CN119235949A - 一种具有免疫抑制功能的毛棉杜鹃提取物及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种具有免疫抑制活性的毛棉杜鹃花提取物及其制备方法和应用。以毛棉杜鹃花的干燥花朵微粉为原料，浓度为95％的乙醇作为提取剂在温度60℃，料液比1:10的条件下，进行冷凝回流提取2h，过滤收集提取液，合并上述提取液进行真空、减压浓缩，得毛棉杜鹃花提取浸膏，该浸膏在浓度为100mg/mL时对刀豆蛋白诱导的T淋巴细胞增殖和脂多糖诱导的B淋巴细胞增殖抑制率分别为61.41％和51.54％，且对正常小鼠的脾淋巴细胞无细胞毒性。本发明为研究与开发新型的免疫抑制剂提供了候选研究材料，同时也为开发利用毛棉杜鹃资源提供了科学依据。

Description

一种具有免疫抑制功能的毛棉杜鹃提取物及其制备方法和 应用

技术领域

本发明属于医药生物技术领域，具体涉及一种具有免疫抑制功能的毛棉杜鹃提取物及其制备方法及应用。

背景技术

自身免疫性疾病是一种慢性疾病，包括类风湿性关节炎、多发性硬化症和系统性红斑狼疮等，全球患病人群约占总人口数的9.4％。患者通常会出现异常的免疫反应和炎症，表现为免疫细胞群紊乱、免疫细胞活化、炎症介质上调和组织损伤。由于发病根源尚不清楚，多数患者无法得到彻底治愈。目前临床上使用的免疫抑制剂主要包括五大类：细胞因子抑制剂，如环孢菌素A(Cyclosporin A,CsA)、他克莫司(FK506)和雷帕霉素；DNA合成抑制剂，如霉酚酸酯；肾上腺皮质激素类，如泼尼松；抗淋巴细胞抗体，如抗淋巴细胞球蛋白；和其它免疫抑制剂，如Sotrastaurin(AEB071)、Fingolimod(FTY720)、环磷酰胺等。其中，大多数的免疫抑制剂是基于T细胞相关的免疫反应信号通路发挥作用的。例如：CsA和FK506进入人体后分别与亲环素和FK506结合蛋白12(FKBP12)形成复合物，这两种复合物均可抑制细胞内钙调神经磷酸酶，干扰T细胞核因子通路，从而抑制T细胞的活化。而雷帕霉素在细胞中与FKBP12形成的复合物是通过抑制mTOR的磷酸化从而阻断增殖信号的传递。托法替尼可通过抑制JAK3的磷酸化，进而发挥免疫抑制作用。

毛棉杜鹃(Rhododendron radendum Fang)为杜鹃花科(Ericaceae)杜鹃花属(Rhododendron)植物，常绿小灌木，多生于海拔3000米-4100米的山地灌丛中或华山松、高山栎林下。主要分布于中国四川西部和西南部。该物种因花朵美丽，具有较高的园艺观赏价值。毛棉杜鹃根、叶、花和果实均可入药，具有收敛止血、消肿止痛、活血化瘀、祛风除湿、淡斑美白等功效，主用于治疗跌打损伤所致外伤出血、淤血肿痛，风湿痹症所致骨痛、关节疼痛、肢体麻木以及气血不足引起的面色无华、黯淡无光等。然而，前对毛棉杜鹃的活性成分及提取物药理活性的相关报道较少，仅有一篇文献对毛棉杜鹃的花色素提取液进行了初步鉴定和含量测定。

发明内容

本发明的目的是针对毛棉杜鹃花活性成分的研究不足，提供一种具有免疫抑制功能的毛棉杜鹃提取物及其制备方法和应用。

本发明的第一个目的是提供具有免疫抑制功能的毛棉杜鹃提取物的制备方法，包括以下步骤：

将新鲜毛棉杜鹃花用乙醇或乙醇水溶液浸提，提取液经浓缩后得到毛棉杜鹃花提取浸膏，即为毛棉杜鹃提取物。

进一步优选，是将毛棉杜鹃花提取浸膏依次用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取，随后将萃取液减压浓缩，得到毛棉杜鹃的四个不同极性部位，分别为：石油醚部位，乙酸乙酯部位，正丁醇部位，水部位，乙酸乙酯部位即为毛棉杜鹃提取物。

进一步优选，将乙酸乙酯部位用石油醚-乙酸乙酯作为洗脱剂，以体积比20:1，10:1，5:1，3:1，1:1，1:3，0:1进行梯度洗脱，收集流份，流份用TLC薄层层析，以石油醚：乙酸乙酯＝30:1-1:1，v/v作为展开剂，收集石油醚：乙酸乙酯＝2：1，Rf＝0.5-0.6，硫酸乙醇显暗红色斑点的成分，即为毛棉杜鹃提取物。

优选，所述的将新鲜毛棉杜鹃花用乙醇或乙醇水溶液浸提，提取液经浓缩后得到毛棉杜鹃花提取浸膏是将新鲜毛棉杜鹃花进行冷冻干燥，粉碎，采用95％的乙醇在温度60℃，料液比1:10g/ml的条件下，进行冷凝回流提取，过滤收集提取液，提取液进行真空、减压浓缩，得到毛棉杜鹃花提取浸膏。

本发明的第二个目的是提供上述毛棉杜鹃提取物在制备免疫抑制剂中的应用。

本发明的第三个目的是提供一种免疫抑制剂，其包括上述毛棉杜鹃提取物作为活性成分。

本发明通过实验发现，毛棉杜鹃粗提物以及所有组分对小鼠正常脾细胞均无明显细胞毒作用，但对ConA诱导的小鼠T淋巴细胞和LPS诱导的小鼠B淋巴细胞增殖表现出一定程度抑制作用。根据免疫抑制活性导向分离策略，成功追踪到毛棉杜鹃粗提物的强活性流份，EADJ-H段，其在终浓度为100μg/mL时对ConA诱导的小鼠T淋巴细胞和LPS诱导的小鼠B淋巴细胞增殖的抑制率分别为73.87％和56.97％；同时，终浓度为20μM的阳性药环孢霉素A(CsA)和霉酚酸酯(MMF)对T细胞和B细胞的增值率抑制率分别为91.48％和70.56％。此结果表明：毛棉杜鹃的EADJ-H段具有显著的免疫抑制活性作用。

本发明通过免疫抑制活性导向追踪分离策略，成功从毛棉杜鹃Rhododendronradendum Fang干燥花微粉的95％乙醇提取物中追踪得到具有显著免疫抑制活性的流份EADJ-H，该部位组合成分显示出显著的免疫抑制活性，有望用于免疫抑制剂联合应用的研究与开发，同时也为新型免疫抑制药物的创制提供了候选活性组分，为开发利用药用植物毛棉杜鹃资源的天然活性物质提供了科学依据。

附图说明

图1是毛棉杜鹃花活性成分提取分离流程图；

图2是EADJ-H流份的¹H-NMR谱(CDCl₃)；

图3是EADJ-H流份的¹³C-NMR谱(CDCl₃)。

具体实施方式

以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。

实施例1：

采用冷冻干燥预处理、95％乙醇回流提取方法、有机溶剂萃取以及正向硅胶柱色谱分离手段等对毛棉杜鹃花进行成分的提取和分离。

1.1、试验用试剂、填料及仪器：无水乙醇，石油醚、乙酸乙酯和正丁醇等有机试剂均购自广州化学试剂厂；正相硅胶柱层析硅胶粉(60-100目、100-200目以及200-300目)购自青岛海洋化工有限公司；薄层层析硅胶板GF254购自青岛谱科分离材料有限公司。核磁共振仪(Bruker，以TMS为内标，德国)、旋转蒸发仪(Eyela N-1100，上海爱朗仪器有限公司，中国)、水浴锅(Eyela SB-1100，上海爱朗仪器有限公司，中国)、循环水真空泵(Eyela A-1000S，日本)、低温冷却循环泵(DLSB-5/20，郑州长城科工贸有限公司，中国)、分析天平(Precisa，上海天美天平仪器有限公司，中国)。

1.2、实验方法

1.2.1毛棉杜鹃花活性成分提取和分离

如图1所示，首先，将毛棉杜鹃花鲜品进行冷冻干燥处理，粉碎成微粉状态，采用95％的乙醇在温度60℃，料液比1:10的条件下，进行冷凝回流提取2h，重复上述操作三次，过滤并收集三次的提取液，合并后进行真空、减压浓缩，得到毛棉杜鹃花提取浸膏(DJ)；随后，将浸膏用一定量的蒸馏水分散成水混悬液，依次用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇(v:v＝1:2，水和有机溶剂的体积比)对不同极性部位进行反复萃取，直至萃取液完全澄清，随后将萃取液减压浓缩，得到毛棉杜鹃的四个不同极性部位，分别为：石油醚部位(PEDJ)，乙酸乙酯(EADJ)，正丁醇部位(nButDJ)，水部位(WDJ)。

紧接着，根据免疫制抑制活性筛选结果，对活性最显著的乙酸乙酯(EADJ)部位进行正向硅胶柱层析，用石油醚-乙酸乙酯作为洗脱剂，以体积比20:1，10:1，5:1，3:1，1:1，1:3，0:1对毛棉杜鹃提取物乙酸乙酯部位(EADJ)进行梯度洗脱，收集流份，然后根据TLC薄层层析(石油醚：乙酸乙酯＝30:1-1:1，v/v)Rf值和不同成分显色情况进行合并，真空减压浓缩后得以下10个组分：EADJ-A，EADJ-B，EADJ-C，EADJ-D，EADJ-E，EADJ-F，EADJ-G，EADJ-H，EADJ-I，EADJ-J；最后，对以上流份进行体外免疫进行小鼠正常脾细胞毒性和免疫抑制活性测试，从而精准锁定强活性部位EADJ-H段(石油醚：乙酸乙酯＝2：1，Rf＝0.5-0.6，硫酸乙醇显暗红色斑点)，并对该段进行初步的核磁氢谱和碳谱分析(图2和3)。

实施例2：

采用MTT法对毛棉杜鹃粗提物总浸膏、不同萃取部位及不同洗脱流份进行免疫抑制活性筛选。

2.1、试验用试剂：RPMI-1640培养基，将毛棉杜鹃提取物所有流份用二甲基亚砜(DMSO)溶解并稀释至所需终浓度：100μg/mL，刺激剂选择终浓度为5μg/mL的T淋巴细胞刺激剂刀豆蛋白(ConA)和B淋巴细胞刺激剂脂多糖(LPS)溶液。阳性对照药选择终浓度为20μg/mL的T淋巴细胞抑制剂环孢霉素A(CsA)和B淋巴细胞抑制剂霉酚酸酯(MMF)溶液。

本实验所用BALB/c小鼠采购自广东省实验动物中心，批号为：SCXK(粤)2022-0002。

2.2、实验方法

2.2.1小鼠脾细胞制备

6-8周龄，体重20g左右，雄性BALB/c小鼠，超净工作台内颈椎脱臼处死，并用75％的医用酒精对其进行体表消毒3-5min，用经高温灭菌的手术镊取出小鼠脾脏，并放入Mesh网研磨，持续用PBS磷酸盐冲洗，过滤得到脾细胞悬浮液，将细胞悬浮液离心5分钟(转速1000rpm)，弃上清。加入适量红细胞裂解液避光裂解1分钟后，立刻加入8mL的RPMI-1640培养基终止裂解反应，并离心5分钟(转速1000rpm)，弃上清。然后用RPMI-1640培养基洗涤2次，1000rpm离心5min，弃上清，目的以完全去除红细胞裂解液。加入含有10％胎牛血清的RPMI-1640培养基重悬细胞稀释，并计数。

2.2.2待测样品对小鼠正常脾细胞的细胞毒作用

将上述脾细胞悬液按照每孔1×10⁶个细胞的浓度接种于96孔板上(180μL/孔)，空白组对照组每孔加入20μL含有5％ DMSO的PBS缓冲液，实验组每孔加入20μL终浓度为100μg/mL的待测样品，阳性对照组加入20μL终浓度为20μM的CsA或MMF。作用36h后，每孔加入25μL浓度为5mg/mL的MTT溶液。37℃培养箱孵育4h后，将96孔板3000r/min离心10分钟，弃上清，每孔加入100μL的DMSO溶剂，于摇床上避光慢速振摇15min，待甲瓒晶体完全溶解后，用酶标仪测定490nm处OD值。

细胞存活率计算公式为：存活率(％)＝给药组OD均值/空白对照组OD均值×100％。

2.2.3待测样品对ConA和LPS诱导T和B淋巴细胞增殖抑制作用

本实验利用ConA和LPS分别诱导T和B淋巴细胞增殖的体外模型来筛选测样品的免疫抑制活性。按上述方案制备得到裂解红细胞后的脾淋巴细胞悬浮液，然后将浓度为5×10⁵个细胞接种于96孔板上，每孔180μL，其中以不加ConA或LPS诱导剂作为非模型组；加入终浓度为5μg/mL的ConA或者10μg/mL LPS刺激剂的作为模型组，分别用以模拟T、B细胞增殖分化。在非模型组和模型组阴性对照组每孔加入20μL含有5％ DMSO的PBS缓冲液，在刺激剂组每孔加入20μL不同浓度的选测样品和阳性药(CsA或MMF)。在37℃含有5％ CO₂的培养箱中培养36h后，每孔加入25μL浓度为5mg/mL的MTT溶液。作用4h后，将96孔板3000r/min离心10分钟并弃上清，每孔加入100μL的DMSO，于摇床上避光慢速振摇15min，待甲瓒晶体完全溶解后，用酶标仪测定490nm处OD值。增殖抑制率计算公式为：增殖抑制率(％)＝(模型组阴性对照OD均值-测试组OD均值)/(模型组阴性对照OD均值-非模型组阴性对照OD均值)×100％，每个样品三个重复。

2.2.4、实验结果：结果如表2所示，毛棉杜鹃粗提物以及所有组分对小鼠正常脾细胞均无明显细胞毒作用。随后，根据免疫抑制活性导向分离策略，成功追踪到毛棉杜鹃粗提物的强活性流份，EADJ-H段，如表2所示，终浓度为100μg/mL的EADJ-H段流份对ConA诱导的小鼠T淋巴细胞和LPS诱导的小鼠B淋巴细胞增殖的抑制率分别为73.87％和56.97％；同时，终浓度为20μM的阳性药环孢霉素A(CsA)和霉酚酸酯(MMF)对T细胞和B细胞的增值率抑制率分别为91.48％和70.56％。此结果表明：毛棉杜鹃的EADJ-H段具有显著的免疫抑制活性作用。因此，本发明为研究与开发新型的免疫抑制剂提供了候选研究材料，同时也为开发利用毛棉杜鹃资源提供了科学依据。

表2对小鼠淋巴细胞的细胞毒作用以及对ConA(5μg/mL)和LPS(10μg/mL)诱导的小鼠淋巴细胞增殖的免疫抑制作用

注：数据均表示为平均值±SD(n＝3)，CsA为T细胞增殖模型的阳性对照药，MMF为B细胞增殖模型的阳性对照药，NT表示未测试。

Claims (7)

1.一种具有免疫抑制功能的毛棉杜鹃提取物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

将新鲜毛棉杜鹃花用乙醇或乙醇水溶液浸提，提取液经浓缩后得到毛棉杜鹃花提取浸膏，即为毛棉杜鹃提取物。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，是将毛棉杜鹃花提取浸膏依次用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取，随后将萃取液减压浓缩，得到毛棉杜鹃的四个不同极性部位，分别为：石油醚部位，乙酸乙酯部位，正丁醇部位，水部位，乙酸乙酯部位即为毛棉杜鹃提取物。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，将乙酸乙酯部位用石油醚-乙酸乙酯作为洗脱剂，以体积比20:1，10:1，5:1，3:1，1:1，1:3，0:1进行梯度洗脱，收集流份，流份用TLC薄层层析，以石油醚：乙酸乙酯＝30:1-1:1，v/v作为展开剂，收集石油醚：乙酸乙酯＝2：1，Rf＝0.5-0.6，硫酸乙醇显暗红色斑点的成分，即为毛棉杜鹃提取物。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的将新鲜毛棉杜鹃花用乙醇或乙醇水溶液浸提，提取液经浓缩后得到毛棉杜鹃花提取浸膏是将新鲜毛棉杜鹃花进行冷冻干燥，粉碎，采用95％的乙醇在温度60℃，料液比1:10g/ml的条件下，进行冷凝回流提取，过滤收集提取液，提取液进行真空、减压浓缩，得到毛棉杜鹃花提取浸膏。

5.一种按照权利要求1、2、3或4所述的制备方法得到的毛棉杜鹃提取物。

6.权利要求5所述的毛棉杜鹃提取物在制备免疫抑制剂中的应用。

7.一种免疫抑制剂，其特征在于，包括权利要求5所述的毛棉杜鹃提取物作为活性成分。