不同的生物学功能。
(1)表位
抗体可以免疫特异性结合GFAP(SEQ ID NO:2)、其片段或其变体。抗体可以免疫特异性识别并结合表位区内的至少三个氨基酸、至少四个氨基酸、至少五个氨基酸、至少六个氨基酸、至少七个氨基酸、至少八个氨基酸、至少九个氨基酸或至少有十个氨基酸。抗体可以免疫特异性识别并结合具有表位区的至少三个连续氨基酸、至少四个连续氨基酸、至少五个连续氨基酸、至少六个连续氨基酸、至少七个连续氨基酸、至少八个氨基酸连续氨基酸、至少九个连续氨基酸或至少十个连续氨基酸的表位。
c.抗体制备/产生
抗体可以通过多种技术，包括本领域技术人员熟知的那些技术中的任何一种制备。通常，抗体可以通过细胞培养技术产生，包括经由常规技术、或经由将抗体基因、重链和/或轻链转染到合适的细菌或哺乳动物细胞宿主中来产生单克隆抗体，以实现抗体的生产，其中抗体可以是重组的。术语“转染”的各种形式旨在涵盖通常用于将外源DNA引入原核或真核宿主细胞中的多种技术，例如电穿孔、磷酸钙沉淀、DEAE-葡聚糖转染等。尽管可以在原核或真核宿主细胞中表达抗体，但是在真核细胞中表达抗体是优选的，并且在哺乳动物宿主细胞中最优选，因为这种真核细胞(特别是哺乳动物细胞)比原核细胞更可能表达组装并分泌适当折叠且具有免疫活性的抗体。
用于表达重组抗体的示例性哺乳动物宿主细胞包括中国仓鼠卵巢(CHO细胞)(包括dhfr-CHO细胞，描述于Urlaub和Chasin,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,77:4216-4220(1980))，其与DHFR选择性标志物一起使用，例如如Kaufman和Sharp,J.Mol.Biol.,159:601-621(1982)中所述；NS0骨髓瘤细胞、COS细胞和SP2细胞。当将编码抗体基因的重组表达载体引入到哺乳动物宿主细胞中时，通过将宿主细胞培养一段足以允许抗体在宿主细胞中表达或者更优选使抗体分泌到宿主细胞所生长的培养基中的时间来产生抗体。可以使用标准蛋白质纯化方法从培养基中回收抗体。
宿主细胞也可以用于产生功能性抗体片段，诸如Fab片段或scFv分子。应当理解，可以对以上程序进行变型。例如，可能希望用编码抗体的轻链和/或重链的功能片段的DNA转染宿主细胞。重组DNA技术还可以用于去除编码与感兴趣的抗原结合不必要的轻链或重链中一个或两个的部分或全部DNA。所述抗体也涵盖由此类截短DNA分子表达的分子。此外，可以通过用标准化学交联方法使抗体与第二抗体交联来产生双功能抗体，其中一条重链和一条轻链是抗体(即结合人类GFAP)且另一重链和另一轻链对除人类GFAP以外的抗原具有特异性。
在用于抗体或其抗原结合部分的重组表达的优选系统中，通过磷酸钙介导的转染将编码抗体重链和抗体轻链的重组表达载体引入到dhfr-CHO细胞中。在重组表达载体内，使抗体重链和轻链基因各自可操作地连接至CMV增强子/AdMLP启动子调控元件以驱动基因高度转录。重组表达载体还携带DHFR基因，所述基因允许使用甲氨蝶呤的选择/扩增来选择已被所述载体转染的CHO细胞。培养所选择的转化株宿主细胞以便允许表达抗体重链和轻链并且从培养基中回收完整抗体。使用标准分子生物学技术制备重组表达载体，转染宿主细胞，选择转化体，培养宿主细胞，并从培养基中回收抗体。另外，合成重组抗体的方法可以是通过在合适的培养基中培养宿主细胞直到合成重组抗体。所述方法还可以包括从培养基中分离重组抗体。
制备单克隆抗体的方法涉及制备能够产生具有所需特异性的抗体的永生细胞系。此类细胞系可以由从经免疫的动物获得的脾细胞产生。可以用GFAP或其片段和/或变体使动物免疫。用于使动物免疫的肽可以包含编码人Fc(例如可结晶片段)或人抗体的尾区的氨基酸。然后可以通过例如与骨髓瘤细胞融合伴侣融合来使脾细胞永生化。可以采用多种融合技术。例如，可以将脾细胞和骨髓瘤细胞与非离子去污剂混合几分钟，然后以低密度铺板在支持杂交细胞而非骨髓瘤细胞的生长的选择性培养基上。一种这样的技术使用次黄嘌呤、氨基蝶呤、胸苷(HAT)选择。另一种技术包括电融合。在足够的时间(通常约1至2周)后，观察到杂种的集落。选择单个集落，并测试其培养上清液对多肽的结合活性。可以使用具有高反应性和特异性的杂交瘤。
可以从生长的杂交瘤集落的上清液中分离单克隆抗体。此外，可以采用各种技术来提高产量，诸如将杂交瘤细胞系注射到合适的脊椎动物宿主(诸如小鼠)的腹膜腔中。然后可以从腹水或血液中收获单克隆抗体。可以通过常规技术，诸如色谱法、凝胶过滤、沉淀和提取，从抗体中去除污染物。亲和色谱法是可以在纯化抗体的过程中使用的方法的实例。
蛋白水解酶木瓜蛋白酶优先切割IgG分子以产生几个片段，其中两个片段(F(ab)片段)各自包含具有完整抗原结合位点的共价异二聚体。胃蛋白酶能够切割IgG分子，以提供多个包含两个抗原结合位点的片段，包括F(ab')2片段。
Fv片段可以优选通过IgM的蛋白水解切割而产生，并且在极少数情况下可以是IgG或IgA免疫球蛋白分子。Fv片段可以使用重组技术衍生。Fv片段包括非共价的VH::VL异二聚体，其包含保留天然抗体分子的许多抗原识别和结合能力的抗原结合位点。
抗体、抗体片段或衍生物可以包含分别插置在重链框架(“FR”)组和轻链框架(“FR”)组之间的重链互补决定区(“CDR”)组和轻链互补决定区(“CDR”)组，所述框架组为CDR提供支撑并限定CDR相对于彼此的空间关系。CDR组可以包含重链或轻链V区的三个高变区。
可以使用产生或分离具有必需特异性的抗体的其他合适方法，包括但不限于从肽或蛋白质文库(例如但不限于噬菌体、核糖体、寡核苷酸、RNA、cDNA、酵母等展示库)中选择重组抗体的方法；例如，如使用本领域中已知的方法可从各种商业供应商诸如CambridgeAntibody Technologies(Cambridgeshire,UK)、MorphoSys(Martinsreid/Planegg,Del.)、Biovation(Aberdeen,Scotland,UK)BioInvent(Lund,Sweden)获得。参见美国专利号4,704,692、5,723,323、5,763,192、5,814,476、5,817,483、5,824,514、5,976,862。替代方法依赖于使能够产生人抗体组库的转基因动物(例如，SCID小鼠，Nguyen等人(1997)Microbiol.Immunol.41:901-907；Sandhu等人(1996)Crit.Rev.Biotechnol.16:95-118；Eren等人(1998)Immunol.93:154-161)免疫，如本领域中已知并且/或者如本文所述。此类技术包括但不限于核糖体展示(Hanes等人(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.USA,94:4937-4942；Hanes等人(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA,95:14130-14135)；单细胞抗体生产技术(例如，选定的淋巴细胞抗体方法(“SLAM”)(美国专利号5,627,052；Wen等人(1987)J.Immunol.17:887-892；Babcook等人(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93:7843-7848)；凝胶微滴和流式细胞术(Powell等人(1990)Biotechnol.8:333-337；One Cell Systems,(Cambridge,Mass).；Gray等人(1995)J.Imm.Meth.182:155-163；Kenny等人(1995)Bio/Technol.13:787-790)；B细胞选择(Steenbakkers等人(1994)Molec.Biol.Reports 19:125-134(1994))。
亲和力成熟的抗体可以通过本领域中已知的多种程序中的任一种产生。例如，参见Marks等人,BioTechnology,10:779-783(1992)描述了通过VH和VL结构域改组进行的亲和力成熟。对CDR和/或框架残基的随机诱变描述于Barbas等人,Proc.Nat.Acad.Sci.USA,91:3809-3813(1994)；Schier等人,Gene,169:147-155(1995)；Yelton等人,J.Immunol.,155:1994-2004(1995)；Jackson等人,J.Immunol.,154(7):3310-3319(1995)；Hawkins等人,J.Mol.Biol.,226:889-896(1992)。在选择性诱变位置和在接触或超突变位置用活性增强氨基酸残基进行的选择性突变描述于美国专利号6,914,128B1。
抗体变体还可以利用以下方式制备：将编码抗体的多核苷酸递送至合适的宿主，诸如以提供在其乳汁中产生此类抗体的转基因动物或哺乳动物，诸如山羊、牛、马、绵羊等来制备。这些方法在本领域中是已知的并且例如描述于美国专利号5,827,690、5,849,992、4,873,316、5,849,992、5,994,616、5,565,362和5,304,489中。
抗体变体还可以通过递送多核苷酸以提供转基因植物和培养的植物细胞(例如但不限于烟草、玉米和浮萍)来制备，所述转基因植物和植物细胞在植物部分或从中培养的细胞中产生此类抗体、特定部分或变体。例如，Cramer等人(1999)Curr.Top.Microbiol.Immunol.240:95-118和其中引用的参考文献描述了例如使用诱导型启动子产生表达大量重组蛋白的转基因烟草叶。转基因玉米已用于以商业生产水平表达哺乳动物蛋白，其生物活性与其他重组系统中产生的或从天然来源纯化的生物活性相同。参见例如Hood等人,Adv.Exp.Med.Biol.(1999)464:127-147和其中引用的参考文献。抗体变体也已经由包括抗体片段(诸如单链抗体(scFv))的转基因植物种子(包括烟草种子和马铃薯块茎)大量产生。参见例如Conrad等人(1998)Plant Mol.Biol.38:101-109和其中引用的参考文献。因此，还可以根据已知方法使用转基因植物产生抗体。
抗体衍生物可以例如通过添加外源序列以修饰免疫原性或减少、增强或修饰结合、亲和力、缔合速率、解离速率、亲合力、特异性、半衰期或任何其他合适的特征来产生。一般来讲，保持部分或全部非人或人CDR序列，而可变区和恒定区的非人序列被人或其他氨基酸替代。
小抗体片段可以是具有两个抗原结合位点的双抗体，其中片段包含与同一条多肽链(VH VL)中的轻链可变结构域(VL)连接的重链可变结构域(VH)。参见例如EP 404,097；WO93/11161；和Hollinger等人,(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448。通过使用太短而不允许同一条链的两个结构域之间的配对的接头，迫使结构域与另一条链的互补结构域配对并产生两个抗原结合位点。还参见Chen等人的美国专利号6,632,926，其据此以引用的方式整体并入，并且公开了具有一个或多个氨基酸插入亲本抗体的高变区中并且对靶抗原的结合亲和力比抗原的亲本抗体的结合亲和力强至少约两倍的抗体变体。
抗体可以是线性抗体。用于制备线性抗体的程序在本领域中是已知的并描述于Zapata等人(1995)Protein Eng.8(10):1057-1062。简而言之，这些抗体包含一对串联的Fd区段(VH-CH1-VH-CH1)，其形成一对抗原结合区。线性抗体可以是双特异性或单特异性的。
可以通过已知方法从重组细胞培养物中回收和纯化抗体，所述已知方法包括但不限于蛋白A纯化、硫酸铵或乙醇沉淀、酸提取、阴离子或阳离子交换色谱法、磷酸纤维素色谱法、疏水相互作用色谱法、亲和色谱法、羟基磷灰石色谱法和凝集素色谱法。高效液相色谱法(“HPLC”)也可以用于纯化。
可检测地标记抗体可能是有用的。用于将抗体缀合至这些试剂的方法是本领域中已知的。仅出于说明的目的，抗体可以用可检测部分标记，例如放射性原子、发色团或荧光团等。这种经标记的抗体可以用于在体内或在分离的测试样品中的诊断技术。它们可以与细胞因子、配体和另一种抗体连接。用于偶联至抗体以实现抗肿瘤作用的合适的剂包括细胞因子，诸如白介素2(IL-2)和肿瘤坏死因子(TNF)；用于光动力疗法中的光敏剂，包括酞菁四磺酸铝(III)、血卟啉和酞菁；放射性核素，诸如碘-131(131I)、钇-90(90Y)、铋-212(212Bi)、铋-213(213Bi)、锝-99m(99mTc)、铼-186(186Re)和铼-188(188Re)；抗生素，诸如多柔比星、阿霉素、柔红霉素、甲氨蝶呤、道诺霉素、新抑癌素和卡铂；细菌、植物和其他毒素，诸如白喉毒素、假单胞菌外毒素A、葡萄球菌肠毒素A、相思豆毒素蛋白-A毒素、蓖麻毒素A(去糖基化蓖麻毒素A和天然蓖麻毒素A)、TGF-α毒素、来自中华眼镜蛇(眼镜蛇)的细胞毒素和白树毒素(一种植物毒素)；来自植物、细菌和真菌的核糖体失活蛋白，诸如局限曲菌素(一种由局限曲霉产生的核糖体失活蛋白)、皂草素(一种来自石碱草的核糖体失活蛋白)和RNA酶；酪氨酸激酶抑制剂；ly207702(二氟化嘌呤核苷)；含有反囊性剂的脂质体(例如，反义寡核苷酸、编码毒素的质粒、甲氨蝶呤等)；和其他抗体或抗体片段，诸如F(ab)。
经由使用杂交瘤技术、选择的淋巴细胞抗体方法(SLAM)、转基因动物和重组抗体文库进行的抗体产生在下面更详细地描述。
(1)使用杂交瘤技术的抗GFAP单克隆抗体
单克隆抗体可以使用本领域中已知的多种技术(包括使用杂交瘤、重组体和噬菌体展示技术或其组合)来制备。例如，可以使用杂交瘤技术产生单克隆抗体，所述杂交瘤技术包括本领域中已知的并且例如在以下文献中教导的那些：Harlow等人,Antibodies:ALaboratory Manual,第二版,(Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold SpringHarbor,1988)；Hammerling等人,Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas,(Elsevier,N.Y.,1981)。还应注意，如本文所用的术语“单克隆抗体”并不限于通过杂交瘤技术产生的抗体。术语“单克隆抗体”是指源自单一克隆的抗体，包括任何真核生物、原核生物或噬菌体克隆，而不是指产生所述抗体的方法。
产生单克隆抗体的方法以及由所述方法产生的抗体可以包括培养分泌本公开抗体的杂交瘤细胞，其中杂交瘤优选通过以下方式产生：将从用GFAP免疫的动物，例如大鼠或小鼠分离的脾细胞与骨髓瘤细胞融合，然后筛选由融合产生的杂交瘤中分泌能够结合本公开多肽的抗体的杂交瘤克隆。简而言之，可以用GFAP抗原免疫大鼠。在一个优选的实施方案中，GFAP抗原与佐剂一起施用以刺激免疫反应。此类佐剂包括完全或不完全弗氏佐剂、RIBI(胞壁酰二肽)或ISCOM(免疫刺激复合物)。此类佐剂可以通过将多肽隔离在局部沉积物中来保护多肽免于快速扩散，或者它们可含有刺激宿主分泌对巨噬细胞和免疫系统其他组分具有趋化性的因子的物质。优选地，如果施用多肽，则免疫方案将涉及两次或更多次施用多肽，在数周内开展；然而，也可以使用多肽的单次施用。
在用GFAP抗原使动物免疫后，可以从动物获得抗体和/或产生抗体的细胞。通过放血或处死动物而从动物获得含有抗GFAP抗体的血清。可以使用从动物获得的血清，可以从血清中获得免疫球蛋白级分，或者可以从血清纯化抗GFAP抗体。以这种方式获得的血清或免疫球蛋白是多克隆的，因此具有一系列异质性。
一旦检测到免疫反应，例如，在大鼠血清中检测到对抗原GFAP具有特异性的抗体，就收获大鼠脾并且分离脾细胞。然后通过熟知的技术使脾细胞与任何适合的骨髓瘤细胞(例如来自可从American Type Culture Collection(ATCC,Manassas,Va.,US))获得的细胞系SP20的细胞)融合。通过有限稀释选择并克隆杂交瘤。然后通过本领域中已知的方法测定杂交瘤克隆的分泌能够结合GFAP的抗体的细胞。可以通过用阳性杂交瘤克隆使大鼠免疫来产生一般来讲含有高水平抗体的腹水。
在另一个实施方案中，可以从经免疫的动物制备产生抗体的永生化杂交瘤。免疫之后，将动物处死，并且将脾B细胞与永生化骨髓瘤细胞融合，和在本领域中众所周知的那样。参见例如Harlow和Lane，同上。在一个优选的实施方案中，骨髓瘤细胞不分泌免疫球蛋白多肽(非分泌型细胞系)。在融合和抗生素选择之后，使用GFAP、或其一部分、或表达GFAP的细胞筛选杂交瘤。在一个优选的实施方案中，使用酶联免疫吸附测定(ELISA)或放射免疫测定(RIA)，优选ELISA，进行初始筛选。PCT公布号WO 00/37504中提供了ELISA筛选的实例。
选择、克隆产生抗GFAP抗体的杂交瘤，并进一步筛选其所需特征，包括稳健的杂交瘤生长、高抗体产量和所需的抗体特征。杂交瘤可以在体内在同系动物中、在缺乏免疫系统的动物(例如，裸小鼠)中或在体外在细胞培养中培养和扩增。选择、克隆和扩增杂交瘤的方法是本领域普通技术人员所熟知的。
在一个优选的实施方案中，杂交瘤是大鼠杂交瘤。在另一个实施方案中，杂交瘤在非人、非大鼠物种诸如小鼠、绵羊、猪、山羊、牛或马中产生。在又另一个优选的实施方案中，杂交瘤是人杂交瘤，其中人非分泌性骨髓瘤与表达抗GFAP抗体的人细胞融合。
可以通过已知技术产生识别特定表位的抗体片段。例如，可以通过使用酶(诸如木瓜蛋白酶(以产生两个相同的Fab片段)或胃蛋白酶(以产生F(ab')2片段))对免疫球蛋白分子进行蛋白水解裂解来产生本公开的Fab和F(ab')2片段。IgG分子的F(ab')2片段保留了较大(“亲本”)IgG分子的两个抗原结合位点，所述IgG分子包括两条轻链(含有可变轻链区和恒定轻链区)、重链的CH1结构域和亲本IgG分子的形成二硫键的铰链区。因此，F(ab')2片段仍然能够像亲本IgG分子一样交联抗原分子。
(2)使用SLAM的抗GFAP单克隆抗体
在本公开的另一个实施方案中，使用本领域中称为选择淋巴细胞抗体方法(SLAM)的方法，从单一经分离的淋巴细胞产生重组抗体，如美国专利号5,627,052；PCT公布号WO92/02551；和Babcook等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,93:7843-7848(1996)中所述。在这种方法中，分泌感兴趣的抗体的单细胞，例如来源于任一个免疫的动物的淋巴细胞，使用抗原特异性溶血蚀斑测定来筛选，其中使用接头(诸如，生物素)将抗原GFAP、GFAP的亚基或其片段与绵羊红细胞偶联，并且用于鉴定分泌对GFAP具有特异性的抗体的单细胞。在鉴定出感兴趣的抗体分泌细胞后，通过逆转录酶-PCR(RT-PCR)从细胞中拯救重链和轻链可变区cDNA，然后可以在哺乳动物宿主细胞(诸如COS或CHO细胞)中的适当的免疫球蛋白恒定区(例如，人恒定区)中的情况下表达这些可变区。用经扩增的免疫球蛋白序列转染的宿主细胞(来源于体内选择的淋巴细胞)然后可以在体外进行进一步的分析和选择，例如，通过淘选转染的细胞以分离表达针对GFAP的抗体的细胞。经扩增的免疫球蛋白序列可进一步在体外操作，诸如通过体外亲和力成熟法。参见例如PCT公布号WO 97/29131和PCT公布号WO 00/56772。
(3)使用转基因动物的抗GFAP单克隆抗体
在本公开的另一个实施方案中，通过用GFAP抗原免疫包含一些或全部人类免疫球蛋白基因座的非人类动物来产生抗体。在一个实施方案中，非人类动物是转基因小鼠，一种包含人免疫球蛋白基因座的较大片段且缺乏小鼠抗体产生的工程化小鼠品系。参见例如Green等人,Nature Genetics,7:13-21(1994)和美国专利号5,916,771、5,939,598、5,985,615、5,998,209、6,075,181、6,091,001、6,114,598和6,130,364。还参见PCT公布号WO 91/10741、WO 94/02602、WO 96/34096、WO 96/33735、WO98/16654、WO 98/24893、WO 98/50433、WO 99/45031、WO 99/53049、WO 00/09560和WO 00/37504。转基因小鼠产生成人样的完全人抗体组库，并且产生抗原特异性人类单克隆抗体。转基因小鼠通过引入人重链基因座和x轻链基因座的兆碱基大小、种系构型YAC片段，包含大约80％的人抗体组库。参见Mendez等人,NatureGenetics,15:146-156(1997)；Green和Jakobovits,J.Exp.Med.,188:483-495(1998)，其公开以引用的方式并入本文。
(4)使用重组抗体文库的抗GFAP单克隆抗体
体外方法也可用于制备本公开抗体，其中筛选抗体文库以鉴定具有所需GFAP结合特异性的抗体。重组抗体文库的此类筛选的方法是本领域中熟知的，并且包括以下文献中所述的方法：例如美国专利号5,223,409(Ladner等人)；PCT公布号WO 92/18619(Kang等人)；PCT公布号WO 91/17271(Dower等人)；PCT公布号WO 92/20791(Winter等人)；PCT公布号WO 92/15679(Markland等人)；PCT公布号WO 93/01288(Breitling等人)；PCT公布号WO92/01047(McCafferty等人)；PCT公布号WO 92/09690(Garrard等人)；Fuchs等人,Bio/Technology,9:1369-1372(1991)；Hay等人,Hum.Antibod.Hybridomas,3:81-85(1992)；Huse等人,Science,246:1275-1281(1989)；McCafferty等人,Nature,348:552-554(1990)；Griffiths等人,EMBO J.,12:725-734(1993)；Hawkins等人,J.Mol.Biol.,226:889-896(1992)；Clackson等人,Nature,352:624-628(1991)；Gram等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:3576-3580(1992)；Garrard等人,Bio/Technology,9:1373-1377(1991)；Hoogenboom等人,Nucl.Acids Res.,19:4133-4137(1991)；Barbas等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,88:7978-7982(1991)；美国专利申请公布号2003/0186374；以及PCT公布号WO 97/29131，每一篇所述文献的内容通过引用并入本文。
重组抗体文库可以来自用GFAP或GFAP的一部分免疫的受试者。替代地，重组抗体文库可以来自初始受试者，即，未用GFAP免疫的人，诸如来自未用人GFAP免疫的人类受试者的人抗体文库。本公开的抗体是通过用包含人类GFAP的肽筛选重组抗体文库来选择的，从而选择那些识别GFAP的抗体。用于进行这种筛选和选择的方法在本领域中是熟知的，诸如先前段落中的参考文献中所述。为了选择对GFAP具有特定结合亲和力的本公开的抗体，诸如以特定Koff速率常数从人GFAP解离的那些，可以使用本领域已知的表面等离振子共振方法选择具有所需Koff速率常数的抗体。为了选择对GFAP具有特定中和活性的本公开的抗体，诸如具有特定IC50的那些，可以使用本领域中已知的用于评估GFAP活性的抑制的标准方法。
在一个实施方案中，本公开涉及一种结合人GFAP的经分离的抗体或其抗原结合部分。优选地，抗体是中和抗体。在各种实施方案中，抗体是重组抗体或单克隆抗体。
例如，还可以使用本领域中已知的各种噬菌体展示方法产生抗体。在噬菌体展示方法中，功能性抗体结构域展示在携带编码它们的多核苷酸序列的噬菌体粒子的表面上。此类噬菌体可以用于展示从组库或组合抗体文库(例如，人或鼠科动物)表达的抗原结合域。表达结合感兴趣抗原的抗原结合结构域的噬菌体可以用抗原来选择或鉴定，例如，使用标记的抗原或结合或捕获到固体表面或珠粒的抗原。这些方法中使用的噬菌体通常是丝状噬菌体，包括从噬菌体表达的fd和M13结合结构域，Fab、Fv或二硫化物稳定的Fv抗体结构域以重组方式与噬菌体基因III或基因VIII蛋白融合。可以用于制备抗体的噬菌体展示方法的实例包括在以下文献中公开的方法：Brinkmann等人,J.Immunol.Methods,182:41-50(1995)；Ames等人,J.Immunol.Methods,184:177-186(1995)；Kettleborough等人,Eur.J.Immunol.,24:952-958(1994)；Persic等人,Gene,187:9-18(1997)；Burton等人,Advances in Immunology,57:191-280(1994)；PCT公布号WO 92/01047；PCT公布号WO 90/02809；WO 91/10737；WO 92/01047；WO 92/18619；WO 93/11236；WO 95/15982；WO 95/20401；以及美国专利号5,698,426、5,223,409、5,403,484、5,580,717、5,427,908、5,750,753、5,821,047、5,571,698、5,427,908、5,516,637、5,780,225、5,658,727、5,733,743和5,969,108。
如以上参考文献中所述，在噬菌体选择之后，可以从噬菌体分离抗体编码区并且将其用于产生完整抗体，包括人抗体或任何其他所需的抗原结合片段，并且在任何所需的宿主中表达，所述宿主包括哺乳动物细胞、昆虫细胞、植物细胞、酵母和细菌，例如如下文所详述。例如，还可以使用本领域中已知的方法来采用重组产生Fab、Fab'和F(ab')2片段的技术，诸如以下文献中所公开的技术：PCT公布号WO 92/22324；Mullinax等人,BioTechniques,12(6):864-869(1992)；Sawai等人,Am.J.Reprod.Immunol.,34:26-34(1995)；和Better等人,Science,240:1041-1043(1988)。可以用于产生单链Fv和抗体的技术的实例包括美国专利号4,946,778和5,258,498；Huston等人,Methods in Enzymology,203:46-88(1991)；Shu等人,Proc.Natl.Acad,Sci.USA,90:7995-7999(1993)；和Skerra等人,Science,240:1038-1041(1988)中所述的技术。
作为通过噬菌体展示来筛选重组抗体文库的替代方案，可以应用本领域中已知用于筛选大型组合文库的其他方法来鉴定本公开的抗体。一种类型的替代表达系统是其中重组抗体文库表达为RNA-蛋白质融合物的系统，如PCT公布号WO 98/31700(Szostak和Roberts)以及Roberts和Szostak,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,94:12297-12302(1997)中所述。在这个系统中，在mRNA与它编码的肽或蛋白质之间，通过体外翻译在其3'末端携带嘌呤霉素(肽基受体抗生素)的合成mRNA，产生了共价融合。因此，可以基于所编码的肽或蛋白质(例如，抗体或其一部分)的特性(诸如抗体或其一部分与双重特异性抗原的结合)，从mRNA的复杂混合物(例如，组合文库)富集特定mRNA。可以通过如上所述的重组手段(例如，在哺乳动物宿主细胞中)表达从筛选这类文库所回收的编码抗体或其一部分的核酸序列，并且另外可以通过对突变已引入到最初选择的序列中的mRNA-肽融合物进行更多轮筛选或通过如上所述的用于重组抗体的体外亲和力成熟的其他方法来经受进一步亲和力成熟。所述方法的优选实例是PROfusion展示技术。
在另一种方法中，还可以使用本领域中已知的酵母展示方法产生抗体。在酵母展示方法中，使用遗传方法将抗体结构域拴系到酵母细胞壁并且将它们展示在酵母表面上。具体来说，这种酵母可以用于展示从组库或组合抗体文库(例如，人或鼠科动物)表达的抗原结合结构域。可以用于制备抗体的酵母展示方法的实例包括美国专利号6,699,658(Wittrup等人)中公开的方法，所述专利以引用的方式并入本文。
d.重组GFAP抗体的产生
抗体可以通过本领域中已知的许多技术中的任一种产生。例如，从宿主细胞表达，其中通过标准技术将编码重链和轻链的一种或多种表达载体转染到宿主细胞中。术语“转染”的各种形式旨在涵盖通常用于将外源DNA引入原核或真核宿主细胞中的多种技术，例如电穿孔、磷酸钙沉淀、DEAE-葡聚糖转染等。尽管有可能在原核或真核宿主细胞中表达本公开抗体，但优选在真核细胞且最优选哺乳动物宿主细胞中表达抗体，因为这类真核细胞(且特别是哺乳动物细胞)相比于原核细胞更有可能组装和分泌经过正确折叠且具有免疫学活性的抗体。
用于表达本公开重组抗体的示例性哺乳动物宿主细胞包括中国仓鼠卵巢(CHO细胞)(包括dhfr-CHO细胞，描述于Urlaub和Chasin,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,77:4216-4220(1980))，其与DHFR选择性标志物一起使用，例如如Kaufman和Sharp,J.Mol.Biol.,159:601-621(1982)中所述；NS0骨髓瘤细胞、COS细胞和SP2细胞。当将编码抗体基因的重组表达载体引入到哺乳动物宿主细胞中时，通过将宿主细胞培养一段足以允许抗体在宿主细胞中表达或者更优选使抗体分泌到宿主细胞所生长的培养基中的时间来产生抗体。可以使用标准蛋白质纯化方法从培养基中回收抗体。
宿主细胞也可以用于产生功能性抗体片段，诸如Fab片段或scFv分子。应当理解，可以对以上程序进行变型。例如，可能合乎需要的是用编码本公开抗体的轻链和/或重链的功能性片段的DNA转染宿主细胞。重组DNA技术还可以用于去除编码与感兴趣的抗原结合不必要的轻链或重链中一个或两个的部分或全部DNA。本公开抗体也涵盖由此类截短DNA分子表达的分子。此外，可以通过用标准化学交联方法使本公开的抗体与第二抗体交联来产生双功能抗体，其中一条重链和一条轻链是本公开的抗体(即结合人类GFAP)且另一重链和另一轻链对除人类GFAP以外的抗原具有特异性。
在用于重组表达本公开抗体、或其抗原结合部分的一个优选系统中，通过磷酸钙介导的转染将编码抗体重链和抗体轻链两者的重组表达载体引入到dhfr-CHO细胞中。在重组表达载体内，使抗体重链和轻链基因各自可操作地连接至CMV增强子/AdMLP启动子调控元件以驱动基因高度转录。重组表达载体还携带DHFR基因，所述基因允许使用甲氨蝶呤的选择/扩增来选择已被所述载体转染的CHO细胞。培养所选择的转化株宿主细胞以便允许表达抗体重链和轻链并且从培养基中回收完整抗体。使用标准分子生物学技术制备重组表达载体，转染宿主细胞，选择转化体，培养宿主细胞，并从培养基中回收抗体。另外，本公开提供一种合成本公开的重组抗体的方法，所述方法通过在适合培养基中培养本公开的宿主细胞，直到合成本公开的重组抗体来进行。所述方法还可以包括从培养基中分离重组抗体。
(1)人源化抗体
人源化抗体可以是抗体或其变体、衍生物、类似物或部分，其免疫特异性地结合感兴趣抗原并且包含基本上具有人抗体的氨基酸序列的框架(FR)区和基本上具有非人抗体的氨基酸序列的互补决定区(CDR)。人源化抗体可以来自非人类物种抗体，其结合具有来自非人类物种的一个或多个互补决定区(CDR)和来自人类免疫球蛋白分子的框架区的所需抗原。
如本文所用，在CDR的情境下的术语“基本上”是指氨基酸序列与非人抗体CDR的氨基酸序列至少90％、至少95％、至少98％或至少99％相同的CDR。人源化抗体包含至少一个且通常两个可变结构域的基本上全部(Fab、Fab'、F(ab')2、FabC、Fv)，其中全部或基本上全部CDR区对应于非人免疫球蛋白(即供体抗体)的那些CDR区并且全部或基本上全部框架区是人免疫球蛋白共有序列的那些。根据一个实施方案，人源化抗体还包含免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分，通常是人免疫球蛋白的至少一部分。在一些实施方案中，人源化抗体含有轻链以及至少重链的可变结构域两者。抗体也可以包括重链的CH1、铰链、CH2、CH3和CH4区。在一些实施方案中，人源化抗体仅含有人源化轻链。在一些实施方案中，人源化抗体仅含有人源化重链。在特定实施方案中，人源化抗体仅含有轻链和/或重链的人源化可变结构域。
人源化抗体可以选自免疫球蛋白的任何类别，包括IgM、IgG、IgD、IgA和IgE，以及任何同种型，包括但不限于IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。人源化抗体可以包含来自多于一种类别或同种型的序列，并且可以使用本领域中熟知的技术选择特定的恒定结构域以优化所需的效应子功能。
人源化抗体的框架区和CDR区无需精确对应于亲本序列，例如可以通过取代、插入或/或缺失至少一个氨基酸残基来对捐献者抗体CDR或共有框架进行诱变以使该位点处的CDR或框架残基不对应于捐献者抗体或共有框架。然而，在一个实施方案中，此类突变将不是广泛的。通常，至少90％、至少95％、至少98％、或至少99％的人源化抗体残基将对应于亲本FR和CDR序列的那些。如本文所用，术语“共有框架”是指共有免疫球蛋白序列中的框架区。如本文所用，术语“共有免疫球蛋白序列”是指由相关免疫球蛋白序列家族中最常出现的氨基酸(或核苷酸)形成的序列(参见例如Winnaker,From Genes to Clones(Verlagsgesellschaft,Weinheim,1987))。在免疫球蛋白家族中，共有序列中的每个位置由家族中最常出现在那个位置的氨基酸占据。如果两种氨基酸出现的频率相同，则任一种氨基酸都可以纳入共有序列中。
人源化抗体可以被设计成最小化对啮齿类动物抗人抗体的不需要的免疫反应，这限制了那些部分在人类接受者中的治疗应用的持续时间和有效性。人源化抗体可具有从非人类来源引入其中的一个或多个氨基酸残基。这些非人类残基通常被称为“输入”残基，通常取自可变结构域。人源化可以通过用高变区序列代替人抗体的对应序列来进行。因此，此类“人源化”抗体是嵌合抗体，其中基本上少于完整的人类可变结构域已被来自非人类物种的对应序列取代。例如，参见美国专利号4,816,567，其内容通过引用并入本文。人源化抗体可以是人抗体，其中一些高变区残基和可能的一些FR残基被啮齿动物抗体中类似位点的残基取代。可以使用任何已知方法进行对本公开抗体的人源化或工程化，诸如但不限于美国专利号5,723,323、5,976,862、5,824,514、5,817,483、5,814,476、5,763,192、5,723,323、5,766,886、5,714,352、6,204,023、6,180,370、5,693,762、5,530,101、5,585,089、5,225,539和4,816,567中所述的那些方法。
人源化抗体可以保留对GFAP的高亲和力和其他有利的生物特性。人源化抗体可以通过使用亲本和人源化序列的三维模型分析亲本序列和各种概念性人源化产物的过程来制备。三维免疫球蛋白模型很常见。说明并且展示所选候选免疫球蛋白序列的可能的三维构象结构的计算机程序是可用的。检查这些展示允许分析残基在候选免疫球蛋白序列功能中的可能作用，即，对影响候选免疫球蛋白与其抗原结合的能力的残基的分析。通过这种方式，可以从接受体和输入序列中选择并组合FR残基，以使得实现所需的抗体特征，诸如对GFAP的亲和力增加。一般来讲，高变区残基可以直接地并且最实质性地涉及影响抗原结合。
作为人源化的替代方案，可以产生人抗体(在本文中也称为“完全人抗体”)。例如，有可能经由PROfusion和/或酵母相关技术从文库分离出人抗体。还可以产生转基因动物(例如，小鼠)，其能够在免疫后在不存在内源性免疫球蛋白产生的情况下产生人抗体的完全组库。例如，嵌合和种系突变小鼠中抗体重链连接区(JH)基因的纯合缺失导致内源性抗体产生的完全抑制。在这种种系突变小鼠中转移人种系免疫球蛋白基因阵列将导致在抗原挑战后产生人抗体。人源化或完全人抗体可以根据美国专利号5,770,429、5,833,985、5,837,243、5,922,845、6,017,517、6,096,311、6,111,166、6,270,765、6,303,755、6,365,116、6,410,690、6,682,928和6,984,720中所述的方法制备，每一个所述专利的内容通过引用并入本文。
e.抗GFAP抗体
可以使用上述技术以及使用本领域中已知的常规技术产生抗GFAP抗体。在一些实施方案中，抗GFAP抗体可以是未缀合的GFAP抗体，诸如可购自以下的GFAP抗体：Dako(目录号：M0761)；ThermoFisher Scientific(目录号：MA5-12023、A-21282、13-0300、MA1-19170、MA1-19395、MA5-15086、MA5-16367、MA1-35377、MA1-06701或MA1-20035)；AbCam(目录号：ab10062、ab4648、ab68428、ab33922、ab207165、ab190288、ab115898或ab21837)；EMDMillipore(目录号：FCMAB257P、MAB360、MAB3402、04-1031、04-1062、MAB5628)；Santa Cruz(目录号：sc-166481、sc-166458、sc-58766、sc-56395、sc-51908、sc-135921、sc-71143、sc-65343或sc-33673)；Sigma-Aldrich(目录号：G3893或G6171)；Sino Biological Inc.(目录号：100140-R012-50)。抗GFAP抗体可以与荧光团缀合，诸如可购自以下的经缀合的GFAP抗体：ThermoFisher Scientific(目录号：A-21295或A-21294)；EMD Millipore(目录号：MAB3402X、MAB3402B、MAB3402B或MAB3402C3)；或AbCam(目录号：ab49874或ab194325)。
替代地，还可以使用WO 2018/067474、WO2018/081649、美国专利号11,078,298、美国公布号2019/0502127和/或Bazarian等人,“Accuracy of a rapid GFAP/UCH-L1 testfor the prediction of intracranial injuries on head CT after mild traumaticbrain injury”,Acad.Emerg.Med.,(2021年8月6日)中所述的抗体，所述文献的内容以引用的方式并入本文。
7.其他因素
如上文所述的诊断、预后和/或评估的方法还可以包括使用其他因素进行诊断、预后和评估。在一些实施方案中，可以使用格拉斯哥昏迷量表或扩展的格拉斯哥结局量表(GOSE)来诊断创伤性脑损伤。也可以单独使用或与格拉斯哥昏迷量表组合使用其他测试、量表或指数。一个实例是瑞秋洛斯阿米哥斯量表(Ranchos Los Amigos Scale)。瑞秋洛斯阿米哥斯量表测量意识、认知、行为和与环境的互动的水平。瑞秋洛斯阿米哥斯量表包括：I级：无反应；II级全身性反应；III级：局部反应；IV级：混乱-躁动；V级：混乱-不适当；VI级：混乱-适当；VII级：自动-适当；和VIII级：有目的-适当。另一个实例是Rivermead脑震荡后症状问卷，其为测量TBI之后脑震荡后症状的严重程度的自我报告量表。要求患者对过去24小时内所具有的16种症状(例如头痛、头晕、恶心、呕吐)中每一种的严重程度进行评分。在每种情况下，将症状与损伤发生之前(发病前)的严重程度进行比较。这些症状按0至4的严重程度报告：没有经历过、不再是问题、轻度问题、中度问题和重度问题。
8.样品
在一些实施方案中，从已遭受头部损伤或怀疑已遭受头部损伤的受试者(例如，人类受试者)获得样品，所述头部损伤可能已由或已由任一种因素或因素组合引起。在一些实施方案中，在所述受试者遭受由身体摇动、导致闭合性或开放性头部创伤的外部机械力或其他力产生的钝性冲击、一次或多次跌倒、爆炸或冲击波或其他类型的钝力创伤引起的头部损伤之后获得样品。在一些实施方案中，在受试者摄入或暴露于火、化学品或毒素或者火、化学品和/或毒素的组合之后获得样品。此类化学品和/或毒素的实例包括霉菌、石棉、杀虫剂和杀昆虫剂、有机溶剂、油漆、胶水、气体(诸如一氧化碳、硫化氢和氰化物)、有机金属(诸如甲基汞、四乙基铅和有机锡)和/或一种或多种滥用药物。在一些实施方案中，所述样品从罹患自身免疫疾病、代谢紊乱、脑肿瘤、缺氧、病毒感染(SARS-CoV-2)、真菌感染、细菌感染、脑膜炎、脑积水或其任何组合的受试者获得。
在另一个实施方案中，本文所述的方法使用的样品还可以用于通过使用下文所述的抗UCH-L1和/或抗GFAP抗体或其抗体片段确定受试者中的UCH-L1和/或GFAP的水平来确定受试者是否患有TBI(诸如轻度TBI、中度TBI、重度TBI或中度至重度TBI)或处于发展它的风险中。因此，在特定实施方案中，本公开还提供了一种用于确定患有本文所述且本领域中已知的创伤性脑损伤或处于本文所述且本领域中已知的创伤性脑损伤的风险中的受试者是否是用于疗法或治疗的候选者的方法。通常，受试者是以下中的至少一者：(i)经历过头部损伤；(ii)摄入和/或暴露于一种或多种化学物质和/或毒素；(iii)罹患自身免疫疾病、代谢紊乱、脑肿瘤、缺氧、病毒感染(例如SARS-CoV-2)、真菌感染、细菌感染、脑膜炎、脑积水或其任何组合；或(iv)(i)-(iii)的任何组合；或者，实际上已被诊断患有TBI或处于TBI的风险下(诸如像，罹患自身免疫疾病、代谢紊乱、脑肿瘤、缺氧、病毒感染(例如SARS-CoV-2)、真菌感染、细菌感染、脑膜炎、脑积水或其任何组合的受试者)和/或展现出不利的(即临床上不希望的)如本文所述的UCH-L1和/或GFAP或者UCH-L1和/或GFAP片段的浓度或量。
A.测试或生物样品
如本文所用，“样品”、“测试样品”、“生物样品”是指含有或怀疑含有GFAP和/或UCH-L1的流体样品。样品可以源自任何适合的来源。在一些情况下，样品可以包含液体、流动的微粒固体或固体粒子的流体悬浮液。在一些情况下，可以在本文所述的分析之前处理样品。例如，可以在分析之前将样品从其来源分离或纯化；然而，在某些实施方案中，可以直接测定含有GFAP和/或UCH-L1的未处理样品。在特定实例中，含有GFAP和/或UCH-L1的来源是人类(例如，儿科或成人人类)物质或来自另一物种的物质。如本文所用，“儿科”或“儿科受试者”是指小于18岁(即非18岁或以上)的受试者。例如，儿科受试者可以小于约18岁，或为约17岁、约16岁、约15岁、约14岁、约13岁、约12岁、约11岁、约10岁、约9岁、约8岁、约7岁、约6岁、约5岁、约4岁、约3岁、约2岁、约1岁，或小于约1岁。在一些实施方案中，儿科受试者可以小于约1岁至约小于18岁。在一些实施方案中，儿科受试者可以小于约1岁至约17岁。例如，儿科受试者可以是约一天、约两天、约三天、约四天、约五天、约六天、约一周、约两周、约三周、约一个月、约两个月、约三个月、约四个月、约五个月、约六个月、约七个月、约八个月、约九个月、约十个月或约十一个月，总计小于约18岁、或约17岁、或约16岁、或约15岁、或约14岁、或约13岁、或约12岁、或约11岁、或约10岁、或约9岁、或约8岁、或约7岁、或约6岁、或约5岁、或约4岁、或约3岁、或约2岁、或约1岁、或小于约1岁中的任何年龄。“成人”或“成人受试者”是指18岁或以上的受试者。
物质任选地是人体物质(例如，体液、血液(诸如全血、血清、血浆)、尿液、唾液、汗液、痰液、精液、粘液、泪液、淋巴液、羊水、间质液、肺灌洗液、脑脊髓液、粪便、组织、器官等)。组织可以包括但不限于骨骼肌组织、肝组织、肺组织、肾组织、心肌组织、脑组织、骨髓、子宫颈组织、皮肤等。样品可以是液体样品或固体样品的液体提取物。在某些情况下，样品的来源可以是器官或组织，诸如活检样品，其可以通过组织分解/细胞裂解而溶解。在一些实施方案中，样品是全血样品、血清样品、脑脊液样品、静脉血和毛细管血的混合样品、毛细管血和间质液的混合样品、组织样品、体液或血浆样品。
可以分析广泛范围体积的流体样品。在一些示例性实施方案中，样品体积可以为约0.5nL、约1nL、约3nL、约0.01μL、约0.1μL、约1μL、约5μL、约10μL、约100μL、约1mL、约5mL、约10mL等。在一些情况下，流体样品的体积在约0.01μL与约10mL之间、在约0.01μL与约1mL之间、在约0.01μL与约100μL之间、或在约0.1μL与约10μL之间。
在一些情况下，流体样品可以在用于测定中之前进行稀释。例如，在含有GFAP和/或UCH-L1的来源为人体液(例如，血液、血清)的实施方案中，可以用适当的溶剂(例如，缓冲液，诸如PBS缓冲液)稀释流体。在使用之前可以将流体样品稀释约1倍、约2倍、约3倍、约4倍、约5倍、约6倍、约10倍、约100倍或更多倍。在其他情况下，流体样品在用于测定之前不进行稀释。
在一些情况下，样品可以经历分析前处理。分析前处理可以提供额外的功能性，诸如非特异性蛋白质去除和/或有效但可廉价实现的混合功能性。分析前处理的一般方法可以包括使用电动力捕获、AC电动力学、表面声波、等速电泳、介电电泳、电泳或本领域中已知的其他预浓缩技术。在一些情况下，流体样品可以在用于测定中之前进行浓缩。例如，在含有GFAP和/或UCH-L1的来源为来自受试者(例如，人类或其他物质)的体液(例如，血液、血清)的实施方案中，可以通过沉淀、蒸发、过滤、离心或其组合来浓缩流体。在使用之前可以将流体样品浓缩约1倍、约2倍、约3倍、约4倍、约5倍、约6倍、约10倍、约100倍或更多倍。
9.试剂盒
本文提供了一种试剂盒，其可以用于测定或评估测试样品的UCH-L1和/或GFAP或者UCH-L1和/或GFAP片段。试剂盒包括至少一个用于测定测试样品的UCH-L1和/或GFAP的侧向流装置。在一些实施方案中，试剂盒包括多个(例如，两个)侧向流装置，其单独地包裹在湿气不可透的包装材料中并且包装在一起。除至少一个侧向流装置之外，试剂盒还可以含有用于测定测试样品的UCH-L1和/或GFAP的说明。例如，试剂盒可以包括用于使用本文所述的侧向流装置来测定测试样品的UCH-L1和/或GFAP的说明。试剂盒中所包括的说明可以粘贴于包装材料上或可以作为包装说明包括在内。虽然说明通常是书写或印刷的材料，但它们不限于此类。例如，在一些实施方案中，可以在侧向流装置、包装材料或包装插页上提供条形码(例如，QR代码)，其可以通过移动装置(例如，电话、iPad、手表)扫描以查看说明。事实上，本公开涵盖了能够存储此类说明并将它们传达给最终使用者的任何介质。此类介质包括但不限于电子存储介质(例如，磁盘、磁带、磁片盒、芯片)、光学介质(例如，CD ROM)等。如本文所用，术语“说明”可以包括提供说明的互联网网站的地址。
替代地或另外，试剂盒可以包括校准物或对照(例如纯化的且任选冻干的UCH-L1和/或GFAP)和/或用于进行测定的至少一个容器(例如管、微量滴定板或条，其可以已经用抗UCH-L1和/或GFAP单克隆抗体涂布)和/或缓冲液，诸如测定缓冲液或洗涤缓冲液，其中任一者都可以提供为浓缩溶液、可检测标记(例如酶标记)的底物溶液或终止溶液。优选地，试剂盒包括进行测定所必需的所有组分，即侧向流装置、试剂、标准物、缓冲液、稀释剂等。
试剂盒还可以任选地包括进行测定所需的其他试剂，诸如缓冲液、盐、酶、酶辅因子、底物、检测试剂等。用于分离和/或处理测试样品的其他组分(诸如缓冲液和溶液)(例如预处理试剂)也可以包括于试剂盒中。试剂盒可以另外包括一个或多个其他对照。试剂盒的一种或多种组分可以被冻干，在所述情况下试剂盒可以还包括适于复原经冻干的组分的试剂。
试剂盒的各种组分任选地根据需要提供于合适的容器中。试剂盒还可以包括用于容纳或存储样品的容器(例如，用于尿液、全血、血浆或血清样品的容器或匣)。适当时，试剂盒任选地还可以含有混合容器和有利于制备试剂或测试样品的其他组分。试剂盒还可以包括用于帮助获得测试样品的一种或多种仪器，诸如注射器、移液管、钳子、测量匙等。
如果需要，试剂盒还可以单独或与说明进一步组合地包括用于测定测试样品中的另一分析物(其可以是生物标志物)的一种或多种组分。
10.实施例
对于本领域技术人员显而易见的是，本文所述的本公开方法的其他适合修改和变型是容易应用和了解的，并且可以在不脱离本公开或本文公开的方面和实施方案的范围下使用适合等同物来进行。现已详细描述本公开，通过参考以下实施例将对其有更明确理解，所述实施例仅旨在说明本公开的一些方面和实施方案，并且不应视为限制本公开的范围。本文中提及的所有期刊参考文献、美国专利和公布的公开均据此以引用的方式整体并入。
本公开具有多个方面，所述多个方面通过以下非限制性实施例说明。
实施例1
GFAP侧向流测定
提供了一种用于使用夹心型测定检测GFAP的示例性侧向流测定。具体来说，侧向流装置包括第一区(例如，试剂区)，其包括对GFAP上的第一表位具有特异性并且用可检测标记(诸如胶体金属，诸如胶体金)标记的Fab单克隆抗体。装置包括在第二区(例如，检测区)包括对GFAP的第二种不同的表位具有特异性的经固定的单克隆抗体。指示GFAP的存在的阳性测定通过在检测区(例如，在测试线)出现可见的线来指示。
使用单克隆抗体对，诸如作为捕获单克隆抗体的抗体A和作为检测单克隆抗体的抗体B。抗体A和抗体B是在Abbott Laboratories(Abbott Park,IL)内部开发的示例性抗GFAP抗体。抗体A和抗体B结合同一GFAP分解产物内的表位。可以在这种侧向流装置中以各种组合一起使用其他可商购获得的抗体，诸如前文所述的那些，作为捕获抗体或检测抗体。任选地，可以使用任何形式、组合和/或数目的抗体。例如，所有使用的抗体可以是单克隆抗体，所有采用的抗体可以是Fab，替代地，可以有单克隆抗体和Fab的混合物。可以使用两种抗体，可以使用三种抗体，可以使用四种抗体等。
可以将重组GFAP掺入(约40pg/mL至约1000pg/mL)至缓冲溶液中，以提供80μL的样品体积。将样品的一部分施加至示例性侧向流装置的第一区中。指示GFAP的存在的阳性测试在15分钟内通过在检测区出现可见的线来指示。视觉检测限被确定为大约125pg/mL。这种视觉检测限对应于内部分配的免疫色谱法(ICT)评分0.5。
ICT评分仅用于帮助标准化实验结果和理解测试的灵敏度极限，这可能实现更深的线和更高的阳性读出发生率。基本上，针对分配评分，开发了对应于值的梯度的ICT评分卡，其中在检测区可能观察到的可见线的亮度或暗度以粉色或另一颜色的阶梯值显示，并且分配的数字随着值的暗度或颜色的饱和度/强度的增加而增加。一般来说，对于ICT评分＝0.5，应当理解为初始操作员(即，没有查看可见线经验的操作员)可以读取70-80％之间的显色的线。看不到ICT评分0.5的相同初始操作员通常可以看到在ICT评分0.5或1时强度更高的线。初始操作员可以看到10-20％在ICT评分＝0.25时显色的线。相比之下，100％的‘有经验’的操作员(即，那些有查看可见线经验的操作员，诸如内部R&D和QC操作员)可以看到在ICT＝0.5或更低时显色的线。
另外，发现在缓冲液中掺入约40pg/mL至约1000pg/mL之间的重组GFAP所提供的信号在ICT评分0.25至2.5之间(包括零对照)时测试的稀释度内为线性。
实施例2
UCH-L1侧向流测定
提供了一种用于使用夹心型测定检测UCH-L1的示例性侧向流测定。具体来说，侧向流装置包括第一区(例如，试剂区)，其包括对UCH-L1上的第一表位具有特异性并且用可检测标记标记的单克隆抗体。装置包括在第二区(例如，检测区)包括对UCH-L1的第二种不同的表位具有特异性的经固定的单克隆抗体。指示UCH-L1的存在的阳性测定通过在检测区(例如，在测试线)出现可见的线来指示。
使用单克隆抗体对，诸如作为捕获单克隆抗体的抗体A和作为检测单克隆抗体的抗体B。抗体A是在Abbott Laboratories(Abbott Park,IL)内部开发的示例性抗UCH-L1抗体。抗体B识别UCH-L1的不同表位并且由Banyan Biomarkers(Alachua，Florida)开发。可以在这种侧向流装置中以各种组合一起使用其他在Abbott Laboratories(Abbott Park，IL)内部开发的抗体或其他可商购获得的抗体，诸如本文所述的那些，作为捕获抗体或检测抗体。任选地，可以使用任何形式、组合和/或数目的抗体。例如，所有使用的抗体可以是单克隆抗体，所有采用的抗体可以是Fab，替代地，可以有单克隆抗体和Fab的混合物。可以使用两种抗体，可以使用三种抗体，可以使用四种抗体等。
可以将重组UCH-L1掺入(约400pg/mL至约20000pg/mL)至缓冲溶液中，以提供80μL的样品体积。将样品的一部分施加至示例性侧向流装置的第一区中。指示UCH-L1的存在的阳性测试在15分钟内通过在检测区出现可见的线来指示。视觉检测限(ICT评分＝0.5)被确定为大约1250pg/mL。另外，发现在缓冲液中掺入约400pg/mL至约20000pg/mL之间的重组UCH-L1所提供的信号在ICT评分0.25至2.5之间(包括零对照)时为线性。
应理解先前详细描述和随附实施例仅是说明性的，并且不应视为对本公开的范围的限制，所述范围仅由随附权利要求及其等效物限定。
所公开的实施方案的各种改变和修改对本领域技术人员是显而易见的。在不偏离其本质和范围的前提下，可以进行与包括但不限于本公开的化学结构、取代基、衍生物、中间体、合成、组合物、制剂和/或使用方法有关的这类改变和修改。
出于完整性的原因，在以下编号条款中列出本公开的各个实施方案：
出于完整性的原因，在以下编号条款中列出本公开的各个实施方案：
条款1.一种方法，其包括：
对获自受试者的生物样品进行至少一种侧向流测定，以确定单独泛素羧基末端水解酶L1(UCH-L1)的量或存在或者UCH-L1的量或存在和胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的量或存在；以及
显示在所述样品中确定的单独UCH-L1或者UCH-L1和GFAP的量或存在。
条款2.如条款1所述的方法，其中所述至少一种侧向流测定为侧向流装置的一部分。
条款3.如条款2所述的方法，其中所述侧向流装置包括(a)至少一个测试条；或(b)至少两个测试条。
条款4.如条款1-3中任一项所述的方法，其中(a)所述针对UCH-L1的侧向流测定包括结合UCH-L1上的表位的第一特异性结合配偶体和包含可检测标记的第二特异性结合配偶体；并且(b)所述针对GFAP的侧向流测定包括结合GFAP上的表位的第三特异性结合配偶体和包含可检测标记的第四特异性结合配偶体。
条款5.如条款4所述的方法，其中所述第一特异性结合配偶体、第二特异性结合配偶体、第三特异性结合配偶体、第四特异性结合配偶体或其任何组合为抗体或其抗体片段。
条款6.如条款1-5中任一项所述的方法，其中所述方法用于帮助诊断和评价已经遭受或可能已经遭受头部损伤的受试者。
条款7.如条款6所述的方法，其中所述受试者被诊断为患有创伤性脑损伤。
条款8.如条款7所述的方法，所述受试者被诊断为患有轻度、中度、重度或中度至重度创伤性脑损伤。
条款9.如条款1-8中任一项所述的方法，其中所述生物样品为选自由以下组成的组的样品：血液样品、尿液样品、脑脊液样品、组织样品、体液样品、唾液样品、口咽样本和鼻咽样本。
条款10.如条款1-9中任一项所述的方法，其中所述方法用于确定受试者是否应接受头部计算机断层(CT)扫描、磁共振成像(MRI)扫描或者头部CT扫描和MRI扫描两者。
条款11.一种方法，其包括：
对获自受试者的生物样品进行至少一种侧向流测定，以确定泛素羧基末端水解酶L1(UCH-L1)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)或者UCH-L1和GFAP两者的量或存在；以及
使在所述样品中确定的UCH-L1、GFAP、UCH-L1和GFAP的量或存在可视化，
其中所述测定不需要读取UCH-L1、GFAP或者UCH-L1和GFAP的量或存在的装置。
条款12.如条款11所述的方法，其中(a)所述针对UCH-L1的侧向流测定包括结合UCH-L1上的表位的第一特异性结合配偶体和包含可检测标记的第二特异性结合配偶体；并且(b)所述针对GFAP的侧向流测定包括结合GFAP上的表位的第三特异性结合配偶体和包含可检测标记的第四特异性结合配偶体。
条款13.如条款12所述的方法，其中所述第一特异性结合配偶体、第二特异性结合配偶体、第三特异性结合配偶体、第四特异性结合配偶体或其任何组合为抗体或其抗体片段。
条款14.如条款11-13中任一项所述的方法，其中所述方法用于帮助诊断和评价已经遭受或可能已经遭受头部损伤的受试者。
条款15.如条款14所述的方法，其中所述受试者被诊断为患有创伤性脑损伤。
条款16.如条款15所述的方法，所述受试者被诊断为患有轻度、中度、重度或中度至重度创伤性脑损伤。
条款17.如条款11-16中任一项所述的方法，其中所述生物样品为选自由以下组成的组的样品：血液样品、尿液样品、脑脊液样品、组织样品、体液样品、唾液样品、口咽样本和鼻咽样本。
条款18.如条款11-17中任一项所述的方法，其中所述方法用于确定受试者是否应接受头部计算机断层(CT)扫描、磁共振成像(MRI)扫描或者头部CT扫描和MRI扫描两者。
条款19.如条款12-18中任一项所述的方法，其中所述可检测标记为胶体金属粒子、胶体非金属粒子、乳胶粒子、彩色或经染色的粒子或其任何组合。
条款20.如条款19所述的方法，其中所述可检测标记为胶体金属粒子。
条款21.如条款19所述的方法，其中所述胶体金属粒子为金或银胶体粒子。
条款22.如条款12-21中任一项所述的方法，其中所述可检测标记肉眼可见。
条款23.一种试剂盒，其用于执行如条款1或11所述的方法，其中所述试剂盒包括：
用于检测所述样品中泛素羧基末端水解酶L1(UCH-L1)的存在的第一侧向流装置；
用于检测所述样品中胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的存在的第二侧向流装置；以及
用于检测所述样品中UCH-L1和GFAP的存在的说明。
条款24.一种试剂盒，其用于执行如条款1或11所述的方法，其中所述试剂盒包括：
用于检测所述样品中泛素羧基末端水解酶L1(UCH-L1)和胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的存在的侧向流装置；以及
用于检测所述样品中UCH-L1和GFAP的存在的说明。
条款25.如条款24所述的试剂盒，其中所述试剂盒包括至少一个测试条。
条款26.如条款24所述的试剂盒，其中所述试剂盒包括至少两个测试条。
条款27.如条款1-22中任一项所述的方法，其中所述至少一种针对GFAP的侧向流测定、所述至少一种针对UCH-L1的侧向流测定、或者至少一种针对GFAP的侧向流测定和至少一种针对UCH-L1的侧向流测定各自在或能够在小于约30分钟、小于约25分钟、小于约20分钟、小于约18分钟或小于约15分钟内进行。
条款28.如条款1-22中任一项所述的方法，其中所述至少一种针对GFAP的侧向流测定、所述至少一种针对UCH-L1的侧向流测定、或者至少一种针对GFAP的侧向流测定和至少一种针对UCH-L1的侧向流测定各自在或能够在范围为约4至约20分钟、约10至约15分钟或约15至约18分钟的时间内进行。

Claims (28)

1.一种方法，其包括：
对获自受试者的生物样品进行至少一种侧向流测定，以确定单独泛素羧基末端水解酶L1(UCH-L1)的量或存在、或者UCH-L1的量或存在和胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的量或存在；以及
显示在所述样品中确定的单独UCH-L1或者UCH-L1和GFAP的量或存在。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述至少一种侧向流测定为侧向流装置的一部分。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述侧向流装置包括(a)至少一个测试条；或(b)至少两个测试条。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中(a)针对UCH-L1的侧向流测定包括结合UCH-L1上的表位的第一特异性结合配偶体和包含可检测标记的第二特异性结合配偶体；并且(b)针对GFAP的侧向流测定包括结合GFAP上的表位的第三特异性结合配偶体和包含可检测标记的第四特异性结合配偶体。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述第一特异性结合配偶体、第二特异性结合配偶体、第三特异性结合配偶体、第四特异性结合配偶体或其任何组合为抗体或其抗体片段。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述方法用于帮助诊断和评价已经遭受或可能已经遭受头部损伤的受试者。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述受试者被诊断为患有创伤性脑损伤。
8.根据权利要求7所述的方法，所述受试者被诊断为患有轻度、中度、重度或中度至重度创伤性脑损伤。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其中所述生物样品为选自由以下组成的组的样品：血液样品、尿液样品、脑脊液样品、组织样品、体液样品、唾液样品、口咽样本和鼻咽样本。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的方法，其中所述方法用于确定受试者是否应接受头部计算机断层(CT)扫描、磁共振成像(MRI)扫描、或者头部CT扫描和MRI扫描两者。
11.一种方法，其包括：
对获自受试者的生物样品进行至少一种侧向流测定，以确定泛素羧基末端水解酶L1(UCH-L1)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、或者UCH-L1和GFAP两者的量或存在；以及
使在所述样品中确定的UCH-L1、GFAP、UCH-L1和GFAP的量或存在可视化，
其中所述测定不需要读取UCH-L1、GFAP、或者UCH-L1和GFAP的量或存在的装置。
12.根据权利要求11所述的方法，其中(a)针对UCH-L1的侧向流测定包括结合UCH-L1上的表位的第一特异性结合配偶体和包含可检测标记的第二特异性结合配偶体；并且(b)针对GFAP的侧向流测定包括结合GFAP上的表位的第三特异性结合配偶体和包含可检测标记的第四特异性结合配偶体。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述第一特异性结合配偶体、第二特异性结合配偶体、第三特异性结合配偶体、第四特异性结合配偶体或其任何组合为抗体或其抗体片段。
14.根据权利要求11-13中任一项所述的方法，其中所述方法用于帮助诊断和评价已经遭受或可能已经遭受头部损伤的受试者。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述受试者被诊断为患有创伤性脑损伤。
16.根据权利要求15所述的方法，所述受试者被诊断为患有轻度、中度、重度或中度至重度创伤性脑损伤。
17.根据权利要求11-16中任一项所述的方法，其中所述生物样品为选自由以下组成的组的样品：血液样品、尿液样品、脑脊液样品、组织样品、体液样品、唾液样品、口咽样本和鼻咽样本。
18.根据权利要求11-17中任一项所述的方法，其中所述方法用于确定受试者是否应接受头部计算机断层(CT)扫描、磁共振成像(MRI)扫描、或者头部CT扫描和MRI扫描两者。
19.根据权利要求12-18中任一项所述的方法，其中所述可检测标记为胶体金属粒子、胶体非金属粒子、乳胶粒子、彩色或经染色的粒子或其任何组合。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述可检测标记为胶体金属粒子。
21.根据权利要求20所述的方法，其中所述胶体金属粒子为金或银胶体粒子。
22.根据权利要求12-21中任一项所述的方法，其中所述可检测标记肉眼可见。
23.一种试剂盒，其用于执行根据权利要求1或11所述的方法，其中所述试剂盒包括：
用于检测所述样品中泛素羧基末端水解酶L1(UCH-L1)的存在的第一侧向流装置；
用于检测所述样品中胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的存在的第二侧向流装置；以及
用于检测所述样品中UCH-L1和GFAP的存在的说明。
24.一种试剂盒，其用于执行根据权利要求1或11所述的方法，其中所述试剂盒包括：
用于检测所述样品中泛素羧基末端水解酶L1(UCH-L1)和胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的存在的侧向流装置；以及
用于检测所述样品中UCH-L1和GFAP的存在的说明。
25.根据权利要求24所述的试剂盒，其中所述试剂盒包括至少一个测试条。
26.根据权利要求24所述的试剂盒，其中所述试剂盒包括至少两个测试条。
27.根据权利要求1-22中任一项所述的方法，其中至少一种针对GFAP的侧向流测定、至少一种针对UCH-L1的侧向流测定、或者至少一种针对GFAP的侧向流测定和至少一种针对UCH-L1的侧向流测定各自在或能够在小于约30分钟、小于约25分钟、小于约20分钟、小于约18分钟或小于约15分钟内进行。
28.根据权利要求1-22中任一项所述的方法，其中至少一种针对GFAP的侧向流测定、至少一种针对UCH-L1的侧向流测定、或者至少一种针对GFAP的侧向流测定和至少一种针对UCH-L1的侧向流测定各自在或能够在范围为约4至约20分钟、约10至约15分钟或约15至约18分钟的时间内进行。
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