CN119256076A - 用于产生调节性t细胞的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了：一种用于产生含有调节性T细胞的细胞群的方法，所述方法包括步骤(1)在存在选自由CDK8和/或CDK19抑制剂、TNFR2激动剂、mTOR抑制剂和TGF‑βR激动剂组成的组的至少一种物质的情况下培养包含多能干细胞来源的CD4⁺T细胞的细胞群；一种通过所述方法获得的含有调节性T细胞的细胞群；以及一种包含含有调节性T细胞的所述细胞群的药物。

Description

用于产生调节性T细胞的方法

技术领域

本发明涉及一种用于产生含有调节性T细胞的细胞群的方法，通过该方法获得的含有调节性T细胞的细胞群，包含含有调节性T细胞的细胞群的药物等等。

发明背景

近年来，由于调节性T细胞(Treg)的免疫反应抑制功能，使用调节性T细胞的细胞疗法(Treg疗法)的研究和开发已经在世界范围内得到推广，以用于治疗各种自身免疫性疾病的目的。因此，调节性T细胞预期用于移植物抗宿主病(GvHD)和自身免疫性疾病的治疗中，以及用于炎性疾病和过敏性疾病的治疗和预防中。

调节性T细胞大致分为两种类型：天然存在的调节性T细胞(天然Treg：nTreg或胸腺Treg：tTreg)和诱导性调节性T细胞(诱导性Treg：iTreg)，并且已知nTreg天然存在于胸腺中，并且iTreg通过抗原刺激和细胞因子(诸如，IL-2、TGF-β)从外周血中的初始T细胞诱导分化。这些调节性T细胞根据细胞中要表达的标志物类型而进一步细分。

当调节性T细胞从生物体中移除时，各种器官特异性自身免疫性疾病会自发发展，并且此时当移植调节性T细胞时，自身免疫性疾病的发展受到阻止，从而调节性T细胞被认为在维持外周免疫自身耐受性方面发挥重要作用。从那时起，人们已经清楚调节性T细胞不仅可抑制自身免疫，还可抑制大多数免疫反应，诸如外源抗原引起的炎症、移植引起的排斥、感染免疫、过敏和肿瘤免疫。此外，目前已经显示，转录因子FOXP3是调节性T细胞的主调节因子。

FOXP3是Treg的主调节因子，并且已知，FOXP3在Treg中组成型表达，并且在不具有抑制功能的正常T细胞(也可以称为Tconv(常规T细胞)、效应T细胞或炎性T细胞)中未观察到组成型表达。因此，已经进行了关于在原代Treg中维持FOXP3表达以及在原代Tconv或大量CD4单阳性(SP)T细胞中诱导FOXP3表达的研究，并且已经报道了具有维持和诱导FOXP3表达的活性的此类化合物和细胞因子以及它们的组合。此类化合物、细胞因子以及它们的组合包括作为CDK8/19抑制剂的AS2863619((NPL 1和PTL 1))、作为mTOR抑制剂的雷帕霉素(rapamycin)(NPL 2、NPL 3、NPL 4和NPL 5)、TNFR2激动剂抗体(NPL 4、NPL 6和NPL 7)、细胞因子TGF-β(NPL 1和NPL 5)等。

然而，对于多能干细胞来源的调节性T细胞，维持FOXP3表达的化合物和细胞因子，以及它们的组合；诱导不表达FOXP3的T细胞表达FOXP3的化合物和细胞因子，以及它们的组合；等等仍是未知的。已知调节性T细胞难以增殖，但是具有高产生效率(收率)的工业产生方法是所期望的，并且它们的有效诱导方法是所期望的。

在NPL 8中，关于FOXP3的突变导致的IPEX(X连锁多内分泌腺病肠病伴免疫失调)综合征，以下内容已有所描述：使用慢病毒载体将基因转导至自体造血干细胞，以恢复FOXP3表达，并且将该细胞施用于IPEX综合征的模型小鼠。因此，据报道，造血干细胞分化成功能性调节性T细胞并且从自身免疫表型中恢复。此外，PTL 2也描述了含有编码人FOXP3蛋白的核苷酸序列的类似重组慢病毒载体。

PTL 3公开了以下内容：同时表达Mcl-1和Foxp3对于改善Treg存活是重要的。此外，PTL 4公开了以下内容：含有编码谱系定型因子的转基因的经基因工程化的哺乳动物细胞可促进向CD4⁺Treg的分化。PTL 5公开了一种用于通过培养三维细胞聚集体来制备来自干细胞或祖细胞的T细胞组合物的方法，所述三维细胞聚集体包含选定的表达Notch配体的基质细胞群和选定的干细胞或祖细胞群。

引文列表

专利文献

PTL 1：WO2018/139660

PTL 2：WO2019/040655

PTL 3：WO2014/180943

PTL 4：WO2021/092581

PTL 5：WO2017/075389

非专利文献

NPL 1：Akamatsu等人,Sci.Immunol.4,eaaw2707(2019)

NPL 2：Charbonnier等人,Nat.Immunol.20(9),1208-1219(2019)

NPL 3：MacDonald等人,Clin.Exp.Immunol.,197(1):52-63.(2019)

NPL 4：Urbano等人,Front.Immunol.9:573(2018)

NPL 5：Schmid等人,PLoS One.,11(2):e0148474.(2016)

NPL 6：He等人,PLoS One.11(5),e0156311(2016)

NPL 7：Torrey等人,Sci.Signal.13,eaba9600(2020)

NPL 8：Cell Stem Cell 24,309-317,2019年2月7日

发明内容

技术问题

本发明的目的是提供一种用于产生含有调节性T细胞的细胞群的方法，所述方法可以高效地产生调节性T细胞。

问题的解决方案

本发明人为了实现上述目的已经进行了深入研究，结果发现，通过在存在选自由以下各项组成的组的至少一种物质的情况下培养含有多能干细胞(尤其是，iPS细胞)来源的CD4⁺T细胞的细胞群，可以高效地产生含有调节性T细胞的细胞群：CDK8和/或CDK19抑制剂、TNFR2激动剂、mTOR抑制剂和TGF-βR激动剂。

本发明通过基于这些发现进一步进行研究来完成，并且提供了用于产生含有调节性T细胞的细胞群、含有调节性T细胞的细胞群、药物等等的以下方法。

[1]一种用于产生含有调节性T细胞的细胞群的方法，所述方法包括：

步骤(1)在存在选自由CDK8和/或CDK19抑制剂、TNFR2激动剂、mTOR抑制剂和TGF-βR激动剂组成的组的至少一种物质的情况下培养含有多能干细胞来源的CD4⁺T细胞的细胞群。

[1a]一种用于产生含有调节性T细胞的细胞群的方法，所述方法包括：

步骤(1)在存在选自由CDK8和/或CDK19抑制剂、TNFR2激动剂、mTOR抑制剂和TGF-βR激动剂组成的组的至少一种物质的情况下培养含有多能干细胞来源的CD8⁺T细胞的细胞群。

[2]根据[1]或[1a]所述的方法，其中步骤(1)在存在CDK8和/或CDK19抑制剂和mTOR抑制剂的情况下进行。

[3]根据[1]或[1a]所述的方法，其中步骤(1)在存在CDK8和/或CDK19抑制剂、mTOR抑制剂和TGF-βR激动剂的情况下进行。

[4]根据[1]或[1a]所述的方法，其中步骤(1)在存在CDK8和/或CDK19抑制剂、TNFR2激动剂、mTOR抑制剂和TGF-βR激动剂的情况下进行。

[5]根据[1]至[4]中任一项所述的方法，其中所述CDK8和/或CDK19抑制剂是选自由以下各项组成的组中的至少一者：4-[1-(2-甲基-1H-苯并咪唑-5-基)-1H-咪唑并[4,5-c]吡啶-2-基]-1,2,5-噁二唑-3-胺、3-{1-[1-(4-甲氧基苯基)哌啶-4-基]-4-甲基-1H-咪唑并[4,5-c]吡啶-2-基}吡嗪-2-胺以及CDK8和/或CDK19的siRNA。

[6]根据[1]至[5]中任一项所述的方法，其中所述mTOR抑制剂是雷帕霉素。

[7]根据[1]、[1a]和[4]至[6]中任一项所述的方法，其中所述TNFR2激动剂是TNFR2激动剂抗体。

[8]根据[1]、[1a]和[3]至[7]中任一项所述的方法，其中所述TGF-βR激动剂是TGF-β。

[9]根据[1]至[8]中任一项所述的方法，其中所述调节性T细胞是CD25⁺/FOXP3⁺细胞。

[9a]根据[1]至[8]中任一项所述的方法，其中所述调节性T细胞是CD25⁺/CD127^-细胞。

[10]根据[1]至[9]中任一项所述的方法，其中所述CD4⁺T细胞是CD4⁺/CD8^-T细胞。

[10a]根据[1a]至[9a]中任一项所述的方法，其中所述CD8⁺T细胞是CD4^-/CD8⁺T细胞。

[11]根据[1]至[10]中任一项所述的方法，其在步骤(1)之前还包括：步骤(2)诱导多能干细胞分化成含有CD4⁺T细胞的细胞群。

[11a]根据[1a]至[9a]和[10a]中任一项所述的方法，其在步骤(1)之前还包括：步骤(2)诱导多能干细胞分化成含有CD8⁺T细胞的细胞群。

[11b]根据[1]至[11a]中任一项所述的方法，其包括(3)将外源基因(尤其是用于表达嵌合抗原受体的基因)引入含有多能干细胞(尤其是iPS细胞)、CD4⁺T细胞，CD8⁺T细胞或调节性T细胞的细胞群中。

[12]根据[1]至[11b]中任一项所述的方法，其中所述多能干细胞是iPS细胞。

[13]根据[11]、[11b]或[12]中任一项所述的方法，其中在步骤(2)中培养三维细胞聚集体，所述三维细胞聚集体含有能够分化成所述多能干细胞来源的CD4⁺T细胞的细胞和表达Notch配体的基质细胞。

[13a]根据[11a]、[11b]或[12]中任一项所述的方法，其中在步骤(2)中培养三维细胞聚集体，所述三维细胞聚集体含有能够分化成所述多能干细胞来源的CD8⁺T细胞的细胞和表达Notch配体的基质细胞。

[14]一种含有调节性T细胞的细胞群，其是通过根据[1]至[13a]中任一项所述的方法获得的。

[15]一种药物，其包含根据[14]所述的含有调节性T细胞的细胞群。

[16]根据[15]所述的药物，其用于预防和/或治疗自身免疫性疾病、移植物抗宿主病或移植排斥。

[17]一种用于预防和/或治疗自身免疫性疾病、移植物抗宿主病或移植排斥的方法，所述方法包括将根据[14]所述的含有调节性T细胞的细胞群施用于有需要的受试者。

[18]根据[14]所述的含有调节性T细胞的细胞群，其用于预防和/或治疗自身免疫性疾病、移植物抗宿主病或移植排斥。

[19]根据[14]所述的含有调节性T细胞的细胞群在制备用于预防和/或治疗自身免疫性疾病、移植物抗宿主病或移植排斥的药物中的用途。

[20]根据[1]至[13a]中任一项所述的方法，其中所述CD4⁺T细胞是已经引入表达构建体的细胞，所述表达构建体包含：

(1)(a)Foxp3基因的保守非编码序列(CNS)1、CNS2和CNS3；

(b)启动子；以及

(c)编码FOXP3的核酸。

[20a]一种用于增殖含有调节性T细胞的细胞群的方法，所述方法包括

(A)在存在CDK8和/或CDK19抑制剂、TNFR2激动剂和TGF-βR激动剂的情况下培养含有调节性T细胞的细胞群，所述调节性T细胞是原代培养细胞。

[20b]根据[20a]所述的方法，其中步骤(A)在存在CDK8和/或CDK19抑制剂、TNFR2激动剂、和TGF-βR激动剂、以及mTOR抑制剂的情况下进行。

[20c]根据[20a]或[20b]所述的方法，其中所述CDK8和/或CDK19抑制剂是选自由以下各项组成的组中的至少一者：4-[1-(2-甲基-1H-苯并咪唑-5-基)-1H-咪唑并[4,5-c]吡啶-2-基]-1,2,5-噁二唑-3-胺、3-{1-[1-(4-甲氧基苯基)哌啶-4-基]-4-甲基-1H-咪唑并[4,5-c]吡啶-2-基}吡嗪-2-胺以及CDK8和/或CDK19的siRNA。

[20d]根据[20b]或[20c]所述的方法，其中所述mTOR抑制剂是雷帕霉素。

[20e]根据[20a]至[20d]中任一项所述的方法，其中所述TNFR2激动剂是TNFR2激动剂抗体。

[20f]根据[20a]至[20e]中任一项所述的方法，其中所述TGF-βR激动剂是TGF-β。

[20g]根据[20a]至[20f]中任一项所述的方法，其中所述调节性T细胞是CD25⁺/FOXP3⁺细胞。

[20h]根据[20a]至[20f]中任一项所述的方法，其中所述调节性T细胞是CD25⁺/CD127^-细胞。

发明的有利效果

根据本发明，可以高效地产生调节性T细胞。

附图说明

图1显示了流式细胞术(FACS)图，图中显示了在9周时包含来源于4GAD1-4的ATO的细胞(上)和在6周时包含来源于FFI01s04的ATO的细胞(下)。

图2显示了FACS图，图中显示了在使用基础培养基进行初始扩增培养之后PBMC来源的Tconv和4GAD1-4来源的CD4SP T细胞的特征谱。

图3显示了FACS图，图中显示了来自健康志愿者供体的PBMC中的大量(CD4(+)分选级分)、Tconv(CD4(+)CD25(-)分选级分)和Treg(CD4(+)CD25(+)CD127(-)分选级分)。

图4显示了在基础培养基的情况下或在添加有AMT或AMRT的基础培养基的情况下PBMC来源的Treg的扩增培养结果(显示FOXP3表达的FACS图)。

图5显示了在IL-2浓度改为100ng/mL的基础培养基的情况下或在添加有AMT或AMRT的基础培养基的情况下PBMC来源的Treg的扩增培养结果(显示FOXP3表达的FACS图(左)和扩增比率的图表(右))。

图6显示了在基础培养基的情况下或在添加有AR、ART、AMT或AMRT的基础培养基的情况下4GAD1-4来源的CD4SP T细胞的扩增培养结果(显示FOXP3表达率的FACS图)。

图7显示了通过用添加有AMT且IL-2浓度改为100ng/mL的基础培养基进行培养所扩增的PBMC来源的Treg(上排)，通过在基础培养基中进行培养所扩增的PBMC来源的Tconv(中排)，以及通过用添加有ART的基础培养基进行培养所扩增的PBMC来源的Tconv(下排)的FACS图。

图8显示了通过在基础培养基中进行培养所扩增的4GAD1-4来源的CD4SP T细胞(上排)，以及通过用添加有AMRT的基础培养基进行培养所扩增的4GAD1-4来源的CD4SP T细胞(下排)的FACS图。

图9是显示各细胞类型中的去甲基化的FOXP3 TSDR区的拷贝数与去甲基化的GAPDH基因的拷贝数之比的图表。由于GAPDH基因在任何细胞中都以大致上恒定速率去甲基化，因此可以将其解释为表示细胞群中有多少百分比(％)的细胞是具有去甲基化的TSDR区的细胞的值。

图10显示了实施例4中使用的CAR分子的结构。

图11显示了FACS图，图中显示了在进行(上排)和不进行(下排)CAR基因转导的情况下，通过用添加有AMT的基础培养基进行培养所扩增的PBMC来源的Treg，以及通过用添加有AMRT的基础培养基进行培养所扩增的iPS细胞来源的CD4SP T细胞。

图12显示了当CTL(从与下文描述的体内实验中使用和培养所扩增的PBMC相同的PBMC分选)与单独用IL-2培养所扩增的iPS细胞来源的CD4SP T细胞、用AMRT培养所扩增的iPS细胞来源的CD4SP T细胞、或者用AMT培养所扩增的PBMC来源的Treg一起共培养时，细胞毒性T细胞(CTL)的增殖程度的图(进行(上排)和不进行(下排)CAR基因转导)。检测到的峰越靠右，细胞增殖的抑制就越严重。

图13是显示当以下六种类型细胞中的一种以不同比率与CTL共培养时，CTL的增殖抑制率(％抑制)的图表：在不进行CAR基因转导的情况下，单独用IL-2培养所扩增的iPS细胞来源的CD4SP T细胞(iPS-CD4T，不进行CAR，用IL-2培养)，在进行CAR基因转导的情况下，单独用IL-2培养所扩增的iPS细胞来源的CD4SP T细胞(iPS-CD4T，进行CAR，用IL-2培养)，在不进行CAR基因转导的情况下，用AMRT培养所扩增的iPS细胞来源的CD4SP T细胞(iPS-CD4T，不进行CAR，用AMRT培养)，在进行CAR基因转导的情况下，用AMRT培养所扩增的iPS细胞来源的CD4SP T细胞(iPS-CD4T，进行CAR，用AMRT培养)，以及在不进行CAR基因转导的情况下，用AMT培养所扩增的PBMC来源的Treg细胞(nTreg，不进行CAR，用AMT培养)，或在进行CAR基因转导的情况下，用AMT培养所扩增的PBMC来源的Treg细胞(nTreg CAR，进行CAR，用AMT培养)。数据值是平均值±SEM。n＝3

图14是显示在给每组小鼠移植以下四种类型细胞中的一种之后的体重(上排)和总体存活率(下排)的图表：在不进行CAR基因转导的情况下，用AMRT培养所扩增的iPS细胞来源的CD4SP T细胞，在进行CAR基因转导的情况下，用AMRT培养所扩增的iPS细胞来源的CD4SP T细胞，在不进行CAR基因转导的情况下，用AMT培养所扩增的PBMC来源的Treg细胞，或在进行CAR基因转导的情况下，用AMT培养所扩增的PBMC来源的Treg细胞，以及HLA-A2阳性PBMC。数据值是平均值±SEM。n＝5(n＝4仅在不进行CAR基因转导的情况下的iPS细胞来源的CD4SP T细胞中)

图15是显示在给每组小鼠移植以下四种类型细胞中的一种之后的体重(上排)和总体存活率(下排)的图表：在不进行CAR基因转导的情况下，用AMRT培养所扩增的iPS细胞来源的CD4SP T细胞，在进行CAR基因转导的情况下，用AMRT培养所扩增的iPS细胞来源的CD4SP T细胞，在不进行CAR基因转导的情况下，用AMT培养所扩增的PBMC来源的Treg细胞，在进行CAR基因转导的情况下，用AMT培养所扩增的PBMC来源的Treg细胞，以及HLA-A2阳性PBMC(来源于与图14中的HLA-A2阳性PBMC供体不同的供体)。数据值是平均值±SEM。n＝5

图16显示了用含有或不含有AMRT的培养基进行培养的CNS-Foxp3转导的iPS细胞来源的Treg的扩增比率的图表。

图17显示了用含有或不含有AMRT的培养基进行培养的CNS-Foxp3转导的iPS细胞来源的Treg的FACS图。

图18显示了当来源于供体的PBMC与用添加有AMRT或不添加AMRT的培养基进行培养所扩增的CNS-Foxp3转导的iPS细胞来源的Treg共培养时，PBMC的增殖程度的图。检测到的峰越靠右，细胞增殖的抑制就越严重。

图19A显示了对类器官培养物中的细胞和胸腺细胞的整合单细胞RNA-seq数据集进行的拟时间分析的结果(3D类器官培养物的单细胞RNA-seq数据与人胸腺细胞的单细胞RNA-seq数据整合的轨迹分析)。

图19B显示了对类器官培养物中的细胞和胸腺细胞(提取的T细胞谱系分化的细胞)的整合单细胞RNA-seq数据集进行的拟时间分析的结果。

图19C显示了对类器官培养物中的细胞和胸腺细胞的整合单细胞RNA-seq数据集进行的拟时间分析的结果(基于拟时间分析的DEG模块的热图)。

图19D显示了对类器官培养物中的细胞和胸腺细胞的整合单细胞RNA-seq数据集进行的拟时间分析的结果(每个模块簇的前10个显著基因)。

图20A显示了通过单细胞RNA测序分析获得的2D和3D培养物中的分化的细胞的转录物组谱(3D类器官、2D培养物和人胸腺细胞的整合UMAP)。

图20B显示了通过单细胞RNA测序分析获得的2D和3D培养物中的分化的细胞的转录物组谱(显示CD4、CD8A和CD8B的特征图)。

图20C显示了通过单细胞RNA测序分析获得的2D和3D培养物中的分化的细胞的转录物组谱(3D类器官培养物样品、胸腺细胞和2D成熟细胞的CD4特征图)。

图21A是显示3D培养物、胸腺细胞和2D培养物的指定基因集的特征图的视图。

图21B是显示3D培养物、胸腺细胞和2D培养物的指定基因集的特征图的视图。

图21C是显示3D培养物、胸腺细胞和2D培养物的指定基因集的特征图的视图。

具体实施方式

下文将对本发明的实施方案进行详细描述。

术语“包括(comprise(s)/comprising)”表示包含但不限于该词后面的要素。因此，这表明包含该词后面的一个或多个要素，但并不表明排除任何其他要素。短语“由……组成(consist(s)of/consisting of)”意指包含并限于该短语后面的所有一个或多个要素。因此，短语“由......组成”表示所列举的一个或多个要素是需要的或必需的，并且基本上不存在其他要素。短语“基本上由......组成(consist(s)essentially of/consistingessentially of)”意指包含该短语后面的任何要素，并且将其他要素限制为不影响本公开中详述的所列举的一个或多个要素的活性或效果的那些要素。因此，短语“基本上由......组成”表示所列举的一个或多个要素是需要的或必需的，而其他要素是任选的，并且可以存在或不存在，这取决于它们是否影响所列举的一个或多个要素的活性或效果。

在本说明书中，术语“培养”是指细胞在体外环境中的维持或/和增殖。术语“培养”是指在组织外或体外(例如，在细胞培养皿或烧瓶中)维持或/和增殖细胞。

在本说明书中，短语“在物质的存在下培养细胞群”是指例如在含有所述物质的培养基中培养细胞群。这种培养的实例包括在仅含有所述物质的培养基中或在含有所述物质、其他分化诱导因子等的培养基中培养。当将物质添加到培养基中时，可直接添加到培养基中，或可在使用前溶解在适当的溶剂中，然后添加到培养基中。此外，在培养期间，也可在将物质固定在基底或载剂表面上的同时进行培养。

在本说明书中，术语“阳性(+)”意指蛋白质或基因以通过本领域已知方法可检测到的量表达。在蛋白质在细胞内表达并且不出现在细胞表面(例如，转录因子或其亚基)上的情况下，报告蛋白与所述蛋白质一起表达，并且检测所述报告蛋白，由此可检测到靶蛋白。基因检测可通过使用核酸扩增和/或核酸检测方法进行，诸如RT-PCR、微阵列、生物芯片和RNAseq。

在本说明书中，术语“阴性(-)”意指蛋白质或基因的表达水平小于通过上文所述的已知方法中的所有或任一种的检测下限，或者它们的表达程度较低。蛋白质或基因表达的检测下限可能因方法而异。通过与在相同条件下测量的对照细胞的结果进行比较，可以确定蛋白质或基因表达的程度(低表达或高表达)。对照细胞的实例包括实施例部分中所述的PBMC来源的Treg和iPS细胞来源的CD4SP T细胞。例如，可以使用流式细胞术将某一细胞群中的CD25的表达水平与PBMC来源的Tconv(对照：已知CD25表达较低)中的CD25的表达水平进行比较来确定该细胞群中的CD25的表达程度，并且当观察到与对照相当的表达时，可以将该表达水平确定为低表达，并且当表达高于对照细胞时，可以将该表达水平确定为高表达。

在本说明书中，术语“标志物”是指在给定细胞类型的细胞表面上、细胞质中或细胞核中特异性表达的蛋白质或其基因。标志物优选是“细胞表面标志物”。“细胞表面标志物”是指在细胞表面上表达的蛋白质，其可用荧光物质标记(染色)并且促进表达细胞表面标志物的细胞的检测、浓缩、分离等。细胞表面标志物是指在给定的细胞类型中特异性表达(阳性标志物)或不特异性表达(阴性标志物)的基因，并且具体是指通过基因组中的基因的转录而产生(阳性标志物)或不产生(阴性标志物)为mRNA或通过mRNA的翻译而产生(阳性标志物)或不产生(阴性标志物)为蛋白质的物质。

此类细胞表面标志物可使用对细胞表面标志物具有特异性的抗体通过免疫学测定诸如ELISA、免疫染色和流式细胞术来检测。

在本说明书中，术语“表达”被定义为由细胞内启动子驱动的特定核苷酸序列的转录和/或翻译。

在本说明书中，“多能干细胞”是指胚胎干细胞(ES细胞)和具有类似多能性的细胞，即具有分化成活体的各种组织(内胚层、中胚层和外胚层)的潜力的细胞。作为具有与ES细胞相同的多能性的细胞的实例包括“诱导性多能干细胞”(在本说明书中也称为“iPS细胞”)。

在本说明书中，“造血干细胞(HSC)”是能够分化成血细胞的多能干细胞。造血干细胞主要存在于人类活体的骨髓中，并且分化成白细胞(中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、淋巴细胞、单核细胞和巨噬细胞)、红细胞、血小板、肥大细胞、树突状细胞等。在本说明书中，造血干细胞(HSC)可以是CD34阳性的并且是CD7阴性的(CD34⁺/CD7^-)。在本说明书中，短语“CD34⁺/CD7^-”等中使用的“/”意指“和”。

在本说明书中，“造血祖细胞”(HPC)是具有分化成血细胞的能力，但是不具有像干细胞那样的自我更新能力的细胞。造血祖细胞主要存在于人类活体的骨髓中。在本说明书中，造血祖细胞(HPC)可以是CD34阳性的并且是CD43阴性的(CD34⁺/CD43⁺)。此外，HPC可以是CD24、CD62L、CD90、CD143、CD263、Notch3、CD32、CD39、CD49a、CD164、CD317、CD200、CD218a、CD7、CD144、CD56、CD226、CD262和CD325阳性的，并且是CD49f、CD51、CD102、CD42b、CD61、CD62P、CD69、CD102和CD156c阴性的，如WO2018/199186中所述。

在本说明书中，“造血内皮细胞(HEC)”是表达CD34但不表达CD43、CD184和CD73的细胞(CD34⁺/CD43^-/CD184^-/CD73^-)(CD34⁺/CD43^-/CD184^-/CD73^-细胞不表达CD7，因此CD34⁺/CD43^-/CD184^-/CD73^-细胞也被称为“CD34⁺/CD7^-/CD43^-/CD184^-/CD73^-细胞”)。

在本说明书中，“祖T细胞(proT)”是指在人类活体内由造血干细胞分化成CD3阳性T细胞的过程中产生的造血细胞，并且是CD34和CD7(CD34⁺/CD7⁺细胞)阳性的。此外，在本说明书中，proT可以是CD43、CD1a和/或CD116阴性的。

在本说明书中，“中胚层祖细胞”是指例如表达选自由T(与Brachyury同义)、KDR、FOXF1、FLK1、BMP4、MOX1和SDF1组成的组的至少一种标记基因的细胞。中胚层祖细胞与中胚层细胞没有区别，上述标记基因表达较弱的细胞可以称为“中胚层祖细胞”。

在本说明书中，“调节性T细胞”是指当经由T细胞受体刺激时具有抑制效应T细胞活化的能力并且负责抑制免疫反应(免疫耐受)的T细胞。调节性T细胞通常是CD25⁺/FOXP3⁺细胞或CD25⁺/CD127^-细胞，并且其中存在CD4⁺或CD8⁺细胞。在本发明中，调节性T细胞可以是CD4⁺细胞(即，CD4⁺/CD25⁺/FOXP3⁺或CD4⁺/CD25⁺/CD127^-)或CD8⁺细胞(即，CD8⁺/CD25⁺/FOXP3⁺或CD8⁺/CD25⁺/CD127^-)，并且更优选是CD4⁺细胞。此外，已知转录因子FOXP3是CD4⁺/CD25⁺调节性T细胞的主调节因子。

在本说明书中，“CD4⁺T细胞”是指在T细胞中表面抗原CD4阳性的细胞。优选地，CD4⁺T细胞是CD8阴性的(CD4⁺/CD8^-，CD4单阳性(SP))，并且在这种情况下，由于T细胞可以通过表面抗原CD3和CD45阳性来标识，因此CD4⁺T细胞可以被标识为CD8阴性以及CD4、CD3和CD45阳性的细胞(CD4⁺/CD8^-/CD3⁺/CD45⁺细胞)。CD4⁺T细胞是CD25和FOXP3阴性以及CD127阳性的细胞。CD4⁺T细胞的实例包括辅助性T细胞。

在本说明书中，“CD8⁺T细胞”是指在T细胞中表面抗原CD8阳性的细胞。优选地，CD8⁺T细胞是CD4阴性的(CD4^-/CD8⁺，CD8单阳性(SP))，并且在这种情况下，由于T细胞可以通过表面抗原CD3和CD45阳性来标识，因此CD8⁺T细胞可以被标识为CD4阴性以及CD8、CD3和CD45阳性的细胞(CD4^-/CD8⁺/CD3⁺/CD45⁺细胞)。CD8⁺T细胞是CD25和FOXP3阴性以及CD127阳性的细胞。CD8⁺T细胞的实例包括细胞毒性T细胞。

在本说明书中，“基质细胞”是在活组织中构成支持实质细胞的结缔组织的细胞，并且尤其指能够产生ATO(产生T细胞)的基质细胞，通常，基质细胞包含在造血组织(诸如骨髓或胸腺)中，并且它们的实例包括成纤维细胞、血细胞、间充质干细胞、内皮细胞、平滑肌细胞、上皮细胞和组织干细胞。基质细胞可以是已建立的细胞，诸如MS-5、OP9和S17(它们是小鼠骨髓细胞株)，或者HS-5和HS-27a(它们是人基质细胞株)，或者可以是从诸如人收集的原代细胞、从多能干细胞(iPS细胞等)分化的细胞，并且在从诸如人的多能干细胞诱导分化的细胞的情况下，从人iPS细胞诱导分化的基质细胞(尤其是从人iPS细胞诱导分化的成纤维细胞)是优选的。

在本说明书中，“CD4CD8双阳性T细胞”是指在T细胞中表面抗原CD4和CD8均为阳性的细胞(CD8⁺/CD4⁺)，并且由于T细胞可以通过表面抗原CD3和CD45阳性来标识，因此CD4CD8双阳性T细胞可以被标识为CD4、CD8、CD3和CD45阳性的细胞(CD8⁺/CD4⁺/CD3⁺/CD45⁺细胞)。

在本说明书中，“CD4CD8双阴性T细胞”是指在T细胞中表面抗原CD4和CD8均为阴性的细胞(CD8^-/CD4^-)，并且由于T细胞可以通过表面抗原CD3和CD45阳性来标识，因此CD4CD8双阴性T细胞可以被标识为CD4和CD8阴性以及CD3和CD45阳性的细胞(CD8^-/CD4^-/CD3⁺/CD45⁺细胞)。

在本说明书中，“细胞群”意指相同类型或不同类型的两种或更多种细胞。“细胞群”也意指大量相同类型或不同类型的细胞。

从治疗应用的角度来看，本发明中使用的各种细胞优选是通过药品生产质量管理规范(GMP)认证的细胞。

多能干细胞的实例包括胚胎干细胞(ES细胞)、诱导性多能干细胞(iPS细胞)、胚胎癌细胞(EC细胞)、胚胎生殖干细胞(EG细胞)和Muse细胞；并且优选iPS细胞(更优选是人iPS细胞)。当多能干细胞是ES细胞或源自人胚胎的任何细胞时，可通过破坏胚胎或不破坏胚胎来产生细胞，并且优选不破坏胚胎而产生的细胞。

关于“ES细胞”，可使用Ingenious Targeting Laboratory、RIKEN等建立的各种小鼠ES细胞株作为小鼠ES细胞，并且可使用威斯康星大学(the University of Wisconsin)、NIH、RIKEN、京都大学(Kyoto University)、国家儿童健康与发展中心(National Centerfor Child Health and Development)、Cellartis等建立的各种人ES细胞株作为人ES细胞。人ES细胞株的可用实例包括ESI Bio提供的CHB-1至CHB-12株、RUES1株、RUES2株、HUES1至HUES28株等；WiCell Research提供的H1株、H9株等；以及RIKEN提供的KhES-1株、KhES-2株、KhES-3株、KhES-4株、KhES-5株、SSES1株、SSES2株、SSES3株等。

“诱导性多能干细胞”是指通过引入特定因子(核重编程因子)对哺乳动物体细胞或未分化干细胞进行重编程而获得的细胞。目前，诱导性多能干细胞存在许多不同类型。可用的实例包括由Yamanaka等人通过将四种因子Oct3/4、Sox2、Klf4和c-Myc引入小鼠成纤维细胞中而建立的iPS细胞(Takahashi K,Yamanaka S.,Cell,(2006)126:663-676)，以及通过将相同的四种因子引入人成纤维细胞中而建立的人细胞来源的iPS细胞(Takahashi K,Yamanaka S.等人Cell,(2007)131:861-872.)、通过引入上述四种因子然后使用Nanog表达作为索引进行筛选而建立的Nanog-iPS细胞(Okita,K.,Ichisaka,T.和Yamanaka,S.(2007).Nature 448,313-317.)、通过不包括c-Myc的方法产生的iPS细胞(Nakagawa M,Yamanaka S.等人Nature Biotechnology,(2008)26,101-106)以及通过无病毒方法通过引入六种因子而建立的iPS细胞(Okita K等人Nat.Methods 2011年5月；8(5):409-12,OkitaK等人Stem Cells.31(3):458-66.)。其他可用的实例包括由Thomson等人产生的并且通过引入四种因子OCT3/4、SOX2、NANOG和LIN28而建立的诱导性多能干细胞(Yu J.,ThomsonJA.等人,Science(2007)318:1917-1920.)、由Daley等人产生的诱导性多能干细胞(ParkIH,DaleyGQ.等人,Nature(2007)451:141-146)、由Sakurada等人产生的诱导性多能干细胞(JP2008-307007A)等。

其他可用的实例是本领域已知并且在所有已发表的文章(例如，Shi Y.,Ding S.等人,Cell Stem Cell,(2008)第3卷,第5期,568-574；Kim JB.,Scholer HR.等人,Nature,(2008)454,646-650；Huangfu D.,Melton,DA.等人,Nature Biotechnology,(2008)26,第7期,795-797)或专利(例如，JP2008-307007A、JP2008-283972A、US2008/2336610、US2009/047263、WO2007/069666、WO2008/118220、WO2008/124133、WO2008/151058、WO2009/006930、WO2009/006997和WO2009/007852)中描述的任何诱导性多能干细胞。

作为诱导性多能干细胞株，可使用由NIH、RIKEN、京都大学等建立的各种iPS细胞株。人iPS细胞株的实例包括HiPS-RIKEN-1A株、HiPS-RIKEN-2A株、HiPS-RIKEN-12A株和Nips-B2株(RIKEN)；Ff-I01s04株、QHJI株、RWMH株、DRXT株、RJWI株、YZWJ株、ILCL株、GLKV株、253G1株、201B7株、409B2株、454E2株、606A1株、610B1株和648A1株(京都大学)等。

“核酸”可以是通过核苷酸和具有与核苷酸相同功能的分子聚合而获得的任何分子，实例包括作为核糖核苷酸的聚合物的RNA、作为脱氧核糖核苷酸的聚合物的DNA、作为核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸的混合物的聚合物以及含有核苷酸类似物的核苷酸聚合物，并且核酸也可以是含有核酸衍生物的核苷酸聚合物。核酸可以是单链核酸或双链核酸。双链核酸包括其中一条链在严格条件下与另一条链杂交的双链核酸。

核苷酸类似物可以是任何分子，只要它是通过修饰核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸、RNA或DNA而获得的与RNA或DNA相比改进核酸酶抗性、稳定化、增加与互补链核酸的亲和力、增强细胞渗透性或可视化的分子即可。核苷酸类似物可以是天然存在的分子或非天然分子。实例包括糖修饰的核苷酸类似物(例如，2'-O-甲基核糖取代的核苷酸类似物、2'-O-丙基核糖取代的核苷酸类似物、2'-甲氧基乙氧基核糖取代的核苷酸类似物、2'-O-甲氧基乙基核糖取代的核苷酸类似物、2'-O-[2-(胍鎓)乙基]核糖取代的核苷酸类似物、2'-氟核糖取代的核苷酸类似物、桥接核酸(BNA)、锁核酸(LNA)、乙烯桥接核酸(ENA)、肽核酸(PNA)、氧肽核酸(OPNA)和肽核糖核酸(PRNA))、磷酸二酯键修饰的核苷酸类似物(例如，硫代磷酸酯键取代的核苷酸类似物和N3'-P5'氨基磷酸酯键取代的核苷酸类似物)等。

核酸衍生物可以是任何分子，只要是通过向核酸中添加另一种化学物质而获得的分子即可，与核酸相比，核酸衍生物的核酸酶耐受性得以改善、更稳定、与互补链核酸的亲和力增加、细胞渗透性增强或可视化增加，并且具体实例包括5'-多胺加合物衍生物、胆固醇加合物衍生物、类固醇加合物衍生物、胆汁酸加合物衍生物、维生素加合物衍生物、Cy5加合物衍生物、Cy3加合物衍生物、6-FAM加合物衍生物、生物素加合物衍生物等等。

本发明的用于产生含有调节性T细胞的细胞群的方法(在本说明书中也简称为“本发明的产生方法”)特征性地包括以下步骤：

1)在存在选自由CDK8和/或CDK19抑制剂、TNFR2激动剂、mTOR抑制剂和TGF-βR激动剂组成的组的至少一种物质的情况下培养含有多能干细胞来源的CD4⁺T细胞的细胞群。

CDK8(周期蛋白依赖性激酶8)和/或CDK19抑制剂被定义为抑制CDK8和/或CDK19的功能的物质，尤其是抑制CDK8和/或CDK19的激酶活性的物质，并且可以是CDK8和CDK19两者的抑制剂，或者可以是它们中的任一者的抑制剂。CDK8和/或CDK19抑制剂的实例包括4-[1-(2-甲基-1H-苯并咪唑-5-基)-1H-咪唑并[4,5-c]吡啶-2-基]-1,2,5-噁二唑-3-胺(AS2863619)(下文也称为“化合物1”)；3-{1-[1-(4-甲氧基苯基)哌啶-4-基]-4-甲基-1H-咪唑并[4,5-c]吡啶-2-基}吡嗪-2-胺(AS3334366)(下文也称为“化合物2”)；编码CDK8和/或CDK19的基因和/或它们的转录物的siRNA、shRNA、dsRNA、miRNA和反义核酸，以及表达它们的表达载体；US8598344、WO2013/116786、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.109 13799-13804(2012)、WO2013/001310、WO2013/040153、WO2014/029726、WO2014063778、WO2014/072435、WO2014/090692、WO2014/106606、WO2014/123900、WO2014/154723、WO2014/194245、WO2015/049325、WO2015/100420、WO2015/144290、WO2015/159937和WO2015/159938中所述的化合物(尤其是，(2E)-N-(2-氟-4-(吗啉-4-基甲基)苯基)-3-(4-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)吡啶-3-基)丙烯酰胺(下文也称为“化合物3”)和(2E)-3-(4-(1-环丙基-1H-吡唑-4-基)吡啶-3-基)-N-(1-甲基-1H-吲哚-5-基)丙烯酰胺(下文也称为“化合物4”))；WO2016/009076和WO2018/159805中所述的化合物(尤其是，8-(2,4-二氟苯氧基)-1-甲基-4,5-二氢-1H-噻吩并[3,4-g]吲唑-6-甲酰胺(下文也称为“化合物5”)、4-((4-氟苯基)磺酰基)-3-(2-(咪唑并[1,2-b]哒嗪-6-基硫烷基)乙基)-3,4-二氢喹喔啉-2(1H)-酮(下文也称为“化合物6”)、2-(苄基氨基)-4-(1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-3-基)苯甲酰胺(下文也称为“化合物7”)、3-(3-(苄氧基)苯基)-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶(下文也称为“化合物8”)、4-(4-(2,3-二氢-1,4-苯并二噁英-6-基)-1H-吡唑-3-基)苯-1,3-二醇(尤其是其三氟乙酸盐)(下文也称为“化合物9”)、N-丁基-8-(4-甲氧基苯基)-1,6-萘啶-2-甲酰胺和8-(4-甲基苯基)-N,N-二丙基-1,6-萘啶-2-甲酰胺(尤其是其三氟乙酸盐)(下文也称为“化合物10”))；WO2022/107877中所述的化合物(尤其是(E)-(4-(3-(5-(4-氟苯基)-1-甲基-1H-吡唑-4-基)丙烯酰胺)苄基)膦酸二乙酯(下文也称为“化合物11”)、2-(4-(4-(异喹啉-4-基)苯基)-1H-吡唑-1-基)-N,N-二甲基乙酰胺(BI-1347)和4-((2-(6-(4-甲基哌嗪-1-羰基)萘-2-基)乙基)氨基)喹唑啉-6-甲腈(Senexin B))；MSC2530818(CAS编号：1883423-59-3)和CCT251921(CAS编号：1607837-31-9)，等等。这些物质中优选的是化合物1、化合物2、化合物3、化合物4、化合物5、化合物6、化合物7、化合物8、化合物9、化合物10、化合物11、BI-1347、Senexin B、MSC2530818、CCT251921以及针对编码CDK8和/或CDK19的基因和/或它们的转录物的siRNA；更优选的是化合物1、化合物2以及针对编码CDK8和/或CDK19的基因和/或它们的转录物的siRNA；并且另外优选的是化合物1。CDK8和/或CDK19抑制剂可以单独使用或者以其两种或更多种的组合使用。此外，作为用于抑制CDK8和/或CDK19的方法，该方法也可以通过敲除编码CDK8和/或CDK19的基因来进行。作为用于敲除这种基因的方法，例如，可以使用本领域已知方法，诸如使用ZFN、TALEN、CRISPR/Cas系统等等进行的基因组编辑。

TNFR2(肿瘤坏死因子受体-2)激动剂被定义为可以结合至TNFR2以活化TNFR2信号传导的物质，并且它们的实例包括抗体(例如，抗TNFR2抗体)、肽、低分子量化合物、蛋白质等等。TNFR2激动剂抗体的实例包括与TNFR2结合的单克隆抗体，诸如克隆MR2-1(HycultBiotech)和克隆MAB2261(R&D Systems)。TNFR2激动剂可以是作为激动剂的仅与TNFR2结合的TNF-α突变蛋白。TNFR2激动剂可以单独使用或者以其两种或更多种的组合使用。

TNFR2激动剂优选为TNFR2激动剂抗体。抗体可以是其功能片段，并且功能片段的实例包括Fd、Fv、Fab、F(ab')、F(ab)₂、F(ab')₂、单链Fv(scFv)、双抗体、三抗体、四抗体和微抗体。抗体的实例包括衍生自动物(诸如小鼠、大鼠、牛、兔、山羊、绵羊和豚鼠)的那些抗体。抗体的同种型没有特别限制，并且它们的实例包括IgG(IgG1、IgG2、IgG3和IgG4)、IgA、IgD、IgE和IgM。抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体，并且优选地是单克隆抗体，并且抗体可以是人源化抗体、嵌合抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)等等。可以通过已知方法产生抗体，例如可通过以下方式来产生抗体：构建含有编码所述抗体的核酸的表达载体，以及培养其中被引入所述核酸的转化体，或者培养产生所述抗体的杂交瘤。

mTOR(雷帕霉素的机制靶标)抑制剂被定义为抑制mTOR的功能的物质，并且这些物质包括抑制mTOR本身的功能的物质以及抑制mTOR复合物1(mTORC1)和mTOR复合物2(mTORC2)(它们是mTOR复合物)的功能的物质。mTOR抑制剂的实例包括雷帕霉素或其衍生物、依维莫司(everolimus)、坦罗莫司(temsirolimus)、地磷莫司(ridaforolimus)、西罗莫司(sirolimus)、KU0063794、AZD805、AZD8055、WYE-354、WAY-600、WYE-687、Pp121、Pp242、达托里昔布(Dactolisib)、萨帕尼塞替(Sapanisertib)、奥米利昔布(Omipalisib)、维妥塞替(Vistusertib)、Torin 1、Torin 2等。mTOR抑制剂的其他实例包括编码mTOR的基因和/或其转录物的siRNA、shRNA、dsRNA、miRNA和反义核酸，以及表达他们的表达载体；并且还包括编码磷酸化和活化mTOR的酶的基因和/或其转录物的siRNA、shRNA、dsRNA、miRNA和反义核酸，以及表达他们的表达载体。其中，mTOR抑制剂优选为雷帕霉素或其衍生物，并且更优选为雷帕霉素。mTOR抑制剂可以单独使用或者以其两种或更多种的组合使用。

TGF-βR(转化生长因子-β受体)激动剂被定义为可以结合至TGF-βR以活化TGF-βR信号传导的物质。TGF-βR激动剂的实例包括属于TGF-β超家族的因子，并且TGF-β超家族包括TGF-β家族、活化素家族和BMP(骨形态发生蛋白)家族。属于TGF-β超家族的因子的实例包括TGF-β(TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3)、活化素A、活化素B、GDF-8、GDF-11等等。TGF-βR激动剂优选是TGF-β。TGF-βR激动剂可以单独使用或者以其两种或更多种的组合使用。

此外，CDK8和/或CDK19抑制剂、TNFR2激动剂、mTOR抑制剂和TGF-βR激动剂可以游离形式或以盐形式使用。盐的实例包括与无机碱形成的盐，诸如钠盐、镁盐、钾盐、钙盐和铝盐；与有机碱形成的盐，诸如甲胺盐、乙胺盐和乙醇胺盐；与碱性氨基酸(诸如赖氨酸、鸟氨酸和精氨酸)形成的盐；以及铵盐。这些盐可以是酸加成盐，并且此类盐的具体实例包括与以下酸形成的加成盐：无机酸，诸如盐酸、氢溴酸、氢碘酸、硫酸、硝酸和磷酸；有机酸，诸如甲酸、乙酸、丙酸、草酸、丙二酸、苹果酸、酒石酸、富马酸、琥珀酸、乳酸、马来酸、柠檬酸、甲磺酸和乙磺酸；以及酸性氨基酸，诸如天冬氨酸和谷氨酸。CDK8和/或CDK19抑制剂、TNFR2激动剂、mTOR抑制剂和TGF-βR激动剂还包括水合物、溶剂化物、多晶型物等。

当CDK8和/或CDK19抑制剂、TNFR2激动剂、mTOR抑制剂和TGF-βR激动剂含有不对称碳时，这些包括R-异构体、S-异构体以及含有任意比的两种异构体的混合物(例如，外消旋体)。

siRNA(小干扰RNA)是包含具有与靶基因的mRNA的核苷酸序列或其部分序列(靶标核苷酸序列)互补的序列的RNA及其互补链的双链寡RNA。siRNA还包括：作为单链RNA的RNA(小发夹RNA(shRNA))，其中与靶标核苷酸序列(第一序列)互补的序列及其互补序列(第二序列)通过发夹环部分连接，其中第一序列通过采取发夹环型结构与第二序列形成双链结构；以及哑铃形核酸，其中第一序列和第二序列的双链结构的两个末端以环状结构闭合。

siRNA可以在有义链和反义链中的一条或两条的5’-末端或3’-末端处具有突出端。突出端通过在有义链和/或反义链的末端处添加一个至几个(例如，1个、2个或3个)碱基来形成。siRNA的碱基长度没有特别限制，只要可以诱导RNA干扰即可，例如，一条侧链具有10至50个碱基、15至30个碱基或21至27个碱基。

siRNA是靶向编码CDK8和/或CDK19、mTOR等等的mRNA的siRNA，并且可以根据mRNA的碱基序列上的信息来设计，并且序列没有特别限制，只要可以诱导RNA干扰即可。siRNA可以使用已知方法通过化学合成来获得，或者使用遗传重组技术来产生。

培养基中的CDK8和/或CDK19抑制剂的浓度没有特别限制，只要可产生调节性T细胞即可，并且根据所使用的CDK8和/或CDK19抑制剂的类型等合适地调整。CDK8和/或CDK19抑制剂的浓度为例如0.1至300nM，并且优选0.5至150nM。

培养基中的TNFR2激动剂的浓度没有特别限制，只要可产生调节性T细胞即可，并且根据所使用的TNFR2激动剂的类型等合适地调整。TNFR2激动剂的浓度为例如0.0001至100μg/mL，并且优选0.01至10μg/mL。

培养基中的mTOR抑制剂的浓度没有特别限制，只要可产生调节性T细胞即可，并且根据所使用的mTOR抑制剂的类型等合适地调整。mTOR抑制剂的浓度为例如1至100nM，并且优选10至100nM。

培养基中的TGF-βR激动剂的浓度没有特别限制，只要可产生调节性T细胞即可，并且根据所使用的TGF-βR激动剂的类型等合适地调整。TGF-βR激动剂的浓度为例如0.1至100ng/mL，并且优选1至50ng/mL。

在步骤(1)中，培养在存在选自由以下各项组成的组的至少一种物质的情况下进行：CDK8和/或CDK19抑制剂(下文也缩写为“A”)、TNFR2激动剂(下文也缩写为“M”)、mTOR抑制剂(下文也缩写为“R”)和TGF-βR激动剂(下文也缩写为“T”)。这四种物质可以单独使用或者以AM、AR、AT、MR、MT、RT、AMR、ART、AMT、MRT或AMRT的组合使用。这四种物质优选地以AR、ART或AMRT的组合使用，更优选地以AMRT的组合使用。

步骤(1)的培养中所用的培养基使用用于培养动物细胞的培养基作为基础培养基，并且含有选自由以下各项组成的组的至少一种物质：上文所述的CDK8和/或CDK19抑制剂、TNFR2激动剂、mTOR抑制剂和TGF-βR激动剂。基础培养基没有特别限制，只要可以用于培养动物细胞即可，并且它们的实例包括AIM V、X-VIVO-15、NeuroBasal、EGM2、TeSR、BME、BGJb、CMRL 1066、Glasgow’s MEM、改良的MEM锌选择(Improved MEM Zinc Option)、IMDM、199培养基、Eagle’s MEM、αMEM、DMEM、Ham、RPMI-1640、Fischer培养基等等。这些培养基可以单独使用或者以其两种或更多种的混合物使用。

培养基可含有血清，或可不含血清。培养基还可含有血清替代物(例如，白蛋白、转铁蛋白、Knockout血清替代物(KSR)、脂肪酸、胰岛素、胶原前体、微量元素、2-巯基乙醇、3'-硫代甘油、ITS-补充剂、B27(商标)补充剂等)。血清替代物可单独使用或以其两种或更多种的组合使用。

培养基可以另外含有脂质、氨基酸(非必需氨基酸等)、L-谷氨酰胺、维生素、生长因子、细胞因子(IL-2等)、结合有CD3抗体和/或CD28抗体的珠粒、抗生素、抗氧化剂、丙酮酸、缓冲剂、无机盐等等中的一种或多种物质，特别优选地含有IL-2。作为培养基，使用不含有组分不明确物质的化学成分确定的培养基(诸如血清)是所期望的，因为这样可以减少批次间培养基的差异，并且可以制备质量稳定的细胞。

当培养基含有IL-2时，IL-2的浓度为例如1至500ng/mL，优选地1至300ng/mL。具体而言，当含有多能干细胞来源的CD4⁺T细胞的细胞群在步骤(1)中培养时，其浓度为例如优选地1至100ng/mL，更优选地1至50ng/mL，另外优选地3至30ng/mL，特别优选地5至15ng/mL。此外，当含有调节性T细胞(作为原代培养细胞)的细胞群在下文描述的步骤(A)中使用AMT的组合进行培养扩增时，为了维持较高的FOXP3表达率，培养基中含有的IL-2浓度例如被设定为优选地30至300ng/mL，更优选地50至200ng/mL。

培养基的pH为通常7.0至7.8，优选地7.2至7.6。为了防止使用前的污染，优选通过诸如过滤、UV照射、加热灭菌或辐射的方法对培养基进行灭菌。

培养是在饲养细胞存在或不存在的情况下进行。由于本发明的产生方法可以稳定地产生具有均一性质的调节性T细胞，而无需混合组分不明确的物质，因此在不存在饲养细胞的情况下进行该产生方法是所期望的。

本发明的产生方法的培养条件没有特别限制，并且培养温度为例如约37至42℃，优选地约37至39℃，并且CO₂浓度为例如2％至10％，优选地2％至5％，并且氧浓度为例如1％至20％，优选地5％至20％。

培养时间也没有特别限制，并且可以由本领域技术人员在监测调节性T细胞的数量时适当确定，并且为例如10天或更长，优选地1周或更长，更优选地2周或更长。培养时间的上限没有特别限制，并且例如为35天或更短，优选28天或更短，并且更优选为21天或更短。在本发明的培养中，可根据需要执行多次传代以获得期望量的调节性T细胞，或可执行培养基的添加和替换。本发明中的培养可以使用已知的CO₂培养箱来进行。培养容器没有特别限制，并且可从板、皿、培养皿、烧瓶、袋、瓶、槽(培养槽)、生物反应器等中适当地选择。

本发明中使用的多能干细胞和用于产生多能干细胞的细胞可以来源于人，或者可以来源于除人以外的哺乳动物(非人哺乳动物)，并且优选地来源于人。非人哺乳动物的实例包括小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠、兔、狗、猫、猪、牛、马、羊和猴。此外，还可以使用通用iPS细胞(具有不会在大量患者中引起免疫排斥的特定HLA，或者HLA被敲除)。

本发明的产生方法中使用的含有CD4⁺T细胞的细胞群是含有从多能干细胞(尤其是iPS细胞(尤其是人iPS细胞))诱导分化的CD4⁺T细胞的细胞群。含有CD4⁺T细胞的细胞群中所含有的CD4⁺T细胞的比例(细胞的数量)为例如5％或更多，优选地50％或更多，更优选地90％或更多，并且上限为例如100％或更少。

本发明的产生方法还可以包括分离调节性T细胞，以浓缩所获得的调节性T细胞。调节性T细胞的分离可以通过已知方法(诸如使用流式细胞术的方法或磁性细胞分离方法)来进行。

根据本发明的产生方法，可以产生具有高含量比的调节性T细胞的含有调节性T细胞的细胞群。含有调节性T细胞的细胞群中所含有的调节性T细胞的比例(细胞的数量)为例如10％或更多，优选地40％或更多，更优选地80％或更多，并且上限为例如90％或更少，更优选地100％或更少。

根据本发明的产生方法，可以产生具有高含量比的显示出高抑制功能的调节性细胞(例如，作为可抑制性的功能标志物的Helios阳性细胞，实际上在体外和/或体内显示出高可抑制性的细胞)的含有调节性T细胞的细胞群。含有调节性T细胞的细胞群中所含有的调节性T细胞的比例(细胞的数量)为例如10％或更多，优选地50％或更多，更优选地80％或更多，并且上限为例如90％或更少，更优选地100％或更少。

本发明的产生方法除了可以应用于含有CD4⁺T细胞的细胞群以外，还可以应用于含有CD8⁺T细胞的细胞群。

在本发明的另一个实施方案中，用于增殖含有调节性T细胞的细胞群的方法(在本说明书中也简称为“本发明的增殖方法”)在特征上包括以下步骤：

A)在存在CDK8和/或CDK19抑制剂、TNFR2激动剂和TGF-βR激动剂的情况下，或者在存在CDK8和/或CDK19抑制剂、TNFR2激动剂、TGF-βR激动剂和mTOR抑制剂的情况下培养含有调节性T细胞(作为原代培养细胞)的细胞群。

除非另外指明，否则本发明的增殖方法可以按照与上文所述的本发明的产生方法相同的方式进行，但是使用含有调节性T细胞的细胞群作为原代培养细胞，等等。

本发明的增殖方法中使用的含有调节性T细胞的细胞群是从生物组织(诸如骨髓、脐带血和血液)分离的原代培养细胞。含有调节性T细胞的细胞群中所含有的调节性T细胞的比例(细胞的数量)为例如80％或更多，优选地90％或更多，更优选地95％或更多，并且上限为例如100％或更少。

本发明的增殖方法中使用的含有调节性T细胞的细胞群可以来源于人，或者可以来源于除人以外的哺乳动物(非人哺乳动物)，并且优选地来源于人。非人哺乳动物的实例包括小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠、兔、狗、猫、猪、牛、马、羊和猴。

在步骤(A)中，培养在存在(i)CDK8和/或CDK19抑制剂(A)、TNFR2激动剂(M)、mTOR抑制剂(R)和TGF-βR激动剂(T)的条件下，或者在存在(ii)CDK8和/或CDK19抑制剂(A)、TNFR2激动剂(M)和TGF-βR激动剂(T)的条件下进行。更优选地，培养在存在AMT的情况下进行。

本发明的产生方法可以在步骤(1)之前另外包括步骤(2)诱导多能干细胞分化成含有CD4⁺T细胞的细胞群。

多能干细胞分化成含有CD4⁺T细胞的细胞群可以根据已知方法来诱导。此类方法的实例包括诱导多能干细胞分化成可分化成CD4⁺T细胞的细胞，然后诱导可分化成CD4⁺T细胞的细胞分化成含有CD4⁺T细胞的细胞群。可分化成CD4⁺T细胞的细胞的实例包括CD34⁺细胞、中胚层祖细胞、CD4CD8双阴性T细胞、CD4CD8双阳性T细胞等等，CD34⁺细胞或中胚层祖细胞是优选的，造血内皮细胞、造血干细胞、造血祖细胞、祖T细胞或中胚层祖细胞是更优选的，并且造血内皮细胞是特别优选的。CD34⁺细胞是表达CD34的(CD34⁺)细胞，尤其是表达CD34但不表达CD7的(CD34⁺/CD7^-)细胞。CD34⁺细胞的实例包括造血内皮细胞、造血干细胞和造血祖细胞。

多能干细胞分化成可分化成CD4⁺T细胞的细胞可以根据已知方法来诱导(参见，例如，WO2021/085576等)。例如，可分化成CD4⁺T细胞的细胞可以通过无饲养细胞方法，尤其是“胚体法(EB法)”来产生(参见AE Grigoriadis等人(2010).Blood,115(14):2769-2776.)，其中不使用产生造血祖细胞的饲养细胞来形成胚体是优选的。

多能干细胞也可以在饲养细胞上培养，以诱导向造血干细胞和/或造血祖细胞的分化(参见WO2011/096482和WO2013/176197)。从易于诱导分化成中胚层谱系的观点来看，饲养细胞优选地是基质细胞。从有助于分化成造血谱系的观点来看，基质细胞优选地是OP9细胞、10T1/2细胞(C3H10T1/2细胞)等等。

多能干细胞分化成CD34⁺细胞可以根据已知方法来进行，并且当多能干细胞是iPS细胞时，例如，造血祖细胞的分化可以通过WO2017/221975、WO2018/135646和Cell Reports2(2012)1722-1735中所述的方法来诱导，以产生CD34⁺细胞。

用于诱导可分化成CD4⁺T细胞的细胞分化成含有CD4⁺T细胞的细胞群的方法的实例包括人工胸腺类器官(ATO)方法(参见WO2017/075389等)。ATO方法包括培养含有可分化成CD4⁺T细胞的细胞和表达Notch配体的基质细胞的三维细胞聚集体，从而向CD4⁺T细胞的分化可以高效地诱导。ATO方法是已知方法，并且可以参考WO2017/075389、WO2021/085576等等的描述来进行。其他方法包括WO2021/092581中所述的分化方法(例如，与MS5-DLL1/4基质细胞、OP9或OP9-DLL1基质细胞或EpCAM-CD56⁺基质细胞共培养)。

当进行ATO方法时，分离可分化成CD4⁺T细胞的细胞可以不在进行ATO方法之前进行，并且ATO方法也可以针对通过已知方法(例如，流式细胞术或磁性细胞分离方法)分离的可分化成CD4⁺T细胞的细胞进行。

优选地将用于表达Notch配体的核酸引入基质细胞中。可以通过将核酸引入基质细胞中来产生表达Notch配体的基质细胞。此外，表达Notch配体的基质细胞可以通过以下方式来产生：将核酸引入多能干细胞(尤其是iPS细胞(尤其是人iPS细胞))中，然后将多能干细胞分化成基质细胞。

本发明的产生方法中使用的基质细胞的实例包括从多能干细胞(尤其是iPS细胞(尤其是人iPS细胞))诱导分化的基质细胞，其中使用通过将多能干细胞(尤其是iPS细胞(尤其是人iPS细胞))诱导分化成成纤维细胞来获得的细胞是所期望的。多能干细胞向基质细胞的分化可以根据已知方法来进行，并且当多能干细胞是人iPS细胞时，例如，从iPS细胞诱导分化的成纤维细胞可以通过PLoS ONE 8(10):e77673,2013中所述的方法来产生。

Notch配体没有特别限制，并且包括WO2017/075389中描述的规范Notch配体和非规范Notch配体。规范Notch配体的实例包括DLL4(δ样配体4)、DLL1(δ样配体1)、JAG1(Jagged 1)、JAG2(Jagged 2)等。这些可单独使用或以其两种或更多种的组合使用。非规范Notch配体的实例包括接触蛋白-1(Contactin-1)、NOV/CCN3、接触蛋白-6、骨膜蛋白/OSF-2、DLK2/EGFL9、Pref-1/DLK1/FA1、DNER、血小板反应蛋白-2(Thrombospondin-2)、MAGP-1/MFAP2、血小板反应蛋白-3、MAGP-2/MFAP5、血小板反应蛋白-4和纺锤蛋白-1(Netrin-1)。优选使用人DLL4作为Notch配体。

将用于表达Notch配体的核酸引入基质细胞或多能干细胞中的方法没有特别限制，并且可采用各种已知或通用方法。通常，使用表达载体将用于表达Notch配体的核酸引入基质细胞，并且对该核酸进行表达。表达载体可以是线性的或环状的，并且可以是非病毒载体(诸如质粒)、病毒载体或转座子载体。

将表达载体引入基质细胞中的方法可以根据所述实施方案进行。例如，可以通过已知方法诸如病毒感染方法、磷酸钙方法、脂质转染方法、显微注射方法或电穿孔方法将表达载体引入基质细胞中。表达载体可通过已知的手段或适当地使用可商购获得的试剂盒(根据其说明书)制备成适合在每个方法中使用的形式。

表达载体可以通过病毒感染方法引入基质细胞中。病毒载体的实例包括逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体和腺相关病毒载体。当使用这些病毒载体时，可以使用相应的商业上可获得的试剂盒将含有用于表达Notch配体的核酸的载体和每种病毒的包装载体(质粒)转染到宿主细胞中以生产重组病毒，然后可以用获得的重组病毒感染基质细胞。

除了用于表达Notch配体的核酸以外，如果需要，表达载体可以含有序列，诸如核定位信号(NLS)和多克隆位点(MCS)。表达载体还可含有编码“功能基因”的核酸(碱基序列)，所述基因诸如报告基因(例如，编码各种颜色荧光蛋白的基因)、药物选择基因(例如，卡那霉素抗性基因、氨苄西林抗性基因和嘌呤霉素(puromycin)抗性基因)以及自杀基因(例如，编码以下的基因：白喉A毒素、单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-TK)、羧肽酶G2(CPG2)、羧酸酯酶(CA)、胞嘧啶脱氨酶(CD)、细胞色素P450(cyt-450)、脱氧胞苷激酶(dCK)、硝基还原酶(NR)、嘌呤核苷磷酸化酶(PNP)、胸苷磷酸化酶(TP)、水痘带状疱疹病毒(varicellazoster virus)胸苷激酶(VZV-TK)、黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(XGPRT)、诱导型半胱天冬酶9等)。

三维细胞聚集体可以例如通过离心可分化成CD4⁺T细胞的细胞和表达Notch配体的基质细胞来形成。优选地将用于表达Notch配体的核酸引入基质细胞中。基质细胞与可分化成CD4⁺T细胞的细胞的比率可以由本领域技术人员根据所用的基质细胞和可分化成CD4⁺T细胞的细胞的类型等等合适地调整，并且为例如100:1至1:100、90:1至1:90、80:1至1:80、70:1至1:70、60:1至1:60、50:1至1:50、40:1至1:40、30:1至1:30、20:1至1:20、10:1至1:10等等。例如，当基质细胞是小鼠骨髓细胞(尤其是MS-5)时，该比率为优选地20:1至1:4，并且当基质细胞是多能干细胞来源的基质细胞(尤其是从iPS细胞(尤其是人iPS细胞)诱导分化的成纤维细胞)时，该比率为优选地4:1至1:4，另外优选地1:1。

用于培养三维细胞聚集体的培养基没有特别限制，并且它们的实例包括含血清培养基、无血清培养基或无异种物培养基，并且优选地包括无血清培养基，尤其是含胰岛素无血清培养基(还含有生物素、运铁蛋白和白蛋白)。

用于培养三维细胞聚集体的基础培养基的实例包括AIM V、X-VIVO-15、NeuroBasal、EGM2、TeSR,BME、BGJb、CMRL 1066、Glasgow MEM、经改良MEM锌选择(ImprovedMEM Zinc Option)、IMDM、199培养基、Eagle MEM、αMEM、DMEM、Ham、RPMI-1640、Fischer培养基等。这些培养基可以单独使用或者以其两种或更多种的混合物使用。

培养基可含有血清，或可不含血清。培养基还可含有血清替代物(例如，白蛋白、转铁蛋白、Knockout血清替代物(KSR)、脂肪酸、胰岛素、胶原前体、微量元素、2-巯基乙醇、3'-硫代甘油、ITS-补充剂、B27(商标)补充剂等)。血清替代物可单独使用或以其两种或更多种的组合使用。

培养基可以另外含有脂质、氨基酸(非必需氨基酸等)、L-谷氨酰胺、维生素、生长因子、细胞因子、抗生素、抗氧化剂、丙酮酸、缓冲剂、无机盐等等中的一种或多种物质。作为培养基，使用不含有组分不明确物质的化学成分确定的培养基(诸如血清)是所期望的，因为这样可以减少批次间培养基的差异，并且可以制备质量稳定的细胞。此外，还可以适当地共混WO2017/075389等等中所述的培养基组分。

三维细胞聚集体的培养温度为例如20至40℃，优选地约37℃，并且CO₂浓度为例如2％至10％，优选地2％至5％，并且氧浓度为例如1％至20％，优选地5％至20％。培养开始时的细胞密度可以是例如约1.0×10⁴至1.0×10¹⁰个细胞/mL。

三维细胞聚集体的培养时间可以由本领域技术人员根据例如使用的细胞类型(诸如基质细胞和可分化成CD4⁺T细胞的细胞)合适地调整，并且为例如4周或更长，优选地5周或更长，更优选地6周或更长，另外优选地7周或更长。培养时间的上限没有特别限制，并且为优选地16周或更短，更优选地14周或更短，另外优选地12周或更短，特别优选地9周或更短。

由于除CD4⁺T细胞以外的细胞可以包含在含有通过培养三维细胞聚集体获得的CD4⁺T细胞的细胞群中，因此CD4⁺T细胞可以通过例如流式细胞术(通常是荧光激活细胞分选术：FACS)使用荧光标记的抗CD4抗体以及细胞分选仪针对含有CD4⁺T细胞的细胞群来分离和回收。此外，可以分离和回收CD4SP T细胞。此外，可以分离和回收被分离为CD25阴性的效应T细胞(Tconv)。

当含有CD8⁺T细胞的细胞群用于步骤(1)时，步骤(2)的进行用于诱导含有CD8⁺T细胞的细胞群的分化。

在本发明的产生方法中，作为CD4⁺T细胞，可以使用引入有表达构建体(在本说明书中也简称为“CNS-Foxp3”)的细胞，所述表达构建体包含：

(a)Foxp3基因的CNS1、CNS2和CNS3；

(b)启动子；以及

(c)编码FOXP3的核酸。

引入有表达构建体的细胞没有特别限制，并且可以处于分化的任何阶段，并且它们的实例包括CD4⁺T细胞、多能干细胞或可分化成CD4⁺T细胞的细胞。用于将表达构建体引入CD4⁺T细胞、多能干细胞或可分化成CD4⁺T细胞的细胞的方法的实例包括上文所述的方法。

本发明的表达构建体用于表达FOXP3，并且包含：(a)Foxp3基因的CNS1(保守非编码序列1)、CNS2(保守非编码序列2)和CNS3(保守非编码序列3)、(b)启动子和(c)编码FOXP3的核酸。通过将这种表达构建体引入CD4⁺T细胞、多能干细胞或可分化成CD4⁺T细胞的细胞中可以高效地产生调节性T细胞。表达构建体没有特别限制，只要其可表达FOXP3即可。除上述(a)、(b)和(c)以外，表达构建体优选地还含有终止子、多腺苷酸化信号、Foxp3 3'UTR等，并且更优选的是，其组分(例如这些组分)在引入有表达构建体的细胞中发挥功能。

人Foxp3基因的碱基序列注册为RefSeq登录号NM_001114377(SEQ ID No.1)和NM_014009(SEQ ID No.2)，并且其氨基酸序列也注册为RefSeq登录号NP_001107849(SEQ IDNo.3)和NP_054728(SEQ ID No.4)。这些RefSeq ID在NCBI网站上注册。在本发明中，上述基因还包括除具有上述数据库中注册的碱基序列的基因以外的基因的简并产物和变体，并且所期望的变体是编码生物活性与由上述氨基酸序列组成的蛋白质相当的蛋白质的变体。变体的实例包括FOXP3变体，其具有与天然氨基酸序列具有80％或更多、85％或更多、90％或更多、91％或更多、92％或更多、93％或更多、94％或更多、95％或更多、96％或更多、97％或更多、98％或更多、或99％或更多的同一性的氨基酸序列。在本说明书中，FOXP3是指蛋白质，并且Foxp3是指基因；然而，当这种解释适当时，FOXP3和Foxp3分别是指基因和蛋白质。

编码FOXP3的核酸没有特别限制，只要其是编码FOXP3蛋白的核酸即可，并且优选是FOXP3的cDNA。

用于本发明中的CNS1、CNS2和CNS3都源自Foxp3基因。CNS1、CNS2和CNS3是Foxp3增强子元件。本发明中使用的启动子没有特别限制，并且实例包括CAG启动子、泛素基因启动子、Foxp3基因启动子、EF1α启动子、SRα启动子、SV40启动子、LTR启动子、巨细胞病毒(CMV)启动子、劳斯肉瘤病毒(RSV)启动子、莫洛尼鼠白血病病毒(MoMuLV)LTR、单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-TK)启动子等；并且优选是Foxp3基因启动子。人Foxp3基因的CNS1、CNS2、CNS3和启动子的碱基序列的优选实例包括分别由SEQ ID No.5至8表示的碱基序列。启动子、CNS1、CNS2、CNS3即使不具有上文所述的碱基序列也包括变体，并且所期望的变体是生物活性与由上述碱基序列组成的启动子、CNS1、CNS2、CNS3相当的变体。变体的实例包括具有碱基序列的那些变体，所述碱基序列与天然碱基序列具有80％或更多、85％或更多、90％或更多、91％或更多、92％或更多、93％或更多、94％或更多、95％或更多、96％或更多、97％或更多、98％或更多、或99％或更多的同一性。

表达构建体中的启动子、CNS1、CNS2、CNS3和编码FOXP3的核酸的排列方式(顺序)没有特别限制，并且优选地，CNS1、CNS2和CNS3定位于启动子的上游；并且从5’末端侧开始CNS1、CNS2、CNS3、启动子和编码FOXP3的核酸的顺序是更优选的。

引入有表达构建体的细胞没有特别限制，只要它们是CD4⁺T细胞、多能干细胞或可分化成CD4⁺T细胞的细胞即可，它们的实例包括多能干细胞、造血干细胞、造血内皮细胞、造血祖细胞、祖T细胞、中胚层祖细胞、辅助性T细胞等等，多能干细胞是优选的，并且iPS细胞是更优选的。

通过本发明的产生方法和增殖方法获得的调节性T细胞可以是引入有外源基因的调节性T细胞。

“外源基因”是从外部引入以在调节性T细胞中表达期望蛋白质的基因，并且可根据调节性T细胞的用途合适地选择。

外源基因可以是例如用于表达嵌合抗原受体(CAR)的基因，并且还可含有用于表达细胞因子和/或趋化因子的基因。与一般或已知的CAR一样，由调节性T细胞表达的CAR基本上被配置成使得以下位点处的肽根据需要经由间隔子连接：(i)识别癌细胞的细胞表面抗原的抗原识别位点(例如，单链抗体)，(ii)跨膜区，和(iii)诱导T细胞活化的信号转导区。外源基因还可以是例如用于表达外源T细胞受体(TCR)的基因。外源TCR意指对于其中待引入编码外源TCR的核酸的T细胞来说是外源的。外源TCR的氨基酸序列可与T细胞的内源TCR的氨基酸序列相同或不同。可引入一种或两种或更多种外源基因(例如，CAR和外源TCR)。

将外源基因引入细胞的方法的实例包括上述方法。引入有外源基因的细胞没有特别限制，并且可以处于分化的任何阶段，并且它们的实例包括多能干细胞(尤其是iPS细胞)、CD4⁺T细胞、调节性T细胞等等。

通过本发明的产生方法和增殖方法产生的含有调节性T细胞的细胞群可用于治疗具有异常增强的免疫反应的动物(尤其是人)，并且例如可用于治疗和预防X连锁多内分泌腺病肠病伴免疫失调(IPEX)综合征、移植物抗宿主病(GVHD)、器官移植排斥、自身免疫性疾病、炎性疾病、过敏性疾病(花粉症、哮喘、特应性皮炎、湿疹、食物过敏、食物超敏反应、荨麻疹、过敏性鼻炎、过敏性结膜炎和药物过敏)等等，但不限于此。通过本发明的生产方法生产的调节性T细胞可用于自体移植或同种异体移植。此外，调节性T细胞可与其他药物组合使用。

当进行这种细胞疗法时，从不发生排斥的观点来看，从中分离细胞以产生调节性T细胞的受试者优选具有与待施用调节性T细胞的受试者相同的HLA类型，并且更优选与待施用调节性T细胞的受试者相同。

根据本发明，可以制备包含含有调节性T细胞的细胞群的药物(下文也称为“本发明的药物”)。本发明的药物优选通过根据已知方法(例如，日本药典中描述的方法)将有效量的调节性T细胞与药学上可接受的载剂混合而作为肠胃外制剂生产。本发明的药物优选制成肠胃外制剂，诸如注射剂、混悬剂或输注剂。肠胃外施用方法的实例包括静脉内、动脉内、肌肉内、腹膜内或皮下施用。药学上可接受的载剂的实例包括溶剂、基质、稀释剂、赋形剂、舒缓剂、缓冲剂、防腐剂、稳定剂、混悬剂、等渗剂、表面活性剂、增溶剂等。

本发明的药物的剂量可以根据各种条件适当确定，所述条件诸如患者的体重、年龄、性别和症状，通常，本发明的药物的施用使得对于体重为60kg的患者，每次施用的细胞数为通常1×10⁶至1×10¹⁰个细胞，优选地1×10⁷至1×10⁹个细胞，更优选地5×10⁷至5×10⁸个细胞。本发明的药物可以施用一次或几次。本发明的药物可以具有适用于肠胃外施用的已知形式，诸如注射或输注。此外，本发明的药物可含有生理盐水、磷酸盐缓冲盐水(PBS)、培养基等以稳定维持细胞。培养基的实例包括RPMI、AIM-V、X-VIVO10和其他培养基，但不限于此。此外，出于稳定的目的，可将药学上可接受的载剂(例如，人血清白蛋白)、防腐剂等添加到药物中。本发明的药物应用于哺乳动物，包括人。

如本说明书和权利要求书中所用，除非上下文另有要求，否则单数术语应包括复数并且复数术语应包括单数。因此，除非另外明确指出，否则单数冠词(例如，在英语的情况下，“一个/种(a/an)”、“所述(the)”等)也应当被理解为涵盖其复数形式的概念。

实施例

下面将给出实施例，以对本发明进行更详细的描述。然而，本发明根本不限于这些实施例。

实施例1iPS细胞向CD4SP T细胞的分化和CD4SP T细胞的分离

步骤i：将T细胞来源的iPS细胞株(4GAD1-4)或非T细胞来源的iPS细胞株(FFI01s04)通过胚体法(EB法)(下文也称为“EB法”)分化成含有造血内皮细胞(HEC)和造血祖细胞(HPC)的细胞群。本发明的步骤i至v根据WO2021/085576中所述的方法进行，并提取和描述差异。

步骤ii：在来源于T细胞的iPS细胞株4GAD1-4中，以未分化的细胞开始分化的日期为第0天，使第5天的EB法产物进行ATO分化培养法。在来源于非T细胞的iPS细胞株FFI01s04中，使第7天的EB法产物进行ATO分化培养法。

步骤iii：本实施例中，将不进行分选的情况下回收的EB法产物与MS5hDLL4细胞混合，以使得细胞数之比为EB法产物中含有的细胞的总数:MS5hDLL4细胞的总数＝4:1(在4GAD1-4中)和1:20(在FFI01s04中)，并且将悬浮液的液滴放置于插入式培养皿(MerckMillipore,MILLICELL INSERT 30MM ORGANOTYPIC PTFE 0.4UM 50/PK)上，并与插入式培养皿一起漂浮于培养基上，以开始ATO分化培养法。培养基组成与WO2021/085576中所述的方法相同。

步骤iv：当将iPS细胞来源的EB法产物和MS5hDLL4的混合物在漂浮于该培养基上的插入式培养皿上培养6至9周时，混合物中的细胞分化成CD4SP T细胞和CD8SP T细胞，如图1所示。

步骤v：将该阶段的ATO悬浮于2％ FBS/1mM EDTA/PBS中，用细胞分选仪分选出CD3阳性TCRab阳性T细胞中的CD4阳性CD8b阴性细胞，并且通过培养来扩增分离的CD4SP T细胞。对于扩增培养，使用Dynabeads人T-活化物CD3/CD28(Thermo Fisher Scientific，下文称为“Dynabeads”)，它是结合有CD3抗体和CD28抗体的珠粒。第一次扩增培养物中的珠粒与细胞的比率仅为4:1(第二次及后续扩增培养物为1:1)。培养基(下文称为“基础培养基”)通过以下方式来制备：将IL-2(终浓度：10ng/mL)和PAA(磷酸化抗坏血酸)(100μg/mL)添加至补充有15％胎牛血清(FBS)、以稀释100倍的方式补充的PSG(青霉素、链霉素和L-谷氨酰胺)和同样以稀释100倍的方式补充的ITS(Thermo Fisher Scientific，胰岛素-运铁蛋白-硒(ITS-G)(100×))的α-MEM(Thermo Fisher Scientific，MEM-a，核苷，制备成粉末)中。

来源于iPS细胞的CD4SP T细胞在初始扩增培养物中显示出数百倍至数千倍的增殖。通过细胞内染色和流式细胞术的方法来评价这些CD4SP T细胞的细胞因子产生能力。如图2所示，在添加有莫能菌素(2μM)的条件下，用PMA(40ng/mL)和离子霉素(4μg/mL)刺激4小时，结果显示，在刺激后，来源于4GAD1-4的CD4SP T细胞有13.24％产生干扰素-γ(IFN-γ)，有23.77％产生白介素-4(IL-4)(两者有部分重叠)。

作为对照，从人类活体的外周血单核细胞级分(PBMC)分选出CD4SP T细胞中以CD25阴性状态进一步分离的炎性T细胞(Tconv)，并且通过培养扩增的细胞以类似方式放置，结果显示，43.6％的Tconv也产生干扰素-γ(IFN-γ)，38.8％的Tconv产生白介素-4(IL-4)(同样，两者有部分重叠)。该结果显示，通过扩增CD4SP T细胞(使用Dynabeads和IL-2通过培养从ATO获得)获得的细胞是FOXP3阴性细胞(接近于分泌炎性细胞因子的Tconv)。

实施例2从CD4SP T细胞诱导Treg

人类活体的外周血单核细胞级分(PBMC)中含有的T细胞是TCRab阳性和CD4阳性CD4SP T细胞，并且可以进一步分离为具有抑制炎症功能的上述CD25阴性炎性T细胞(Tconv)和CD25阳性CD127阴性调节性T细胞(Treg)(图3)。

维持或诱导FOXP3的实验使用大量CD4SP T细胞、Tconv或来源于PBMC(来源于健康志愿者供体)的Treg来进行。向基础培养基中按照以下组合添加32.52nM AS2863619(MedChemExpress)、100nM雷帕霉素(LKT Labs)、2.5μg/mL TNFR2抗体(Hycult Biotech，克隆MR2-1)和5ng/mL TGF-β(PeproTech，HEK293来源的)，以通过培养扩增每种细胞，并且通过细胞内染色和流式细胞术来分析14天后的FOXP3阳性率。

AR：AS2863619+雷帕霉素

ART：AS2863619+雷帕霉素+TGF-β

AMT：AS2863619+TNFR2抗体+TGF-β

AMRT：AS2863619+雷帕霉素+TNFR2抗体+TGF-β

首先，将Treg从PBMC中分选出来，与Dynabeads混合，以使得珠粒:细胞之比为4:1，将Treg悬浮于基础培养基中，并通过培养扩增14天。同时，对于仅基础培养基、AR、ART、AMT和AMRT的每个组，通过细胞数计数以及通过细胞内染色和流式细胞术来分析扩增比率和FOXP3阳性率。在图4中示出了结果。

当与单独的IL-2一起培养时，FOXP3无法维持在足够高的水平，并且当与AR或ART一起培养时，无法实现足够的细胞增殖。另一方面，当与AMT或AMRT一起培养时，FOXP3表达得到高度维持。

结果发现，当与AMT和10ng/mL IL-2一起培养时，FOXP3阳性率低于与AMRT一起培养时，但是当与AMT和100ng/mL IL-2一起培养时，维持相当的FOXP3表达率。因此，当PBMC来源的Treg通过培养扩增时，IL-2浓度被设定为100ng/mL。该情况的结果如图5所示。当与AMT一起培养时，FOXP3阳性细胞的比率为85.6％，当与AMRT一起培养时，为85.3％。此外，与单独的IL-2一起培养相比，当与AMRT一起培养时，扩增比率增加了数倍(本次为2.4倍)，并且当与更高水平的AMT一起培养时，扩增比率增加了数十倍至数百倍(本次为31.5倍)。

然后，使用来源于iPS细胞株4GAD1-4的CD4SP T细胞，通过上文所述的每个组合来进行FOXP3诱导。类似地，对于仅基础培养基、含有AR、含有ART、含有AMT、含有AMRT的每个培养条件组，通过细胞内染色和流式细胞术来分析FOXP3阳性率。此时，使用从ATO分选并且通过使用基础培养基(IL-2 10ng/mL)进行培养扩增一次的CD4阳性CD8b阴性细胞(CD4SP T细胞)。

结果如图6所示。与AR、ART和AMRT的每个组合一起培养诱导高FOXP3表达，FOXP3阳性率大于50％。在这些组中，含有AMRT的组，本次观察到FOXP3阳性率极高，为84.8％。

实施例3Treg的评价

标志物表达模式和炎性细胞因子分泌能力的研究

对在实施例2中所述的条件下获得的诱导FOXP3表达的细胞是否显示出Treg特征性的CD25阳性CD127阴性CTLA-4阳性表达模式，以及细胞是否具有即使受到刺激也很难分泌炎性细胞因子的性状进行验证。在PMA和离子霉素刺激的条件下，通过细胞内染色和流式细胞术方法来进行分析。

图7显示了使用PBMC来源的Treg作为对照，比较在单独的IL-2的条件(基础培养基)下或在添加有ART的基础培养基的条件下进行培养所扩增的PBMC来源的Tconv的FACS图。

Treg高表达FOXP3，并且是CD25阳性的(本次阳性率：93.15％)、CD127阴性的(阳性率：2.09％)和CTLA-4阳性的(阳性率：90.9％)。IFN-γ的阳性率为2.84％，IL-4的阳性率为3.01％，并且Treg几乎不分泌炎性细胞因子。

与在添加有ART的基础培养基中进行培养相比，在基础培养基中进行培养所扩增的PBMC来源的Tconv中，观察到标志物(诸如CD25)的表达率的变化。具体而言，CD25阳性率由1.23％变为88.09％，CD127阳性率由39.52％变为6.80％，并且CTLA-4阳性率由16.49％变为60.10％。此外，IFN-γ的阳性率由50.12％降低至5.06％，并且IL-4的阳性率由39.5％降低至5.04％。根据该结果可以确认，关于PBMC来源的Tconv，ART的添加除了FOXP3表达以外，还具有诱导接近于Treg的性状的效果。

还通过同样的方法对即使通过AMRT添加在iPS细胞来源的CD4SP T细胞中诱导FOXP3表达，是否观察到表征除了FOXP3以外的Treg的标志物分子的表达模式进行验证。图8显示了比较在单独的IL-2的条件(基础培养基)下和在添加有AMRT的基础培养基的条件下进行培养所扩增的4GAD1-4来源的CD4SP T细胞的FACS图。

另外就4GAD1-4来源的CD4SP T细胞而言，通过用添加有AMRT的基础培养基进行培养，观察到CD25阳性率(本次从28.89％增加至92.85％)、CD127表达水平降低(从13.03％降低至4.87％)以及CTLA-4表达水平增加(从2.65％增加至5.15％)。此外，IFN-γ的阳性率由19.02％降低至0.100％，并且IL-4的阳性率由27.6％降低至0.802％。

由此可以确认，在iPS细胞来源的CD4SP T细胞中，向基础培养基中添加AMRT除了FOXP3表达以外，还具有诱导接近于Treg的性状的效果。

CNS区的去甲基化研究

具有稳定FOXP3基因的表达功能的转录因子结合位点(称为CNS(保守的非编码DNA序列))存在于FOXP3基因基因座的非翻译区中(Zheng等人Nature,463(7282),808-812(2010))，并且在Treg中去甲基化。此外，Treg中的特异性去甲基化的基因区域也得以鉴定，这些区域被称为TSDR(Treg特异性去甲基化区域)。

因此，使用PureQuant Treg测定(Thermo Fisher Scientific，原始方法描述于Wieczorek等人Cancer Res.,69(2),599-608(2009))来分析用添加有AMRT的基础培养基进行培养所扩增的PBMC来源的大量CD4SP T细胞以及用添加有AMRT的基础培养基进行培养所扩增的iPS细胞来源的CD4SP T细胞是否与TSDR(此处称为FOXP3 CNS2)的去甲基化有关。在图9中示出了结果。

在用单独的IL-2进行培养所扩增的PBMC来源的大量CD4SP T细胞和iPS细胞来源的CD4SP T细胞中，TSDR几乎不发生去甲基化。也就是说，FOXP3(控制免疫抑制功能的转录因子)的组成型表达受到甲基化的强烈抑制。这也与如图2中所示的这两类细胞均显示出强烈的分泌炎性细胞因子趋势的事实一致。

此外，用添加有AMRT的基础培养基进行培养所扩增的PBMC来源的大量CD4SP T细胞显示出去甲基化率高于用单独的IL-2进行扩增培养的情况，为43.3％，并且用添加有AMRT的基础培养基进行培养所扩增的iPS细胞来源的CD4SP T细胞显示出去甲基化率非常高，为86.6％。

这些事实表明，用添加有这些化合物和细胞因子的组合的基础培养基进行的扩增培养不是通过活化来瞬时表达FOXP3的方法，而是通过TSDR的去甲基化来诱导稳定的Treg性状的表达的方法。

实施例4免疫抑制功能的评价

在体外和体内对用AMT进行培养所扩增的PBMC来源的Treg以及用AMRT进行培养所扩增的iPS细胞来源的CD4SP T细胞是否具有免疫抑制功能进行验证。

在这些实验中，作为iPS细胞，使用不具有复原TCR基因的非T细胞来源的iPS细胞株FFI01s04。在这种情况下，从ATO获得的CD4SP T细胞不具有特定的TCR库。然后，通过嵌合抗原受体(CAR)的基因转导来赋予抗原特异性。CAR具有嵌合结构，其中单克隆抗体的可变区的轻链(VL)和重链(HL)与抗原分子串联结合的单链抗体(scFv)被用作胞外结构域，并且共刺激分子和CD3z链被用作胞内结构域。本次，将HLA-A2用作抗原，并且将CD28用作共刺激分子(参见图10)。通过基因转导表达该分子，表达该分子的T细胞(CAR-T细胞)可以以HLA非限制性的方式直接识别细胞表面抗原抗原(此处为HLA-A2)。

使用逆转录病毒载体将上述CAR分子的基因(SEQ ID NO:9)转导至PBMC来源的Treg和iPS细胞来源的CD4SP T细胞中。然后，使用针对myc标签的PE缀合的抗体(CellSignaling Technology，克隆：9B11)来标记表达CAR的细胞，并且使用抗PE微珠和MS柱(均得自Miltenyi Biotec)通过MACS方法来浓缩该细胞。

通过流式细胞仪来分析所获得的细胞的CAR表达率和FOXP3表达率。在图11中示出了结果。在已进行CAR基因转导的细胞中，作为通过MACS进行浓缩的结果，用AMT进行培养所扩增的PBMC来源的Treg和用AMRT进行培养所扩增的iPS细胞来源的CD4SP T细胞均显示出接近于100％的CAR表达率。此外，还证实FOXP3表达不会因CAR基因转导而消失或显著降低。

作为Treg的功能测定的代表性方法，已经建立了一种用于评价Treg的功能的方法，该方法通过以下方式来进行：将HLA-A2阳性人PBMC移植到超级免疫缺陷株小鼠体内，以及针对异来源的抗原产生的移植物抗宿主病(GvHD)反应可以在多大程度上通过Treg(其中已转导靶向HLA-A2的CAR)来抑制，以及作为附属证据，与移植到小鼠体内的相同的PBMC或由此衍生的细胞毒性T细胞(CTL)的增殖可以在多大程度上在体外通过Treg来抑制(MacDonald等人,J.Clin.Invest.,126(4),1413-1424(2016),Dawson等人,Sci.Transl.Med.12,eaaz3866(2020),Lamarthe等人,Nat.Commun.,12(1),6446(2021))。

将从下文所述的体内实验中使用的同一PBMC(来源于与iPS细胞的供体不同的供体以及与分选出Treg的PBMC的供体不同的供体)通过培养所分选和扩增的CD8b阳性CTL与PBMC来源的Treg或iPS细胞来源的CD4SP T细胞(分别不进行或进行CAR基因转导)一起共培养。然后，通过流式细胞术使用Cell Trace Violet细胞增殖试剂盒(Thermo FisherScientific)来分析CTL增殖的抑制程度。在开始共培养之前，用Cell Trace Violet(CTV)染料对CTL进行染色，并利用细胞分裂产生的每个子细胞具有其亲本细胞的荧光强度的一半这一事实来评估增殖的程度。流式细胞术直接获得的结果如图12所示。

首先，用单独的IL-2进行培养所扩增的iPS细胞来源的CD4SP T细胞，无论是否存在CAR表达，均未显示出对CTL的增殖抑制作用。在CD4SP T细胞的数量优于CTL的数量的条件下，诸如CD4SP T细胞:CTL＝4:1，使用CAR转导的细胞时CTL的数量减少，这表明CD4SP T细胞对CTL具有细胞杀伤作用。另一方面，无论是否进行CAR基因转导，用添加有AMRT的基础培养基进行培养所扩增的iPS细胞来源的CD4SP T细胞均显示出抑制CTL增殖的作用。

为了定量评价各种细胞对CTL的细胞生长抑制作用，将六种类型的细胞，即，用单独的IL-2进行培养所扩增的iPS细胞来源的CD4SP T细胞(不进行或进行CAR基因转导)、用AMRT进行培养所扩增的iPS细胞来源的CD4SP T细胞(不进行或进行CAR基因转导)、用AMT进行培养所扩增的PBMC来源的Treg(不进行或进行CAR基因转导)以各种比率的iPS细胞来源的CD4SP T细胞(或Treg):CTL＝1:16、1:8、1:4、1:2、1:1、2:1和4:1进行混合，并进行共培养。在共培养96小时后,用流式细胞仪来测量CTV的荧光强度，并计算CTL分裂的比例。然后，对％抑制＝{(未添加CD4SP T细胞时CTL分裂的比例(％))-(以每个比率添加CD4SP T细胞时CTL分裂的比例(％))/未添加CD4SP T细胞时CTL分裂的比例(％)}×100进行进一步计算，并绘制图表。在图13中示出了结果。值越高表示对CTL增殖的抑制越强。

用AMRT或AMT进行培养所扩增的四种类型的细胞均显示出以细胞数比率依赖性方式抑制CTL增殖的作用。iPS细胞来源的CD4SP T细胞的抑制作用并不依赖于是否进行CAR基因转导而存在显著差异。另外对于PBMC来源的Treg，无论是否进行CAR基因转导，其抑制作用都是相等的。此外，iPS细胞来源的CD4SP T细胞与PBMC来源的Treg相比显示出更强的CTL生长抑制作用。

根据上文，确认用AMRT进行培养所扩增的iPS细胞来源的CD4SP T细胞和用AMT进行培养所扩增的PBMC来源的Treg具有抑制CTL体外增殖的功能。

随后，使用同一HLA-A2阳性PBMC来进行体内实验。将HLA-A2阳性PBMC与四种类型的用AMRT进行培养所扩增的iPS细胞来源的CD4SP T细胞(不进行或进行CAR基因转导)和用AMT进行培养所扩增的PBMC来源的Treg(不进行或进行CAR基因转导)中的一种混合成各自5.0×10⁶个，并在2.2Gy照射后通过静脉注射移植到NSG小鼠体内。随后，将移植日设定为第0天，每天测量体重直到第29天，并评估总体存活期。在图14中示出了结果。

在体内功能测定中，无论细胞是iPS细胞来源的CD4SP T细胞还是PBMC来源的Treg，与仅PBMC的移植相比，在不进行CAR基因转导的情况下的细胞移植均未使体重减轻减少并显示出总体存活期延长。另一方面，在iPS细胞来源的CD4SP T细胞和PBMC来源的Treg两者中，CAR基因转导的细胞使小鼠的体重减轻显著减少，并且使总体存活期显著延长，这表明GvHD受到抑制。此外，此时在存活的NSG小鼠的外周血中确认了HLA-A2阳性人PBMC，这表明GvHD的抑制机制不仅仅是由于CAR阳性T细胞对HLA-A2阳性人PBMC的细胞毒性。

如上文所述，用AMT进行培养所扩增的PBMC来源的Treg具有预期的免疫抑制能力得到确认，并且用AMRT进行培养所扩增的iPS细胞来源的CD4SP T细胞具有以与PBMC来源的Treg同样的方式在体内抑制免疫的功能得到确认。

还使用来源于另一个供体的HLA-A2阳性PBMC来重复相同的实验。在图15中示出了结果。同样，结果显示，已进行CAR基因转导的iPS细胞来源的CD4SP T细胞使小鼠的体重减轻减少并且使总体存活期延长，并且已进行CAR基因转导的PBMC来源的Treg也如此。

实施例5通过包含CNS-Foxp3的iPS细胞进行评价

(1)将构建体引入iPS细胞中并将构建体引入的iPS细胞分化成HEC

所用的含有造血内皮细胞的细胞群是从京都大学iPS细胞研究和应用中心提供的iPS细胞(Ff-I01s04株：来源于健康外周血单核细胞)通过已知方法(例如，Cell Reports 2(2012)1722-1735和WO2017/221975中所述的方法)分化的漂浮细胞群。

具体而言，方式如下。质粒序列通过以下方式设计和合成：将DNA序列(通过将GenBank注册的序列(MK012431)中的mStrawberry蛋白序列改为dTomato序列来获得)引入转移质粒中，以产生第三代慢病毒载体。将该质粒与包装质粒和包膜质粒一起转染至HEK293谱系细胞中以产生慢病毒载体，并且收集含有所产生的慢病毒载体的上清液，然后通过高速离心进行浓缩，以获得待引入iPS细胞中的携带CNS-Foxp3的慢病毒载体。将Ff-I01s04株以1×10⁴个细胞/孔接种于24孔板中，以10μg/mL的终浓度添加鱼精蛋白，然后直接添加至携带CNS-Foxp3基因的慢病毒悬浮液中，以产生病毒感染的iPS细胞。将病毒感染的Ff-I01s04株以1×10⁶个细胞/孔接种于超低附着6孔板(Corning)中的EB培养基(StemPro34(Gibco)，补充有50ng/mL BMP4(R&D Systems)、50ng/mL bFGF(FUJIFILM WakoPure Chemical Corporation)、50ng/mL VEGF(R&D Systems)和2μM SB431542(FUJIFILMWako Pure Chemical Corporation)、10μg/ml人胰岛素、5.5μg/ml人运铁蛋白、5ng/mL亚硒酸钠(ITS,Gibco)、2mM L-谷氨酰胺(Sigma-Aldrich)、45mMα-单硫代甘油(NacalaiTesque,Inc.)和50μg/ml抗坏血酸2-磷酸盐(Sigma-Aldrich))中(第0天)，然后在低氧条件下培养细胞(5％ O₂)4天(第4天)。随后，将细胞在补充有50ng/mL bFGF、50ng/mL VEGF和50ng/mL SCF(R&D Systems)的培养基中进一步培养4天(第8天)，从而获得含有HEC的细胞群。

(2)HEC至Treg的分化

参见WO2017/075389等所述的方法，允许在(1)中获得的含有HEC的细胞群分化成Treg(CD25⁺/FOXP3⁺)。

具体而言，方式如下。从京都大学iPS细胞研究应用中心提供的iPS细胞(Ff-I01s04株：来源于健康外周血单核细胞)诱导分化成纤维细胞，以在从iPS细胞诱导分化为T细胞时将它们用作饲养细胞。随后，使用慢病毒来产生强制表达DLL4(在EF1α启动子下作为Notch配体)的细胞。更具体地，将Ff-I01s04株以1×10⁶个细胞/孔接种于超低附着6孔板(Corning)中的培养基中(第0天)，该培养基通过以下方式制备：将Y-27632(FUJIFILM WakoPure Chemical Corporation)和CHIR990211(Tocris Bioscience)添加至AK03N(Ajinomoto Co.,Inc.)中，在第二天，将细胞接种于用0.1％明胶(Nacalai Tesque)包被的10cm培养皿(Corning)中的成纤维细胞培养基(α-MEM(Invitrogen)，补充有20％ FBS(Corning)、10μg/ml人胰岛素、5.5μg/ml人运铁蛋白、5ng/mL亚硒酸钠(ITS,Gibco)、2mM L-谷氨酰胺、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素(PSG,Sigma-Aldrich)和50μg/ml抗坏血酸2-磷酸盐(Sigma-Aldrich))中(第1天)。每周更换培养基两次，并且继续培养7天以获得含有成纤维细胞的细胞群(第8天)。将获得的iPS细胞来源的成纤维细胞以1×10⁵个细胞/孔接种于明胶包被的24孔板中，在第二天，添加携带在EF1α启动子下游的人DLL4基因的慢病毒悬浮液和终浓度为10μg/mL的鱼精蛋白，从而产生iPS细胞来源的成纤维细胞/DLL4细胞(iFibro/DLL4)。

将所产生的iFibro/DLL4用作支持物，并且与(1)中产生的CNS-Foxp3转导的人iPS细胞来源的HEC以1:1的细胞比率共培养。培养基是RPMI-1640(FUJIFILM Wako PureChemical Corporation)，以终浓度计，该培养基分别含有2×B27补充剂(Invitrogen)、1×PSG(Sigma-Aldrich)、1×Glutamax(Invitrogen)、5ng/mL IL-7(PeproTech)、5ng/mLFlT3L(PeproTech)和50μg/mL抗坏血酸(Sigma-Aldrich)，将细胞在6孔板(TPP)中的30mmMillicell(亲水性PTFE，孔径：0.4μm，高度：5mm，Merck Millipore)上共培养，并培养7周，同时每三天或每四天更换培养基一次。

(3)iPS-Treg的扩增培养

将(2)中获得的从iPS细胞分化的Treg在以下培养基中培养扩增，该培养基含有10nM雷帕霉素(Merck)和3μg/mL抗TNFR2抗体(Hycult Biotech，克隆MR2-1)。

具体而言，将(2)中获得的CNS-Foxp3转导的人iPS细胞来源的Treg在抗CD3抗体(eBioscience)结合的48孔细胞培养板中培养3天，然后重新接种于24孔G-Rex细胞培养板中并培养。培养基是α-MEM(Invitrogen)，以终浓度计，该培养基分别含有FBS(15％,Corning)、L-谷氨酰胺-青霉素-链霉素溶液(1/100,Invitrogen,Sigma-Aldrich)、胰岛素-运铁蛋白-硒补充剂(1/100,Invitrogen)、抗坏血酸2-磷酸盐(50μg/mL,Sigma-Aldrich)和IL-2(10ng/mL,PeproTech)。前三天，向上述制剂进一步添加抗CD28抗体(1.5μg/mL，BioLegend)、抗CD30抗体(300ng/mL，R&D Systems)和半胱天冬酶抑制剂(10μM，R&DSystems)。培养进行9或10天，同时在培养开始后第3天替换培养基，并且此后每三或四天替换一次培养基。当回收第一次扩增培养后获得的细胞时，使用TregCD4微珠(MyltenyiBiotec)来分离CD4阳性级分。进一步连续进行扩增培养两次，总共进行扩增培养三次。

(4)用AMRT进行iPS-Treg的扩增培养

将(3)中获得的iPS-Treg在添加有AS2863619(作为CDK8/19抑制剂)和TGF-β(AMRT)的培养基中进一步培养扩增。

具体而言，将(3)中获得的iPS-Treg在与(3)相同的条件(对照)下，或者在另外添加有AS2863619(MedChemExpress,30nM)和TGF-β(Peprotech,5ng/mL)(AMRT)的培养基中进一步培养扩增。培养时间为14天，并且扩增培养重复三次。此时的细胞增殖结果如图16所示。在扩增培养的最后一天，用以下抗体对每个细胞群进行染色(Zombie NIR、BV510 CD3、BV421 CD4、PE/Cy7 CD8β、APC CD25、FITC FOXP3和PE Helios)。在图17中示出了结果。图17显示了Zombie NIR^-CD3⁺CD4⁺CD8β^-细胞。

在AMRT条件下进行培养所扩增的组中，与对照组相比，未观察到细胞增殖的显著差异，但是CD25⁺FOXP3⁺级分和FOXP3⁺Helios⁺级分的获得量分别为76.5％和47.4％，均高于对照组(对照组分别为28.6％和24.7％)。

实施例6CNS-Foxp3转导的iPS细胞来源的Treg的抑制功能的评价

使用实施例5中培养扩增的Treg，在与人PBMC来源的同种异体T细胞一起共培养后，通过流式细胞术进行分析。

具体而言，在存在或不存在抗CD3抗体的情况下，对来源于与Treg的供体不同的供体的PBMC进行处理，并用Cell Trace Violet(Thermo Fisher Scientific)进行染色，以用作靶细胞，并且将PBMC与Treg以Treg(实施例5中的对照组或在AMRT条件下通过培养扩增的组):PBMC的细胞数比＝0:1、1:1和2:1共培养。培养基是α-MEM(Invitrogen)，以终浓度计，该培养基分别含有FBS(15％,Corning)、L-谷氨酰胺-青霉素-链霉素溶液(1/100,Invitrogen,Sigma-Aldrich)、胰岛素-运铁蛋白-硒补充剂(1/100,Invitrogen)和抗坏血酸2-磷酸盐(50μg/mL,Sigma-Aldrich)，并且将细胞培养5天。每个细胞群均用以下抗体(Zombie NIR、PE/Cy7 CD3和PE HLA-A24)进行染色。在图18中示出了结果。

在与iPS-Treg一起共培养的组中，靶细胞的细胞分裂以Treg细胞数依赖性方式受到抑制。此外，就抑制功能而言，在AMRT条件下培养的Treg中观察到比对照组更强的作用。当Treg:靶标＝2:1时，对照组的抑制率为58.9％，而在AMRT条件下培养的细胞群中，观察到的抑制率为75.7％。

实施例7用于诱导CD4SP T细胞的分化的候选基因

人诱导性多能干细胞株

人iPS细胞株TKT3V1-7使用携带OCT3/4、KLF-4、SOX-2和C-MYC的逆转录病毒载体从健康志愿者的抗原非特异性CD3 T细胞获得(Molecular Therapy 29 10,2013kanekoS)。

细胞株

为了产生MS5-hDLL4，将MS5细胞(K Itoh等人,1989.Exp Hematol 17,145-153)用编码全长人DLL4的逆转录病毒载体来转化。使用抗DLL4抗体通过FACS分选出多达5％的表达DLL4的细胞，将该细胞在DMEM/10％胎牛血清(FCS)中传代。在培养数周后，通过流式细胞术来证实DLL4的稳定表达。

从iPSC产生iHPC

将iPSC(iPS细胞)分化成T细胞的方法此前已有所报道(Nishimura等人,2013,Cell Stem Cell 12,114-126)。将iPSC在StemFit AK02N的iMatrix-511上培养扩增6至7天，并用0.5×TryPLE select(Thermo Fisher Scientific)分离成单细胞。将3至6×10⁵个所有细胞重悬于补充有10μM Y-27632(FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation)和10μM CHIR99021(Tocirs Bioscience)的StemFit AK02N中，并在6孔超低附着板(Corning)上培养24小时。随后，将EB回收并沉淀于管底，并重悬于2mL/孔的“EB基础培养基”(StemPro-34(Thermo Fisher Scientific)，补充有10ng/mL青霉素/链霉素(Sigma-Aldrich)、2mMGlutamax(Thermo Fisher Scientific)、50μg/mL抗坏血酸-2-磷酸盐(Sigma-Aldrich)、4×10^-4M单硫代甘油(MTG,Nacalai Tesque)和1×胰岛素-运铁蛋白-硒溶液(ITS-G,ThermoFisher Scientific))中，进一步添加50ng/mL重组人(rh)BMP-4(R&DSystems)、50ng/mLrhVEGF(R&D Systems)和50ng/mL bFGF(FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation)。在24小时后，添加6μMSB431542(FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation)。在4天后，收集分化的EB，洗涤，然后重悬于2mL/孔的EB基础培养基中，该EB基础培养基补充有50ng/mLrhVEGF、50ng/mL rhbFGF、50ng/mL rhSCF(R&D Systems)，并培养2天。在7天后，再次收集分化的EB，洗涤，并重悬于2mL/孔的EB基础培养基中，该EB基础培养基补充有50ng/mLrhVEGF、50ng/mL rhbFGF、50ng/mL rhSCF、30ng/mL rhTPO(PeproTech)和10ng/mL FLT3L(PeproTech)。从第7天开始，每2至3天收获细胞一次并更换为新鲜培养基。前7天将培养物维持在5％ CO₂/5％ O₂/90％ N₂环境中，随后维持在5％ CO₂环境中。将分化的iHPC通过40μm细胞过滤器过滤，并使用TC-保护剂(Bio-Rad抗体)在-80℃处冷冻保存。

iHPC向祖T细胞的2D无饲养细胞分化

使用此前报道的来源于TKT3v1-7的iHPC(Iriguchi等人,2021,Nat Commun 12,430.10.1038/s41467-020-20658-3)。在iHPC接种前一天制备的rhDL4包被板上诱导T细胞分化。将rhDL4/Fc嵌合蛋白溶液(5μg/mL,Sino Biological)用等量的retronectin(5μg/mL,Takara Bio Inc.)稀释，并以150μL/孔添加至48孔板中，并在4℃处对板进行温育过夜。在添加T细胞分化培养基之前立即移除包被溶液。

对于接种iHPC，收集11至14份EB，并通过TryPLE Select(Thermo FisherScientific)将EB分离为单细胞。将2000个CD34⁺/CD43⁺细胞直接通过FACS分选至DL4包被的平板的孔中，该孔含有T细胞分化培养基，该培养基由αMEM(Thermo Fisher Scientific)(补充有15％ FBS(Corning)、100×ITS-G(1×)、55μM 2-巯基乙醇(Thermo FisherScientific)、50μg/mL抗坏血酸-2-磷酸盐、2mM Glutamax、50ng/mL rhSCF、50ng/mLrhTPO、50ng/mL rhIL-7、50ng/mL FLT3L、30nM rhSDF-1α(PeproTech)和15μM SB203580(Tocris Bioscience))组成。每隔一天更换大部分培养基(80％)一次。在第7天将分化的细胞转移至新的DL4包被板中，并在第14天将1至2×10⁵个细胞/孔转移至新的DL4包被板中。将培养物维持在5％ CO₂环境中。

祖T细胞成熟为CD8单阳性T细胞

在第21天，用500ng/mL抗CD3单克隆抗体(克隆：OKT3,eBioscience)在成熟培养基中对DL4细胞进行刺激，该成熟培养基由αMEM、15％ FBS、100×ITS-G(1×)、50μg/mL抗坏血酸-2-磷酸盐、100×PSG(1×,Sigma-Aldrich)、10ng/mL rhIL-7、10ng/mL rhIL-2(PeproTech)和10nM地塞米松(Fuji Pharma Co.,Ltd.)组成。在3天后，将细胞回收，洗涤，重悬于无OKT3的成熟培养基中，并在含有5％CO₂的环境中在37℃的温度处培养4天。

iHPC成熟为CD4和CD8单阳性T细胞

使用此前报道的方法并进行一些修改(Seet等人,2017,Nat Methods 14,521-530.10.1038/nmeth.4237)。简而言之，将1×10⁶个MS5-hDLL4细胞和1×10⁵个纯化的iHPC添加至1.5mL微量离心管中，以制备致密的MS5-hDLL4-iHPC混合物。将混合物调整为每孔15μL。对于每种培养物，将0.4μm Millicell Transwell插入式培养皿(EMD Millipore,Billerica,MA；产品目录号PICM0RG50)放置于6孔板中，每个孔含有1.5mL类器官培养物。每3至4天彻底更换培养基一次。

单细胞RNA-seq

根据制造商的说明，使用Chromium Single Cell 50试剂盒(10xGenomics)对分离的单细胞悬液进行基于液滴的大规模平行scRNA-seq。简而言之，将细胞悬液以700至1,200个细胞/μL添加，以便每个孔捕获3,000个细胞。GEM液滴在10x Chromium控制器上产生，每个细胞用特定的条形码标记，并且每个转录物在逆转录时用独特分子标识符(UMI)标记。用Dynabeads MyOne SILANE珠粒清理混合物来分离条形码cDNA。cDNA通过PCR来扩增并通过SPRI珠粒清理来纯化。

对于基因表达文库，使用50ng扩增的cDNA，并根据制造商的说明来进行文库制备，该文库制备由片段化、末端修复、A加尾、连接头连接和样品索引PCR组成。使用NovaSeq测序仪(Illumina,Inc.)对文库进行测序。

单细胞RNA-seq数据处理

将类器官培养物样品的序列读段与人GRCh38基因组参照物进行比对，并使用CellRanger v3.1.0软件(10x Genomics)将基因和抗体的标签计数定量为UMI。将UMI计数矩阵导入R v3.6.1软件Seurat v3.1.1包中，并使用Seurat包来进行进一步数据处理。线粒体基因数量比例为20％或更多的细胞被排除在进一步分析以外，作为死细胞或受损的细胞。分别通过全局尺度归一化方法和中心对数比率归一化方法来对来源于抗体的基因数和标签计数进行归一化。通过Seurat包中的“vst”方法来选择细胞内差异表达的基因，并进行主要组分分析。将计算的主要组分用于降维和基于图的聚类。

从SRA储存库下载人胸腺细胞样品的BAM文件(GSE148978)。使用bamtofastq软件v1.3.2(10x Genomics)将BAM文件转换为FASTQ序列文件。将序列读段与人GRCh38基因组参照物进行比对，并使用Cell Ranger v5.0.1软件将基因标签计数定量为UMI。UMI数量小于200或10000或更多的细胞，或者线粒体基因数量比例为5％或更多的细胞被排除在进一步分析以外。通过Seurat标准积分方法来整合人胸腺细胞数据集并进行数据处理。由具有相同UMI数量的细胞或来源于一个供体的细胞组成的簇被删除。

将2D培养物样品的序列读段与人GRCh38基因组参照物进行比对，并使用CellRanger软件v5.0.1将基因标签计数定量为UMI。用Seurat v3.2.3.包进行数据处理。

通过Seurat标准积分方法来整合类器官培养物、二维培养物和人胸腺细胞样品的数据集，并进行数据处理。

相对于其他簇，簇中表达水平不同的基因被定义为倍数变化为2或更大的基因，并且通过威尔科克森(Wilcoxon)秩和检验确定p值小于0.05。

拟时间分析

将整合数据集转换为monocle3 v0.2.3.0包(Cao等人,2019,Nature566,496-502.10.1038/s41586-019-0969-x；Qiu等人,2017,Nat Methods14,309-315.10.1038/nmeth.4150；Qiu等人,2017,Nat Methods 14,979-982.10.1038/nmeth.4402；Trapnell等人,2014,Nat Biotechnol 32,381-386.10.1038/nbt.2859)格式并进行数据处理。使用UMAP的Seurat嵌入空间来进行进一步分析。对主UMAP的嵌入空间进行拟合，以获得轨迹图。以DN细胞的节点为起点，确定拟时间。根据Moran I检验，在不同轨迹的路径中提取表达水平不同的基因，将所标识的表达水平不同的基因与轨迹和拟时间一起分类到共调控基因的基因集模块中。

通过拟时间分析来鉴定涉及类器官培养物中向CD4SP T细胞分化转变的基因候选物。

为了鉴定从DP(CD4⁺CD8⁺双阳性)细胞进行CD4SP T-iPS-T分化的关键基因，对类器官培养物和胸腺细胞中的所有细胞的整合单细胞RNA-seq数据集进行拟时间分析(图19A)。特定于类器官培养物的簇被排除在整合数据集以外。轨迹分析的结果显示，细胞数据集被分为三个分支(图19B)。这些分支将细胞分为未成熟的细胞(红色)、CD4SP系(绿色)和CD8SP系(蓝色)(图19B)。对显著控制的基因进一步进行层次聚类分析，得到17个模块(图19C；每个模块簇的前10个基因如图19D所示)。为了研究从DP至CD4SP的T细胞分化过程中表达不同的基因，关注模块簇#7、#8和#9，这些模块簇含有在从未成熟阶段至CD4SP分化的过程中表达增加的基因，以及模块簇#2、#5和#6，这些模块簇含有在向CD8SP分化的相对早期阶段表达降低的基因。这些模块簇中包含的基因被认为是从DP期向CD4SP T细胞转变的候选基因。

敏化辅助群体包含在2D分化样品中

为了通过无饲养细胞培养物来鉴定CD4SP T细胞分化的潜在基因/途径，比较了从2D培养物(仅CD8SP)和类器官培养物(CD4SP和CD8SP细胞)获得的细胞的单细胞转录物组。

对6周类器官培养物、2D培养物和胸腺细胞的数据集进行整合并以UMAP图进行处理(图20A，左)。非整合数据集也显示出共同聚类(图20A，右)。胸腺细胞显示出各种簇。簇#1和#3显示出极强的CD8表达增加，而簇#0和#2则显示出CD4表达。这些簇基因表达在胸腺细胞数据集中比在培养物数据中更高。2D和类器官培养物簇显示出T细胞相关性基因表达。出乎意料的是，来自2D培养物样品的一些细胞也在簇(图20C)中显示出胸腺细胞和类器官培养物数据中的CD4表达(图20B和20C)。此外，与Tscm相关的SELL(Cheng-Chi Chao等人,1997,J Immunol 159,1686-1694)在簇#0中表达，并且与T细胞相关的BACH2(RahulRoychoudhuri等人,2013,Nature 498,506-512.10.1038/nature12199)在簇#2中表达。这些结果表明，2D培养物中的一些细胞具有辅助功能。

为了阐明2D培养物中CD4表达低的机制，比较了向成熟CD4SP T细胞转变过程中的基因表达动力学。利用拟时间分析中确定的受控制的基因簇(图19D)，并假设表达差异与类器官培养物中的CD4表达有关，评价了2D培养物数据集的模块簇#2、#5、#6、#7、#8和#9的前10个基因的表达。对于潜在辅助功能簇(图20C)，模块簇#2的SELENOW(ENSG00000178980)和SYTL2(ENSG00000137501)、模块簇#5的S100A11(ENSG00000163191)和STAT1(ENSG00000115415)、模块簇#6的GIMAP4(ENSG00000133574)、GIMAP7(ENSG00000179144)、IFITM1(ENSG00000185885)和IL7R(ENSG00000168685)以及模块簇#8的LZTFL1(ENSG00000163818)、SATB1(ENSG00000182568)、SLAMF1(ENSG00000117090)和SOX4(ENSG00000124766)显示出在类器官培养物中的表达水平比在2D培养物中的更高(集合基因ID显示在括号中)(图21)。据设想，通过控制这些基因，可以诱导从多能干细胞(尤其是iPS细胞)等向所期望的T细胞(尤其是CD4SP T细胞)的分化。

本申请基于2022年3月23日在日本提交的日本专利申请2022-47437和2022年9月26日在日本提交的日本专利申请2022-152604，这两件专利申请的内容整体并入本文。

Claims (20)

1.一种用于产生含有调节性T细胞的细胞群的方法，所述方法包括：

步骤(1)在存在选自由CDK8和/或CDK19抑制剂、TNFR2激动剂、mTOR抑制剂和TGF-βR激动剂组成的组的至少一种物质的情况下培养含有多能干细胞来源的CD4⁺T细胞的细胞群。

2.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(1)在存在CDK8和/或CDK19抑制剂和mTOR抑制剂的情况下进行。

3.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(1)在存在CDK8和/或CDK19抑制剂、mTOR抑制剂和TGF-βR激动剂的情况下进行。

4.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(1)在存在CDK8和/或CDK19抑制剂、TNFR2激动剂、mTOR抑制剂和TGF-βR激动剂的情况下进行。

5.根据权利要求1所述的方法，其中所述CDK8和/或CDK19抑制剂是选自由以下各项组成的组中的至少一者：4-[1-(2-甲基-1H-苯并咪唑-5-基)-1H-咪唑并[4,5-c]吡啶-2-基]-1,2,5-噁二唑-3-胺、3-{1-[1-(4-甲氧基苯基)哌啶-4-基]-4-甲基-1H-咪唑并[4,5-c]吡啶-2-基}吡嗪-2-胺以及CDK8和/或CDK19的siRNA。

6.根据权利要求1所述的方法，其中所述mTOR抑制剂是雷帕霉素。

7.根据权利要求1所述的方法，其中所述TNFR2激动剂是TNFR2激动剂抗体。

8.根据权利要求1所述的方法，其中所述TGF-βR激动剂是TGF-β。

9.根据权利要求1所述的方法，其中所述调节性T细胞是CD25⁺/FOXP3⁺细胞。

10.根据权利要求1所述的方法，其中所述CD4⁺T细胞是CD4⁺/CD8^-T细胞。

11.根据权利要求1所述的方法，其在步骤(1)之前还包括：

步骤(2)诱导多能干细胞分化成含有CD4⁺T细胞的细胞群。

12.根据权利要求1所述的方法，其中，所述多能干细胞是iPS细胞。

13.根据权利要求11所述的方法，其中，在步骤(2)中培养三维细胞聚集体，所述三维细胞聚集体含有能够分化成所述多能干细胞来源的CD4⁺T细胞的细胞和表达Notch配体的基质细胞。

14.一种含有调节性T细胞的细胞群，其是通过根据权利要求1所述的方法获得的。

15.一种药物，其包含根据权利要求14所述的含有调节性T细胞的细胞群。

16.根据权利要求15所述的药物，其用于预防和/或治疗自身免疫性疾病、移植物抗宿主病或移植排斥。

17.一种用于预防和/或治疗自身免疫性疾病、移植物抗宿主病或移植排斥的方法，所述方法包括将根据权利要求14所述的含有调节性T细胞的细胞群施用于有需要的受试者。

18.根据权利要求14所述的含有调节性T细胞的细胞群，其用于预防和/或治疗自身免疫性疾病、移植物抗宿主病或移植排斥。

19.根据权利要求14所述的含有调节性T细胞的细胞群在制备用于预防和/或治疗自身免疫性疾病、移植物抗宿主病或移植排斥的药物中的用途。

20.根据权利要求1所述的方法，其中所述CD4⁺T细胞是已经引入表达构建体的细胞，所述表达构建体包含：

(1)(a)Foxp3基因的保守非编码序列(CNS)1、CNS2和CNS3；

(b)启动子；以及

(c)编码FOXP3的核酸。