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CN119241620B - 一种双链siRNA及其制备方法，药物组合物和用途 - Google Patents

一种双链siRNA及其制备方法，药物组合物和用途 Download PDF

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Abstract

本发明公开了具有亲脂性修饰的双链siRNA，修饰后的siRNA分子，经由鞘内注射和皮内注射及其他给药方式，达到优异的体内分布性能和递送效率，在有效敲降靶基因表达的同时，兼具良好的耐受性和安全性。本发明还公开了具有亲脂性修饰的siRNA的制备方法，药物组合物，及其在制备治疗TNF‑α介导的疾病或病症的药物中的用途。

Description

一种双链siRNA及其制备方法，药物组合物和用途
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体而言，是关于一种双链siRNA，及其制备方法，药物组合物和其在制备治疗TNF-α介导的疾病或病症的药物中的用途。
背景技术
已上市的RNAi药物中，多以脂质纳米颗粒和N-乙酰半乳糖胺修饰，靶向肝脏组织。由于siRNA分子自身亲水性和负电荷属性，其难以被细胞摄取。若要将RNAi技术应用于其它组织（如中枢神经系统、眼、肺），还需要开发新的技术，以改善siRNA在肝外组织的递送和分布性能。
目前已有研究报道了不同类别的siRNA载体，包括聚合物和多肽等。例如美国专利号US9061995 B2描述了一种用于递送核酸（如siRNA）的肽缀合物，该缀合物包含一个细胞穿透肽部分，旨在提高核酸药物的细胞内递送效率。尽管这些肽可以在实验室条件下展示出良好的效果，但在将其转化为临床应用的过程中仍存在诸多难点，细胞穿透肽在体内的稳定性较差，容易被酶降解，导致药效降低，并且大规模合成和纯化较为复杂，成本较高。随着技术的进步，多聚物材料也在开发中，PEI是一种阳离子聚合物，通过与带负电荷的核酸结合，形成纳米级复合物，这些复合物能够进入细胞并通过内吞途径释放核酸；PLGA是一种生物可降解的共聚物，具有良好的生物相容性和可控的降解速率，其可以封装小核酸药物，并通过被动或主动靶向机制递送到目标组织或细胞；但某些多聚物可能会引起免疫反应或细胞毒性，导致不良副作用。
更多肝外递送的药物一直在开发中。肺部靶向中，Alnylam Pharmaceuticals开发的ALN-HPN-19用于治疗肺纤维化，通过吸入方式将小核酸药物递送到肺部。眼部靶向中，Regeneron Pharmaceuticals开发的RGX-314用于治疗湿性年龄相关性黄斑变性，通过滴眼液的方式将小核酸药物递送到眼睛，这种方式未来还可能治疗青光眼、糖尿病视网膜病变等疾病。肿瘤靶向中，Arrowhead Pharmaceuticals开发的AMG-160用于治疗实体瘤，利用肿瘤微环境的特性（如pH值、氧化还原状态等）设计响应性递送系统，将小核酸药物特异性递送到肿瘤组织。心脏靶向中，Cardior Pharmaceuticals开发的CARDIO-RNA-001用于治疗心力衰竭。肾脏靶向中，使用纳米粒子包裹小核酸药物，通过静脉注射方式递送到肾脏组织，用于治疗肾病综合征和慢性肾病，例如Silence Therapeutics开发的SLN201用于治疗IgA肾病。
递送核酸药物到神经系统是一个极具挑战性的任务，因为血脑屏障的存在使得许多常规递送方法难以有效传递药物，但核酸药物在治疗神经系统疾病方面展现出了巨大的潜力，多家企业正在加大研发中。Voyager Therapeutics的VY-HTT01，使用AAV（腺相关病毒）载体递送siRNA，靶向亨廷顿基因（HTT），降低突变HTT蛋白的表达，其正在进行临床试验，初步结果显示安全性和潜在疗效。Biogen的Spinraza，通过鞘内注射递送反义寡核苷酸（ASO），改变SMN2基因的剪接，增加功能性SMN蛋白的产生，已获FDA批准，广泛用于SMA患者的治疗。Acuitas Therapeutics的ACU-193，使用脂质纳米颗粒（LNP）递送siRNA，靶向β-淀粉样蛋白前体基因（APP），降低β-淀粉样蛋白的产生，处于早期研发阶段。UniQure的AMT-130，使用AAV载体递送miRNA，靶向突触核蛋白基因（SNCA），降低α-突触核蛋白的表达，正在进行临床试验，评估其安全性和有效性。
有效递送小核酸，对递送载体的依赖性非常高，许多小核酸药物的成药需要建立在开发出合适的递送载体之上，这就加大了小核酸成药的限制。因此，开发一种有效的无载体siRNA肝外递送技术是当前siRNA药物的研发重点。
发明内容
改善药物的亲脂性是提高siRNA药物细胞摄取、实现肝外靶向的有效策略。为了改善siRNA在肝外组织的无载体递送和分布性能，本发明通过对siRNA分子进行精细化的结构设计，增强其亲脂性，从而改善其分布性能和递送效果。
本发明的一个方面，提供了一种核苷，其具有如式（Ⅰ）所示的结构，其包含R1，R3和亲脂性的R2，其中：
（Ⅰ）
R1选自含氮碱基或含氮碱基类似物；
R2选自如下基团：
、
、
、
、或
；
R3选自4,4'-二甲氧基三苯甲基（DMTr），4-单甲氧基三苯甲基（MMTr），4,4',4''-三甲氧基三苯甲基（TMTr），特戊酰基氧基甲基（PIVOM），叔丁基二甲基硅烷基（TBDMS），9-芴基甲氧基羰基（Fmoc），苯氧基乙酰基（PAC），4-叔-丁基苯氧基乙酰基（tBPAC），2-氰基乙氧基-N,N-二异丙基氨基膦基（CEP），3-乙酰丙酰基，乙酰基，苯甲酰基，2-氰基乙基，N,N-二丁基氨基羰基（DBF），N,N-二甲基氨基羰基（DMF），异丁酰基，2-(2-硝基苯基)-丙氧羰基（NPPOC），三乙基铵（TEA），三氟乙酰基，三异丙基甲硅烷氧基甲基（TOM），对异丙基苯氧基乙酰基（iPrPAC），O-缩醛乙酰丙基酯（ALE，acetal levulinyl ester），苯乙酰基，或1,1',3,3'-四异丙基二硅氧烷基（tetra-isopropyl disiloxanyl）。
本发明的另一个方面，提供了一种双链siRNA，其包含一条正义链和一条反义链，其中的核苷酸具有特殊修饰，所述经特殊修饰的核苷酸包含R1和亲脂性的R2，具有如式（Ⅱ）所示的结构：
（Ⅱ）
R1选自含氮碱基或含氮碱基类似物；
R2选自如下基团：
、
、
、
、或
。
在一个或多个实施方案中，所述经特殊修饰的核苷酸位于正义链或反义链的5’至3’方向的任意的一个或多个位点。
在一个或多个实施方案中，所述经特殊修饰的核苷酸位于正义链或反义链的5’至3’方向的第1，2，5，8，9，10，11，14，17，18或19位中的一个或多个位点。
在一个或多个实施方案中，所述经特殊修饰的核苷酸位于正义链的5’至3’方向的第1，2，5，8，14，17，18或19位中的一个或多个位点。
在一个或多个实施方案中，所述经特殊修饰的核苷酸位于反义链的5’至3’方向的第1，2，9，10，11，17，18或19位中的一个或多个位点。
在一个或多个实施方案中，所述经特殊修饰的核苷酸位于：
正义链的5’至3’方向的第1位；
正义链的5’至3’方向的第1位和第19位；
正义链的5’至3’方向的第1位和第2位；
正义链的5’至3’方向的第1，2，18和19位；或
正义链的5’至3’方向的第1，5，8，14和17位。
在一个或多个实施方案中，所述经特殊修饰的核苷酸位于：
反义链的5’至3’方向的第1位；
反义链的5’至3’方向的第1位和第19位；
反义链的5’至3’方向的第1位和第2位；
反义链的5’至3’方向的第1，2，18和19位；或
反义链的5’至3’方向的第9，10，11，17和18位。
在一个或多个实施方案中，所述经特殊修饰的核苷酸位于：
正义链的5’至3’方向的第1位，和反义链的5’至3’方向的第1位；
正义链的5’至3’方向的第1位和第19位，和反义链的5’至3’方向的第1位和第19位；
正义链的5’至3’方向的第1位和第2位，和反义链的5’至3’方向的第1位和第2位；
正义链的5’至3’方向的第1，2，18和19位，和反义链的5’至3’方向的第1，2，18和19位；
正义链的5’至3’方向的第1，5，8，14和17位；或
正义链的5’至3’方向的第1，5，8，14和17位，和反义链的5’至3’方向的第9，10，11，17和18位。
在一个或多个实施方案中，
所述正义链的序列为5'- GCCUGUAGCCCAUGUUGUATT - 3'，所述反义链的序列为5'- UACAACAUGGGCUACAGGCTT - 3’。
在一个或多个实施方案中，所述正义链或反义链的任意的一位或多位的核苷酸单体中与3'- C连接的磷酸基团中的一个非桥接氧原子被硫原子替代。
在一个或多个实施方案中，所述正义链的第2，3，4，6，7，9，10，11，12，13，15，16，18和19位核苷酸单体中与3'- C连接的磷酸基团中的一个非桥接氧原子被硫原子替代。
本发明的另一个方面，提供了一种制备如本文任一实施方案中所述的核苷的方法，所述方法包括亲脂链的合成以及将亲脂链与脱水核苷进行反应得到本文任一实施方案中所述的核苷，所述脱水核苷选自脱水腺苷或其类似物，脱水尿嘧啶或其类似物，脱水胞嘧啶或其类似物，脱水胸腺嘧啶或其类似物，或脱水鸟嘌呤或其类似物。
本发明的另一个方面，提供了一种制备如本文任一实施方案中所述的双链siRNA的方法，所述方法包括以本文任一实施方案中所述的核苷为原料进行RNA合成。
在一个或多个实施方案中，所述方法为亚磷酰胺三酯法。
本发明的另一个方面，提供了一种药物组合物，其包含治疗有效量的如本文任一实施方案中所述的双链siRNA，和药学上可接受的载体、溶剂或赋形剂。
本发明的另一个方面，提供了一种制备如本文任一实施方案中所述的药物组合物的方法，所述方法包括向溶剂中加入双链siRNA，和药学上可接受的载体或赋形剂。
在一个或多个实施方案中，所述方法包括向部分溶剂中加入按终体积计算的质量浓度的0.2~20 mg/ml 双链siRNA，0.02~1 mg/ml 二水氯化钙、0.01~1 mg/ml二氢磷酸钠、0.01~1 mg/ml六水氯化镁、0.01~1 mg/ml磷酸钠、0.01~1 mg/ml氯化钾，充分溶解后，用溶剂稀释溶液至接近终体积，所述溶剂为无菌注射用水，最后使用1mg/ml HCl或NaOH溶液将pH调节至6.5~7.5。
在一个或多个实施方案中，所述方法包括向部分溶剂中加入按终体积计算的质量浓度的2 mg/ml 双链siRNA，0.2 mg/ml 二水氯化钙、0.1 mg/ml二氢磷酸钠、0.16 mg/ml六水氯化镁、0.03 mg/ml磷酸钠、0.22 mg/ml氯化钾，充分溶解后，用溶剂稀释溶液至接近终体积，所述溶剂为无菌注射用水，最后使用1 mg/ml HCl或NaOH溶液将pH调节至6.9~7.1。
本发明的另一个方面，提供了如本文任一实施方案中所述的双链siRNA在制备治疗TNF-α介导的疾病或病症的药物中的用途。在一个或多个实施方案中，所述TNF-α介导的疾病或病症选自炎症，自免疾病，痛觉敏感和癌症。更优选地，所述TNF-α介导的疾病或病症选自银屑病，银屑病关节炎，脊柱炎，脊髓炎，脑炎，系统性红斑狼疮，关节炎，炎症性肠病，中枢神经过敏，外周神经过敏，白血病，淋巴瘤，黑色素瘤，胃癌，肝癌，胆癌，肾癌，肺癌，骨髓瘤，生殖系统癌，乳腺癌，胰腺癌，骨癌或头颈部肿瘤。
本发明将亲脂性碳链连接到siRNA中核苷酸单体中五碳糖的2’-C端，以增加siRNA序列的亲脂性，从而改善其无载体递送效果和分布性能，同时不会对其疗效和安全性有负面影响，具有亲脂链修饰的siRNA能够更加有效地敲降靶基因的表达。
附图说明
图1是亲脂链a的1H-NMR谱图与13C-NMR谱图。其中图1A是亲脂链a的1H-NMR谱图，图1B是亲脂链a的13C-NMR谱图。
图2是亲脂链b的1H-NMR谱图与13C-NMR谱图。其中图2A是亲脂链b的1H-NMR谱图，图2B是亲脂链b的13C-NMR谱图。
图3是亲脂链c的1H-NMR谱图与13C-NMR谱图。其中图3A是亲脂链c的1H-NMR谱图，图3B是亲脂链c的13C-NMR谱图。
图4是亲脂链d的1H-NMR谱图与13C-NMR谱图。其中图4A是亲脂链d的1H-NMR谱图，图4B是亲脂链d的13C-NMR谱图。
图5是亲脂链e的1H-NMR谱图与13C-NMR谱图。其中图5A是亲脂链e的1H-NMR谱图，图5B是亲脂链e的13C-NMR谱图。
图6是示例性的一种核苷A的合成路线图。
图7是核苷A-核苷E的结构图。其中图7A是核苷A的结构图，图7B是核苷B的结构图，图7C是核苷C的结构图，图7D是核苷D的结构图，图7E是核苷E的结构图。
图8是转染siRNA后小鼠脑细胞中靶基因mRNA表达水平变化。其中图8A是转染1#~6#后小鼠脑细胞中靶基因mRNA表达水平变化，图8B是转染5#B~5#E后小鼠脑细胞中靶基因mRNA表达水平变化。
图9是鞘内注射siRNA后小鼠各器官中靶基因mRNA表达水平变化。其中图9A是鞘内注射5#后小鼠各器官中靶基因mRNA表达水平变化，其中图9B是鞘内注射5#A后小鼠各器官中靶基因mRNA表达水平变化，其中图9C是鞘内注射5#B后小鼠各器官中靶基因mRNA表达水平变化，其中图9D是鞘内注射5#C后小鼠各器官中靶基因mRNA表达水平变化，其中图9E是鞘内注射5#D后小鼠各器官中靶基因mRNA表达水平变化，其中图9F是鞘内注射5#E后小鼠各器官中靶基因mRNA表达水平变化。
图10是皮内注射siRNA后小鼠皮肤组织中靶基因mRNA表达水平变化。
图11是转染siRNA后HaCat细胞的细胞活力变化。
图12是鞘内注射5#A后小鼠各组织的荧光成像图。其中图12A是鞘内注射5#A后小鼠各组织的荧光成像图，图12B是相应的颜色标尺。
具体实施方式
核苷
本发明提供一种核苷，其具有如式（Ⅰ）所示的结构，包含R1，R3和亲脂性的R2，其中：
（Ⅰ）
R1选自含氮碱基或含氮碱基类似物；
优选地，R1选自腺嘌呤基，尿嘧啶基，胞嘧啶基或鸟嘌呤基。优选地，R1选自包含硫代，卤代，羟基化，氨基化，羧基化或甲基化中一种或多种修饰的腺嘌呤基，尿嘧啶基，胞嘧啶基或鸟嘌呤基。优选地，R1选自包含硫代，卤代，羟基化，氨基化，羧基化或甲基化中一种或多种修饰的腺嘌呤甲基，尿嘧啶甲基，胞嘧啶甲基或鸟嘌呤甲基。优选地，R1选自包含硫代，卤代，羟基化，氨基化，羧基化或甲基化中一种或多种修饰的腺嘌呤甲酰基，尿嘧啶甲酰基，胞嘧啶甲酰基或鸟嘌呤甲酰基。
R2选自H，C12-C50烷基，或具有选自羟基，醚键，羰基，酰胺键，羧基，酯键，氨基，亚氨基，叔氨基，卤代，硫代，硫醚键，巯基，磺酸基，磷代和磷酸基中一种或多种修饰的C12-C50烷基。
优选地，R2选自如下基团：
、
、
、
、或
；
R3选自4,4'-二甲氧基三苯甲基（DMTr），4-单甲氧基三苯甲基（MMTr），4,4',4''-三甲氧基三苯甲基（TMTr），特戊酰基氧基甲基（PIVOM），叔丁基二甲基硅烷基（TBDMS），9-芴基甲氧基羰基（Fmoc），苯氧基乙酰基（PAC），4-叔-丁基苯氧基乙酰基（tBPAC），2-氰基乙氧基-N,N-二异丙基氨基膦基（CEP），3-乙酰丙酰基，乙酰基，苯甲酰基，2-氰基乙基，N,N-二丁基氨基羰基（DBF），N,N-二甲基氨基羰基（DMF），异丁酰基，2-(2-硝基苯基)-丙氧羰基（NPPOC），三乙基铵（TEA），三氟乙酰基，三异丙基甲硅烷氧基甲基（TOM），对异丙基苯氧基乙酰基（iPrPAC），O-缩醛乙酰丙基酯（ALE，acetal levulinyl ester），苯乙酰基，或1,1',3,3'-四异丙基二硅氧烷基（tetra-isopropyl disiloxanyl）。优选地，R3为4,4’-二甲氧基三苯甲基（DMTr）。
双链siRNA
本发明提供一种双链siRNA，其包含一条正义链和一条反义链，其中的核苷酸具有特殊修饰，所述经特殊修饰的核苷酸包含R1和亲脂性的R2，具有如式（Ⅱ）所示的结构：
（Ⅱ）
R1选自含氮碱基或含氮碱基类似物；优选地，R1选自腺嘌呤基，尿嘧啶基，胞嘧啶基或鸟嘌呤基。
优选地，R1选自包含硫代，卤代，羟基化，氨基化，羧基化或甲基化中一种或多种修饰的腺嘌呤基，尿嘧啶基，胞嘧啶基或鸟嘌呤基。优选地，R1选自包含硫代，卤代，羟基化，氨基化，羧基化或甲基化中一种或多种修饰的腺嘌呤甲基，尿嘧啶甲基，胞嘧啶甲基或鸟嘌呤甲基。优选地，R1选自包含硫代，卤代，羟基化，氨基化，羧基化或甲基化中一种或多种修饰的腺嘌呤甲酰基，尿嘧啶甲酰基，胞嘧啶甲酰基或鸟嘌呤甲酰基。
R2选自H，C12-C50烷基，或具有选自羟基，醚键，羰基，酰胺键，羧基，酯键，氨基，亚氨基，叔氨基，卤代，硫代，硫醚键，巯基，磺酸基，磷代和磷酸基中一种或多种修饰的C12-C50烷基。
优选地，R2选自如下基团：
、
、
、
、或
。
实施例
实施例1：核苷的合成
亲脂链a的合成路线
S1：原料1（CAS号:55182-74-6）根据参考文献（CN110028405A）的方法得到中间产物1，再以中间产物1为原料，根据参考文献（Journal of Chemical Ecology; vol. 27; 4;(2001); p. 791-806）的方法得到中间产物2。
S2：原料2（CAS号:112-31-2）和中间产物2根据参考文献European Journal ofOrganic Chemistry; 9; (2000); p. 1821-1826的方法得到中间产物3。
S3：中间产物3根据参考文献（Vanka, Kumar; vol. 10; 14; (2020); p. 4586-4592）的方法得到亲脂链a，其结构如式（Ⅲ）所示。
（Ⅲ）
得到亲脂链a的1H-NMR谱图如图1A所示，13C-NMR谱图如图1B所示。
亲脂链b的合成路线
S1：将3-丁烯-1-醇（200 mg，2.77 mmol）与N,N-二甲基甲酰胺（DMF，2.0 mL，纯度＞99%）混合。
S2：在室温下向S1的混合物中加入1-溴壬烷（355 μL，1.85 mmol）和氢化钠（NaH，112 mg，2.77 mmol），并持续搅拌，直至起始原料完全消耗（通过薄层层析监测）。搅拌结束后，用水淬灭反应。
S3：对S2搅拌结束后的反应混合物，用乙酸乙酯/己烷（体积比10:1）萃取。
S4：取S3萃取后的有机层，用水和盐水洗涤各洗涤一次，每次洗涤后分液萃取有机层。然后用无水硫酸钠干燥洗涤后的有机层，干燥完成后进行过滤。取滤液在真空下浓缩以得到粗产物。
S5：以己烷/乙酸乙酯（体积比20:1）作为洗脱剂，通过硅胶柱色谱法纯化粗产物，得到无色油状物（中间产物1）。
S6：根据参考文献（Liebigs Annalen der Chemie; 1; (1981); p. 92 - 98），得到中间产物2。
S7：根据参考文献（Journal of the American Chemical Society; vol. 123;50; (2001); p. 12504 - 12509），将中间产物1和中间产物2进行反应，得到亲脂链b，其结构如式（Ⅳ）所示。
（Ⅳ）
得到亲脂链b的1H-NMR谱图如图2A所示，13C-NMR谱图如图2B所示。
亲脂链c的合成路线
S1：根据下列参考文献，得到中间产物1：
Chemistry and Industry (London, United Kingdom); (1959); p. 1288;Journal of the Chemical Society; (1961); p. 2779,2786；
Bioorganic and Medicinal Chemistry; vol. 15; 2; (2007); p. 854 – 867；
Journal of Organic Chemistry; vol. 63; 11; (1998); p. 3741 – 3744；
Journal of Organic Chemistry; vol. 54; 23; (1989); p. 5522 – 5527。
S2：根据下列参考文献，将化合物（CAS号2566-89-4）和化合物（CAS号2134-29-4）进行反应，得到中间产物2：
Angewandte Chemie - International Edition; vol. 54; 13; (2015); p.4023 – 4027；
Angew. Chem.; vol. 127; 13; (2015); p. 5。
S3：根据参考文献（WO2019010414A1），用中间产物1和中间产物2进行反应，得到中间产物3。
S4：根据下列参考文献，得到中间产物4。
Liebigs Annalen der Chemie; 11; (1992); p. 1113 – 1124
Monatshefte fuer Chemie; vol. 112; (1981); p. 825 – 840
S5：根据参考文献（Journal of Medicinal Chemistry; vol. 40; 22; (1997);p. 3626 – 3634），用中间产物3和中间产物4进行反应，得到亲脂链c，其结构如式（Ⅴ）所示。
（Ⅴ）
得到亲脂链c的1H-NMR谱图如图3A所示，13C-NMR谱图如图3B所示。
亲脂链d的合成路线
S1：根据参考文献（Tetrahedron Letters; vol. 48; 42; (2007); p. 7456 –7459），用原料1（CAS号:542-78-9）和原料2（CAS号:1120-16-7）进行反应，得到中间产物1。
S2：根据参考文献（Molecules; vol. 27; 9; (2022)），用中间产物1进行反应，得到亲脂链d，其结构如式（Ⅵ）所示。
（Ⅵ）
得到亲脂链d的1H-NMR谱图如图4A所示，13C-NMR谱图如图4B所示。
亲脂链e的合成路线
使用原料（CAS号156-60-5），根据参考文献（Journal of Organic Chemistry;vol. 34; (1969); p. 1130 – 1133）进行反应，得到亲脂链e，其结构如式（Ⅶ）所示。
（Ⅶ）
得到亲脂链e的1H-NMR谱图如图5A所示，13C-NMR谱图如图5B所示。
包含特殊修饰的核苷的合成
核苷A的合成
以亲脂链a和脱水核苷为原料，可合成核苷A。脱水核苷选自脱水腺苷，脱水尿嘧啶，脱水胞嘧啶，脱水胸腺嘧啶，脱水鸟嘌呤，或它们的类似物。
例如，以亲脂链a和脱水尿苷合成一种核苷A，即含亲脂链a的尿苷，其流程如图6所示：
S1：向2ml四氢呋喃（THF）中加入0.06~0.1M化合物①（2,2'-脱水尿苷，CAS号3736-77-4），缓慢滴加100 μl叔丁基二苯基氯硅烷（TBDPSCl，CAS号58479-61-1），同时搅拌混合均匀。向反应体系中缓慢滴加碱性催化剂三乙胺100 μl，继续搅拌混合均匀，室温过夜，生成含化合物②的溶液。
S2：向S1中含化合物②的溶液缓慢滴加0.1M的三甲基铝（CAS号75-24-1）10 μl，同时搅拌混合均匀，生成含化合物③的溶液。
S3：向S2中含化合物③的溶液缓慢滴加10 μl吡啶氢氟酸盐（CAS号62778-11-4），同时搅拌混合均匀，生成含化合物④的溶液。
S4：向S3中含化合物④的溶液缓慢滴加100 μl DMTrCl（CAS号40615-36-9），同时加入少许吡啶（CAS号110-86-1）和DMAP（CAS号1122-58-3）作为催化剂，得到含化合物⑤的溶液。
S5：向S4中含化合物⑤的溶液加入双(二异丙基氨基)(2-氰基乙氧基)膦（CAS号102691-36-1）50 μl，同时搅拌混合均匀，得到核苷A。
核苷B-E的合成
除把原料中的亲脂链a替换为亲脂链b-e的其中一种外，核苷B-E的合成条件与核苷A的合成条件基本相同。
表1：核苷A-E的部分合成原料
核苷A-E的部分合成原料如表1所示。
通过上述方法合成得到具有不同特殊修饰类型的核苷A-E，其结构通式如图7所示。
实施例2：siRNA序列设计与合成
siRNA序列设计
siRNA-T1（靶基因GenBank：MH180383.1），其正义链的序列为5’- GCCUG UAGCCCAUGU UGUA TT-3’，反义链的序列为5’- UACAA CAUGG GCUAC AGGC TT -3’。其正义链从5’端起第2、3、4、6、7、9、10、11、12、13、15、16、18和19位碱基核苷酸中α位磷酸基团的一个非桥接氧原子采用硫原子替代，即使用硫代修饰。此外，对各siRNA-T1序列做不同类型亲脂链的修饰。序列信息详见表2。
表2：siRNA-T1修饰序列信息
siRNA序列合成
用AGCUT 5种市售可得的核苷，以及实施例1获得的具有不同含氮碱基的核苷A-E，采用亚磷酰胺三酯法合成siRNA序列，即通过“脱保护——偶联——氧化——盖帽”4个程序重复，每个重复结束后寡核苷酸链延长一个碱基。脱保护试剂为三氯乙烷/二氯甲烷混合液，活化剂为5-苄硫基四氮唑，氧化剂为碘液或(E)-N,N-二甲基-N' - (3-硫代-3H-1,2,4-二噻唑-5-基)甲脒，硫代试剂采用CAS号为56950-66-4的化合物，盖帽试剂为醋酐/四氢呋喃混合液及N-甲基咪唑。得到合成产物后进行脱保护和退火。
使用HPLC法对退火产物进行纯化，得到不同的siRNA序列。
纯化材料与参数：选用NanoQ-15L阴离子交换柱，平衡液：100 mmol/L 三羟甲基氨基甲烷 (pH7.5)，10 mmol/L乙二胺四乙酸 (pH8.0)，300 mmol/L NaCl，pH9.0，电导率32mS/cm。洗脱液：100 mmol/L三羟甲基氨基甲烷 (pH7.5)，10 mmol/L 乙二胺四乙酸(pH8.0)，700 mmol/L NaCl，pH9.0，电导率65.2 ms/cm，流速10 mL/min。
实施例3：siRNA转染小鼠脑细胞
小鼠脑细胞制备
从B6小鼠（小鼠3~4月龄，雌性，购买自上海昇敞生物科技有限公司）大脑中取脑髓灰质，仔细剥除脑膜、血管和纤维成分，置Hanks液中漂洗一、二次。将漂洗好后的灰质组织置于30~50倍体积的Hanks液中，反复吹打即制成细胞悬液。把悬液注入离心管，于室温直立静置离心管5~10分钟后，细胞或细胞团块自然下沉，脂肪等杂物易漂浮。小心吸除上层液体，反复二、三次。在剩余的沉降物中加入适量培养液，通过纱网成纱布过滤，对过滤后的细胞液进行细胞计数，并调整细胞密度。将小鼠脑细胞接入培养基瓶或皿中，置5%CO2温箱中培养。将适量细胞传代至12孔板，确保第二天细胞可生长至每孔的约50%密度。
A型修饰siRNA转染
转染时，向各孔细胞滴加1#A~6#A六种siRNA分子中的一种，六个siRNA分子分别设高、低剂量组。高剂量组siRNA转染浓度为100nM，低剂量组siRNA转染浓度为30nM。转染后48h，使用天根试剂盒RNA prep Pure Cell/Bacteria Kit（货号为 DP430）提取RNA基因组，再经逆转录得到cDNA。
通过Q-PCR检测TNF-α的mRNA表达量，其结果如图8A所示。转染浓度为30nM或100nM时，6种siRNA均能有效敲降mRNA的表达。在低、高转染浓度下，5#A分子的mRNA表达敲降效果均为最优，敲降后剩余mRNA的表达水平分别为约36%和约18.3%。由于5#A分子特异性敲降TNF-α的mRNA效果最优，选取5#A分子作后续验证。
B~E型修饰siRNA转染
参考A型修饰siRNA转染结果，使用5#B~5#E siRNA，用于转染试验。
转染时，向各孔细胞滴加5#B、5#C、5#D或5#E中的一种siRNA，每种siRNA均设高、低剂量组。高剂量组siRNA转染浓度为100nM ，低剂量组siRNA转染浓度为30nM。48h时，按照天根试剂盒RNA prep Pure Cell/Bacteria Kit（货号为DP430）提取RNA基因组，再经逆转录得到cDNA。
通过Q-PCR检测TNF-α的mRNA表达量，其结果如图8B所示。转染浓度为30nM或100nM时，四种siRNA均能有效敲降mRNA的表达。在低、高转染浓度下，5#C 效果均为最优，敲降后剩余mRNA的表达水平分别为约29%和约15.5%。敲降效果从高到底依次为：5#C＞5#B＞5#D＞5#E。
实施例4：鞘内注射siRNA分子对小鼠体内靶基因mRNA表达的影响
将siRNA 5#（不含特殊修饰）、5#A、5#B、5#C、5#D和5#E分别制备成无菌制剂，溶剂为无菌注射用水。制备时，向部分溶剂中加入按终体积计算的质量浓度的2 mg/ml siRNA，0.2 mg/ml 二水氯化钙、0.1mg/ml二氢磷酸钠、0.16mg/ml六水氯化镁、0.03 mg/ml磷酸钠、0.22 mg/ml氯化钾，充分溶解后，用溶剂稀释溶液至接近终体积，最后使用1mg/ml HCl或NaOH溶液将pH调节至6.9~7.1。对B6小鼠鞘内注射50μL siRNA制剂，注射24 h后对小鼠进行安乐死处理，分别取小鼠心脏、肝脏、脾、肺、肾、脊柱脊髓和大脑白质，同时取一只空白小鼠的脏器作对照，立即在液氮中快速冷冻。
使用75%浓度的乙醇溶液对镊子、剪刀进行消毒处理，以尽可能消除RNA酶。将2 ml离心管置于冰块上，并加入适量的PBS缓冲液用于制备组织匀浆。实验所需的组织匀浆的质量体积比约为10%。将需要进行研磨的组织样本从零下80℃的冰箱内取出，置于冰上的离心管中，使用灭菌后的镊子和剪刀，将样本切成小块。将已经灭菌的氧化锆研磨球，按照每个离心管一颗的数量放入离心管中。将离心管置于研磨机中进行研磨，设置振动频率为1000次/分钟，振动时间为5分钟，温度-20℃。研磨完成后，将离心管放入预冷的高速离心机内，以4000 rpm的速度离心30 min。将所得的上清液用移液器取出，转入至新的离心管内，使用天根试剂盒RNA prep Pure Cell/Bacteria Kit（货号为DP430）提取RNA基因组，并通过Q-PCR检测各器官TNF-α mRNA的表达。
鞘内注射5# siRNA分子后，对小鼠体内靶基因mRNA表达的影响如图9所示。结果显示，5#在心脏、脾、肺中对靶基因基本没有敲降效果，在肝、肾、脊髓和大脑白质有一定敲降效果，但敲降效果均小于50%。5#A~5#E在心脏几乎未有敲降效果，在肝脏、脾、肺、肾、脊柱脊髓、大脑白质均有不同程度的敲降效果，总体均优于5#。其中5#C的效果相对最优，肝脏敲降至约45%，脾约敲降至71%，肺敲降至约65%，肾敲降至约52.5%，脊柱脊髓敲降至约21%，大脑白质敲降至约28.5%（图9D）。
综上，本发明的具有特殊修饰的siRNA分子，通过鞘内注射的方式，能够达到敲降肝脏、脾、肺、脊柱脊髓、大脑白质中靶基因mRNA表达的效果，效果相比未修饰的siRNA显著提升，具有优异的亲脂性和分布性能。
实施例5：皮内注射siRNA分子对小鼠体内靶基因mRNA表达的影响
将5# A、5# B、5#C、5# D、5# E及5#不含修饰结构的分子分别制备成无菌制剂，制备方法参考实施例4。对B6小鼠皮内注射含50 μg siRNA的制剂，注射24 h后对小鼠进行安乐死处理，取下注射部位皮肤，同时取一只空白小鼠的皮肤（包含表皮和真皮）作对照，立即在液氮中快速冷冻。
使用75%浓度的乙醇溶液对镊子、剪刀进行消毒处理，以尽可能消除RNA酶。将2 ml离心管置于冰块上，并加入适量的PBS缓冲液用于制备组织匀浆。实验所需的组织匀浆的质量体积比约为10%。将需要进行研磨的组织样本从零下80℃的冰箱内取出，置于冰上的离心管中，使用灭菌后的镊子和剪刀，将样本切成小块。将已经灭菌的氧化锆研磨球，按照每个离心管一颗的数量放入离心管中。将离心管置于研磨机中进行研磨，设置振动频率为1000次/分钟，振动时间为5分钟，温度-20℃。研磨完成后，将离心管放入预冷的高速离心机内，以4000 rpm的速度离心30 min。将所得的上清液用移液器取出，转入至新的离心管内，使用天根试剂盒RNA prep Pure Cell/Bacteria Kit（货号为DP430）提取RNA基因组，并通过Q-PCR检测各器官TNF-α mRNA的表达。
皮内注射siRNA分子后，小鼠皮肤靶基因mRNA表达的影响如图10所示。结果显示，5#敲降皮肤组织中mRNA的表达水平至约67.5%。五种特殊修饰的siRNA分子均能有效敲降mRNA的表达，效果优于5#。5#A~5#E敲降后剩余mRNA的表达水平分别约为19.5%、27.5%、3.5%、52.5%、55.0%，可见其中5#C 效果均为最优，敲降效果从高到底依次为：5#C＞5#A＞5#B＞5#D＞5#E。
实验结果表明，本发明的具有特殊修饰的siRNA，通过皮内注射的方式，能够达到敲降皮肤组织中靶基因mRNA表达的效果，效果相比未修饰的siRNA显著提升，具有优异的亲脂性和透皮性。
实施例6：siRNA分子的细胞毒性
将5# A、5# B、5#C、5# D、5# E分子分别转染HaCat细胞，之后使用试剂盒检测细胞毒性，具体操作步骤如下：
S1：第一天，将适量细胞传代至96孔板，确保第二天细胞可生长至每孔的约50%密度。
S2：第二天，达到约50%密度时，各孔分别加入5#A~5#E 的siRNA制剂（制剂制备方法参考实施例4）进行转染，转染浓度为100 pmol siRNA。
S3：转染后的细胞置于5% CO2，37℃环境孵育过夜。
S4：于不同时间点，用酶标仪在450nm处测量各孔吸光值。
由图11得知，五个siRNA分子在转染后第4-8h表现出轻微毒性，随后细胞活力逐渐恢复正常，可见五个siRNA分子对细胞毒性较小。
实施例7：siRNA分子体内递送分布评价
使用链接有FAM（Carboxyfluorescein，羧基荧光素）的CPG（Controlled PoreGlass）柱合成得到正义链3’端链接有FAM的5#A siRNA分子，再制备成无菌制剂（制备方法参考实施例4）。鞘内注射B6小鼠50 μL siRNA制剂，注射3h后安乐死处理小鼠，取小鼠心脏、肝脏、脾、肺、肾、脊柱脊髓和大脑白质，进行组织荧光成像。
由图12显示，荧光信号由强到弱排序依次是脊柱脊髓、大脑、肝、肾，而此时心脏、脾、肺基本没有信号检出。可见5#A siRNA分子经过鞘内注射，在脊髓脊柱组织中能够迅速分布，具有优异的分布性能。
综上所述，本发明通过亲脂链修饰，增加了siRNA序列的亲脂性，修饰后的siRNA分子，经由鞘内注射和皮内注射及其他给药方式，达到优异的体内无载体递送效率和分布性能，在有效敲降靶基因表达的同时，兼具良好的耐受性和安全性。
上述实施例仅是为充分说明本发明技术方案和效果而所举的优选实施例，其目的在于让熟悉此项技术的人能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。本领域技术的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。

Claims (13)

1.一种核苷，其具有如式(Ⅰ)所示的结构，其特征在于，其包含R1，R3和亲脂性的R2，其中：
R1选自腺嘌呤基，尿嘧啶基，胞嘧啶基或鸟嘌呤基，
包含硫代，卤代，羟基化，氨基化，羧基化或甲基化中一种或多种修饰的腺嘌呤基，尿嘧啶基，胞嘧啶基或鸟嘌呤基，
包含硫代，卤代，羟基化，氨基化，羧基化或甲基化中一种或多种修饰的腺嘌呤甲基，尿嘧啶甲基，胞嘧啶甲基或鸟嘌呤甲基，或
包含硫代，卤代，羟基化，氨基化，羧基化或甲基化中一种或多种修饰的腺嘌呤甲酰基，尿嘧啶甲酰基，胞嘧啶甲酰基或鸟嘌呤甲酰基；
R2选自如下基团：
R3选自4,4'-二甲氧基三苯甲基，4-单甲氧基三苯甲基，4,4',4”-三甲氧基三苯甲基，特戊酰基氧基甲基，叔丁基二甲基硅烷基，9-芴基甲氧基羰基，苯氧基乙酰基，4-叔-丁基苯氧基乙酰基，2-氰基乙氧基-N,N-二异丙基氨基膦基，3-乙酰丙酰基，乙酰基，苯甲酰基，2-氰基乙基，N,N-二丁基氨基羰基，N,N-二甲基氨基羰基，异丁酰基，2-(2-硝基苯基)-丙氧羰基，三乙基铵，三氟乙酰基，三异丙基甲硅烷氧基甲基，对异丙基苯氧基乙酰基，O-缩醛乙酰丙基酯，苯乙酰基，或1,1',3,3'-四异丙基二硅氧烷基。
2.一种双链siRNA，其包含一条正义链和一条反义链，所述正义链的序列为5'-GCCUGUAGCCCAUGUUGUATT-3'，所述反义链的序列为5'-UACAACAUGGGCUACAGGCTT-3’，其特征在于，其中的核苷酸具有特殊修饰，所述经特殊修饰的核苷酸包含R1和亲脂性的R2，具有如式(Ⅱ)所示的结构：
R1选自腺嘌呤基，尿嘧啶基，胞嘧啶基或鸟嘌呤基，
包含硫代，卤代，羟基化，氨基化，羧基化或甲基化中一种或多种修饰的腺嘌呤基，尿嘧啶基，胞嘧啶基或鸟嘌呤基，
包含硫代，卤代，羟基化，氨基化，羧基化或甲基化中一种或多种修饰的腺嘌呤甲基，尿嘧啶甲基，胞嘧啶甲基或鸟嘌呤甲基，或
包含硫代，卤代，羟基化，氨基化，羧基化或甲基化中一种或多种修饰的腺嘌呤甲酰基，尿嘧啶甲酰基，胞嘧啶甲酰基或鸟嘌呤甲酰基；
R2选自如下基团：
3.如权利要求2所述的双链siRNA，其特征在于，所述经特殊修饰的核苷酸位于正义链的5’至3’方向的第1，2，5，8，14，17，18或19位中的一个或多个位点。
4.如权利要求2所述的双链siRNA，其特征在于，所述经特殊修饰的核苷酸位于反义链的5’至3’方向的第1，2，9，10，11，17，18或19位中的一个或多个位点。
5.如权利要求3所述的双链siRNA，其特征在于，所述经特殊修饰的核苷酸位于：
正义链的5’至3’方向的第1位；
正义链的5’至3’方向的第1位和第19位；
正义链的5’至3’方向的第1位和第2位；
正义链的5’至3’方向的第1，2，18和19位；或
正义链的5’至3’方向的第1，5，8，14和17位。
6.如权利要求4所述的双链siRNA，其特征在于，所述经特殊修饰的核苷酸位于：
反义链的5’至3’方向的第1位；
反义链的5’至3’方向的第1位和第19位；
反义链的5’至3’方向的第1位和第2位；
反义链的5’至3’方向的第1，2，18和19位；或
反义链的5’至3’方向的第9，10，11，17和18位。
7.如权利要求2所述的双链siRNA，其特征在于，所述经特殊修饰的核苷酸位于：
正义链的5’至3’方向的第1位，和反义链的5’至3’方向的第1位；
正义链的5’至3’方向的第1位和第19位，和反义链的5’至3’方向的第1位和第19位；
正义链的5’至3’方向的第1位和第2位，和反义链的5’至3’方向的第1位和第2位；
正义链的5’至3’方向的第1，2，18和19位，和反义链的5’至3’方向的第1，2，18和19位；
正义链的5’至3’方向的第1，5，8，14和17位；或
正义链的5’至3’方向的第1，5，8，14和17位，和反义链的5’至3’方向的第9，10，11，17和18位。
8.如权利要求2-7中任一项所述的双链siRNA，其特征在于，所述正义链的第2，3，4，6，7，9，10，11，12，13，15，16，18和19位核苷酸单体中与3'-C连接的磷酸基团中的一个非桥接氧原子被硫原子替代。
9.一种制备如权利要求1所述的核苷的方法，其特征在于，所述方法包括亲脂链的合成以及将亲脂链与脱水核苷反应进行得到如权利要求1所述的核苷，所述脱水核苷选自脱水腺苷或其类似物，脱水尿嘧啶或其类似物，脱水胞嘧啶或其类似物，脱水胸腺嘧啶或其类似物，或脱水鸟嘌呤或其类似物。
10.一种制备如权利要求2-8中任一项所述的双链siRNA的方法，其特征在于，所述方法包括以权利要求1中所述的核苷为原料进行RNA合成。
11.一种药物组合物，其包含治疗有效量的如权利要求2-8中任一项所述的双链siRNA，和药学上可接受的载体、溶剂或赋形剂。
12.一种制备如权利要求11所述药物组合物的方法，其特征在于，所述方法包括向溶剂中加入双链siRNA，和药学上可接受的载体或赋形剂。
13.如权利要求2-8中任一项所述的双链siRNA在制备治疗TNF-α介导的疾病或病症的药物中的用途。
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