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CN119193509A - 一种苹果漆酶lac3基因及其在提高植物抗蚜中的应用 - Google Patents

一种苹果漆酶lac3基因及其在提高植物抗蚜中的应用 Download PDF

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CN119193509A
CN119193509A CN202411356402.5A CN202411356402A CN119193509A CN 119193509 A CN119193509 A CN 119193509A CN 202411356402 A CN202411356402 A CN 202411356402A CN 119193509 A CN119193509 A CN 119193509A
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lac3
apple
gene
laccase
tobacco
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周洪旭
李津洋
崔梦霞
陈芳龙
王颖
滕子文
范银君
万方浩
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Original Assignee
Qingdao Agricultural University
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Abstract

本发明提供一种苹果漆酶LAC3基因及其在提高植物抗蚜中的应用，本发明克隆了苹果漆酶LAC3基因，明确了其核酸序列和蛋白结构，在此基础上设计引物，构建其过表达载体,通过烟草组培苗培养和农杆菌介导，转入烟草中,得到转基因植株,并进行筛选获得了纯合体株系，通过EPG技术进行蚜虫取食行为学观测,接种蚜虫研究并明确其抗蚜功能。转基因植株与野生型相比,地上部分长势密度均大于野生型,茎秆粗壮，木质素增多，对蚜虫起到很好抗性作用，为抗蚜分子改良育种提供理论基础。

Description

一种苹果漆酶LAC3基因及其在提高植物抗蚜中的应用
技术领域
本发明属于植物病虫害防治技术领域，具体涉及一种苹果漆酶LAC3基因及其在提高植物抗蚜中的应用。
背景技术
蚜虫是重要的农业害虫，苹果绵蚜是重大果树害虫，感染苹果绵蚜的苹果树，感染部位会附着羊毛状的白色物质，果树受害减产10％-30％，可削弱树势，果实质量差，严重时会使果树枯死，每年造成巨大损失。
化学防治是防治苹果绵蚜等蚜虫害虫的有效方法，但易产生3R问题；另外，化学防治给果农带来了不小的经济压力，最终导致果农整体经济效益下降。因此，替代化学防治的灭蚜办法亟待开发。
植物抗虫育种、提高植物自身对害虫的抗性是防治农业害虫的可持续发展策略，明确植物的抗虫特性并挖掘植物的抗虫基因是抗虫育种的关键问题。然而苹果是木本植物，在木本植物中筛选抗虫基因比较困难。利用转基因验证基因功能技术发展比较缓慢，再加上木本植物难以培养，所以苹果的抗虫基因筛选及利用方面进展缓慢，限制了苹果园害虫的可持续治理发展，急需挖掘抗虫基因，利用苹果自身抗虫性，可持续地治理果园害虫。
发明内容
本发明的目的是提供一种苹果漆酶LAC3基因及其在提高植物抗蚜中的应用，本发明克隆了苹果漆酶LAC3基因，明确了其核酸序列和蛋白结构，在此基础上设计引物，构建其过表达载体,通过烟草组培苗培养和农杆菌介导，转入烟草中,得到转基因植株,并进行筛选获得了纯合体株系，通过EPG技术进行蚜虫取食行为学观测,接种蚜虫研究并明确其抗蚜功能。转基因植株与野生型相比,地上部分长势密度均大于野生型,茎秆粗壮，木质素增多，对蚜虫起到很好抗性作用，为苹果抗蚜分子改良育种提供理论基础。
本发明首先提供一种苹果漆酶LAC3基因，所述的基因编码：
1)氨基酸序列为SEQ ID NO:1的蛋白酶
MEALNAIFVNKIRFTLCLFGLCLLVASSTMSLAEPQIHKHEFVVQATPVKRLCKTQNSITVNGQLPGPTLEVNNGDTLVVKVTNRAQYNVTI
HWHGIRQMRTGWADGPEFVTQCPIRPGGSYTYRFTIQGQEGTLWWHAHSSWLRATVYGALIIHPKQGDSYPFTKPKSETTLLLGEWWNANPI
DVLRQATMTGAAPNVSDAYTINAQPGDLYNCSSQDTVIVPIDSGETNLLRVINAALNQPLFFSVANHKLTVVSADASYTKPFTTTVLMLGPG
QTTDVLITGDQSPARYYLAASAYFSAQNAAFDNTTTTAILEYKSAPCSPNCKNSSAAKPIMAQLPAFNDTNTASAFTKSFRSPRKVEVPTEI
DENLFFTIGLGLNNCPKNFGSQRCQGPNGTRFTASMNNVSFVLPNNISILQAYLQNIPGVFTADFPANPPTKFDYTGNVSRSLWQPMSGTRG
YKLKYGSRVQVVLQDTSIVTPENHPIHLHGYDFYILAEGFGNFNAQTDTKKFNLIDPPLRNTVAVPANGWAVIRFVADNPGAWIMHCHLDVHINWGLAMVFLVDNGVGALQSVEQPPVDLPLC；
2)与1)中的蛋白酶具有不低于90％同源性的蛋白酶；
更进一步的，所述的同源性不低于95％；
本发明所提供的苹果漆酶LAC3基因，其一种具体的核苷酸序列如下：
ATGGAGGCACTCAACGCTATTTTCGTCAACAAGATTCGCTTCACGTTATGCCTTTTTGGTCTTTGCCTTCTCGTGGCGTC
ATCGACAATGTCCTTGGCAGAACCCCAAATTCACAAGCATGAGTTTGTTGTTCAAGCAACACCAGTGAAGAGGCTGTGCA
AAACCCAAAACTCCATCACAGTGAATGGACAGCTCCCTGGACCAACCTTGGAAGTAAACAATGGTGACACTCTTGTCGTC
AAAGTCACCAACAGAGCTCAATACAACGTCACCATCCACTGGCATGGGATTAGGCAAATGAGAACTGGATGGGCAGATGG
GCCAGAATTTGTGACTCAGTGCCCGATTAGGCCAGGAGGGAGCTACACCTACCGCTTTACAATTCAAGGGCAAGAGGGTA
CTCTGTGGTGGCATGCTCACAGCTCATGGCTTAGAGCCACCGTTTACGGAGCACTCATCATTCATCCTAAACAAGGAGAC
TCCTACCCCTTCACTAAACCGAAAAGTGAAACAACCCTTCTTCTCGGTGAATGGTGGAACGCTAACCCTATCGATGTCTT
GAGGCAGGCGACTATGACAGGAGCAGCTCCAAATGTTTCTGATGCATACACCATCAATGCTCAACCTGGTGATCTTTACA
ACTGCTCAAGCCAAGACACTGTCATAGTTCCTATAGACTCCGGCGAGACCAACCTTCTTAGAGTCATCAACGCTGCACTC
AACCAACCTCTTTTCTTCTCCGTGGCCAACCACAAGCTCACCGTTGTTAGCGCTGATGCCTCCTACACCAAACCTTTCAC
TACCACGGTTCTCATGCTAGGGCCTGGGCAGACCACTGATGTTTTAATCACCGGTGACCAGTCACCAGCCCGGTACTACT
TGGCGGCAAGTGCTTATTTCAGCGCGCAAAATGCAGCATTCGACAACACCACCACCACCGCCATTCTTGAATACAAGTCT
GCCCCTTGCAGCCCCAATTGCAAAAACAGTTCAGCAGCCAAACCAATTATGGCACAACTCCCTGCTTTCAATGACACAAA
CACTGCTTCTGCTTTCACCAAGAGTTTCAGAAGTCCAAGAAAAGTTGAAGTCCCAACTGAAATCGATGAAAATCTCTTCT
TCACAATTGGTCTTGGACTCAACAACTGCCCGAAAAATTTTGGATCCCAAAGGTGCCAAGGCCCAAATGGGACACGCTTC
ACAGCCAGCATGAACAATGTGTCCTTCGTGCTTCCAAACAACATTTCAATCCTTCAGGCATACCTACAAAACATCCCTGG
AGTTTTCACTGCTGATTTTCCAGCAAACCCTCCGACGAAATTCGACTACACTGGCAATGTGAGTCGCTCTCTCTGGCAAC
CAATGTCAGGCACTAGAGGATACAAGTTGAAGTATGGATCAAGGGTGCAGGTTGTGCTGCAGGACACAAGCATCGTCACA
CCAGAAAACCATCCTATCCATCTTCACGGATACGATTTTTACATCCTTGCTGAGGGTTTTGGAAATTTCAATGCCCAGAC
TGATACCAAAAAGTTCAACCTTATTGATCCACCTCTGAGGAACACAGTGGCAGTGCCTGCGAATGGATGGGCAGTCATTC
GATTTGTCGCTGACAATCCAGGTGCATGGATAATGCATTGTCACTTGGATGTCCACATCAACTGGGGTTTGGCCATGGTG
TTCTTGGTGGACAATGGAGTTGGGGCACTGCAGTCAGTCGAGCAACCACCGGTGGATCTGCCTCTTTGTTAA(SEQ ID NO:2)。
本发明再一个方面还提供一种植物表达载体，所述的表达载体中携带有所述的苹果漆酶LAC3基因的核酸片段。
本发明还提供一种重组农杆菌，所述的重组农杆菌中携带有上述的植物表达载体；
本发明还提供所述的苹果漆酶LAC3基因的一种用途，是在提高烟草中木质素的生物合成量中的应用；
本发明再一个方面还提供一种提高烟草抗蚜虫抗性的方法，所述的方法是在烟草植株中提高所述的苹果漆酶LAC3基因的表达量；
本发明还提供一种筛选具有更好抗蚜虫抗性的烟草植株的方法，是通过筛选苹果漆酶LAC3基因的表达量来进行筛选。
本发明以苹果为材料，通过克隆得到LAC3基因，在此基础上构建过量表达载体pBI121-CutGUS-LAC3，转入本氏烟中，得到转基因植株，并进行迭代筛选得到能稳定遗传转入基因的植株进行表型观测及生物指标测定，基因功能鉴定结果表明在与未转基因的植株相比，转基因烟草植株生长更快、更加茂密，且具有抗蚜功能。
附图说明
图1为本发明中MdLac3基因克隆电泳凝胶结果图；
图2为本发明中MdLac3核酸序列图；
图3为本发明中转基因烟草植株中MdLac3的表达水平图；
图4为本发明中蚜虫在烟草上取食6h EPG波形持续时间比例图；
图5为本发明中烟蚜在两种不同品种烟草上的存活情况比较图；
图6为本发明中不同品种烟草上烟蚜的最大产蚜及平均产蚜量情况图；
图7为本发明中不同品种烟草叶片总木质素含量图。
图8：对照组与转Lac3基因烟草1月生长情况照片图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进一步进行描述。以下实施例中，未详细叙述的操作均为常规生物学实验操作，可参照分子生物学实验手册以及现有公开的期刊文献等进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。下述实例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
本发明实施例中使用的植物材料为苹果(Malus domestica)、本氏烟(Nicotianabenthamiana)，其培养条件为25℃，光照16h。
本发明采用的载体为pBI121，购自山东淼灵质粒平台；
本发明采用的大肠杆菌菌株为DH5α,购自诺唯赞生物科技股份有限公司；
本发明采用的农杆菌为EHA105，购自昂羽生物技术有限公司；
实施例1：苹果漆酶LAC3基因克隆
1.引物设计
通过NCBI数据库blast比对筛选出LAC3基因序列，利用Primer Premier5软件进行引物设计，引物序列如下：
LAC3-F：ATGGAGGCACTCAACGCTATTT；
LAC3-R：TTAACAAAGAGGCAGATCCACCG。
2.基因克隆与目的片段回收
①采用FastPure Universal Plant Total RNA Isolation Kit试剂盒(诺唯赞)提取新红星苹果枝条的总RNA，具体方法参照说明书。
②准备反转录反应液1∶Total RNA 1μg、RNase-Free ddH2 O-xμL，总体积为8μL；反转录反应液1于65℃中加热5min，之后迅速冰浴2min。
准备反转录反应液2∶上一步的混合液8μL、5×gDNA wiper Mix 2μL，总体积10μL。混匀后，42℃中加热2min。
准备反转录反应液3∶上一步的混合液10μL、10×RT Mix 2μL、HiScriptⅢEnzymeMix 2μL、Oligo(dT)20VN 1μL、RNase-Free ddH2 O 5μL混匀，总体积20μL。使用PCR仪进行反转录反应。反应程序为：25℃5min；37℃45min；85℃5s；-20℃保存。
③以反转录合成的cDNA为模板，使用P525高保真酶进行基因克隆。
PCR反应体系为：cDNA 2μL、Primer-F(10μM)2μL、Primer-R(10μM)2μL、2×PhantaMax Master Mix 25μL、ddH2 O 31μL，总体积为50μL。
PCR反应程序为：95℃3min；95℃15s、55℃15s、72℃2min，共35个循环；72℃5min；-20℃保存。
反应完成后，扩增产物用1％琼脂糖凝胶进行电泳分离；将大小正确的条带切下，并回收纯化。
确定扩增的苹果漆酶LAC3基因的CDS区域的核苷酸为SEQ ID NO:2，其编码蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO:1。
实施例2：构建表达载体并转化大肠杆菌、转化农杆菌
1.构建表达载体
利用诺唯赞单片段克隆网站设计同源重组引物，引物序列如下：PBI121-LAC3-F：gagaacacgggggactctagaATGGAGGCACTCAACGCTATTT；
PBI121-LAC3-R：cgatcggggaaattcgagctcTTAACAAAGAGGCAGATCCACCG。
本发明使用的植物表达载体PBI121从山东淼灵质粒平台购买。取含有PBI121质粒的甘油菌进行摇菌(Kan抗性)，使用质粒纯化试剂盒(Takara)提取质粒。
按照说明书使用快切酶XbaI和SacI对PBI121载体进行双酶切处理，去掉载体上的Gus区域，凝胶电泳后利用胶回收试剂盒回收纯化PBI121(不含GUS)载体。利用诺唯赞同源重组kit将目的基因构建到载体pBI121中，得到重组的植物表达载体pBI121-Lac。
重组反应体系如下：线性化载体XμL、插入片段YμL、5×CEII Buffer 4μL、ExnaseⅡ2μL，补充ddH2O至总体积为20μL，其中线性化载体和目的片段体积视其质粒浓度而定。反应程序为：37℃0.5h。
2.大肠杆菌转化
将反应产物转化大肠杆菌感受态细胞，涂布于含Kan的LB固体培养基上，37℃过夜培养，挑取板上的单克隆扩繁并进行菌液PCR检测、凝胶电泳，挑选正确条带的单克隆送公司测序。根据测序返回结果保存最优菌株，后续转化农杆菌。
3.农杆菌转化
取1μg待转化质粒，加入100μl EHA105农杆菌感受态细胞，混匀之后依次于冰上静置5min、液氮速冻5min、28℃热激5min，迅速冰浴5min。加入700μL LB液体培养基，28℃200rpm摇菌3h后，涂布于平板，28℃培养48h。第三日挑选单克隆，进行菌液PCR检测。使用甘油菌将正确的菌于-80℃冰箱保存。
实施例3：烟草组培苗培养、农杆菌介导转入烟草，转基因烟草筛选鉴定
1.无菌本氏烟草苗的培养
将本氏烟种子经75％乙醇、2.5％ NaClO消毒30s，无菌水冲洗3～5次，将种子接种于MS培养基上，25℃光照培养4周，组培苗叶片用于转化实验。
2.农杆菌介导转入烟草
①农杆菌的活化：取验证正确的农杆菌到LB液体培养基(Rif 20mg/L，Kan50mg/L)，28℃振荡过夜培养至OD600＝0.8～1.2，待用。
②农杆菌介导的烟草转化：参考Horsch等(1985)采用叶盘法转化烟草。将本氏烟叶片制备成半径5mm的叶圆盘，放置在1mg/L 6-BA的MS预培养培养基上，预培养两天；将叶圆盘浸泡在制备好的农杆菌侵染液中，浸泡后的叶圆盘用无菌滤纸吸干，置于1mg/L 6-BA的MS预培养培养基上黑暗共培养四天，直至叶盘底部有明显菌渍；将叶圆盘放入含1mg/L6-BA+200mgL Cef+50mg/L Kan的培养基进行分化筛选培养；直至再生芽生长后将芽转移到200mgL Cef+50mg/L Kan的生根培养基中，再生芽生根且根系发达后炼苗转移至营养土中培养。
3.转基因烟草筛选鉴定
采集炼苗1个月的转基因及普通烟草植株叶片，使用诺唯赞生物科技股份有限公司的FastPure Plant DNA Isolation Mini Kit试剂盒提取烟草植株DNA，方法参照说明书，进行DNA水平方面鉴定。使用M13通用上游引物(M13–F：caggaaacagctatgac)和M13通用下游引物(M13-R：gtaaaacgacggccagt)进行PCR检测。PCR反应体系：模板1μL、2xTaq PlusMaster MixⅡ12.5μL、M13-F(10μM)1μL、M13-R(10μM)1μL、ddH2O 9.5μL，总体系为25μL。PCR反应程序为：95℃3min；95℃15s、56℃20s、72℃3min，共35个循环；72℃10min；4℃保存。最后进行1％琼脂糖凝胶电泳检测。
使用诺唯赞生物科技股份有限公司的FastPure Universal Plant Total RNAIsolation Kit试剂盒提取烟草植株RNA，方法参照说明书，对其进行RNA水平方面鉴定。使用q-Lac3上游引物(q-Lac3–F：tacttggcggcgagtgctta)和q-Lac3下游引物(q-Lac3-R：tggctgctgaactgtttttgc)进行荧光定量检测。定量反应体系：样本1μL、2xRealStar FastSYBR qPCR Mix 5μL、q-Lac3–F(10μM)0.25μL、q-Lac3-R(10μM)0.25μL、ddH2O 3.5μL，总体系为10μL。qPCR反应程序为：95℃30s；95℃5s、60℃30s，共39个循环；Melt Curve 65℃to95℃,increment 0.5℃,5S。根据数据处理结果选择表达倍数高的植株进行后续抗蚜功能测定实验。
实施例4：转基因烟草抗蚜功能验证
1.烟蚜取食行为的EPG分析
为观察烟蚜在不同烟草品种上的取食行为，选用成蚜在两种烟草上进行EPG试验。在试验开始之前，在显微镜下对蚜虫个体进行检查，以确保它们的口器没有损坏。使用Giga-8dd DC-EPG(输入抵抗：1GΩ，数模转换器：100Hz/14位分辨率)系统记录昆虫的刺探电位图谱。为屏蔽外界环境的电磁干扰，取食试验分别在法拉第笼中(80cm×60cm×100cm)进行。将测试昆虫放置在冰盒上，然后用直径18μm、长3-4cm的金丝用导电银胶粘在供试昆虫的前胸背板上，金丝另一端用导电银胶粘在铜丝端(铜丝和铜钉通过锡焊接)。将粘连好的昆虫饥饿1h，然后将蚜虫分别放在不同植株相同位置处的烟叶反面。当蚜虫的口针刺穿植物的组织时，电路闭合并放大，然后转换为数字信号，并通过Giga-8d控制单元进行放大，将其存储在计算机中。该数字信号被转换为波形，并使用Stylet+d软件显示在屏幕上，该软件还用于将波形解释并将其转换为可用于模式识别的数字文件。每种昆虫试验数据记录15次，每次试验记录6h。在记录的6h内未显示取食波或无波形的昆虫不记录在数据中。记录结束后，使用Stylet+a软件根据Tjallingii的标准，将蚜虫的EPG波形划分为非刺探波(np)、路径波(C)、非主动细胞内取食波(pd)、木质部取食波(G)、韧皮部唾液分泌波(E1)、韧皮部取食波(E2)。
烟蚜在不同品种烟草上取食的EPG比较，采用SPSS25.0软件对试验数据进行独立样本T检验。
从烟蚜在烟草上取食的非韧皮部阶段来看，烟蚜在转新红星Lac3基因烟草植株上取食时，第一次开始刺探时间、np波总时间、c波总时间和pd波次数都显著高于普通烟草。在两种烟草上的刺探次数和G波总时间不显著(表1)。
表1：烟蚜在不同烟草植株非韧皮部取食的EPG指标比较表
从烟蚜在烟草上取食的韧皮部阶段来看，烟蚜在转新红星Lac3基因烟草植株上取食时，E1次数、E2波总时间及E1、E2占总E波比例均显著低于普通烟草。在两个烟草品种中，E1波总时间、E2次数、第一次到达韧皮部所用时间及第一次出现E2波的时间数值相近，无明显差异(表2)。
表2：烟蚜在不同烟草植株韧皮部取食的EPG指标比较表
在EPG波形中，E波形分为E1波形和E2波形，其中E1波形表示蚜虫口针正在分泌唾液，为取食做准备；E2波形表示蚜虫正在取食。根据波形分析得出以下结论。
蚜虫在普通烟草上取食时，G波总时间占11.5697％，E1波(在韧皮部分泌唾液)总时间占0.4297％，E2波(在韧皮部取食)总时间占5.4574％，E波(E1+E2)的时间占比为5.8871％。pd波总时间占0.3702％。C波总时间占82.1692％，np波总时间占0.0039％(如图4a)。
蚜虫在转基因烟草上取食时，G波总时间占10.7778％。E1波(在韧皮部分泌唾液)总时间占0.1733％，E2波(在韧皮部取食)总时间占0.4283％，E波(E1+E2)的时间占比为0.6016％，表明蚜虫在转基因烟草上有效取食时间较短，普通烟草有效取食时间较长。pd波总时间占0.6172％。C波总时间占85.1567％，np波总时间占2.8467％，表明蚜虫要花费更多的时间在转基因烟草上，来寻找合适的取食部位(如图4b)。
2.接种蚜虫，明确其抗蚜功能
将不同品种烟草叶片的叶柄插入裝有琼脂培养基的培养皿中(琼脂量为25ml)，在叶片上分别接种2龄期烟蚜，总共15组平行重复，每个重复里面各有6头蚜虫，每天观察存活率及产蚜量，整个试验的观察期为7天，烟蚜已完成一个生命周期。
烟蚜在转基因烟草及普通烟草上生存后，数据结果如图5所示，可以看出转基因植株上的蚜虫存活率比普通烟草上的蚜虫存活率显著降低。
3.转基因烟草叶片总木质素含量测定
使用格锐思木质素含量测定试剂盒，检测不同烟草品种叶片的总木质素含量。采用乙酰化法，使木质素中的酚羟基发生乙酰化，其在280nm处有特征吸收峰，280nm的吸光值高低与木质素含量正相关。
取生长周期一致，相同位置处的烟草叶片进行样本制备。加入试剂1、2及乙酸后进行上机检测。得到的数据按照以下公式进行计算：木质素(mg/g重量)＝[(ΔA+0.003)÷10.615]×V1÷W×2＝0.1413×(ΔA+0.003)÷W×2。结果如图7所示，普通烟草木质素含量平均约为47.26mg/g，转LAC3基因植株木质素含量平均约为122.18mg/g，转基因型木质素含量相对于野生型总体提高了约158.53％。以上结果说明LAC3基因的超量表达促进了木质素的生物合成。

Claims (9)

1.一种苹果漆酶LAC3基因，其特征在于，所述的基因编码：
1)氨基酸序列为SEQ ID NO:1的蛋白酶
2)与1)中的蛋白酶具有不低于90％同源性的蛋白酶。
2.如权利要求1所述的苹果漆酶LAC3基因，其特征在于，所述2)中的同源性不低于95％。
3.如权利要求1所述的苹果漆酶LAC3基因，其特征在于，所述的基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:2。
4.一种植物表达载体，所述的表达载体中携带有权利要求1所述的苹果漆酶LAC3基因的核酸片段。
5.一种重组农杆菌，其特征在于，所述的重组农杆菌中携带有权利要求4所述的植物表达载体。
6.权利要求1所述的苹果漆酶LAC3基因在提高烟草中木质素的生物合成中的应用。
7.一种提高烟草抗蚜虫抗性的方法，其特这个在于，所述的方法是在烟草植株中提高权利要求1所述的苹果漆酶LAC3基因的表达量。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述的提高权利要求1所述的苹果漆酶LAC3基因的表达量，是使用权利要求5所述的重组农杆菌来转化烟草植株。
9.一种筛选具有更好抗蚜虫抗体的烟草植株的方法，其特征在于，所述的方法是通过检测权利要求1所述的苹果漆酶LAC3基因的表达量来进行筛选。
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