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CN119215193A - 利用环糊精类化合物制备抗体-药物偶联物的方法 - Google Patents

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CN119215193A
CN119215193A CN202411353599.7A CN202411353599A CN119215193A CN 119215193 A CN119215193 A CN 119215193A CN 202411353599 A CN202411353599 A CN 202411353599A CN 119215193 A CN119215193 A CN 119215193A
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CN
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antibody
buffer system
cyclodextrin
drug
tris
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CN202411353599.7A
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王泽坤
毛威芃
李雨鑫
原玉洁
范启睿
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Shanghai Yaoming Helian Biotechnology Co ltd
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Shanghai Yaoming Helian Biotechnology Co ltd
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Abstract

本文提供一种抗体‑药物偶联物的制备方法，包括：(a)在过渡金属离子存在的情况下，用还原剂处理抗体；和(b)在大环类化合物存在的情况下，使连接子‑药物中间体与步骤(a)中获得的经还原的抗体偶联。

Description

利用环糊精类化合物制备抗体-药物偶联物的方法
技术领域
本发明涉及生物医药领域，具体涉及利用大环类化合物制备抗体-药物偶联物的方法。
背景技术
抗体-药物偶联物(antibody drug conjugate，ADC)由与在靶细胞表面表达、且能向细胞内化的抗原结合的抗体上连接具有细胞毒性的药物得到，包含抗体、连接子和细胞毒性药物。其中，抗体部分将抗体-药物偶联物精准递送至靶细胞表面，连接子部分负责在靶细胞内或表面释放细胞毒性药物，且在血液循环系统中保持稳定，从而促进释放的细胞毒性药物在靶细胞内蓄积，并杀死靶细胞。因其在多个适应症上展现出卓越的临床特性，当前ADC已成为肿瘤学领域的关键治疗方式，未来市场规模预计将持续增长。
在现有用于制备抗体偶联药物的方法中，通常需采用大量有机溶剂(含量可高达20vol％)以使连接子-药物在反应体系中更好地溶解。而大量的有机溶剂的引入会使后续的纯化变得困难，例如：溶解半透膜，使蛋白质在填料表面的吸附变得困难等。生产上可以稀释反应液以使有机溶剂水平回归至纯化设备可以耐受的范围之内，但这意味着纯化设备需要处理的液体量大幅增加，对应的废液量将以同样的幅度增加以满足纯化效果。此外，使用部分连接子-药物进行偶联时，高含量有机溶剂通常会导致所得混合物中的D6比例较高，对产品质量有较大影响。
因此，希望能提供一种改进的抗体-药物偶联物的制备方法，在降低有机溶剂用量而提高生产效率的同时，改善生产所需抗体-药物偶联物的同质性。
发明内容
发明人通过长期探索实践，提出了一种制备抗体-药物偶联物的方法，其能够大幅降低生产过程中的有机溶剂用量，改善生产所需抗体-药物偶联物的同质性，生产过程经济高效、环境友好。
本文在一个方面中提供一种抗体-药物偶联物的制备方法，包括：
(a)在过渡金属离子存在的情况下，用还原剂处理抗体；和
(b)在大环类化合物存在的情况下，使连接子-药物中间体与步骤(a)中获得的经还原的抗体偶联。
本文在另一个方面中提供大环类化合物用于改善生产的抗体-药物偶联物的同质性的用途。
本文在另一个方面中提供大环类化合物用于通过降低抗体-药物偶联物的生产过程中的有机溶剂用量以提高生产效率的用途。
附图说明
下面结合附图对本发明作进一步说明，其中这些显示仅为了图示说明本发明的实施方案，而不是为了局限本发明的范围。
图1示出了不同有机溶剂含量下制备抗体药物偶联物Herceptin-Dxd(DAR＝4)的HIC谱图。(a)为比较例1-1，有机溶剂终含量20vol％；(b)为实验例1-2，有机溶剂终含量3.6vol％。
图2示出了不同有机溶剂含量下制备衍生自不同抗体的抗体药物偶联物(DAR＝4)的HIC谱图。分图(a)-(b)是抗体药物偶联物Daratumumab-Dxd的HIC谱图，其中(a)为比较例2-1，有机溶剂终含量20vol％；(b)为实验例2-2，有机溶剂终含量3.6vol％。分图(c)-(d)是抗体药物偶联物Cetuximab-Dxd的HIC谱图，其中(c)为比较例2-3，有机溶剂终含量20vol％；(d)为实验例2-4，有机溶剂终含量3.6vol％。
图3示出了不同有机溶剂含量下以多种连接子-药物中间体制备抗体药物偶联物(DAR＝4)的HIC谱图。分图(a)是以连接子-药物中间体Herceptin-GGFG-Exatecan制备抗体药物偶联物(实验例3-3)的HIC谱图，其使用本发明所述方法制备，有机溶剂终含量3.6vol％。分图(b)-(c)是所制备的Herceptin-CL2A-SN38(DAR值约为4)的去卷积质谱，其中(b)为比较例3-1，有机溶剂终含量20vol％；(c)为实验例3-2，有机溶剂终含量3.6vol％。
图4示出了以多种环糊精类化合物降低有机溶剂含量来制备抗体药物偶联物Herceptin-Dxd(DAR＝4)的HIC谱图。分图(a)和(b)分别对应利用羟丙基-α-环糊精(实验例4-1)和α-环糊精(实验例4-2)降低有机溶剂含量来制备的抗体药物偶联物Herceptin-Dxd(DAR＝4)的HIC谱图，其中有机溶剂终含量3.6vol％。
具体实施方式
本申请中科技术语的含意与本领域技术人员的普遍理解一致，除非另做说明。本申请中，“一”或其与各种量词的组合既包括单数含意也包括复数含意，除非特别说明。本申请中，对于同一参数或变量，当给出多个数值、数值范围、或其组合予以说明时，相当于具体揭示了这些数值、范围端值以及由它们任意组合而成的数值范围。本申请中，任一数值不论是否带有“约”之类的修饰词，一律涵盖本领域技术人员能够理解的约略范围，例如正负10％、5％等。本文中，每一“实施方式”均同等地指代且涵盖了本申请各项方法和各项系统的实施方式。本申请中，任意实施方式中一项或多项技术特征可以与任何一个或多个其他实施方式中的一项或多项技术特征自由组合，由此得到的实施方式同样属于本申请公开的内容。
ADC偶联技术大致可以分为两种类别，一类是由抗体序列中具反应活性的天然氨基酸残基(例如表面赖氨酸的侧链氨基和链间二硫键还原后的巯基)介导的偶联技术；另一类则是通过化学修饰、基因工程改造技术或者酶修饰等手段在抗体特定位点引入可供反应的基团，再偶联细胞毒性药物来实现特定位点偶联(例如工程改造的半胱氨酸定点插入、非天然氨基酸定点插入、酶介导以及N-糖链介导的偶联技术)。
由于链间二硫键还原后的巯基具备极强的亲核性，使其成为特殊的生物偶联媒介。但在将连接子-药物中间体偶联至巯基时，需在反应体系中采用高含量有机溶剂保证连接子-药物中间体的溶解度，这可能影响连接子-药物中间体的反应活性，且会增加抗体-药物偶联物的纯化难度，导致生产过程延长、目标产物得率低、资源消耗增加，从而限制了ADC的产业化。
发明人通过长期探索实验，提出了一种制备抗体-药物偶联物的改进方法，其能够提高生产所得抗体-药物偶联物的同质性，并大幅降低生产过程中的有机溶剂用量，使生产过程对环境更加友好。
定义
本文中，术语“抗体”指由4条多肽链构成的Y形四聚蛋白，其包含两个重(H)多肽链及两个轻(L)多肽链，所述多肽链由共价二硫键及非共价键相互作用结合在一起。
人类轻链包含可变结构域(VL)及恒定结构域(CL)，其中恒定结构域可基于氨基酸序列及基因座容易地分类为κ或λ。各重链包含一个可变结构域(VH)及一个恒定区，该恒定区在IgG、IgA及IgD情况下包含三个名为CH1、CH2及CH3的结构域(IgM及IgE具有第四个结构域CH4)。在IgG、IgA及IgD类别中，CH1及CH2结构域是由柔性铰链区分离，该柔性铰链区为具有可变长度(在IgG中通常为约10个至约60个氨基酸)的富含脯氨酸及半胱氨酸的区段。轻链及重链中的可变结构域通过具有约12个或更多个氨基酸的“J”区域与恒定结构域接合，且重链亦具有“D”区域，其具有约10个附加的氨基酸。
就本发明的ADC而言，“抗体”一词包括抗体片段，例如Fab片段、Fab'片段、F(ab')2片段、Fv片段和scFv片段。并且，“抗体”一词延伸包括功能等同物，例如特异性识别并结合靶分子(如抗原，例如肿瘤抗原)的配体和结合蛋白，受体或靶细胞(如疾病相关细胞，例如癌细胞或肿瘤细胞)上的其他表面分子，只要这些等同分子具备或可经改性而具备能够与连接子的马来酰胺基团反应从而与之共价结合的官能团。一些实施方式中，所述官能团是硫醇基团，例如链间二硫键还原释放的那些硫醇基，抗体可由此通过硫-马来酰胺连接键与连接子部分偶联。
各类别的抗体进一步包含由配对半胱氨酸残基形成的链间二硫键和链内二硫键。
本文中，术语“链间二硫键”指位于抗体中的两条重链之间的二硫化物(重链-重链间二硫键)或位于抗体中的重链和轻链之间的二硫化物(重链-轻链间二硫键)。
链间二硫键的位置和数量根据免疫球蛋白类别和种类而有所不同。本文并不限于抗体的任何特定类别或亚类，IgG1免疫球蛋白应仅用于说明目的。链间二硫键位于免疫球蛋白的表面上，是可接触溶剂的，并且通常相对容易还原。在人IgG1同种型中，有四个链间二硫键，两个在各重链-轻链之间，两个在重链-重链之间。链缔合不需要链间二硫键。重链中富含半胱氨酸的IgG1铰链区通常保持为由三部分组成：上部铰链(Ser-Cys-Asp-Lys-Thr-His-Thr)，核心铰链(Cys-Pro-Pro-Cys)，和下部铰链(Pro-Ala-Glu-Leu-Leu-Gly-Gly)。本领域技术人员将理解，该IgG1铰链区含有重链中的半胱氨酸，所述重链包含四个链间二硫键，其提供有利于Fab运动的结构柔性。
本文中，术语“链间巯基”和“链间硫醇基”可互换使用，其指通过还原抗体的链间二硫键而获得的巯基。
本文中，术语“药物”指元素、化合物、试剂或分子实体，包括例如药物、治疗剂或药物化合物。
本文中，术语“连接子”指连接药物和抗体的反应性分子。具体地，连接子含有至少两个反应性基团，其中一个可以共价键合至药物并且另一个可以共价偶联至抗体。
文本中，术语“连接子-药物中间体”指“药物”和“连接子”偶联物。
本文中，术语“抗体-药物偶联物”和“ADC”可互换使用，指以任何给定比率包含由两个药物连接子结合的抗体-药物偶联物、由四个药物连接子结合的抗体-药物偶联物、由六个药物连接子结合的抗体-药物偶联物、由八个药物连接子结合的抗体-药物偶联物以及未由任何药物连接子结合的抗体的组合物。
本文中，术语“DAR(药物：抗体比率)”和“结合药物的数目”可互换使用，指抗体-药物偶联物中结合单个抗体分子的药物的数目。
本文中，术语“大环类化合物”指12元环或以上的环状有机化合物。一般而言，用于本文所述方法的大环类化合物需包括一个疏水的有限空腔和亲水的外表面。典型地，所述大环类化合物可包括不同尺寸的环糊精类化合物，及其化学修饰形式。
一方面，本文提供一种抗体-药物偶联物的制备方法，包括：
(a)在过渡金属离子存在的情况下，用还原剂处理抗体；和
(b)在大环类化合物存在的情况下，使连接子-药物中间体与步骤(a)中获得的经还原的抗体偶联。
1.抗体的还原
一般而言，对于本文中应用的抗体没有特别限制，本领域技术人员可根据需要选择适当抗体。
在一些实施方式中，抗体可具有以下特性中的一种或多种：能识别靶细胞、能经由抗原(例如肿瘤相关抗原(TAA))、病毒抗原或微生物抗原)特异性结合于靶细胞、能进入靶细胞而内化以及损伤靶细胞。在一些具体实施方式中，抗体具有抗体依赖性细胞介导的吞噬作用(ADCP)活性或具有体内抗肿瘤、抗病毒或抗微生物活性。
在一些实施方式中，抗体是抗毒素、抗菌抗体、抗病毒抗体或亲细胞抗体。
在一些实施方式中，抗体选自多无性繁殖系抗体(polyclonal antibody)、多克隆抗体(multiclonal antibody)、单克隆抗体、嵌合抗体、人源化及灵长类动物化(primatized)抗体、CDR移植抗体、人类抗体、以重组方式产生的抗体、细胞内抗体、多特异性抗体、双特异性抗体、单价抗体、多价抗体、抗个体基因型抗体、合成抗体(包括突变蛋白质及其变体)、免疫特异性抗体片段(例如Fd、Fab、F(ab’)2、F(ab’)片段)、单链片段(例如ScFv及ScFvFc)；及其衍生物，包括Fc融合物及其他修饰，及任何其他免疫应答性分子。在一些实施方式中，抗体是单克隆抗体或多克隆抗体。在另一些实施方式中，抗体是单克隆抗体(例如，人类抗体或人源化抗体)。在又一些实施方式中，抗体是IgG1单克隆抗体或IgG4单克隆抗体。
在一些实施方式中，抗体可选自IgA、IgD、IgE、IgG、IgM及IgY中的任一类，例如IgG。在一些实施方式中，抗体选自亚类IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。在一些实施方式中，抗体选自IgG1和IgG4，例如IgG1。在一些具体的实施方式中，抗体是IgG1单克隆抗体，例如但不限于Herceptin(曲妥珠单抗)、Rituxan(利妥昔单抗)、Daratumumab(达雷妥尤单抗)、Cetuximab(西妥昔单抗)。
本文所述抗体可以根据本领域已知的方法产生。
抗体的还原可通过在过渡金属离子存在的情况下，用还原剂处理抗体来进行。该过程能使抗体结构中的二硫键(如Fab区的链间二硫键)被选择性地还原成巯基，以供与连接子-药物偶联。
在一些实施方式中，抗体的还原可以通过使抗体与还原剂在-10℃至37℃的温度反应来产生，例如-10℃、-5℃、0℃、5℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、37℃，或以其中任意两值为端点形成的温度范围。
在一些实施方式中，还原剂的量是0.04mM-0.4mM，例如0.1mM或0.24mM。
在一些实施方式中，还原剂可以是三(2-羧乙基)膦(TCEP)或其盐、二硫苏糖醇(DTT)或2-巯基乙醇(2-ME)、三(3-羟丙基)膦(THPP)、2-二苯基膦基苯磺酸(diPPBs)、二硫赤藓醇(DTE)、LiAlH4、Na2S2O3、KBH4或肼。在一些具体实施方式中，还原剂可以是三(2-羧乙基)膦或其盐。
抗体的还原可在缓冲体系中进行。在一些实施方式中，可用的缓冲体系可包括，例如N-三(羟甲基)甲基-3-氨基丙磺酸缓冲体系(TAPS)、N,N-双(2-羟乙基)甘氨酸缓冲体系(Bicine)、三羟甲基氨基甲烷缓冲体系(Tris)、N-三(羟甲基)甲基甘氨酸缓冲体系(Tricine)、N-三(羟甲基)甲基-2-氨基乙烷磺酸缓冲体系(TES)、3-(N-吗啉基)丙磺酸缓冲体系(MOPS)、哌嗪-1,4-二乙磺酸缓冲体系(PIPES)、组氨酸缓冲体系、磷酸盐缓冲体系(PBS)、硼酸盐缓冲体系(BBS)、乙酸盐缓冲体系(TAE)、(4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸)缓冲体系(HEPES)及其组合。在一些具体实施方式中，抗体的还原在磷酸盐缓冲体系(如PBS)中进行。
抗体的还原中还采用过渡金属离子，以产生在二硫键还原中的选择性。在一些实施方式中，过渡金属离子源自第一到第三过渡系的金属元素，具体地，源自第二到第五主族中的金属元素。在一些具体实施方式中，过渡金属离子源自除碱金属外的其他金属离子。在一些更具体的实施方式中，过渡金属离子源自第一过渡系金属、镓、锗、铟、锡、铋。
在另一些实施方式中，过渡金属离子还可以源自过渡金属盐。所述过渡金属离子可以包括但不限于Zn2+、Cd2+、Hg2+、Mn2+、Ni2+、Fe2+、Fe3+和Cu2+。
在一些实施方式中，用于抗体的还原的过渡金属离子的浓度是0.01mM-0.2mM。
抗体的还原可持续1至15小时，例如1、3、5、7、9、11、13、15小时，或以其中任意两值为端点形成的时长范围。
抗体的还原可在pH 5至9，例如pH 5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9，或以其中任意两值为端点形成的pH范围进行。
2.抗体与连接子-药物中间体的偶联
抗体与连接子-药物中间体的偶联通过使经还原的抗体与连接子-药物中间体溶液接触来进行。通常，为使连接子-药物中间体更好地溶解，会采用大量的有机溶剂(浓度可高达20vol％)来制备连接子-药物中间体溶液，这进而会引发后续纯化过程中的问题，例如半透膜溶解、蛋白质难以吸附至填料表面等。研究发现，利用大环类化合物替代大部分有机溶剂，不仅能大幅降低有机溶剂用量，省去大量后处理操作，还能提高所需DAR值的抗体药物偶联物的生产效率，改善产品质量。
具体地，将含有大环类化合物的连接子-药物中间体溶液添加至经还原的抗体，以使它们彼此反应以偶联。
在一些实施方式中，可使经还原处理的抗体与过量的连接子-药物中间体接触(例如混合)以进行偶联。
在一些实施方式中，连接子-药物中间体以不小于抗体浓度4倍的浓度使用。在一些实施方式中，连接子-药物中间体可以0.03mM-0.30mM的量使用，例如以0.03、0.06、0.09、0.12、0.15、0.18、0.21、0.24、0.27、0.30mM，或以其中任意两值为端点形成的浓度范围的量使用。
在一些实施方式中，大环类化合物包括但不限于卟啉、冠醚、柱芳烃以及环糊精和杯芳烃。
在一些具体的实施方式中，大环类化合物是环糊精类化合物。
本文中，“环糊精”或“环糊精类化合物”可互换使用，其指具有至少五个通过α(1-4)键而连接的吡喃葡糖单元的环状麦芽低聚糖。环糊精分子的特征为一种刚性的、截短圆锥形的分子结构，该结构具有特定体积的一个空心的内部、或孔。“环糊精”或“环糊精类化合物”还可以包括环糊精衍生物、或一种或多种环糊精的共混物。在一些具体的实施方式中，环糊精类化合物选自α-、β-、γ-环糊精及其组合；其中α-环糊精具有六个葡萄糖残基；β-环糊精具有七个葡萄糖残基；而γ-环糊精具有八个葡萄糖残基。更具体地，环糊精类化合物选自α-环糊精、羟丙基-α-环糊精、羟丙基-β-环糊精、β-环糊精、羟丙基-γ-环糊精，及其组合。
在一些实施方式中，大环类化合物(如环糊精类化合物)在偶联步骤(如步骤(b))中使用的浓度可以是0.1-50mM，例如0.1、0.2、0.24、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50mM，或以其中任意两值为端点形成的浓度范围添加。
在一些实施方式中，合适的连接子选自可裂解连接子和不可裂解连接子。可裂解连接子通常易于在细胞内条件下裂解。合适的可裂解连接子包括例如可被细胞内蛋白酶(例如溶酶体蛋白酶或内体蛋白酶)裂解的肽连接子。在示例性实施方式中，连接子可以是二肽连接子，例如缬氨酸-瓜氨酸(val-cit)或苯丙氨酸-赖氨酸(phe-lys)连接子。其他合适的可裂解连接子包括二硫键连接子。
在一些具体的实施方式中，连接子可以包括用于与蛋白质连接的基团。例如，连接子可以包括氨基、羟基、羧基或巯基反应基团(例如马来酰亚胺、卤代乙酰胺(例如碘、溴或氯)、卤代酯(例如碘、溴或氯)、卤代甲基酮(例如碘、溴或氯)、苄基卤化物(例如碘、溴或氯)、乙烯基砜和吡啶硫基)。
本文中使用的药物没有特别限制，只要其为具有所需作用(例如，细胞毒性、细胞抑制、免疫抑制或标记作用)且还具有能够与连接子结构结合的取代基或部分结构的化合物。本文中，包含该药物和该连接子部分的药物连接子也可被称为“药物”。
在一些实施方式中，药物选自细胞毒性剂或细胞抑制剂、免疫抑制剂、放射性同位素、毒素、标记剂、荧光剂(例如胺衍生的荧光探针诸如5-二甲基氨基萘-1-(N-(2-氨基乙基))磺酰胺-丹酰乙二胺、Oregon 488尸胺(cada verine)(例如，目录号O-10465，Molecular Probes)、丹磺酰尸胺、N-(2-氨乙基)-4-氨基-3,6-二硫-l,8-萘亚胺、二钾盐(荧光黄乙二胺)、罗丹明B乙二胺(例如，目录号L-2424，Molecular Probes)、巯基衍生化荧光探针例如FLL-半胱氨酸(例如，目录号B-20340，Molecular Probes))，及其组合。在一些示例性的实施方式中，所述药物可以是细胞毒性剂，例如，卡利霉素、双卡霉素、PBD、DXd、SN38、MMAE、MMAF、美登素衍生物(如DM2和DM4)。
本文中使用的连接子-药物中间体没有特别限制，只要其为能够与抗体的链间巯基反应的化合物，从而使抗体偶联连接子-药物中间体。在一些实施方式中，所述与抗体的链间巯基反应的化合物具有选自下组的亲电基团：(i)马来酰亚胺基团，(ii)活化的二硫化物，(iii)活性酯，例如NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)酯，HOBt(N-羟基苯并三唑)酯，卤代甲酸酯，和酰卤；(iv)烷基和苯甲基卤化物，例如卤代乙酰胺；及(v)醛类，酮类，羧基。在一些具体的实施方式中，所述化合物是有机溴化物、碘化物、砜类化合物、及其他带有缺电子基团的烯、炔类化合物。然而，本文使用的连接子-药物中间体不限于此描述的化合物，并且所有类型的药物连接子中间体可以应用于本发明所述方法，只要它们具有用于促进与抗体的链间巯基反应的官能团。可以通过用含巯基试剂来使未反应的连接子-药物中间体的反应性失活来终止偶联反应。
作为此含巯基试剂，例如可以使用半胱氨酸或N-乙酰基半胱氨酸。更具体地，偶联反应可以通过如下来终止：将N-乙酰基半胱氨酸以0.1mM-1.0mM的量添加至所用的连接子-药物中间体，例如以0.1、0.2、0.24、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0mM或以其中任意两值为端点形成的浓度范围添加。
可使连接子-药物中间体在溶剂中初步溶解。连接子用于该初步溶解的溶剂的实例包括有机溶剂，例如丙酮水溶液、乙醇水溶液、甲醇水溶液、异丙醇水溶液、二甲亚砜水溶液、二甲亚砜(DMSO)、二甲基甲酰胺(DMF)、二甲基乙酰胺(DMA)和N-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)。在一些具体实施方式中，所述溶剂是二甲亚砜(DMSO)。随后，向初步溶解的连接子-药物中间体添加大环类化合物，形成其中有机溶剂含量不高于5vol％的连接子-药物中间体溶液。
在一些实施方式中，大环类化合物(如环糊精类化合物)与抗体的摩尔比在约10:1-1000:1的范围内，例如，大环类化合物(如环糊精类化合物)与抗体的摩尔比为：约10:1、60:1、110:1、160:1、210:1、260:1、310:1、360:1、410:1、460:1、510:1、560:1、610:1、660:1、710:1、760:1、810:1、860:1、910:1、960:1、1000:1，或以其中任意值为端点形成的范围。在一些具体实施方式中，大环类化合物(如环糊精类化合物)与抗体的摩尔比在约20:1-1000:2的范围内，更具体地在约30:1-1000:3的范围内。
抗体与连接子-药物中间体的偶联可在-10℃至37℃的温度，例如-10℃、-5℃、0℃、5℃、10℃、12℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、37℃或以其中任意两值为端点形成的温度范围进行。
抗体与连接子-药物中间体的偶联时间可为0.5至2小时，例如以0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、16、1.7、1.8、1.9、2.0小时或以其中任意两值为端点形成的时间范围进行。
3.后处理
在一些实施方式中，所述方法可进一步包括：添加有效量的氧化剂，以使步骤(b)中未反应的巯基再氧化。
在一些实施方式中，氧化剂选自：5,5'-二硫代双-2-硝基苯甲酸、4,4'-二硫代二吡啶、2,2'-二硫代二吡啶、连四硫酸钠、脱氢抗坏血酸(DHAA)，及其组合。在一些具体的实施方式中，氧化剂是DHAA。在一些的实施方式中，反应溶液中氧化剂的添加浓度大于抗体浓度。在具体的实施方式中，所述氧化剂浓度可以是0.08mM–0.8mM，例如0.08mM、0.16mM、0.24mM、0.32mM、0.40mM、0.48mM、0.56mM、0.64mM、0.72mM、0.8mM或以其中任意两值为端点形成的浓度范围。
在一些实施方式中，所述方法可进一步包括：纯化所述抗体-药物偶联物。
在一些实施方式中，纯化步骤中用于纯化抗体-药物偶联物的方法选自切向流过滤(TFF)(例如，超滤渗滤(UFDF))和层析(例如，尺寸排阻色谱(SEC)、疏水色谱(HIC)、羟基磷灰石层析(HA)以及膜层析(MC))。在一些具体实施方式中，抗体-药物偶联物采用脱盐柱或尺寸排阻色谱进行纯化。
在进一步的实施方式中，纯化步骤中使用螯合剂以去除过渡金属离子。在一些实施方式中，螯合剂选自：氨基羧酸类、有机膦酸类、羟基羧酸类、氨基酸类、聚羧酸类、聚磷酸盐类，及其组合。在一些具体的实施方式中，螯合剂的实例包括乙二胺四乙酸(EDTA)和二乙烯三胺五乙酸(DTPA)。其中，优选乙二胺四乙酸(EDTA)。
在一些实施方式中，所述方法可进一步包括：回收所述抗体-药物偶联物。
另一方面，本文还提供大环类化合物用于改善生产的抗体-药物偶联物的同质性的用途。
另一方面，本文还提供大环类化合物用于通过降低抗体-药物偶联物的生产过程中的有机溶剂用量以提高生产效率的用途。
实施例
以下实施例仅用于说明，不对本发明范围构成限制。
实施例1：有机溶剂含量对抗体-药物偶联物的药物分布的影响
1.1方法
制备抗体-药物偶联物Herceptin-Dxd(DAR＝4)
按照以下方法制备比较例1-1，具体步骤如下：
(1)向在磷酸盐缓冲剂(pH 7，20mM)中的Herceptin溶液(0.03mM)添加ZnCl2(0.12mM)和TCEP(0.1mM)，所得反应混合物在12℃静置过夜；
(2)引入在DMSO中的MC-GGFG-Dxd(终含量为0.3mM；购自药明康德，添加DMSO使有机溶剂终含量为15vol％，在12℃持续反应1小时；
(3)添加N-乙酰基半胱氨酸(0.24mM)以耗竭过量MC-GGFG-Dxd；
(4)添加EDTA(0.24mM)以捕获Zn2+，并添加DHAA(0.24mM)以氧化过量巯基；
(5)使用脱盐柱(40K，0.5mL)(购自Thermo Fisher，货号87766，批次号SJ251704)纯化反应混合物。
按照以下方法制备实验例1-2，与制备比较例1-1的方法相比，其不同之处在于将步骤(2)更改为：
(2)’引入在DMSO中的MC-GGFG-Dxd(终含量为0.12mM；购自药明康德)，添加羟丙基-β-环糊精(0.6mM，购自ROQUETTE)，有机溶剂终含量为3.6vol％，在12℃持续反应1小时。
同质性测定
使用HIC-HPLC分析所得抗体-药物偶联物的药物/抗体比率(DAR)和产物分布。在Butyl-NPR HPLC柱(购自TOSOH BIOSCIENCE，L x I.D 3.5cm x 4.6mm，2.5μm)上以0.6mL/分钟的流速在环境温度下通过疏水相互作用色谱法(HIC)进行各组分的纯化分析。进样量为50μg，溶剂A为1.5M Na2SO4和50mM Na3PO4(pH 7)。溶剂B为25％v/v异丙醇和75％v/v 50mM Na3PO4(pH 7)。不同DAR值的物质通过顺序的分级梯度先后洗脱。
1.2结果
结果显示在表1中，对应图示见于图1。
表1
如表1所示，相较于比较例1-1，经由本发明所述方法所制备的实验例1-2的平均DAR值更接近4，且DAR4组分的含量更高，作为主要的副产物的DAR6组分大幅减少。即在添加羟丙基-β-环糊精以减少生产过程中有机溶剂含量的情况下，连接子-药物中间体可以与抗体充分发生反应，且经由本发明方法所制备的抗体-药物偶联物具有更佳的质量。
实施例2：有机溶剂含量对衍生自不同抗体的抗体-药物偶联物的影响
本实施例中，制备衍生自Cetuximab和Daratumumab(均购自药明生物)的抗体-药物偶联物。
2.1方法
以抗体Daratumumab和Cetuximab分别制备抗体-药物偶联物(DAR＝4)
按照以下方法制备比较例2-1和比较例2-3，具体步骤如下：
(1)向在磷酸盐缓冲剂(pH 7，20mM)中的Daratumumab溶液和Cetuximab溶液(0.03mM)分别添加ZnCl2(0.12mM)和TCEP(0.1mM)，所得反应混合物在12℃静置过夜；
(2)向比较例2-1和比较例2-3中分别引入在DMSO中的MC-GGFG-Dxd(终含量为0.3mM；购自药明康德)，添加DMSO使有机溶剂终含量为20vol％，在12℃持续反应1小时；
(3)添加N-乙酰基半胱氨酸(0.24mM)以耗竭过量MC-GGFG-Dxd；
(4)添加EDTA(0.24mM)以捕获Zn2+，并添加DHAA(0.24mM)以氧化过量巯基；
(5)使用脱盐柱(40K，0.5mL)(购自Thermo Fisher，货号87766，批次号SJ251704)纯化反应混合物。
如本文所述方法制备分别衍生自Daratumumab和Cetuximab的实验例2-2和实验例2-4，与制备比较例2-1和比较例2-3的方法相比，其不同之处在于将步骤(2)更改为：
(2)’向实验例2-2和实验例2-4中分别引入在DMSO中的MC-GGFG-Dxd(终含量为0.12mM；购自药明康德)，添加羟丙基-β-环糊精(10mM，购自ROQUETTE)，有机溶剂终含量为3.6vol％，在12℃持续反应1小时。
同质性分析
使用HIC-HPLC分析所得抗体-药物偶联物的药物/抗体比率(DAR)和产物分布。在Butyl-NPR HPLC柱(购自TOSOH BIOSCIENCE，L x I.D 3.5cm x 4.6mm，2.5μm)上以0.6mL/分钟的流速在环境温度下通过疏水相互作用色谱法(HIC)进行各组分的纯化分析。进样量为50μg，溶剂A为1.5M Na2SO4和50mM Na3PO4(pH 7)。溶剂B为25％v/v异丙醇和75％v/v 50mM Na3PO4(pH 7)。不同DAR值的物质通过顺序的分级梯度先后洗脱。
2.2结果
结果显示在表2中，对应图示见于图2。
表2
如表2所示，添加羟丙基-β-环糊精以减少有机溶剂含量的环境适于制备衍生自Daratumumab和Cetuximab的抗体-药物偶联物。且相较于比较例2-1和比较例2-3，经由本发明所述方法所制备的实验例2-2和实验例2-4的平均DAR值更接近目标DAR值4，且DAR4组分更多。
实施例3：有机溶剂含量对连接子-药物中间体的影响
本实施例中，以喜树碱类连接子-药物中间体MC-GGFG-Exatecan(购自MCE，货号HY-114233)、CL2A-SN38(购自MCE，货号HY-128946)制备抗体-药物偶联物。
3.1方法
以不同连接子-药物中间体制备抗体-药物偶联物Herceptin-SN38/Herceptin- GGFG-Exatecan(DAR＝4)
按照以下方法制备比较例3-1，具体步骤如下：
(1)向在磷酸盐缓冲剂(pH 7，20mM)中的Herceptin溶液(0.03mM)添加ZnCl2(0.12mM)和TCEP(0.1mM)，所得反应混合物在12℃静置过夜；
(2)引入在DMSO中的CL2A-SN38(终含量为0.3mM；购自MCE，结构为
)，添加DMSO使有机溶剂终含量为20vol％，在12℃持续反应1小时；
(3)添加N-乙酰基半胱氨酸(0.24mM)以耗竭过量MC-GGFG-CL2A-SN38；
(4)添加EDTA(0.24mM)以捕获Zn2+，并添加DHAA(0.24mM)以氧化过量巯基；
(5)使用脱盐柱(40K，0.5mL)(购自Thermo Fisher，货号87766，批次号SJ251704)纯化反应混合物。
按照以下方法制备实验例3-2和实验例3-3，与制备比较例3-1的方法相比，其不同之处在于，对于实验例3-3，将CL2A-SN38换为MC-GGFG-Exatecan并且对于实验例3-2和实验例3-3，将步骤(2)更改为：
(2)’引入在DMSO中的MC-GGFG-Exatecan/CL2A-SN38(终含量为0.12mM；购自MCE)，添加羟丙基-β-环糊精(10mM，购自ROQUETTE)，有机溶剂终含量为3.6vol％，在12℃持续反应3小时。
同质性分析
使用HIC-HPLC分析所得抗体-药物偶联物的药物/抗体比率(DAR)和产物分布。在Agilent PLRP-S柱(购自安捷伦科技公司，货号PL1312-1502)上以0.6mL/分钟的流速在环境温度下通过疏水相互作用色谱法(HIC)进行各组分的纯化分析。以TCEP完全还原后进样，进样量为3μg，溶剂A为0.05％(v/v)TFA的水溶液。溶剂B为0.05％(v/v)TFA的乙腈溶液。不同DAR值的物质通过顺序的分级梯度先后洗脱。由于还原质谱的特性，仅展示根据重链信号计算出的D4％与D6％和平均DAR值。
3.2结果
结果显示在表3中，对应图示见于图3中。
表3
如表3所示，添加羟丙基-β-环糊精来减少有机溶剂含量的环境适于以喜树碱类连接子-药物中间体制备抗体-药物偶联物。且相较于比较例3-1，经由本发明所述方法所制备的实验例3-2的平均DAR值更接近目标DAR值4，DAR4组分更多，且作为主要的副产物的DAR6组分大幅减少。类似地，经由本发明所述方法所制备的实验例3-3的平均DAR值更接近目标DAR值4，DAR4组分量显著高于DAR6组分量。
实施例4：环糊精类化合物用于制备抗体-药物偶联物的普适性探究
本实施例采用环糊精类化合物羟丙基-α-环糊精(购自Sigma，货号390690)、α-环糊精(购自Sigma，货号778788)，探究在抗体-药物偶联物制备中以环糊精类化合物降低有机溶剂含量的适用性。
4.1方法
以环糊精类化合物制备抗体-药物偶联物Herceptin-Dxd(DAR＝4)
按照以下方法制备实验例4-1和实验例4-2，具体步骤如下：
(1)向在磷酸盐缓冲剂(pH 7，20mM)中的Herceptin溶液(0.03mM)添加ZnCl2(0.12mM)和TCEP(0.1mM)，所得反应混合物在12℃静置过夜；
(2)’引入在DMSO中的MC-GGFG-Dxd(0.3mM，商购自MCE)，向实验例4-1和实验例4-2中分别添加羟丙基-α-环糊精和α-环糊精(10mM，购自ROQUETTE)，有机溶剂终含量为3.6vol％，在12℃持续反应1小时。；
(3)添加N-乙酰基半胱氨酸(0.24mM)以耗竭过量MC-GGFG-Dxd；
(4)添加EDTA(0.24mM)以捕获Zn2+，并添加DHAA(0.24mM)以氧化过量巯基；
(5)使用脱盐柱(40K，0.5mL)(购自Thermo Fisher，货号87766，批次号SJ251704)纯化反应混合物。
同质性分析
使用HIC-HPLC分析所得抗体-药物偶联物的药物/抗体比率(DAR)和产物分布。在Butyl-NPR HPLC柱(购自TOSOH BIOSCIENCE，L x I.D 3.5cm x 4.6mm，2.5μm)上以0.6mL/分钟的流速在环境温度下通过疏水相互作用色谱法(HIC)进行各组分的纯化分析。进样量为50μg，溶剂A为1.5M Na2SO4和50mM Na3PO4(pH 7)。溶剂B为25％v/v异丙醇和75％v/v 50mM Na3PO4(pH 7)。不同DAR值的物质通过顺序的分级梯度先后洗脱。
4.2结果
结果显示在表4中，对应图示见于图4。
表4
如表4所示，添加环糊精类化合物(实验例4-1和实施例4-2分别对应羟丙基-α-环糊精和α-环糊精)以减少有机溶剂含量的环境适于制备抗体-药物偶联物。经由本发明所述方法所制备的实验例4-1和实验例4-2的平均DAR值更接近目标DAR值4，DAR4组分更多，且作为主要的副产物的DAR6组分大幅减少。

Claims (10)

1.一种抗体-药物偶联物的制备方法，包括：
(a)在过渡金属离子存在的情况下，用还原剂处理抗体；和
(b)在大环类化合物存在的情况下，使连接子-药物中间体与步骤(a)中获得的经还原的抗体偶联。
2.根据权利要求1所述的方法，其中在步骤(b)之后，所述方法进一步包括：(c)添加有效量的氧化剂，以使步骤(b)中未反应的巯基再氧化；更具体地，所述氧化剂选自下组：5,5'-二硫代双-2-硝基苯甲酸、4,4'-二硫代二吡啶、2,2'-二硫代二吡啶、连四硫酸钠、脱氢抗坏血酸(DHAA)，及其组合；具体地，氧化剂选自DHAA。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述抗体选自单克隆抗体、多克隆抗体，及其组合。
4.根据权利要3所述的方法，其中所述抗体是IgG1或IgG4亚型；具体地，所述抗体选自：曲妥珠单抗、利妥昔单抗、达雷妥尤单抗、西妥昔单抗，及其组合。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述过渡金属离子选自下组：Zn2+、Cd2+、Hg2+、Mn2+、Ni2+、Fe2+、Fe3+、Cu2+，及其组合；更具体地，选自Zn2+。
6.根据权利要求5所述的方法，其中步骤(a)在缓冲体系中进行；具体地，所述缓冲体系选自下组：N-三(羟甲基)甲基-3-氨基丙磺酸缓冲体系(TAPS)、N,N-双(2-羟乙基)甘氨酸缓冲体系(Bicine)、三羟甲基氨基甲烷缓冲体系(Tris)、N-三(羟甲基)甲基甘氨酸缓冲体系(Tricine)、N-三(羟甲基)甲基-2-氨基乙烷磺酸缓冲体系(TES)、3-(N-吗啉基)丙磺酸缓冲体系(MOPS)、哌嗪-1,4-二乙磺酸缓冲体系(PIPES)、组氨酸缓冲体系、磷酸盐缓冲体系(PBS)、硼酸盐缓冲体系(BBS)、乙酸盐缓冲体系(TAE)、(4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸)缓冲体系(HEPES)，及其组合；更具体地，磷酸盐缓冲体系(PBS)。
7.根据权利要求1所述的方法，其中所述还原剂选自下组：三(2-羧乙基)膦(TCEP)或其盐、二硫苏糖醇(DTT)、2-巯基乙醇(2-ME)、三(3-羟丙基)膦(THPP)、2-二苯基膦基苯磺酸(diPPBs)、二硫赤藓醇(DTE)、LiAlH4、Na2S2O3、KBH4、肼，及其组合；具体地，选自三(2-羧乙基)膦或其盐。
8.根据权利要求1所述的方法，其中所述大环类化合物包括：卟啉、冠醚、柱芳烃、环糊精、杯芳烃及其组合；具体地，所述大环类化合物是环糊精类化合物；更具体地，所述环糊精类化合物选自α-环糊精、羟丙基-α-环糊精、羟丙基-β-环糊精、β-环糊精、羟丙基-γ-环糊精，及其组合。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述环糊精类化合物与抗体的摩尔比为约10:1-1000:1，具体地为约20:1-1000:2，更具体地为约30:1-1000:3。
10.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(a)在-10℃至37℃的温度范围和pH5至9进行；进一步地，步骤(b)在-10℃至37℃的温度范围进行，持续0.5-2小时。
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