CN115804863A - 包裹间充质干细胞的大鲵皮肤粘液凝胶敷料及制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了包裹间充质干细胞的大鲵皮肤粘液凝胶敷料，包括凝胶基质，所述凝胶基质是利用大鲵皮肤黏液制作，所述凝胶基质的内部装载有间充质干细胞和VEGF，所述凝胶基质的具体制备方法是将大鲵皮肤分泌物颗粒制成的薄层和溶解分泌物颗粒制成的薄层结合压制成，包裹间充质干细胞的大鲵皮肤粘液凝胶敷料的制备方法，包括以下具体步骤：S1：材料制备；S2：材料评价；所述S1，材料制备包括以下具体步骤：S11：制备大鲵皮肤黏液凝胶基质，本发明公开的包裹间充质干细胞的大鲵皮肤粘液凝胶敷料及制备方法有充分利用大鲵皮肤黏液，使凝胶辅料价格低廉、效果显著、性能优良、适合战伤急救的设计理念及优化材料选择的效果。

Description

包裹间充质干细胞的大鲵皮肤粘液凝胶敷料及制备方法

技术领域

本发明涉及医疗设备技术领域，尤其涉及包裹间充质干细胞的大鲵皮肤粘液凝胶敷料及制备方法。

背景技术

伤口敷料是用于伤口的覆盖物或称为保护层，在伤口愈合与治疗过程中可以替代受损皮肤得到暂时性的保护作用。随着科技进步以及救治观念的更新，过去传统的绷带、纱布、棉球等一般敷料已不足够应对新形势下战伤导致的严重出血、大量且多样化的伤口状况。

对战伤来讲，理想的伤口敷料需要具有以下特征：可以起到迅速止血、避免或控制伤口感染、提供受创表面适合的愈合环境、促进伤口无瘢痕快速愈合、改善远期预后，降低二次致残率。

那么，如何适应于新型战争战伤急救军事医疗需求，研究出理想的伤口敷料成了我们需要考虑的问题。

发明内容

本发明公开包裹间充质干细胞的大鲵皮肤粘液凝胶敷料及制备方法，旨在解决如何适应于新型战争战伤急救军事医疗需求，研究出理想的伤口敷料的技术问题。

为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：

包裹间充质干细胞的大鲵皮肤粘液凝胶敷料，包括凝胶基质，所述凝胶基质是利用大鲵皮肤黏液制作，所述凝胶基质的内部装载有间充质干细胞和VEGF，所述凝胶基质的具体制备方法是将大鲵皮肤分泌物颗粒制成的薄层和溶解分泌物颗粒制成的薄层结合压制成。

通过利用大鲵皮肤黏液制作凝胶基质，并在凝胶基质中装载间充质干细胞和VEGF，其中大鲵皮肤黏液相对其他生物材料，具有1、快速止血，效果明显，2、天然黏胶，快速粘合伤口，3、不留瘢痕，促进无瘢痕愈合，4、可体内应用，生物降解，不留残余，5、生物材料，无毒副作用，6、成本较低，获取容易，可大量开发利用等多种功效，且间充质干细胞是具有自我更新和多向分化潜能的成体干细胞，可通过促进血管生成、再上皮化和肉芽组织形成来促进伤口愈合，通过与VEGF相配合，使凝胶辅料具有价格低廉、效果显著、性能优良、适合战伤急救的设计理念及优化材料选择。

包裹间充质干细胞的大鲵皮肤粘液凝胶敷料的制备方法，包括以下具体步骤：

S1：材料制备：明确大鲵粘液凝胶基质的性质及结构，将间充质干细胞和VEGF装载于凝胶基质内部，完成一种新型伤口敷料的制备；

S2：材料评价：对新型敷料的生物学特性、适用性及安全性等进行评估；

所述S1，材料制备包括以下具体步骤：

S11：制备大鲵皮肤黏液凝胶基质：制备大鲵皮肤粘液凝胶基质，对凝胶基质进行材料学表征，观察凝胶基质的内部结构；

S12：凝胶基质与骨髓间充质干细胞共培养：在培养基中，将大鲵皮肤粘液凝胶基质与骨髓间充质干细胞和VEGF共培养，诱导骨髓间充质干细胞分化为内皮细胞，与不加VEGF的包裹骨髓间充质干细胞的大鲵皮肤粘液凝胶基质在内皮细胞诱导培养基培养，并比较两种不同添加VEGF的方式对骨髓间充质干细胞分化的影响，在凝胶基质表面种植内皮细胞和平滑肌细胞，另外，在凝胶基质中包裹骨髓间充质干细胞，评价细胞在凝胶中的形态和细胞活性，筛选出适合的浓度进行功能化实验；

所述S11，制备大鲵皮肤黏液凝胶基质包括以下具体步骤：

S111：制作大鲵皮肤分泌物颗粒；

S112：将大鲵皮肤分泌物颗粒制成薄层；

S113：溶解分泌物颗粒制成薄层；

S114：压制成型水凝胶；

所述S12，凝胶基质与骨髓间充质干细胞共培养包括以下具体步骤：

S121：包裹骨髓间充质干细胞培养:将培养好的骨髓间充质干细胞BMSC与负载于大鲵皮肤粘液凝胶基质，对该凝胶基质进行培养，然后固定，用HE染色和罗丹明染色观察BMSC在凝胶中的分布情况及生长形态；

S122:分析不同EVGF的添加方式对包裹的BMSC的影响：通过CCK-8、罗丹明染色、HE染色和特异性免疫荧光技术(CD31+vWF)研究包裹在大鲵分泌物凝胶基质中的BMSC的分化能力及细胞活性，并将VEGF和BMSC混合形成凝胶再进行培养，培养后用CCK-8检测BMSC活性，然后固定，用罗丹明染色、HE染色和特异性免疫荧光技术(CD31+vWF)观察BMSC在凝胶中的分化能力；

所述S2，材料评价包括以下具体步骤：

S21：利用大鲵皮肤黏液凝胶材料学表征方法：利用水凝胶的表征方法对大鲵皮肤黏液凝胶材料进行评价，其中水凝胶的表征方法包括溶胀度、透射比、红外光谱、扫描电子显微镜、体外降解和力学性能；

S22：大鲵皮肤黏液凝胶表面生物相容性评价：对大鲵皮肤黏液凝胶表面进行生物相容性评价，包括特异性免疫荧光染色、细胞体外静态培养；

S23：大鲵皮肤黏液凝胶的止血评价：对大鲵皮肤黏液凝胶进行止血评价，包括血小板粘附实验、静态全血实验、APTT和乳鼠创伤实验，了解凝胶的止血情况；

S24：创面愈合功能研究：建立创伤动物模型、皮肤全层创面动物模型，探讨新型敷料清除坏死组织的效果和加速创面愈合的功能；

S25：优选配方供进一步研究：对新型敷料的生物学特性、适用性及安全性等进行评估；

所述S21，利用大鲵皮肤黏液凝胶材料学表征方法包括以下具体步骤：

S211：测量大鲵皮肤黏液凝胶溶胀度：将制成的凝胶加入PBS溶液，溶胀后取出凝胶并用滤纸除去表面的水份，称取溶胀后的质量W1；60℃左右恒温真空干燥至恒重W2；利用(W1-W2)/W2计算溶胀度；实验中，每一种样品设置3个平行样，实验结果取平均值，以标准差为误差；

S212：HE染色大鲵皮肤黏液凝胶：对大鲵皮肤黏液凝胶进行HE染色试验；

S213：扫描电子显微镜观察大鲵皮肤黏液凝胶：制备凝胶，用0.5％戊二醛固定30min，然后将固定后的凝胶放入液氮罐，过夜；将冷冻后的凝胶放入冷冻干燥机中冷冻干燥；取其剖面固定在干净的托子上，喷金，扫描电镜观察内部结构；

所述S212，HE染色大鲵皮肤黏液凝胶包括以下具体步骤：

S2121：制样和固定：在1.5cm*1.5cm的PDMS上制备大鲵皮肤分泌物凝胶和包裹细胞的大鲵皮肤分泌物凝胶，成胶后用4％多聚甲醛固定凝胶，静置过夜；

S2122：脱水和包埋：将固定后的样品用酒精脱尽其中的水分，然后将样品置于融化的石蜡中，让蜡液进入样品，待冷却后样品便具有了石蜡的硬度；

S2123：切片和染色：将包有样品的蜡块用切片机切为5-10μm的薄片，贴于载玻片上，脱蜡后进行HE染色；

S2124：封片和观察：切片经脱水类处理后，滴加树胶，用盖玻片密封保存，然后光镜观察凝胶结构及细胞在凝胶中的情况；

通过在切片和染色中，将包有样品的蜡块用切片机切为5-10μm的薄片，贴于载玻片上，脱蜡后进行HE染色，经过HE染色后的切片可提高组织成分的反差，利于后续对于切片的观察。

在一个优选的方案中，所述S22，大鲵皮肤黏液凝胶表面生物相容性评价包括以下具体步骤：

S221：特异性免疫荧光染色：将抗体从动物血清中提取后，与荧光素相结合，即成为标记抗体，用后者与组织切片或细胞涂片孵育，抗体则与其中的相应抗原特异性结合，在荧光显微镜下通过观察标记物而获得该肽或蛋白质的分布部位；

S222：细胞体外静态培养：细胞体外静态培养的细胞选用的是内皮细胞(EC)和平滑肌细胞(SMC)，将这两种细胞以4*106/ml的浓度接种在大鲵皮肤粘液凝胶表面，置于以小牛血清为培养基的培养皿内，放在培养箱预培养(在37℃，5％CO2的条件下)，培养4h、1d、3d后取出，向每个培养皿内加入10ml的CCK-8溶液，将接种上述细胞的培养皿在培养箱内孵育1-4小时，用酶标仪测定在450nm处的吸光度，测CCK-8，比较细胞在样品表面的生长活性，然后固定，用罗丹明染色后，荧光显微镜观察细胞在样品表面的生长情况；

所述S23，大鲵皮肤黏液凝胶的止血评价包括以下具体步骤：

S231：血小板粘附试验：首先进行取血：从兔子耳朵的动脉取血，按体积比9:1与柠檬酸钠混合均匀；将兔子血放入离心管，1500r/min，每次15min，离心两次；用200μL的移液枪在每个样品中滴加100μL富板浆；将加完血小板的样品放在37℃的孵箱中，静置45min；从孵箱中取出样品，用生理盐水清洗2-3遍；用戊二醛(2.5％v/v)固定3个小时以上；再进行罗丹明染色，在避光下进行：固定后，吸出戊二醛，用生理盐水清洗2-3遍，再用吹风机吹干样品；用200μL的移液枪在每个样品中滴加70μL的罗丹明染料并使其铺开；染色15min后再用生理盐水清洗3遍，然后在每个样品中加入一定量的生理盐水避光保存，荧光显微镜拍照观察；

S232：静态全血试验：从兔子耳朵的动脉取血，按体积比9:1与柠檬酸钠混合均匀；用1000μL的移液枪在每个样品表面滴加700μL的全血；将样品放在37℃的摇床中，45min；从摇床中取出样品，用生理盐水清洗2-3遍；观察样品表面血栓的形成情况；

S233：凝血时间评价：将500μLPPP添加到样品表面，37℃下孵育30min；将孵育过的100μLPPP转移到试管中，然后加入100μLAPTT剂，培养3min；将100μL0.025M氯化钙加入试管，在全自动血凝分析仪测定凝血时间，实验中，对照组为载玻片，每一种样品设置3个平行样，实验结果取平均值，以标准差为误差；

S234：乳鼠创伤试验：根据S1的方法制备凝胶；后将出生7d的乳鼠用胶带固定在硬纸板上，然后在乳鼠臀部用手术刀切1-2条长约10mm，深度约3mm的伤口，在乳鼠上，将制好的凝胶贴于伤口，在另外的乳鼠上，将制好的凝胶贴在其中一条伤口上，另一条伤口上覆盖含有生理盐水的医用纱布；分别于伤口覆盖后2分钟、2小时及2天后后观察伤口的出血量、出血停止时间、伤口愈合情况；

所述S24，创面愈合功能研究包括以下具体步骤：

S241：全皮层伤口模型的建立：将实验选取的新西兰大白兔用10％硫化钠溶液脱除兔背部毛，在备皮区，用医用酒精消毒，0.5％利多卡因注射液皮下注射局部麻醉，用手术剪刀和镊子，在兔背部中部脊柱两侧剪去3块直径约为1cm的全层皮肤，深达肌膜，建立全皮层动物伤口模型，模型建立后，分别将凝胶敷料和生理盐水的医用纱布敷在治疗组和对照组伤口处；

S242：伤口愈合情况观测：观察伤后第4、14、20天治疗组和对照组伤口流血、红肿、渗出、瘙痒、结痂和脱痂状态、表面平整度与皮肤弹性等指标，并比较愈合率，用数码相机拍摄记录伤口愈合情况。

通过设置有明确大鲵粘液的材料学特性，并在明确大鲵粘液凝胶基质的性质及结构后对新型敷料的生物学特性、适用性及安全性等进行评估，通过不断反馈，优选配方，可有效改进新型敷料品质，且通过分别对材料学特征、止血和细胞学评价、功能化评价三个大方面进行评价，从而保障配方评价类别的完整性，利于从多个方面更好的确定最佳配方。

由上可知，包裹间充质干细胞的大鲵皮肤粘液凝胶敷料，包括凝胶基质，所述凝胶基质是利用大鲵皮肤黏液制作，所述凝胶基质的内部装载有间充质干细胞和VEGF，所述凝胶基质的具体制备方法是将大鲵皮肤分泌物颗粒制成的薄层和溶解分泌物颗粒制成的薄层结合压制成。本发明提供的包裹间充质干细胞的大鲵皮肤粘液凝胶敷料及制备方法具有充分利用大鲵皮肤黏液，使凝胶辅料价格低廉、效果显著、性能优良、适合战伤急救的设计理念及优化材料选择的技术效果。

附图说明

图1为本发明提出的包裹间充质干细胞的大鲵皮肤粘液凝胶敷料的制备方法的整体流程示意图。

图2为本发明提出的包裹间充质干细胞的大鲵皮肤粘液凝胶敷料的制备方法的制备大鲵皮肤黏液凝胶基质流程示意图。

图3为本发明提出的包裹间充质干细胞的大鲵皮肤粘液凝胶敷料的制备方法的凝胶基质与骨髓间充质干细胞共培养流程示意图。

图4为本发明提出的包裹间充质干细胞的大鲵皮肤粘液凝胶敷料的制备方法的利用大鲵皮肤黏液凝胶材料学表征方法流程示意图。

图5为本发明提出的包裹间充质干细胞的大鲵皮肤粘液凝胶敷料的制备方法的大鲵皮肤黏液凝胶表面生物相容性评价流程示意图。

图6为本发明提出的包裹间充质干细胞的大鲵皮肤粘液凝胶敷料的制备方法的大鲵皮肤黏液凝胶的止血评价流程示意图。

图7为本发明提出的包裹间充质干细胞的大鲵皮肤粘液凝胶敷料的制备方法的创面愈合功能研究流程示意图。

图8为本发明提出的包裹间充质干细胞的大鲵皮肤粘液凝胶敷料的制备方法的整体技术路线结构示意图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。

本发明公开的包裹间充质干细胞的大鲵皮肤粘液凝胶敷料及制备方法主要应用于大鲵皮肤黏液凝胶辅料研究与制备的场景。

参照图1-图3，包裹间充质干细胞的大鲵皮肤粘液凝胶敷料，包括凝胶基质，凝胶基质是利用大鲵皮肤黏液制作，凝胶基质的内部装载有间充质干细胞和VEGF，凝胶基质的具体制备方法是将大鲵皮肤分泌物颗粒制成的薄层和溶解分泌物颗粒制成的薄层结合压制成型，通过利用大鲵皮肤黏液制作凝胶基质，并在凝胶基质中装载间充质干细胞和VEGF，其中大鲵皮肤黏液相对其他生物材料，具有1、快速止血，效果明显，2、天然黏胶，快速粘合伤口，3、不留瘢痕，促进无瘢痕愈合，4、可体内应用，生物降解，不留残余，5、生物材料，无毒副作用，6、成本较低，获取容易，可大量开发利用等多种功效，且间充质干细胞是具有自我更新和多向分化潜能的成体干细胞，可通过促进血管生成、再上皮化和肉芽组织形成来促进伤口愈合，通过与VEGF相配合，使凝胶辅料具有价格低廉、效果显著、性能优良、适合战伤急救的设计理念及优化材料选择。

参照图1和图8，包裹间充质干细胞的大鲵皮肤粘液凝胶敷料的制备方法，包括以下具体步骤：

S1：材料制备：明确大鲵粘液凝胶基质的性质及结构，将间充质干细胞和VEGF装载于凝胶基质内部，完成一种新型伤口敷料的制备；

S2：材料评价：对新型敷料的生物学特性、适用性及安全性等进行评估；

S1，材料制备包括以下具体步骤：

S11：制备大鲵皮肤黏液凝胶基质：制备大鲵皮肤粘液凝胶基质，对凝胶基质进行材料学表征，观察凝胶基质的内部结构；

S12：凝胶基质与骨髓间充质干细胞共培养：在培养基中，将大鲵皮肤粘液凝胶基质与骨髓间充质干细胞和VEGF共培养，诱导骨髓间充质干细胞分化为内皮细胞，与不加VEGF的包裹骨髓间充质干细胞的大鲵皮肤粘液凝胶基质在内皮细胞诱导培养基培养，并比较两种不同添加VEGF的方式对骨髓间充质干细胞分化的影响，在凝胶基质表面种植内皮细胞和平滑肌细胞，另外，在凝胶基质中包裹骨髓间充质干细胞，评价细胞在凝胶中的形态和细胞活性，筛选出适合的浓度进行功能化实验。

参照图2和图8，在一个优选的实施方式中，S11，制备大鲵皮肤黏液凝胶基质包括以下具体步骤：

S111：制作大鲵皮肤分泌物颗粒；

S112：将大鲵皮肤分泌物颗粒制成薄层；

S113：溶解分泌物颗粒制成薄层；

S114：压制成型水凝胶。

参照图3和图8，在一个优选的实施方式中，S12，凝胶基质与骨髓间充质干细胞共培养包括以下具体步骤：

S121：包裹骨髓间充质干细胞培养:将培养好的骨髓间充质干细胞BMSC与负载于大鲵皮肤粘液凝胶基质，对该凝胶基质进行培养，然后固定，用HE染色和罗丹明染色观察BMSC在凝胶中的分布情况及生长形态；

S122:分析不同EVGF的添加方式对包裹的BMSC的影响：通过CCK-8、罗丹明染色、HE染色和特异性免疫荧光技术(CD31+vWF)研究包裹在大鲵分泌物凝胶基质中的BMSC的分化能力及细胞活性，并将VEGF和BMSC混合形成凝胶再进行培养，培养后用CCK-8检测BMSC活性，然后固定，用罗丹明染色、HE染色和特异性免疫荧光技术(CD31+vWF)观察BMSC在凝胶中的分化能力。

参照图1和图8，在一个优选的实施方式中，S2，材料评价包括以下具体步骤：

S21：利用大鲵皮肤黏液凝胶材料学表征方法：利用水凝胶的表征方法对大鲵皮肤黏液凝胶材料进行评价，其中水凝胶的表征方法包括溶胀度、透射比、红外光谱、扫描电子显微镜、体外降解和力学性能；

S22：大鲵皮肤黏液凝胶表面生物相容性评价：对大鲵皮肤黏液凝胶表面进行生物相容性评价，包括特异性免疫荧光染色、细胞体外静态培养；

S23：大鲵皮肤黏液凝胶的止血评价：对大鲵皮肤黏液凝胶进行止血评价，包括血小板粘附实验、静态全血实验、APTT和乳鼠创伤实验，了解凝胶的止血情况；

S24：创面愈合功能研究：建立创伤动物模型、皮肤全层创面动物模型，探讨新型敷料清除坏死组织的效果和加速创面愈合的功能；

S25：优选配方供进一步研究：对新型敷料的生物学特性、适用性及安全性等进行评估。

参照图4和图8，在一个优选的实施方式中，S21，利用大鲵皮肤黏液凝胶材料学表征方法包括以下具体步骤：

S211：测量大鲵皮肤黏液凝胶溶胀度：将制成的凝胶加入PBS溶液，溶胀后取出凝胶并用滤纸除去表面的水份，称取溶胀后的质量W1；60℃左右恒温真空干燥至恒重W2；利用(W1-W2)/W2计算溶胀度；实验中，每一种样品设置3个平行样，实验结果取平均值，以标准差为误差；

S212：HE染色大鲵皮肤黏液凝胶：对大鲵皮肤黏液凝胶进行HE染色试验；

S213：扫描电子显微镜观察大鲵皮肤黏液凝胶：制备凝胶，用0.5％戊二醛固定30min，然后将固定后的凝胶放入液氮罐，过夜；将冷冻后的凝胶放入冷冻干燥机中冷冻干燥；取其剖面固定在干净的托子上，喷金，扫描电镜观察内部结构。

参照图4和图8，在一个优选的实施方式中，S212，HE染色大鲵皮肤黏液凝胶包括以下具体步骤：

S2121：制样和固定：在1.5cm*1.5cm的PDMS上制备大鲵皮肤分泌物凝胶和包裹细胞的大鲵皮肤分泌物凝胶，成胶后用4％多聚甲醛固定凝胶，静置过夜；

S2122：脱水和包埋：将固定后的样品用酒精脱尽其中的水分，然后将样品置于融化的石蜡中，让蜡液进入样品，待冷却后样品便具有了石蜡的硬度；

S2123：切片和染色：将包有样品的蜡块用切片机切为5-10μm的薄片，贴于载玻片上，脱蜡后进行HE染色；以提高组织成分的反差，利于观察；

S2124：封片和观察：切片经脱水类处理后，滴加树胶，用盖玻片密封保存，然后光镜观察凝胶结构及细胞在凝胶中的情况，通过在切片和染色中，将包有样品的蜡块用切片机切为5-10μm的薄片，贴于载玻片上，脱蜡后进行HE染色，经过HE染色后的切片可提高组织成分的反差，利于后续对于切片的观察。

参照图5和图8，在一个优选的实施方式中，S22，大鲵皮肤黏液凝胶表面生物相容性评价包括以下具体步骤：

S221：特异性免疫荧光染色：将抗体从动物血清中提取后，与荧光素相结合，即成为标记抗体，用后者与组织切片或细胞涂片孵育，抗体则与其中的相应抗原特异性结合，在荧光显微镜下通过观察标记物而获得该肽或蛋白质的分布部位；

S222：细胞体外静态培养：细胞体外静态培养的细胞选用的是内皮细胞(EC)和平滑肌细胞(SMC)，将这两种细胞以4*106/ml的浓度接种在大鲵皮肤粘液凝胶表面，置于以小牛血清为培养基的培养皿内，放在培养箱预培养(在37℃，5％CO2的条件下)，培养4h、1d、3d后取出，向每个培养皿内加入10ml的CCK-8溶液，将接种上述细胞的培养皿在培养箱内孵育1-4小时，用酶标仪测定在450nm处的吸光度，测CCK-8，比较细胞在样品表面的生长活性，然后固定，用罗丹明染色后，荧光显微镜观察细胞在样品表面的生长情况。

参照图6和图8，在一个优选的实施方式中，S23，大鲵皮肤黏液凝胶的止血评价包括以下具体步骤：

S231：血小板粘附试验：首先进行取血：从兔子耳朵的动脉取血，按体积比9:1与柠檬酸钠混合均匀；将兔子血放入离心管，1500r/min，每次15min，离心两次；用200μL的移液枪在每个样品中滴加100μL富板浆；将加完血小板的样品放在37℃的孵箱中，静置45min；从孵箱中取出样品，用生理盐水清洗2-3遍；用戊二醛(2.5％v/v)固定3个小时以上；再进行罗丹明染色，在避光下进行：固定后，吸出戊二醛，用生理盐水清洗2-3遍，再用吹风机吹干样品；用200μL的移液枪在每个样品中滴加70μL的罗丹明染料并使其铺开；染色15min后再用生理盐水清洗3遍，然后在每个样品中加入一定量的生理盐水避光保存，荧光显微镜拍照观察；

S232：静态全血试验：从兔子耳朵的动脉取血，按体积比9:1与柠檬酸钠混合均匀；用1000μL的移液枪在每个样品表面滴加700μL的全血；将样品放在37℃的摇床中，45min；从摇床中取出样品，用生理盐水清洗2-3遍；观察样品表面血栓的形成情况；

S233：凝血时间评价：将500μLPPP添加到样品表面，37℃下孵育30min；将孵育过的100μLPPP转移到试管中，然后加入100μLAPTT剂，培养3min；将100μL0.025M氯化钙加入试管，在全自动血凝分析仪测定凝血时间，实验中，对照组为载玻片，每一种样品设置3个平行样，实验结果取平均值，以标准差为误差；

S234：乳鼠创伤试验：根据S1的方法制备凝胶；后将出生7d的乳鼠用胶带固定在硬纸板上，然后在乳鼠臀部用手术刀切1-2条长约10mm，深度约3mm的伤口，在乳鼠上，将制好的凝胶贴于伤口，在另外的乳鼠上，将制好的凝胶贴在其中一条伤口上，另一条伤口上覆盖含有生理盐水的医用纱布；分别于伤口覆盖后2分钟、2小时及2天后后观察伤口的出血量、出血停止时间、伤口愈合情况。

参照图7和图8，在一个优选的实施方式中，S24，创面愈合功能研究包括以下具体步骤：

S241：全皮层伤口模型的建立：将实验选取的新西兰大白兔用10％硫化钠溶液脱除兔背部毛，在备皮区，用医用酒精消毒，0.5％利多卡因注射液皮下注射局部麻醉，用手术剪刀和镊子，在兔背部中部脊柱两侧剪去3块直径约为1cm的全层皮肤，深达肌膜，建立全皮层动物伤口模型，模型建立后，分别将凝胶敷料和生理盐水的医用纱布敷在治疗组和对照组伤口处；

S242：伤口愈合情况观测：观察伤后第4、14、20天治疗组和对照组伤口流血、红肿、渗出、瘙痒、结痂和脱痂状态、表面平整度与皮肤弹性等指标，并比较愈合率，用数码相机拍摄记录伤口愈合情况，通过设置有明确大鲵粘液的材料学特性，并在明确大鲵粘液凝胶基质的性质及结构后对新型敷料的生物学特性、适用性及安全性等进行评估，通过不断反馈，优选配方，可有效改进新型敷料品质，且通过分别对材料学特征、止血和细胞学评价、功能化评价三个大方面进行评价，从而保障配方评价类别的完整性，利于从多个方面更好的确定最佳配方。

工作原理：通过利用大鲵皮肤黏液制作凝胶基质，并在凝胶基质中装载间充质干细胞和VEGF，其中大鲵皮肤黏液相对其他生物材料，具有1、快速止血，效果明显，2、天然黏胶，快速粘合伤口，3、不留瘢痕，促进无瘢痕愈合，4、可体内应用，生物降解，不留残余，5、生物材料，无毒副作用，6、成本较低，获取容易，可大量开发利用等多种功效，且间充质干细胞是具有自我更新和多向分化潜能的成体干细胞，可通过促进血管生成、再上皮化和肉芽组织形成来促进伤口愈合，通过与VEGF相配合，使凝胶辅料具有价格低廉、效果显著、性能优良、适合战伤急救的设计理念及优化材料选择，在对凝胶材料进行评价过程中，通过明确大鲵粘液的材料学特性，并在明确大鲵粘液凝胶基质的性质及结构后对新型敷料的生物学特性、适用性及安全性等进行评估，通过不断反馈，优选配方，可有效改进新型敷料品质，且通过分别对材料学特征、止血和细胞学评价、功能化评价三个大方面进行评价，从而保障配方评价类别的完整性，利于从多个方面更好的确定最佳配方。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.包裹间充质干细胞的大鲵皮肤粘液凝胶敷料，包括凝胶基质，其特征在于，所述凝胶基质是利用大鲵皮肤黏液制作，所述凝胶基质的内部装载有间充质干细胞和VEGF，所述凝胶基质的具体制备方法是将大鲵皮肤分泌物颗粒制成的薄层和溶解分泌物颗粒制成的薄层结合压制成型。

2.包裹间充质干细胞的大鲵皮肤粘液凝胶敷料的制备方法，应用于权利要求1所述的包裹间充质干细胞的大鲵皮肤粘液凝胶敷料，其特征在于，包括以下具体步骤：

S1：材料制备：明确大鲵粘液凝胶基质的性质及结构，将间充质干细胞和VEGF装载于凝胶基质内部，完成一种新型伤口敷料的制备；

S2：材料评价：对新型敷料的生物学特性、适用性及安全性等进行评估；

所述S1，材料制备包括以下具体步骤：

S11：制备大鲵皮肤黏液凝胶基质：制备大鲵皮肤粘液凝胶基质，对凝胶基质进行材料学表征，观察凝胶基质的内部结构；

S12：凝胶基质与骨髓间充质干细胞共培养：在培养基中，将大鲵皮肤粘液凝胶基质与骨髓间充质干细胞和VEGF共培养，诱导骨髓间充质干细胞分化为内皮细胞，与不加VEGF的包裹骨髓间充质干细胞的大鲵皮肤粘液凝胶基质在内皮细胞诱导培养基培养，并比较两种不同添加VEGF的方式对骨髓间充质干细胞分化的影响，在凝胶基质表面种植内皮细胞和平滑肌细胞，另外，在凝胶基质中包裹骨髓间充质干细胞，评价细胞在凝胶中的形态和细胞活性，筛选出适合的浓度进行功能化实验。

3.根据权利要求2所述的包裹间充质干细胞的大鲵皮肤粘液凝胶敷料的制备方法，其特征在于，所述S11，制备大鲵皮肤黏液凝胶基质包括以下具体步骤：

S111：制作大鲵皮肤分泌物颗粒；

S112：将大鲵皮肤分泌物颗粒制成薄层；

S113：溶解分泌物颗粒制成薄层；

S114：压制成型水凝胶。

4.根据权利要求2所述的包裹间充质干细胞的大鲵皮肤粘液凝胶敷料的制备方法，其特征在于，所述S12，凝胶基质与骨髓间充质干细胞共培养包括以下具体步骤：

S121：包裹骨髓间充质干细胞培养:将培养好的骨髓间充质干细胞BMSC与负载于大鲵皮肤粘液凝胶基质，对该凝胶基质进行培养，然后固定，用HE染色和罗丹明染色观察BMSC在凝胶中的分布情况及生长形态；

S122:分析不同EVGF的添加方式对包裹的BMSC的影响：通过CCK-8、罗丹明染色、HE染色和特异性免疫荧光技术(CD31+vWF)研究包裹在大鲵分泌物凝胶基质中的BMSC的分化能力及细胞活性，并将VEGF和BMSC混合形成凝胶再进行培养，培养后用CCK-8检测BMSC活性，然后固定，用罗丹明染色、HE染色和特异性免疫荧光技术(CD31+vWF)观察BMSC在凝胶中的分化能力。

5.根据权利要求2所述的包裹间充质干细胞的大鲵皮肤粘液凝胶敷料的制备方法，其特征在于，所述S2，材料评价包括以下具体步骤：

S21：利用大鲵皮肤黏液凝胶材料学表征方法：利用水凝胶的表征方法对大鲵皮肤黏液凝胶材料进行评价，其中水凝胶的表征方法包括溶胀度、透射比、红外光谱、扫描电子显微镜、体外降解和力学性能；

S22：大鲵皮肤黏液凝胶表面生物相容性评价：对大鲵皮肤黏液凝胶表面进行生物相容性评价，包括特异性免疫荧光染色、细胞体外静态培养；

S23：大鲵皮肤黏液凝胶的止血评价：对大鲵皮肤黏液凝胶进行止血评价，包括血小板粘附实验、静态全血实验、APTT和乳鼠创伤实验，了解凝胶的止血情况；

S24：创面愈合功能研究：建立创伤动物模型、皮肤全层创面动物模型，探讨新型敷料清除坏死组织的效果和加速创面愈合的功能；

S25：优选配方供进一步研究：对新型敷料的生物学特性、适用性及安全性等进行评估。

6.根据权利要求5所述的包裹间充质干细胞的大鲵皮肤粘液凝胶敷料的制备方法，其特征在于，所述S21，利用大鲵皮肤黏液凝胶材料学表征方法包括以下具体步骤：

S211：测量大鲵皮肤黏液凝胶溶胀度：将制成的凝胶加入PBS溶液，溶胀后取出凝胶并用滤纸除去表面的水份，称取溶胀后的质量W1；60℃左右恒温真空干燥至恒重W2；利用(W1-W2)/W2计算溶胀度；

S212：HE染色大鲵皮肤黏液凝胶：对大鲵皮肤黏液凝胶进行HE染色试验；

S213：扫描电子显微镜观察大鲵皮肤黏液凝胶：制备凝胶，用0.5％戊二醛固定30min，然后将固定后的凝胶放入液氮罐，过夜；将冷冻后的凝胶放入冷冻干燥机中冷冻干燥；取其剖面固定在干净的托子上，喷金，扫描电镜观察内部结构。

7.根据权利要求6所述的包裹间充质干细胞的大鲵皮肤粘液凝胶敷料的制备方法，其特征在于，所述S212，HE染色大鲵皮肤黏液凝胶包括以下具体步骤：

S2121：制样和固定：在1.5cm*1.5cm的PDMS上制备大鲵皮肤分泌物凝胶和包裹细胞的大鲵皮肤分泌物凝胶，成胶后用4％多聚甲醛固定凝胶，静置过夜；

S2122：脱水和包埋：将固定后的样品用酒精脱尽其中的水分，然后将样品置于融化的石蜡中，让蜡液进入样品；

S2123：切片和染色：将包有样品的蜡块用切片机切为5-10μm的薄片，贴于载玻片上，脱蜡后进行HE染色；

S2124：封片和观察：切片经脱水类处理后，滴加树胶，用盖玻片密封保存，然后光镜观察凝胶结构及细胞在凝胶中的情况。

8.根据权利要求5所述的包裹间充质干细胞的大鲵皮肤粘液凝胶敷料的制备方法，其特征在于，所述S22，大鲵皮肤黏液凝胶表面生物相容性评价包括以下具体步骤：

S221：特异性免疫荧光染色：将抗体从动物血清中提取后，与荧光素相结合，即成为标记抗体，用后者与组织切片或细胞涂片孵育，抗体则与其中的相应抗原特异性结合，在荧光显微镜下通过观察标记物而获得该肽或蛋白质的分布部位；

S222：细胞体外静态培养：细胞体外静态培养的细胞选用的是内皮细胞和平滑肌细胞，将这两种细胞以4*106/ml的浓度接种在大鲵皮肤粘液凝胶表面，置于以小牛血清为培养基的培养皿内，放在培养箱预培养，培养4h、1d、3d后取出，向每个培养皿内加入10ml的CCK-8溶液，将接种上述细胞的培养皿在培养箱内孵育1-4小时，用酶标仪测定在450nm处的吸光度，测CCK-8，比较细胞在样品表面的生长活性，然后固定，用罗丹明染色后，荧光显微镜观察细胞在样品表面的生长情况。

9.根据权利要求5所述的包裹间充质干细胞的大鲵皮肤粘液凝胶敷料的制备方法，其特征在于，所述S23，大鲵皮肤黏液凝胶的止血评价包括以下具体步骤：

S231：血小板粘附试验：首先进行取血：从兔子耳朵的动脉取血，按体积比9:1与柠檬酸钠混合均匀；将兔子血放入离心管，1500r/min，每次15min，离心两次；用200μL的移液枪在每个样品中滴加100μL富板浆；将加完血小板的样品放在37℃的孵箱中，静置45min；从孵箱中取出样品，用生理盐水清洗2-3遍；用戊二醛固定3个小时以上；再进行罗丹明染色，在避光下进行：固定后，吸出戊二醛，用生理盐水清洗2-3遍，再用吹风机吹干样品；用200μL的移液枪在每个样品中滴加70μL的罗丹明染料并使其铺开；染色15min后再用生理盐水清洗3遍，然后在每个样品中加入一定量的生理盐水避光保存，荧光显微镜拍照观察；

S232：静态全血试验：从兔子耳朵的动脉取血，按体积比9:1与柠檬酸钠混合均匀；用1000μL的移液枪在每个样品表面滴加700μL的全血；将样品放在37℃的摇床中，45min；从摇床中取出样品，用生理盐水清洗2-3遍；观察样品表面血栓的形成情况；

S233：凝血时间评价：将500μLPPP添加到样品表面，37℃下孵育30min；将孵育过的100μLPPP转移到试管中，然后加入100μLAPTT剂，培养3min；将100μL0.025M氯化钙加入试管，在全自动血凝分析仪测定凝血时间，实验中，对照组为载玻片，每一种样品设置3个平行样，实验结果取平均值，以标准差为误差；

S234：乳鼠创伤试验：根据S1的方法制备凝胶；后将出生7d的乳鼠用胶带固定在硬纸板上，然后在乳鼠臀部用手术刀切1-2条长约10mm，深度约3mm的伤口，在乳鼠上，将制好的凝胶贴于伤口，在另外的乳鼠上，将制好的凝胶贴在其中一条伤口上，另一条伤口上覆盖含有生理盐水的医用纱布；分别于伤口覆盖后2分钟、2小时及2天后后观察伤口的出血量、出血停止时间、伤口愈合情况。

10.根据权利要求5所述的包裹间充质干细胞的大鲵皮肤粘液凝胶敷料的制备方法，其特征在于，所述S24，创面愈合功能研究包括以下具体步骤：

S241：全皮层伤口模型的建立：将实验选取的新西兰大白兔用10％硫化钠溶液脱除兔背部毛，在备皮区，用医用酒精消毒，0.5％利多卡因注射液皮下注射局部麻醉，用手术剪刀和镊子，在兔背部中部脊柱两侧剪去3块直径约为1cm的全层皮肤，深达肌膜，建立全皮层动物伤口模型，模型建立后，分别将凝胶敷料和生理盐水的医用纱布敷在治疗组和对照组伤口处；

S242：伤口愈合情况观测：观察伤后第4、14、20天治疗组和对照组伤口流血、红肿、渗出、瘙痒、结痂和脱痂状态、表面平整度与皮肤弹性等指标，并比较愈合率，用数码相机拍摄记录伤口愈合情况。

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