CN119157907B - 一种促进皮肤细胞修复的干细胞组合物及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种促进皮肤细胞修复的干细胞组合物及其制备方法与应用，属于皮肤修复技术领域。本发明首次将分离自养殖大鲵的皮肤修复肽与脐带间充质干细胞上清液混合制备促进皮肤细胞修复的干细胞组合物。本发明提供的组合物中皮肤修复肽与脐带间充质干细胞上清液存在协同增效作用，二者联用能有效提高成纤维细胞增殖，促进I型和III型胶原分泌，有利于皮肤损伤修复，具备良好的商业化应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及皮肤修复技术领域，特别涉及一种促进皮肤细胞修复的干细胞组合物及其制备方法与应用。
背景技术
皮肤修复是指修复皮肤屏障，皮肤屏障是皮肤应对外界的第一道防线，健康的皮肤屏障可以抵御外界的污染物，如灰尘、紫外线、细菌等外界刺激，避免水分过度散失，保持皮肤光滑、滋润。皮肤屏障遭到破坏后，会出现不同程度的泛红、起皮、干燥、紧绷等表现，这个时候就需要对受损的皮肤屏障进行修复。
通常，皮肤屏障轻微的损伤，可以通过使用护肤品和改善生活习惯来进行修复。比如做好基础的保湿补水、避免紫外线照射、多吃水果蔬菜、坚持早睡早起等，可以使皮肤状态得到改善。如果是稍严重的损伤，可以使用药物来对皮肤屏障进行修护。常用的药物有维生素E乳膏，多磺酸粘多糖乳膏以及维A酸乳膏，这些药膏都对皮肤具有一个很好的保湿的作用。如果是由于过敏因素所导致的皮肤受损，要采用糖皮质激素类的药膏。需要注意的是，长期使用糖皮质激素类药膏可能会对药物产生一定的依赖性，并且也会使皮肤屏障变得十分脆弱，因此要在医生的指导下使用。
目前已有研究证实间充质干细胞可用于治疗软组织填充和再生、毛发再生、减少疤痕和抗皮肤衰老。间充质干细胞能够通过增加皮肤厚度、胶原蛋白形成和减少皱纹来改善皮肤健康。然而，基于间充质干细胞的皮肤修复产品目前还没有问世，如何有效改善和提高间充质干细胞对皮肤的修复功能是目前行业领域的研发热点。
发明内容
针对现有技术所存在的技术问题，本发明提供了一种促进皮肤细胞修复的干细胞组合物及其制备方法与应用，本发明首次将分离自养殖大鲵的皮肤修复肽与脐带间充质干细胞上清液混合制备促进皮肤细胞修复的干细胞组合物。该组合物中，皮肤修复肽与脐带间充质干细胞上清液存在协同增效作用，二者联用能有效提高成纤维细胞增殖，促进I型和III型胶原分泌，有利于皮肤损伤修复，具备良好的商业化应用前景。
本发明的目的之一在于提供一种促进皮肤细胞修复的干细胞组合物，其包括10-20mL脐带间充质干细胞上清液和3-8mg皮肤修复肽。
优选地，所述促进皮肤细胞修复的干细胞组合物，其包括10mL脐带间充质干细胞上清液和3mg皮肤修复肽。
优选地，所述促进皮肤细胞修复的干细胞组合物，其包括15mL脐带间充质干细胞上清液和5mg皮肤修复肽。
优选地，所述促进皮肤细胞修复的干细胞组合物，其包括20mL脐带间充质干细胞上清液和8mg皮肤修复肽。
优选地，所述皮肤修复肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
进一步优选地，所述脐带间充质干细胞上清液的制备方法包括如下步骤：
1）在无菌条件下，取新鲜脐带，使用无菌PBS充分洗涤，剥去脐动脉和脐静脉，剥离外膜，仅保留华通胶物质，剪成小块，备用；
2）使用100-200U透明质酸酶和50-100U蛋白酶依次消化，37℃ 30-45分钟；消化液采用100-200目滤网过滤，将收集的滤过液以1000g离心10-20分钟，弃去上清液，用低糖DMEM培养基清洗3-5次，即获得脐带间充质干细胞；
3）取步骤2）中2×105-5×106个脐带间充质干细胞，接种于25mL培养瓶中进行传代培养，连续培养3-5天；
4）培养结束后，通过1200g，4℃离心，10-20min，收集步骤3）中的传代后的脐带间充质干细胞上清液，并使用0.22μm滤膜过滤，备用；
5）利用12000g，4℃离心，30-45min对步骤4）中的脐带间充质干细胞上清液进行高速离心，吸取上清液去除细胞杂质沉淀；使用0.22μm滤膜过滤，备用。
进一步优选地，所述皮肤修复肽是分离自新鲜养殖大鲵，经酶解和高相液相色谱鉴定得到。
优选地，所述皮肤修复肽的分离方法步骤包括：
1）分离取新鲜养殖大鲵肌肉组织，研磨成匀浆，加入100-200U胰蛋白酶和80-150U中性蛋白酶在37℃酶解10-16小时，12000rpm离心30-45min，取上清；
2）采用Unique AutoPrep高压制备液相色谱仪进行分离纯化，收集洗脱液，并进行定量分析。
本发明的另一目的之一在于提供了一种促进皮肤细胞修复的干细胞组合物的制备方法，其特征在于，所述方法包括将上述皮肤修复肽直接溶解于脐带间充质干细胞上清液中，经搅拌澄清后，即可。
本发明的目的之一在于提供了一种促进皮肤细胞修复的干细胞组合物在制备促进皮肤细胞修复产品中的用途。
优选地，所述用途是通过将干细胞组合物直接涂覆与受损皮肤表面。
本发明的优点如下：本发明提供了首次将分离自养殖大鲵的皮肤修复肽与脐带间充质干细胞上清液混合制备促进皮肤细胞修复的干细胞组合物。该组合物中，皮肤修复肽与脐带间充质干细胞上清液存在协同增效作用，二者联用能有效提高成纤维细胞增殖，促进I型和III型胶原分泌，有利于皮肤损伤修复，具备良好的商业化应用前景。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明，以使本领域的技术人员更加清楚地理解本发明。
以下各实施例，仅用于说明本发明，并不用来限制本发明的范围。基于本发明中的具体实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的情况下，所获得的其他所有实施例，都属于本发明的保护范围。
在本发明实施例中，若无特殊说明，所有原料组分均为本领域技术人员熟知的市售产品；在本发明实施例中，若未具体指明，所用的技术手段均为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1
一种促进皮肤细胞修复的干细胞组合物，其包括10mL脐带间充质干细胞上清液和3mg皮肤修复肽。其中，所述皮肤修复肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
其中，所述脐带间充质干细胞上清液的制备方法包括如下步骤：
1）在无菌条件下，取新鲜脐带，使用无菌PBS充分洗涤，剥去脐动脉和脐静脉，剥离外膜，仅保留华通胶物质，剪成小块，备用；
2）使用100U透明质酸酶和50U蛋白酶依次消化，37℃ 30分钟；消化液采用100目滤网过滤，将收集的滤过液以1000g离心10分钟，弃去上清液，用低糖DMEM培养基清洗3次，即获得脐带间充质干细胞；
3）取步骤2）中2×105个脐带间充质干细胞，接种于25mL培养瓶中进行传代培养，连续培养3天；
4）培养结束后，通过1200g，4℃离心，10min，收集步骤3）中的传代后的脐带间充质干细胞上清液，并使用0.22μm滤膜过滤，备用；
5）利用12000g，4℃离心，30min对步骤4）中的脐带间充质干细胞上清液进行高速离心，吸取上清液去除细胞杂质沉淀；使用0.22μm滤膜过滤，备用。
所述皮肤修复肽是分离自新鲜养殖大鲵，经酶解和高相液相色谱鉴定得到，具体方法步骤包括：
分离取新鲜养殖大鲵肌肉组织，研磨成匀浆，加入100U胰蛋白酶和80U中性蛋白酶在37℃酶解10小时，12000rpm离心30min，取上清；
2）采用Unique AutoPrep高压制备液相色谱仪进行分离纯化，收集洗脱液，并进行定量分析。
实施例2
一种促进皮肤细胞修复的干细胞组合物，其包括15mL脐带间充质干细胞上清液和5mg皮肤修复肽。其中，所述皮肤修复肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
实施例3
一种促进皮肤细胞修复的干细胞组合物，其包括20mL脐带间充质干细胞上清液和8mg皮肤修复肽。其中，所述皮肤修复肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
对比例1
一种促进皮肤细胞修复的干细胞组合物，其包括20mL脐带间充质干细胞上清液。
对比例2
一种促进皮肤细胞修复的干细胞组合物，其包括8mg皮肤修复肽，采用20mL 0.9%生理盐水溶解。
试验例1
干细胞组合物对成纤维细胞增殖的影响：采用MTT细胞增殖检测试剂盒（货号Cat.No.11465007001，购自Roche公司）检测所述干细胞组合物对成纤维细胞HFF-1的增殖影响。具体检测步骤可根据试剂盒说明书进行常规调整，其中，空白组为DMEM完全培养基，实验组和对照组中的HFF-1细胞用量均在1×105个，具体结果见表1。
表1中，实验组1-3，分别对应实施例1-3制备的干细胞组合物；对照组1-2，分别对应对比例1-2制备的干细胞组合物。
表1 对成纤维细胞增殖分析
检测结果如表1所示：采用本发明实验组1-3任一项得到的干细胞组合物均可有效促进成纤维细胞进行增殖，而单独采用对比例1和对比例2的情况下，其促增殖效果不显著。原因在于脐带间充质干细胞上清液中富含多种小分子短肽和其他营养成分，与大鲵来源的皮肤修复肽协同促进了成纤维细胞的增殖，具有很好的修护皮肤的作用。
试验例2
干细胞组合物对成纤维细胞胶原蛋白分泌的影响：分别将不同处理组得到的成纤维细胞HFF-1进行24h培养，收集细胞，通过ELISA试剂盒（货号EH7533/EH2866,购自武汉菲恩生物科技有限公司）检测I型和III型胶原分泌情况，结果如表2所示。
表2中，实验组1-3，分别对应实施例1-3制备的干细胞组合物；对照组1-2，分别对应对比例1-2制备的干细胞组合物。
表2 I型和III型胶原分泌结果
从表2的结果可以看出，采用本发明干细胞组合物可以高效率地促进成纤维细胞分泌I型和III型胶原，该效果明显优于对照组（P＜0.05），而对比例1和对比例2也有部分促进成纤维细胞分泌I型和III型胶原分泌功能，但是效果不太明显。当二者联用下，干细胞组合物对成纤维细胞胶原蛋白分泌具有协同作用，进一步证实本发明的干细胞组合物具备良好的皮肤修复功能。
上述实施例的作用在于说明本发明的实质性内容，但并不以此限定本发明的保护范围。本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和保护范围。
Claims (7)
1. 一种促进皮肤细胞修复的干细胞组合物，其特征在于，所述组合物由10-20mL脐带间充质干细胞上清液和3-8mg皮肤修复肽组成；所述皮肤修复肽的氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示。
2.如权利要求1所述的干细胞组合物，其特征在于，所述组合物由10mL脐带间充质干细胞上清液和3mg皮肤修复肽组成。
3.如权利要求1所述的干细胞组合物，其特征在于，所述组合物由15mL脐带间充质干细胞上清液和5mg皮肤修复肽组成。
4.如权利要求1所述的干细胞组合物，其特征在于，所述组合物由20mL脐带间充质干细胞上清液和8mg皮肤修复肽组成。
5.如权利要求1-4任一项所述的干细胞组合物，其特征在于，所述脐带间充质干细胞上清液的制备方法包括如下步骤：
1）在无菌条件下，取新鲜脐带，使用无菌PBS充分洗涤，剥去脐动脉和脐静脉，剥离外膜，仅保留华通胶物质，剪成小块，备用；
2）使用100-200U透明质酸酶和50-100U蛋白酶依次消化，37℃ 30-45分钟；消化液采用100-200目滤网过滤，将收集的滤过液以1000g离心10-20分钟，弃去上清液，用低糖DMEM培养基清洗3-5次，即获得脐带间充质干细胞；
3）取步骤2）中2×105-5×106个脐带间充质干细胞，接种于25mL培养瓶中进行传代培养，连续培养3-5天；
4）培养结束后，通过1200g，4℃离心，10-20min，收集步骤3）中的传代后的脐带间充质干细胞上清液，并使用0.22μm滤膜过滤，备用；
5）利用12000g，4℃离心，30-45min对步骤4）中的脐带间充质干细胞上清液进行高速离心，吸取上清液去除细胞杂质沉淀；使用0.22μm滤膜过滤，备用。
6.权利要求1-5任一项所述干细胞组合物的制备方法，其特征在于，所述方法包括将上述皮肤修复肽直接溶解于脐带间充质干细胞上清液中，经搅拌澄清后，即可。
7.权利要求1-5任一项所述干细胞组合物在制备促进皮肤细胞修复产品中的用途。
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