CN119143828A - 寡核苷酸的汇聚液相合成 - Google Patents
寡核苷酸的汇聚液相合成 Download PDFInfo
- Publication number
- CN119143828A CN119143828A CN202411234221.5A CN202411234221A CN119143828A CN 119143828 A CN119143828 A CN 119143828A CN 202411234221 A CN202411234221 A CN 202411234221A CN 119143828 A CN119143828 A CN 119143828A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- compound
- formula
- mixture
- salt
- oligonucleotide
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 title claims abstract description 51
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 title abstract description 302
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 title abstract description 51
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 title description 98
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 title description 71
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 426
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 558
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims description 282
- 239000002808 molecular sieve Substances 0.000 claims description 114
- URGAHOPLAPQHLN-UHFFFAOYSA-N sodium aluminosilicate Chemical group [Na+].[Al+3].[O-][Si]([O-])=O.[O-][Si]([O-])=O URGAHOPLAPQHLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 100
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 81
- 238000010511 deprotection reaction Methods 0.000 claims description 79
- 125000003545 alkoxy group Chemical group 0.000 claims description 71
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 claims description 51
- 229910001868 water Inorganic materials 0.000 claims description 47
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 45
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 claims description 35
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 claims description 28
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 26
- 239000002274 desiccant Substances 0.000 claims description 19
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 19
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 claims description 19
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 claims description 19
- 125000006242 amine protecting group Chemical group 0.000 claims description 16
- 125000001797 benzyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])* 0.000 claims description 16
- 229910052736 halogen Inorganic materials 0.000 claims description 16
- 150000002367 halogens Chemical class 0.000 claims description 16
- 125000001997 phenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 claims description 16
- 125000000882 C2-C6 alkenyl group Chemical group 0.000 claims description 15
- 125000002103 4,4'-dimethoxytriphenylmethyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C(*)(C1=C([H])C([H])=C(OC([H])([H])[H])C([H])=C1[H])C1=C([H])C([H])=C(OC([H])([H])[H])C([H])=C1[H] 0.000 claims description 13
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 claims description 13
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 claims description 10
- 125000000753 cycloalkyl group Chemical group 0.000 claims description 9
- 238000010533 azeotropic distillation Methods 0.000 claims description 8
- 239000002516 radical scavenger Substances 0.000 claims description 8
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 claims description 6
- 125000001072 heteroaryl group Chemical group 0.000 claims description 5
- 239000004793 Polystyrene Chemical group 0.000 claims description 4
- PDXRQENMIVHKPI-UHFFFAOYSA-N cyclohexane-1,1-diol Chemical compound OC1(O)CCCCC1 PDXRQENMIVHKPI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 229920002223 polystyrene Chemical group 0.000 claims description 3
- BLRPTPMANUNPDV-UHFFFAOYSA-N Silane Chemical group [SiH4] BLRPTPMANUNPDV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 125000000816 ethylene group Chemical group [H]C([H])([*:1])C([H])([H])[*:2] 0.000 claims description 2
- 150000002240 furans Chemical class 0.000 claims description 2
- 125000000592 heterocycloalkyl group Chemical group 0.000 claims description 2
- 150000002475 indoles Chemical class 0.000 claims description 2
- 150000003233 pyrroles Chemical class 0.000 claims description 2
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 claims 1
- 125000001475 halogen functional group Chemical group 0.000 claims 1
- 125000005373 siloxane group Chemical group [SiH2](O*)* 0.000 claims 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 abstract description 180
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 abstract description 109
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 abstract description 75
- 230000008878 coupling Effects 0.000 abstract description 35
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 abstract description 35
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 abstract description 32
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 abstract description 32
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N Dichloromethane Chemical compound ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 567
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 421
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 303
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 219
- 239000000047 product Substances 0.000 description 179
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 171
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 139
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 135
- IMNFDUFMRHMDMM-UHFFFAOYSA-N N-Heptane Chemical compound CCCCCCC IMNFDUFMRHMDMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 108
- BZLVMXJERCGZMT-UHFFFAOYSA-N Methyl tert-butyl ether Chemical compound COC(C)(C)C BZLVMXJERCGZMT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 103
- 239000012043 crude product Substances 0.000 description 99
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 99
- -1 2-dimethylpentyl Chemical group 0.000 description 96
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 90
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 83
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 75
- 235000019439 ethyl acetate Nutrition 0.000 description 70
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 70
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 69
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 67
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 60
- 239000012267 brine Substances 0.000 description 58
- HPALAKNZSZLMCH-UHFFFAOYSA-M sodium;chloride;hydrate Chemical compound O.[Na+].[Cl-] HPALAKNZSZLMCH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 58
- 239000012044 organic layer Substances 0.000 description 56
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 53
- WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N Tetrahydrofuran Chemical compound C1CCOC1 WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 48
- JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N Pyridine Chemical compound C1=CC=NC=C1 JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 46
- 238000006642 detritylation reaction Methods 0.000 description 41
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid group Chemical group C(CC(O)(C(=O)O)CC(=O)O)(=O)O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 37
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 36
- 125000006239 protecting group Chemical group 0.000 description 35
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 description 34
- 238000004895 liquid chromatography mass spectrometry Methods 0.000 description 33
- 239000002585 base Substances 0.000 description 32
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 30
- 238000000589 high-performance liquid chromatography-mass spectrometry Methods 0.000 description 30
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 30
- 150000003949 imides Chemical class 0.000 description 29
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 29
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 27
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 26
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 25
- ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N Triethylamine Chemical compound CCN(CC)CC ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 24
- YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N tetrahydrofuran Natural products C=1C=COC=1 YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 24
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N thymine Chemical compound CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 24
- 238000005915 ammonolysis reaction Methods 0.000 description 23
- UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N pyridine Natural products COC1=CC=CN=C1 UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 23
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 22
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 22
- 239000013256 coordination polymer Substances 0.000 description 21
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 21
- 125000005843 halogen group Chemical group 0.000 description 21
- 125000000623 heterocyclic group Chemical group 0.000 description 21
- 239000007800 oxidant agent Substances 0.000 description 21
- ZAMCTDDIJFNXOH-UHFFFAOYSA-N tributylazanium;acetate Chemical compound CC(O)=O.CCCCN(CCCC)CCCC ZAMCTDDIJFNXOH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 21
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 20
- WNAHIZMDSQCWRP-UHFFFAOYSA-N dodecane-1-thiol Chemical compound CCCCCCCCCCCCS WNAHIZMDSQCWRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 20
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 20
- 239000011877 solvent mixture Substances 0.000 description 20
- GVZJRBAUSGYWJI-UHFFFAOYSA-N 2,5-bis(3-dodecylthiophen-2-yl)thiophene Chemical compound C1=CSC(C=2SC(=CC=2)C2=C(C=CS2)CCCCCCCCCCCC)=C1CCCCCCCCCCCC GVZJRBAUSGYWJI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 19
- 238000006481 deamination reaction Methods 0.000 description 19
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 19
- 150000008300 phosphoramidites Chemical class 0.000 description 19
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical compound NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- 230000009615 deamination Effects 0.000 description 18
- JXTHNDFMNIQAHM-UHFFFAOYSA-N dichloroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(Cl)Cl JXTHNDFMNIQAHM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- 125000003835 nucleoside group Chemical group 0.000 description 18
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 17
- 238000005828 desilylation reaction Methods 0.000 description 17
- JGFZNNIVVJXRND-UHFFFAOYSA-N N,N-Diisopropylethylamine (DIPEA) Chemical compound CCN(C(C)C)C(C)C JGFZNNIVVJXRND-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 16
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 16
- 230000001590 oxidative effect Effects 0.000 description 16
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 15
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 15
- 150000003833 nucleoside derivatives Chemical class 0.000 description 15
- CIHOLLKRGTVIJN-UHFFFAOYSA-N tert‐butyl hydroperoxide Chemical compound CC(C)(C)OO CIHOLLKRGTVIJN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-K thiophosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=S RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 15
- ZAFNJMIOTHYJRJ-UHFFFAOYSA-N Diisopropyl ether Chemical compound CC(C)OC(C)C ZAFNJMIOTHYJRJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 14
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 14
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 14
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 description 14
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 14
- 239000006260 foam Substances 0.000 description 14
- 239000003208 petroleum Substances 0.000 description 14
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 13
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 12
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 239000012456 homogeneous solution Substances 0.000 description 12
- 238000004191 hydrophobic interaction chromatography Methods 0.000 description 12
- 239000013638 trimer Substances 0.000 description 12
- 239000000074 antisense oligonucleotide Substances 0.000 description 11
- 238000012230 antisense oligonucleotides Methods 0.000 description 11
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 11
- NRTYMEPCRDJMPZ-UHFFFAOYSA-N pyridine;2,2,2-trifluoroacetic acid Chemical group C1=CC=NC=C1.OC(=O)C(F)(F)F NRTYMEPCRDJMPZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 11
- HWCKGOZZJDHMNC-UHFFFAOYSA-M tetraethylammonium bromide Chemical compound [Br-].CC[N+](CC)(CC)CC HWCKGOZZJDHMNC-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 11
- 238000004704 ultra performance liquid chromatography Methods 0.000 description 11
- LRSASMSXMSNRBT-UHFFFAOYSA-N 5-methylcytosine Chemical compound CC1=CNC(=O)N=C1N LRSASMSXMSNRBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N Uracil Chemical compound O=C1C=CNC(=O)N1 ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 229940125904 compound 1 Drugs 0.000 description 10
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 10
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 10
- 125000002950 monocyclic group Chemical group 0.000 description 10
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 10
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 10
- MHYGQXWCZAYSLJ-UHFFFAOYSA-N tert-butyl-chloro-diphenylsilane Chemical compound C=1C=CC=CC=1[Si](Cl)(C(C)(C)C)C1=CC=CC=C1 MHYGQXWCZAYSLJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- YBRBMKDOPFTVDT-UHFFFAOYSA-N tert-butylamine Chemical compound CC(C)(C)N YBRBMKDOPFTVDT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- GETQZCLCWQTVFV-UHFFFAOYSA-N trimethylamine Chemical compound CN(C)C GETQZCLCWQTVFV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 9
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 description 9
- 238000011118 depth filtration Methods 0.000 description 9
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 9
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 8
- 125000001181 organosilyl group Chemical group [SiH3]* 0.000 description 8
- 150000004713 phosphodiesters Chemical class 0.000 description 8
- 229940113082 thymine Drugs 0.000 description 8
- 238000011097 chromatography purification Methods 0.000 description 7
- 229960005215 dichloroacetic acid Drugs 0.000 description 7
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 7
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 7
- 238000005731 phosphitylation reaction Methods 0.000 description 7
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 7
- FPGGTKZVZWFYPV-UHFFFAOYSA-M tetrabutylammonium fluoride Chemical group [F-].CCCC[N+](CCCC)(CCCC)CCCC FPGGTKZVZWFYPV-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 7
- JUDOLRSMWHVKGX-UHFFFAOYSA-N 1,1-dioxo-1$l^{6},2-benzodithiol-3-one Chemical compound C1=CC=C2C(=O)SS(=O)(=O)C2=C1 JUDOLRSMWHVKGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- GQHTUMJGOHRCHB-UHFFFAOYSA-N 2,3,4,6,7,8,9,10-octahydropyrimido[1,2-a]azepine Chemical group C1CCCCN2CCCN=C21 GQHTUMJGOHRCHB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 6
- KRHYYFGTRYWZRS-UHFFFAOYSA-N Fluorane Chemical compound F KRHYYFGTRYWZRS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 101100294463 Human adenovirus E serotype 4 L2 gene Proteins 0.000 description 6
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 6
- AFVFQIVMOAPDHO-UHFFFAOYSA-N Methanesulfonic acid Chemical compound CS(O)(=O)=O AFVFQIVMOAPDHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M Potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 108091028664 Ribonucleotide Proteins 0.000 description 6
- YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N Toluene Chemical compound CC1=CC=CC=C1 YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 6
- 150000003973 alkyl amines Chemical class 0.000 description 6
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 description 6
- 125000002619 bicyclic group Chemical group 0.000 description 6
- OSGAYBCDTDRGGQ-UHFFFAOYSA-L calcium sulfate Chemical compound [Ca+2].[O-]S([O-])(=O)=O OSGAYBCDTDRGGQ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 6
- 239000005457 ice water Substances 0.000 description 6
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 6
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 6
- 239000012074 organic phase Substances 0.000 description 6
- 239000002336 ribonucleotide Substances 0.000 description 6
- 125000002652 ribonucleotide group Chemical group 0.000 description 6
- IXGZXXBJSZISOO-UHFFFAOYSA-N s-(2-phenylacetyl)sulfanyl 2-phenylethanethioate Chemical compound C=1C=CC=CC=1CC(=O)SSC(=O)CC1=CC=CC=C1 IXGZXXBJSZISOO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- BHRZNVHARXXAHW-UHFFFAOYSA-N sec-butylamine Chemical compound CCC(C)N BHRZNVHARXXAHW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 6
- 238000005486 sulfidation Methods 0.000 description 6
- YWZHEXZIISFIDA-UHFFFAOYSA-N 5-amino-1,2,4-dithiazole-3-thione Chemical compound NC1=NC(=S)SS1 YWZHEXZIISFIDA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- GONFBOIJNUKKST-UHFFFAOYSA-N 5-ethylsulfanyl-2h-tetrazole Chemical compound CCSC=1N=NNN=1 GONFBOIJNUKKST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000007900 aqueous suspension Substances 0.000 description 5
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 description 5
- 239000012065 filter cake Substances 0.000 description 5
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 5
- 125000005842 heteroatom Chemical group 0.000 description 5
- 238000001819 mass spectrum Methods 0.000 description 5
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 5
- 150000007530 organic bases Chemical class 0.000 description 5
- 125000004193 piperazinyl group Chemical group 0.000 description 5
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 5
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 5
- ILMRJRBKQSSXGY-UHFFFAOYSA-N tert-butyl(dimethyl)silicon Chemical group C[Si](C)C(C)(C)C ILMRJRBKQSSXGY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 125000000026 trimethylsilyl group Chemical group [H]C([H])([H])[Si]([*])(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 5
- 229940035893 uracil Drugs 0.000 description 5
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 4
- XGDRLCRGKUCBQL-UHFFFAOYSA-N 1h-imidazole-4,5-dicarbonitrile Chemical group N#CC=1N=CNC=1C#N XGDRLCRGKUCBQL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- HAEQAUJYNHQVHV-UHFFFAOYSA-N 3-[4-(aminomethyl)-6-(trifluoromethyl)pyridin-2-yl]oxy-N-phenylbenzamide Chemical compound NCC1=CC(=NC(=C1)C(F)(F)F)OC=1C=C(C(=O)NC2=CC=CC=C2)C=CC=1 HAEQAUJYNHQVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N Argon Chemical compound [Ar] XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- ZEEBGORNQSEQBE-UHFFFAOYSA-N [2-(3-phenylphenoxy)-6-(trifluoromethyl)pyridin-4-yl]methanamine Chemical compound C1(=CC(=CC=C1)OC1=NC(=CC(=C1)CN)C(F)(F)F)C1=CC=CC=C1 ZEEBGORNQSEQBE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 125000004429 atom Chemical group 0.000 description 4
- 125000004452 carbocyclyl group Chemical group 0.000 description 4
- GLUUGHFHXGJENI-UHFFFAOYSA-N diethylenediamine Natural products C1CNCCN1 GLUUGHFHXGJENI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229910052731 fluorine Inorganic materials 0.000 description 4
- 238000005984 hydrogenation reaction Methods 0.000 description 4
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 4
- 125000000896 monocarboxylic acid group Chemical group 0.000 description 4
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 4
- 238000002515 oligonucleotide synthesis Methods 0.000 description 4
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 4
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 4
- 238000002953 preparative HPLC Methods 0.000 description 4
- 238000001308 synthesis method Methods 0.000 description 4
- 125000002053 thietanyl group Chemical group 0.000 description 4
- 125000000025 triisopropylsilyl group Chemical group C(C)(C)[Si](C(C)C)(C(C)C)* 0.000 description 4
- GBBJBUGPGFNISJ-YDQXZVTASA-N (4as,7r,8as)-9,9-dimethyltetrahydro-4h-4a,7-methanobenzo[c][1,2]oxazireno[2,3-b]isothiazole 3,3-dioxide Chemical compound C1S(=O)(=O)N2O[C@@]32C[C@@H]2C(C)(C)[C@]13CC2 GBBJBUGPGFNISJ-YDQXZVTASA-N 0.000 description 3
- MCTWTZJPVLRJOU-UHFFFAOYSA-N 1-methyl-1H-imidazole Chemical compound CN1C=CN=C1 MCTWTZJPVLRJOU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- JVSFQJZRHXAUGT-UHFFFAOYSA-N 2,2-dimethylpropanoyl chloride Chemical compound CC(C)(C)C(Cl)=O JVSFQJZRHXAUGT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- LKDWQHQNDDNHSC-UHFFFAOYSA-N 5-phenyl-1,2,4-dithiazol-3-one Chemical compound S1SC(=O)N=C1C1=CC=CC=C1 LKDWQHQNDDNHSC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N Ammonium acetate Chemical compound N.CC(O)=O USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000005695 Ammonium acetate Substances 0.000 description 3
- UHOVQNZJYSORNB-UHFFFAOYSA-N Benzene Chemical compound C1=CC=CC=C1 UHOVQNZJYSORNB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 3
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 3
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L Sodium Sulfate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])(=O)=O PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 3
- 229940043376 ammonium acetate Drugs 0.000 description 3
- 235000019257 ammonium acetate Nutrition 0.000 description 3
- SRSXLGNVWSONIS-UHFFFAOYSA-N benzenesulfonic acid Chemical compound OS(=O)(=O)C1=CC=CC=C1 SRSXLGNVWSONIS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229940092714 benzenesulfonic acid Drugs 0.000 description 3
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 3
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 3
- 235000011148 calcium chloride Nutrition 0.000 description 3
- 235000011132 calcium sulphate Nutrition 0.000 description 3
- 239000005547 deoxyribonucleotide Substances 0.000 description 3
- 125000002637 deoxyribonucleotide group Chemical group 0.000 description 3
- 150000002009 diols Chemical class 0.000 description 3
- 238000004821 distillation Methods 0.000 description 3
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 3
- 125000003187 heptyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 3
- 150000002430 hydrocarbons Chemical group 0.000 description 3
- 238000011031 large-scale manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 3
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 229940098779 methanesulfonic acid Drugs 0.000 description 3
- 239000001103 potassium chloride Substances 0.000 description 3
- 235000011164 potassium chloride Nutrition 0.000 description 3
- 238000004886 process control Methods 0.000 description 3
- 239000000376 reactant Substances 0.000 description 3
- 238000007086 side reaction Methods 0.000 description 3
- 229910052938 sodium sulfate Inorganic materials 0.000 description 3
- 235000011152 sodium sulphate Nutrition 0.000 description 3
- 230000000707 stereoselective effect Effects 0.000 description 3
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 3
- 125000001412 tetrahydropyranyl group Chemical group 0.000 description 3
- 125000001544 thienyl group Chemical group 0.000 description 3
- YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N trichloroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(Cl)(Cl)Cl YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000004073 vulcanization Methods 0.000 description 3
- SDTORDSXCYSNTD-UHFFFAOYSA-N 1-methoxy-4-[(4-methoxyphenyl)methoxymethyl]benzene Chemical compound C1=CC(OC)=CC=C1COCC1=CC=C(OC)C=C1 SDTORDSXCYSNTD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CXBDYQVECUFKRK-UHFFFAOYSA-N 1-methoxybutane Chemical compound CCCCOC CXBDYQVECUFKRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FZWGECJQACGGTI-UHFFFAOYSA-N 2-amino-7-methyl-1,7-dihydro-6H-purin-6-one Chemical compound NC1=NC(O)=C2N(C)C=NC2=N1 FZWGECJQACGGTI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ITQTTZVARXURQS-UHFFFAOYSA-N 3-methylpyridine Chemical compound CC1=CC=CN=C1 ITQTTZVARXURQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OIVLITBTBDPEFK-UHFFFAOYSA-N 5,6-dihydrouracil Chemical compound O=C1CCNC(=O)N1 OIVLITBTBDPEFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- RYVNIFSIEDRLSJ-UHFFFAOYSA-N 5-(hydroxymethyl)cytosine Chemical compound NC=1NC(=O)N=CC=1CO RYVNIFSIEDRLSJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LRFVTYWOQMYALW-UHFFFAOYSA-N 9H-xanthine Chemical compound O=C1NC(=O)NC2=C1NC=N2 LRFVTYWOQMYALW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N Ammonium hydroxide Chemical compound [NH4+].[OH-] VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108020000948 Antisense Oligonucleotides Proteins 0.000 description 2
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ABLZXFCXXLZCGV-UHFFFAOYSA-N Phosphorous acid Chemical group OP(O)=O ABLZXFCXXLZCGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910004298 SiO 2 Inorganic materials 0.000 description 2
- CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L Sodium Carbonate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C([O-])=O CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-N Thiophosphoric acid Chemical class OP(O)(S)=O RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ABRVLXLNVJHDRQ-UHFFFAOYSA-N [2-pyridin-3-yl-6-(trifluoromethyl)pyridin-4-yl]methanamine Chemical compound FC(C1=CC(=CC(=N1)C=1C=NC=CC=1)CN)(F)F ABRVLXLNVJHDRQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N adenosine Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 2
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000011114 ammonium hydroxide Nutrition 0.000 description 2
- 150000003863 ammonium salts Chemical class 0.000 description 2
- 229910052786 argon Inorganic materials 0.000 description 2
- 125000002029 aromatic hydrocarbon group Chemical group 0.000 description 2
- 125000002393 azetidinyl group Chemical group 0.000 description 2
- JEHKKBHWRAXMCH-UHFFFAOYSA-N benzenesulfinic acid Chemical compound O[S@@](=O)C1=CC=CC=C1 JEHKKBHWRAXMCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000003236 benzoyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C(*)=O 0.000 description 2
- 239000013043 chemical agent Substances 0.000 description 2
- 238000010549 co-Evaporation Methods 0.000 description 2
- 125000001047 cyclobutenyl group Chemical group C1(=CCC1)* 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- UZUODNWWWUQRIR-UHFFFAOYSA-L disodium;3-aminonaphthalene-1,5-disulfonate Chemical compound [Na+].[Na+].C1=CC=C(S([O-])(=O)=O)C2=CC(N)=CC(S([O-])(=O)=O)=C21 UZUODNWWWUQRIR-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 125000005883 dithianyl group Chemical group 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 239000006167 equilibration buffer Substances 0.000 description 2
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 2
- NPZTUJOABDZTLV-UHFFFAOYSA-N hydroxybenzotriazole Substances O=C1C=CC=C2NNN=C12 NPZTUJOABDZTLV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N hypoxanthine Chemical compound O=C1NC=NC2=C1NC=N2 FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 150000002460 imidazoles Chemical class 0.000 description 2
- 125000002883 imidazolyl group Chemical group 0.000 description 2
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 2
- NSPJNIDYTSSIIY-UHFFFAOYSA-N methoxy(methoxymethoxy)methane Chemical compound COCOCOC NSPJNIDYTSSIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 2
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 2
- 150000002894 organic compounds Chemical class 0.000 description 2
- AHHWIHXENZJRFG-UHFFFAOYSA-N oxetane Chemical compound C1COC1 AHHWIHXENZJRFG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 2
- VLTRZXGMWDSKGL-UHFFFAOYSA-N perchloric acid Chemical compound OCl(=O)(=O)=O VLTRZXGMWDSKGL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- SXADIBFZNXBEGI-UHFFFAOYSA-N phosphoramidous acid Chemical group NP(O)O SXADIBFZNXBEGI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000010791 quenching Methods 0.000 description 2
- 230000000171 quenching effect Effects 0.000 description 2
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 2
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 2
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 2
- 159000000000 sodium salts Chemical class 0.000 description 2
- 238000010532 solid phase synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 125000003003 spiro group Chemical group 0.000 description 2
- 150000003457 sulfones Chemical class 0.000 description 2
- 150000003462 sulfoxides Chemical class 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- 125000001984 thiazolidinyl group Chemical group 0.000 description 2
- 150000003573 thiols Chemical class 0.000 description 2
- ZGYICYBLPGRURT-UHFFFAOYSA-N tri(propan-2-yl)silicon Chemical compound CC(C)[Si](C(C)C)C(C)C ZGYICYBLPGRURT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- RIOQSEWOXXDEQQ-UHFFFAOYSA-N triphenylphosphine Chemical compound C1=CC=CC=C1P(C=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 RIOQSEWOXXDEQQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- BVOMRRWJQOJMPA-UHFFFAOYSA-N 1,2,3-trithiane Chemical group C1CSSSC1 BVOMRRWJQOJMPA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BGJSXRVXTHVRSN-UHFFFAOYSA-N 1,3,5-trioxane Chemical group C1OCOCO1 BGJSXRVXTHVRSN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OXFSTTJBVAAALW-UHFFFAOYSA-N 1,3-dihydroimidazole-2-thione Chemical compound SC1=NC=CN1 OXFSTTJBVAAALW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IMLSAISZLJGWPP-UHFFFAOYSA-N 1,3-dithiolane Chemical compound C1CSCS1 IMLSAISZLJGWPP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RRQYJINTUHWNHW-UHFFFAOYSA-N 1-ethoxy-2-(2-ethoxyethoxy)ethane Chemical compound CCOCCOCCOCC RRQYJINTUHWNHW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GPAAEZIXSQCCES-UHFFFAOYSA-N 1-methoxy-2-(2-methoxyethoxymethoxymethoxy)ethane Chemical compound COCCOCOCOCCOC GPAAEZIXSQCCES-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- TZMSYXZUNZXBOL-UHFFFAOYSA-N 10H-phenoxazine Chemical compound C1=CC=C2NC3=CC=CC=C3OC2=C1 TZMSYXZUNZXBOL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ABEXEQSGABRUHS-UHFFFAOYSA-N 16-methylheptadecyl 16-methylheptadecanoate Chemical compound CC(C)CCCCCCCCCCCCCCCOC(=O)CCCCCCCCCCCCCCC(C)C ABEXEQSGABRUHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005160 1H NMR spectroscopy Methods 0.000 description 1
- KJUGUADJHNHALS-UHFFFAOYSA-N 1H-tetrazole Substances C=1N=NNN=1 KJUGUADJHNHALS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YQTCQNIPQMJNTI-UHFFFAOYSA-N 2,2-dimethylpropan-1-one Chemical group CC(C)(C)[C]=O YQTCQNIPQMJNTI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000003660 2,3-dimethylpentyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])C([H])(C([H])([H])[H])C([H])(C([H])([H])[H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- NGNBDVOYPDDBFK-UHFFFAOYSA-N 2-[2,4-di(pentan-2-yl)phenoxy]acetyl chloride Chemical compound CCCC(C)C1=CC=C(OCC(Cl)=O)C(C(C)CCC)=C1 NGNBDVOYPDDBFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000001731 2-cyanoethyl group Chemical group [H]C([H])(*)C([H])([H])C#N 0.000 description 1
- ASJSAQIRZKANQN-CRCLSJGQSA-N 2-deoxy-D-ribose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)CC=O ASJSAQIRZKANQN-CRCLSJGQSA-N 0.000 description 1
- JWUJQDFVADABEY-UHFFFAOYSA-N 2-methyltetrahydrofuran Chemical compound CC1CCCO1 JWUJQDFVADABEY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JMTMSDXUXJISAY-UHFFFAOYSA-N 2H-benzotriazol-4-ol Chemical compound OC1=CC=CC2=C1N=NN2 JMTMSDXUXJISAY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MZSAMHOCTRNOIZ-UHFFFAOYSA-N 3-[4-(aminomethyl)-6-(trifluoromethyl)pyridin-2-yl]oxy-N-phenylaniline Chemical compound NCC1=CC(=NC(=C1)C(F)(F)F)OC=1C=C(NC2=CC=CC=C2)C=CC=1 MZSAMHOCTRNOIZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QSIFOTQDNVCTTM-UHFFFAOYSA-N 3-methyl-1h-imidazol-3-ium;trifluoromethanesulfonate Chemical compound CN1C=CN=C1.OS(=O)(=O)C(F)(F)F QSIFOTQDNVCTTM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000003469 3-methylhexyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(C([H])([H])[H])C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- DWAQDRSOVMLGRQ-UHFFFAOYSA-N 5-methoxyindole Chemical compound COC1=CC=C2NC=CC2=C1 DWAQDRSOVMLGRQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YPKBCLZFIYBSHK-UHFFFAOYSA-N 5-methylindole Chemical compound CC1=CC=C2NC=CC2=C1 YPKBCLZFIYBSHK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NOWKCMXCCJGMRR-UHFFFAOYSA-N Aziridine Chemical compound C1CN1 NOWKCMXCCJGMRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910014033 C-OH Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002126 C01EB10 - Adenosine Substances 0.000 description 1
- 125000003601 C2-C6 alkynyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000006414 CCl Chemical group ClC* 0.000 description 1
- DCERHCFNWRGHLK-UHFFFAOYSA-N C[Si](C)C Chemical compound C[Si](C)C DCERHCFNWRGHLK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910014570 C—OH Inorganic materials 0.000 description 1
- GSNUFIFRDBKVIE-UHFFFAOYSA-N DMF Natural products CC1=CC=C(C)O1 GSNUFIFRDBKVIE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LCGLNKUTAGEVQW-UHFFFAOYSA-N Dimethyl ether Chemical compound COC LCGLNKUTAGEVQW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N Hypoxanthine nucleoside Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(NC=NC2=O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000764238 Isis Species 0.000 description 1
- 239000005909 Kieselgur Substances 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 238000003820 Medium-pressure liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N Pyrimidine Chemical compound C1=CN=CN=C1 CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OJFKUJDRGJSAQB-UHFFFAOYSA-N TAK-632 Chemical compound C1=C(NC(=O)CC=2C=C(C=CC=2)C(F)(F)F)C(F)=CC=C1OC(C(=C1S2)C#N)=CC=C1N=C2NC(=O)C1CC1 OJFKUJDRGJSAQB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JXASPPWQHFOWPL-UHFFFAOYSA-N Tamarixin Natural products C1=C(O)C(OC)=CC=C1C1=C(OC2C(C(O)C(O)C(CO)O2)O)C(=O)C2=C(O)C=C(O)C=C2O1 JXASPPWQHFOWPL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- REAYFGLASQTHKB-UHFFFAOYSA-N [2-[3-(1H-pyrazol-4-yl)phenoxy]-6-(trifluoromethyl)pyridin-4-yl]methanamine Chemical compound N1N=CC(=C1)C=1C=C(OC2=NC(=CC(=C2)CN)C(F)(F)F)C=CC=1 REAYFGLASQTHKB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SAHIZENKTPRYSN-UHFFFAOYSA-N [2-[3-(phenoxymethyl)phenoxy]-6-(trifluoromethyl)pyridin-4-yl]methanamine Chemical compound O(C1=CC=CC=C1)CC=1C=C(OC2=NC(=CC(=C2)CN)C(F)(F)F)C=CC=1 SAHIZENKTPRYSN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000002777 acetyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(*)=O 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 229960005305 adenosine Drugs 0.000 description 1
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 1
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 1
- 150000008044 alkali metal hydroxides Chemical class 0.000 description 1
- 229910001860 alkaline earth metal hydroxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 1
- 150000004945 aromatic hydrocarbons Chemical group 0.000 description 1
- 239000012298 atmosphere Substances 0.000 description 1
- 125000003725 azepanyl group Chemical group 0.000 description 1
- HONIICLYMWZJFZ-UHFFFAOYSA-N azetidine Chemical compound C1CNC1 HONIICLYMWZJFZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000004069 aziridinyl group Chemical group 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 125000002527 bicyclic carbocyclic group Chemical group 0.000 description 1
- 125000002618 bicyclic heterocycle group Chemical group 0.000 description 1
- 229920001222 biopolymer Polymers 0.000 description 1
- 125000001246 bromo group Chemical group Br* 0.000 description 1
- YXMVRBZGTJFMLH-UHFFFAOYSA-N butylsilane Chemical compound CCCC[SiH3] YXMVRBZGTJFMLH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 125000001309 chloro group Chemical group Cl* 0.000 description 1
- FOCAUTSVDIKZOP-UHFFFAOYSA-N chloroacetic acid Chemical compound OC(=O)CCl FOCAUTSVDIKZOP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YGHUUVGIRWMJGE-UHFFFAOYSA-N chlorodimethylsilane Chemical compound C[SiH](C)Cl YGHUUVGIRWMJGE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960004106 citric acid Drugs 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 229940125782 compound 2 Drugs 0.000 description 1
- 229940126214 compound 3 Drugs 0.000 description 1
- 229940125898 compound 5 Drugs 0.000 description 1
- 239000006184 cosolvent Substances 0.000 description 1
- 125000001995 cyclobutyl group Chemical group [H]C1([H])C([H])([H])C([H])(*)C1([H])[H] 0.000 description 1
- 125000002188 cycloheptatrienyl group Chemical group C1(=CC=CC=CC1)* 0.000 description 1
- 125000001162 cycloheptenyl group Chemical group C1(=CCCCCC1)* 0.000 description 1
- 125000000582 cycloheptyl group Chemical group [H]C1([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(*)C([H])([H])C1([H])[H] 0.000 description 1
- 125000003678 cyclohexadienyl group Chemical group C1(=CC=CCC1)* 0.000 description 1
- 125000000596 cyclohexenyl group Chemical group C1(=CCCCC1)* 0.000 description 1
- 125000000113 cyclohexyl group Chemical group [H]C1([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(*)C([H])([H])C1([H])[H] 0.000 description 1
- 125000000058 cyclopentadienyl group Chemical group C1(=CC=CC1)* 0.000 description 1
- 125000002433 cyclopentenyl group Chemical group C1(=CCCC1)* 0.000 description 1
- 125000001511 cyclopentyl group Chemical group [H]C1([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(*)C1([H])[H] 0.000 description 1
- 125000000298 cyclopropenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C1([H])* 0.000 description 1
- 125000001559 cyclopropyl group Chemical group [H]C1([H])C([H])([H])C1([H])* 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 1
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000005549 deoxyribonucleoside Substances 0.000 description 1
- 125000005959 diazepanyl group Chemical group 0.000 description 1
- GAURFLBIDLSLQU-UHFFFAOYSA-N diethoxy(methyl)silicon Chemical compound CCO[Si](C)OCC GAURFLBIDLSLQU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HPNMFZURTQLUMO-UHFFFAOYSA-N diethylamine Chemical compound CCNCC HPNMFZURTQLUMO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000004852 dihydrofuranyl group Chemical group O1C(CC=C1)* 0.000 description 1
- 125000005046 dihydronaphthyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000005043 dihydropyranyl group Chemical group O1C(CCC=C1)* 0.000 description 1
- OIKHZBFJHONJJB-UHFFFAOYSA-N dimethyl(phenyl)silicon Chemical compound C[Si](C)C1=CC=CC=C1 OIKHZBFJHONJJB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000532 dioxanyl group Chemical group 0.000 description 1
- NAGJZTKCGNOGPW-UHFFFAOYSA-K dioxido-sulfanylidene-sulfido-$l^{5}-phosphane Chemical compound [O-]P([O-])([S-])=S NAGJZTKCGNOGPW-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 125000000597 dioxinyl group Chemical group 0.000 description 1
- ASQQEOXYFGEFKQ-UHFFFAOYSA-N dioxirane Chemical compound C1OO1 ASQQEOXYFGEFKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VDCSGNNYCFPWFK-UHFFFAOYSA-N diphenylsilane Chemical compound C=1C=CC=CC=1[SiH2]C1=CC=CC=C1 VDCSGNNYCFPWFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KPUWHANPEXNPJT-UHFFFAOYSA-N disiloxane Chemical class [SiH3]O[SiH3] KPUWHANPEXNPJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- ZSWFCLXCOIISFI-UHFFFAOYSA-N endo-cyclopentadiene Natural products C1C=CC=C1 ZSWFCLXCOIISFI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000002170 ethers Chemical class 0.000 description 1
- 125000001495 ethyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 1
- 125000003983 fluorenyl group Chemical group C1(=CC=CC=2C3=CC=CC=C3CC12)* 0.000 description 1
- 125000001153 fluoro group Chemical group F* 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 125000003838 furazanyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000002541 furyl group Chemical group 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- VTIZPJJBPVMLRT-UHFFFAOYSA-N heptane;2-propan-2-yloxypropane Chemical compound CCCCCCC.CC(C)OC(C)C VTIZPJJBPVMLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QGGUMTNPIYCTSF-UHFFFAOYSA-N hexylsilane Chemical compound CCCCCC[SiH3] QGGUMTNPIYCTSF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012145 high-salt buffer Substances 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 125000001165 hydrophobic group Chemical group 0.000 description 1
- WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N hydroxyacetaldehyde Natural products OCC=O WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005417 image-selected in vivo spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 125000002632 imidazolidinyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000002636 imidazolinyl group Chemical group 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 125000003392 indanyl group Chemical group C1(CCC2=CC=CC=C12)* 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 229910017053 inorganic salt Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000012739 integrated shape imaging system Methods 0.000 description 1
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 description 1
- 125000002346 iodo group Chemical group I* 0.000 description 1
- 125000000959 isobutyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])(C([H])([H])[H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 125000001972 isopentyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])(C([H])([H])[H])C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 125000001449 isopropyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])(*)C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 125000004628 isothiazolidinyl group Chemical group S1N(CCC1)* 0.000 description 1
- 125000001786 isothiazolyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000003965 isoxazolidinyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000000842 isoxazolyl group Chemical group 0.000 description 1
- OKHRRIGNGQFVEE-UHFFFAOYSA-N methyl(diphenyl)silicon Chemical compound C=1C=CC=CC=1[Si](C)C1=CC=CC=C1 OKHRRIGNGQFVEE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LAQFLZHBVPULPL-UHFFFAOYSA-N methyl(phenyl)silicon Chemical compound C[Si]C1=CC=CC=C1 LAQFLZHBVPULPL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CPZBTYRIGVOOMI-UHFFFAOYSA-N methylsulfanyl(methylsulfanylmethoxy)methane Chemical compound CSCOCSC CPZBTYRIGVOOMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000001620 monocyclic carbocycle group Chemical group 0.000 description 1
- PJUIMOJAAPLTRJ-UHFFFAOYSA-N monothioglycerol Chemical compound OCC(O)CS PJUIMOJAAPLTRJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000002757 morpholinyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000004108 n-butyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 125000003136 n-heptyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 125000001280 n-hexyl group Chemical group C(CCCCC)* 0.000 description 1
- 125000000740 n-pentyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 125000004123 n-propyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 125000001624 naphthyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000001971 neopentyl group Chemical group [H]C([*])([H])C(C([H])([H])[H])(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 230000005257 nucleotidylation Effects 0.000 description 1
- KZCOBXFFBQJQHH-UHFFFAOYSA-N octane-1-thiol Chemical compound CCCCCCCCS KZCOBXFFBQJQHH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003791 organic solvent mixture Substances 0.000 description 1
- 125000001715 oxadiazolyl group Chemical group 0.000 description 1
- AICOOMRHRUFYCM-ZRRPKQBOSA-N oxazine, 1 Chemical compound C([C@@H]1[C@H](C(C[C@]2(C)[C@@H]([C@H](C)N(C)C)[C@H](O)C[C@]21C)=O)CC1=CC2)C[C@H]1[C@@]1(C)[C@H]2N=C(C(C)C)OC1 AICOOMRHRUFYCM-ZRRPKQBOSA-N 0.000 description 1
- 125000000160 oxazolidinyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000002971 oxazolyl group Chemical group 0.000 description 1
- ATYBXHSAIOKLMG-UHFFFAOYSA-N oxepin Chemical group O1C=CC=CC=C1 ATYBXHSAIOKLMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000003566 oxetanyl group Chemical group 0.000 description 1
- 230000002572 peristaltic effect Effects 0.000 description 1
- PARWUHTVGZSQPD-UHFFFAOYSA-N phenylsilane Chemical compound [SiH3]C1=CC=CC=C1 PARWUHTVGZSQPD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 125000003386 piperidinyl group Chemical group 0.000 description 1
- 239000002798 polar solvent Substances 0.000 description 1
- XAEFZNCEHLXOMS-UHFFFAOYSA-M potassium benzoate Chemical compound [K+].[O-]C(=O)C1=CC=CC=C1 XAEFZNCEHLXOMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 125000004219 purine nucleobase group Chemical group 0.000 description 1
- 150000003212 purines Chemical class 0.000 description 1
- 125000004309 pyranyl group Chemical group O1C(C=CC=C1)* 0.000 description 1
- 125000003373 pyrazinyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000003072 pyrazolidinyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000003226 pyrazolyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000002098 pyridazinyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000004076 pyridyl group Chemical group 0.000 description 1
- 150000003230 pyrimidines Chemical class 0.000 description 1
- 125000000714 pyrimidinyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000000719 pyrrolidinyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000000168 pyrrolyl group Chemical group 0.000 description 1
- 239000002342 ribonucleoside Substances 0.000 description 1
- 125000006413 ring segment Chemical group 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 125000002914 sec-butyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])C([H])(*)C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 229910000077 silane Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 1
- 229910000029 sodium carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 239000006104 solid solution Substances 0.000 description 1
- LMUMMJCCZMWLEN-UHFFFAOYSA-N spiro[3.3]heptyl Chemical group [CH]1CCC11CCC1 LMUMMJCCZMWLEN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 1
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 description 1
- RINCXYDBBGOEEQ-UHFFFAOYSA-N succinic anhydride Chemical compound O=C1CCC(=O)O1 RINCXYDBBGOEEQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010189 synthetic method Methods 0.000 description 1
- 125000000999 tert-butyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(*)(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 125000003718 tetrahydrofuranyl group Chemical group 0.000 description 1
- CXWXQJXEFPUFDZ-UHFFFAOYSA-N tetralin Chemical compound C1=CC=C2CCCCC2=C1 CXWXQJXEFPUFDZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000005247 tetrazinyl group Chemical group N1=NN=NC(=C1)* 0.000 description 1
- 125000003831 tetrazolyl group Chemical group 0.000 description 1
- WROMPOXWARCANT-UHFFFAOYSA-N tfa trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F.OC(=O)C(F)(F)F WROMPOXWARCANT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- 125000001113 thiadiazolyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000004305 thiazinyl group Chemical group S1NC(=CC=C1)* 0.000 description 1
- 125000000335 thiazolyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000001583 thiepanyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000001166 thiolanyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000004568 thiomorpholinyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000004306 triazinyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000001425 triazolyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000006168 tricyclic group Chemical group 0.000 description 1
- ITMCEJHCFYSIIV-UHFFFAOYSA-N triflic acid Chemical compound OS(=O)(=O)C(F)(F)F ITMCEJHCFYSIIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AKQNYQDSIDKVJZ-UHFFFAOYSA-N triphenylsilane Chemical compound C1=CC=CC=C1[SiH](C=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 AKQNYQDSIDKVJZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 239000003643 water by type Substances 0.000 description 1
- 238000010626 work up procedure Methods 0.000 description 1
- 229940075420 xanthine Drugs 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H1/00—Processes for the preparation of sugar derivatives
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H1/00—Processes for the preparation of sugar derivatives
- C07H1/02—Phosphorylation
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
- C07H21/02—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids with ribosyl as saccharide radical
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
- C07H21/04—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids with deoxyribosyl as saccharide radical
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/55—Design of synthesis routes, e.g. reducing the use of auxiliary or protecting groups
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Abstract
本公开描述了一种通过偶联两个或更多个寡核苷酸片段来制造寡核苷酸的汇聚液相方法，每个寡核苷酸片段具有两个或更多个核苷酸。本公开还提供了所述汇聚液相方法所牵涉的反应步骤。
Description
本申请是基于申请日为2020年05月08日，申请号为202080044020.2(PCT/US2020/032070)，发明名称为：“寡核苷酸的汇聚液相合成”的专利申请的分案申请。
相关申请
本申请根据35U.S.C.§119(e)要求2019年5月8日提交的美国临时申请第62/856,160号的提交日期的权益，其全部内容以引用的方式并入本文。
背景技术
寡核苷酸是短的DNA或RNA寡聚物，其可通过化学方式合成以用于广泛的应用。利用合成寡核苷酸作为治疗剂的最新发展增加了对能够以高效率和纯度大量生产寡核苷酸的合成方法的需求。
传统上，寡核苷酸是通过固相自动合成仪，利用亚磷酰胺化学合成的，限于小于2摩尔的规模。因此，固相合成不足以生产大量适应症的寡核苷酸药物的临床开发和商业化所需的材料。此外，固相合成通常需要使用过量的试剂，且因此增加了与生产靶寡核苷酸相关的成本。
因此，需要一种稳健的方法来合成适用于以高效率和高纯度进行的大规模制造过程的寡核苷酸。
发明内容
本公开描述了一种通过偶联两个或更多个(例如，三个、四个、五个、六个等)寡核苷酸片段来制造寡核苷酸的汇聚液相方法，每个寡核苷酸片段具有两个或更多个(例如，三个、四个、五个、六等)核苷酸。令人惊讶地发现，本公开的汇聚液相方法可用于合成具有高纯度的受保护寡核苷酸，而无需通过色谱法(例如柱色谱法)纯化，这使得所述方法适用作大规模制造过程。在脱保护和标准下游纯化后，可获得适用于治疗用途的高纯度ASO寡核苷酸。本公开还提供了涉及汇聚液相方法的反应步骤。
附图说明
图1示出了在产物化合物1-7氨解后获得的化合物1-7-a的反相HPLC和MS。
图2示出了沉淀后获得的产物化合物2-9的HPLC和MS。
图3示出了沉淀后获得的产物化合物3-5的HPLC和MS。
图4示出了沉淀后获得的产物化合物4-9的HPLC和MS。
图5示出了产物化合物5-2氨解后获得的化合物5-2-a的HPLC和MS。
图6示出了产物化合物5-3氨解后获得的化合物5-3-a的HPLC和MS。
图7示出了产物化合物5-5氨解后获得的化合物5-5-a的HPLC和MS。
图8示出了产物化合物5-6氨解后获得的化合物5-6-a的HPLC和MS。
图9示出了产物化合物1氨解后获得的化合物1-a的HPLC和MS。
图10示出了UCC三聚体脱三苯甲基化反应期间获得的脱氨基产物的HPLC比较。
图11示出了CC二聚体脱三苯甲基化反应期间获得的脱氨基产物的HPLC比较。
图12示出了产物ASO 9的HPLC-MS。
图13示出了6聚体DMT-dG-dT-dT-dG-dT-dT-OTBDPS的MS。
图14示出了10聚体DMT-Moe G-Moe U-Moe U-Moe U-Moe U-dT-dT-dG-dT-dT-OTBDPS的MS。
图15示出了化合物1-3A-H的MS。
图16示出了化合物4-3A-H的MS。
图17示出了化合物5-3A-H的MS。
图18示出了15聚体5'-ACoAGATATTTTTGTT-3'-OTBDPS的HPLC和MS。
图19示出了产物ASO 8的HPLC和MS。
图20示出了5'-DMT-GUUUUUGCAA-NO2-苯甲酰基的MS。
图21示出了LHPG脱保护的化合物7-a的HPLC和MS。
图22示出了LHPG脱保护的化合物7-b的HPLC和MS。
图23示出了LHPG脱保护的化合物7-c的HPLC和MS。
图24示出了LHPG脱保护的7-d化合物的HPLC和MS。
图25示出了ASO-9-1的HPLC和MS。
图26示出了LHPG脱保护的7-e化合物的HPLC和MS。
图27示出了ASO-9-2的HPLC和MS。
图28示出了化合物8.4的手性SFC-MS。
图29示出了化合物8.4的外消旋混合物的SFC-MS。
图30示出了化合物8A的HPLC和MS。
图31示出了化合物8.2.12的HPLC和MS。
图32示出了化合物8B的HPLC和MS。
图33示出了化合物8C的HPLC和MS。
具体实施方式
本公开的发明人首次开发了一种用于制备靶寡核苷酸的汇聚液相方法。令人惊讶的是，汇聚液相方法可以大规模生产高纯度的受保护靶寡核苷酸，而无需从寡核苷酸片段的组装中进行色谱纯化。汇聚液相方法可通过从3'-端至5'-端(即3'-5'延伸)或从5'-端至3'-端(即，5'-3’延伸)方向上的延伸来产生靶寡核苷酸。本公开还提供了3'-羟基保护基的选择性脱保护方法，其不影响其他敏感基团，使得副产物的产生最少。本公开的发明人发现脱三苯甲基化反应中水的存在会导致脱氨基副反应(例如，寡核苷酸合成中常用的胞嘧啶或5-甲基胞嘧啶或其衍生物的脱氨基)。为了减少或防止脱氨基副产物的形成，已经开发了控制和最小化水位的反应条件以最小化脱三苯甲基化步骤期间的脱氨基。此外，还发现在脱三苯甲基化反应中使用阳离子清除剂(例如，RSH)促进脱三苯甲基化反应的完成(即，反应更容易完成)。阳离子清除剂的存在还使反应更不容易发生逆脱三苯甲基化(即，DMT保护基被添加回到脱保护的5'-OH基团上)。也已经证明，3'-羟基的亚磷酰化可在液相中进行而无需通过色谱法来纯化。已使用本公开的方法成功地合成了具有四个或五个核苷酸的寡核苷酸片段并在液相中与完全受保护的靶寡核苷酸偶联。通常，本公开中描述的液相方法可用于合成大量所需的受保护核苷酸或寡核苷酸产物，而无需色谱纯化。在脱保护和标准下游纯化后，获得适用于治疗用途的高纯度ASO寡核苷酸。
定义
术语“核碱基”是指核苷的杂环碱基部分。核碱基可为天然存在的或可为修饰的。在某些实施方案中，核碱基可包含能够与另一核酸的核碱基氢键合的任何原子或原子团。具体地，核碱基是杂环碱基，通常是嘌呤和嘧啶。除了“未修饰”或“天然”核碱基，诸如嘌呤核碱基腺嘌呤(A)和鸟嘌呤(G)，以及嘧啶核碱基胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)和尿嘧啶(U)之外，本领域技术人员已知的许多修饰的核碱基或核碱基模拟物也易于掺入通过本文所述方法合成的化合物中。在某些实施方案中，修饰的核碱基是在结构上与亲本核碱基相当类似的核碱基，例如像7-脱氮嘌呤、5-甲基胞嘧啶或G-钳。在某些实施方案中，核碱基模拟物包括更复杂的结构，例如像三环吩恶嗪核碱基模拟物。制备上述修饰的核碱基的方法是本领域技术人员公知的。
术语“核苷”是指包含杂环碱基部分和糖部分的化合物，其可在2'-端被修饰。
术语“核苷酸”是指包含磷酸酯或硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯连接基团的核苷。
术语“寡核苷酸”是指包含多个连接核苷的化合物。在某些实施方案中，多个核苷中的一个或多个被修饰。在某些实施方案中，寡核苷酸包含一个或多个核糖核苷(RNA)和/或脱氧核糖核苷(DNA)。
如本文所用，“靶寡核苷酸”是指可通过本公开的汇聚液相方法制备的寡核苷酸产物。在某些实施方案中，靶寡核苷酸包含至少10个或至少15个核苷酸。在某些实施方案中，靶寡核苷酸具有10至500、15至500、15至200、15至100、15至50、15至40、15至30或16至30个核苷酸。
如本文所用，“汇聚合成”是指用于制备靶寡核苷酸的合成过程，其中两个或更多个寡核苷酸片段从5'-3'方向或3'-5'方向组装。
如本文所用，“寡核苷酸片段”是指组装以制造靶寡核苷酸的短寡核苷酸。在某些实施方案中，寡核苷酸片段具有3至10、3至8、3至6或4至6个核苷酸。在某些实施方案中，寡核苷酸片段具有4或5个核苷酸。
术语“核苷间连键”意指寡核苷酸的相邻核苷之间的共价连键。
术语“缺口聚体(gapmer)”意指其中具有多个支持RNA酶H裂解的核苷的内部区域位于具有一个或多个核苷的外部区域之间的嵌合反义化合物，其中包含内部区域的核苷在化学上不同于包含外部区域的核苷。
如本文所用，术语“烷基”是指完全饱和的支链或非支链烃部分。优选烷基包含1至20个碳原子、更优选1至16个碳原子、1至10个碳原子、1至6个碳原子或1至4个碳原子。在一些实施方案中，烷基包含6至20个碳原子。烷基的代表性实例包括但不限于甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、异丁基、叔丁基、正戊基、异戊基、新戊基、正己基、3-甲基己基、2,2-二甲基戊基、2,3-二甲基戊基、正庚基、正辛基、正壬基或正癸基。
术语“芳基”是指在环部分中具有6至14个碳原子的单环、双环或三环芳烃基团。在一个实施方案中，术语芳基是指具有6至10个碳原子的单环和双环芳烃基团。芳基的代表性实例包括苯基、萘基、芴基和蒽基。
术语“芳基”还指的是双环或三环基团，其中至少一个环是芳族的并且稠合到一个或两个非芳族烃环上。非限制性实例包括四氢萘、二氢萘基和茚满基。
烷基或芳基的任选取代基在每次出现时独立地选自C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、3至7元碳环基、3至7元杂环基、卤基、-CN、-C(O)Ra、-C(O)2Ra、-C(O)N(Ra)2、-ORa、-N(Ra)2、-N(Ra)C(O)Ra、-N(Ra)N(Ra)2、-NO2、-N(Ra)C(O)2Ra、-N(Ra)C(O)N(Ra)2、-N(Ra)S(O)2Ra、-SRa、-S(O)Ra、-S(O)2Ra、-S(O)N(Ra)2和-S(O)2N(Ra)2；并且
Ra在每次出现时独立地选自H、C1-6烷基、3至6元单环碳环基和3至6元单环杂环基。
如本文所用，术语“环烷基”是指3-7个碳原子、3-6个或5-7个碳原子的饱和或不饱和单环或双环烃基。术语“碳环基”包括环烷基和芳族基团。术语“环烷基”是指3-7个碳原子、3-6个碳原子或5-7个碳原子的完全饱和的单环或双环烃基。示例性单环碳环基团包括但不限于：环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基、环丙烯基、环丁烯基、环戊烯基、环己烯基、环庚烯基、环丁二烯基、环戊二烯基、环己二烯基、环庚二烯基、苯基和环庚三烯基。示例性双环碳环基团包括双环[2.1.1]己基、双环[2.2.1]庚基、双环[2.2.1]庚烯基、三环[2.2.1.02,6]庚基、6,6-二甲基双环[3.1.1]庚基或2,6,6-三甲基双环[3.1.1]庚基、螺[2.2]戊基和螺[3.3]庚基。
如本文所用，术语“桥接环系统”是具有碳环基或杂环基环的环系统，其中环的两个非相邻原子通过一个或多个(优选一至三个)选自C、N、O或S的原子相连(桥接)。桥接环系统可具有6-7个环成员。
如本文所用，术语“螺环系统”是具有两个环的环系统，每个环独立地选自碳环基或杂环基，其中两个环结构具有一个共同的环原子。螺环系统具有5至7个环成员。
如本文所用，术语“杂环基”是指具有3至7个环成员、或尤其3至6个环成员或5至7个环成员的饱和或不饱和单环或双环(例如桥接或螺环系统)环系统，其中至少一个环成员为杂原子，且最多4个(例如1、2、3或4个)环成员可为杂原子，其中杂原子独立地选自O、S和N，且其中C可被氧化(例如C(O))，N可被氧化(例如N(O))或季铵化，且S可任选地被氧化成亚砜和砜。不饱和杂环包括杂芳环。如本文所用，术语“杂芳基”是指具有1至4个独立地选自O、S和N的杂原子的芳族5或6元单环系统，且其中N可被氧化(例如N(O))或季铵化，且S可任选地被氧化成亚砜和砜。在一个实施方案中，杂环基是3至7元饱和单环或3至6元饱和单环或5至7元饱和单环。在一个实施方案中，杂环基是3至7元单环或3至6元单环或5至7元单环。在另一实施方案中，杂环基是6或7元双环。杂环基可在杂原子或碳原子处连接。杂环基的实例包括氮杂环丙烷基、氧杂环丙烷基、硫杂环丙烷基、氧氮杂环丙烷基、二氧杂环丙烷基、氮杂环丁烷基、氧杂环丁烷基、硫杂环丁烷基、吡咯烷基、四氢呋喃基、硫杂环戊烷基、咪唑烷基、吡唑烷基、恶唑烷基、异恶唑烷基、噻唑烷基、异噻唑烷基、二氧戊环基、二硫戊环基、硫杂环戊烷基、哌啶基、四氢吡喃基、噻烷基、哌嗪基、吗啉基、硫代吗啉基、二氧杂环己烷基、二噻烷基、三氧杂环己烷基、三噻烷基、氮杂环庚烷基、氧杂环庚烷基、硫杂环庚烷基、二氢呋喃基、咪唑啉基、二氢吡喃基和杂芳环，包括氮杂环丙烯基、氧杂环丙烯基、硫杂环丙烯基、二氮杂环丙烯基、氮杂环丁二烯基、氧杂环丁烯基、硫杂环丁烯基、吡咯基、呋喃基、噻吩基(thiophenyl/thienyl)、咪唑基、吡唑基、恶唑基、异恶唑基、噻唑基、异噻唑基、呋吖基、恶二唑基、噻二唑基、二噻唑基、三唑基、四唑基、吡啶基、吡喃基、硫代吡喃基、吡嗪基、嘧啶基、哒嗪基、恶嗪基、噻嗪基、二恶英基、二硫杂环己二烯基、氧硫杂环己基、三嗪基、四嗪基、氮杂环庚三烯基、氧杂环庚三烯基、硫杂环庚三烯基、二氮杂环庚三烯基和硫氮杂环庚三烯基等。双环杂环系统的实例包括3-氮杂双环[3.1.0]己基、3-氮杂双环[3.1.1]庚基、2-氮杂螺[3.3]庚基、2-氧杂-6-氮杂螺[3.3]庚基、和5-氮杂螺[2.3]己基。
“卤素”或“卤基”可为氟、氯、溴或碘。
如本文所用，术语“基本上无水”是指约百万分之1000(ppm)或更少、优选500ppm或更少、更优选100ppm或更少的水含量。水含量在500-1000ppm之间、100-500ppm之间、50-100ppm之间或小于50ppm。通过使用干燥剂或通过共沸去除水(共沸蒸馏)使有机溶液或溶剂基本上无水。
如本文所用，术语“干燥剂”是指用于从有机溶剂或有机化合物或有机化合物的溶液中除去水的化学试剂。可使用任何合适的干燥剂。示例性干燥剂包括但不限于氯化钙、氯化钾、硫酸钠、硫酸钙、硫酸镁或分子筛。在一些实施方案中，分子筛为或
如本文所用，“羟基保护基”是指适合保护羟基-OH不与其他试剂反应的基团。羟基保护基的例子可见于Greene,TW等人，Protective Groups in Organic Synthesis，第4版，John Wiley and Sons(2007)中。
在某些实施方案中，羟基保护基可选自例如乙酰基(Ac)；苯甲酰基(Bz)；苄基(Bn)；β-甲氧基乙氧基甲基醚(MEM)；甲氧基甲基醚(MOM)；甲氧基三苯甲基[(4-甲氧基苯基)二苯基甲基，MMT)；对甲氧基苄基醚(PMB)；甲硫基甲醚；新戊酰基(Piv)；四氢吡喃基(THP)；四氢呋喃(THF)；甲硅烷基醚(包括但不限于三甲基甲硅烷基(TMS)、叔丁基二苯基甲硅烷基(TBDPS)、叔丁基二甲基甲硅烷基(TBDMS)、三异丙基甲硅烷氧基甲基(TOM)和三异丙基甲硅烷基(TIPS)醚)；甲醚和乙氧基乙醚(EE)。
在某些实施方案中，羟基保护基保护核苷的3'-羟基(称为3'-羟基保护基)。在某些实施方案中，3'-羟基保护基包括甲硅烷基羟基保护基，诸如三甲基甲硅烷基、三乙基甲硅烷基、三异丙基甲硅烷基、二甲基异丙基甲硅烷基、二乙基异丙基甲硅烷基、二甲基叔己基甲硅烷基(dimethylthexylsilyl)、叔丁基二甲基甲硅烷基、叔丁基二苯基甲硅烷基、三苄基甲硅烷基、三对二甲苯基甲硅烷基、三苯基甲硅烷基、二苯基甲基甲硅烷基、二叔丁基甲基甲硅烷基、三(三甲基甲硅烷基)甲硅烷基、叔丁基甲氧基苯基甲硅烷基和叔丁氧基二苯基甲硅烷基。在某些实施方案中，3'-羟基保护基是TBDPS。在某些实施方案中，3'-羟基保护基是大的疏水性保护基(LHPG)，诸如本文所述的那些。
在某些实施方案中，羟基保护基保护核苷的5'-羟基(称为5'-羟基保护基)。示例性5'-羟基包括但不限于本文所述的那些基团(例如，在任何方面或实施方案中的R15)。在一个具体实施方案中，5'-羟基保护基是酸不稳定的4,4’-二甲氧基三苯甲基(或双-(4-甲氧基苯基)苯基甲基)(DMT或DMTr)保护基。在某些实施方案中，5’-羟基保护基是大的疏水性保护基(LHPG)，诸如本文所述的那些。
如本文所用，术语“共沸蒸馏”是指使用材料分离剂通过蒸馏从有机溶液或溶剂中去除水。材料分离剂包括但不限于苯、甲苯。
如本文所用，“选择性沉淀”是指通过以下操作将所需产物与溶液中的一种或多种杂质分离的纯化方法：将溶液添加到使产物沉淀出的溶剂中而；同时使一种或多种杂质留在溶液中。或者，可将溶剂添加到包含粗产物和一种或多种杂质的溶液中以沉淀出产物。在某些实施方案中，本公开的所需化合物或寡核苷酸包含疏水基团(例如，疏水性3'-羟基保护基或疏水性5'-羟基保护基(例如，本文所述的LHPG基团))和极性溶剂(例如CH3CN)，将所述极性溶剂添加到含有化合物或寡核苷酸和一种或多种杂质的溶液中以沉淀出所需的寡核苷酸。在某些实施方案中，本公开的所需化合物或寡核苷酸可通过以下操作来纯化：添加共溶剂或溶剂混合物(例如庚烷、叔丁基甲基醚(TBME或MBTE)、庚烷/MBTE混合物(例如庚烷与MBTE体积比在20:1至1:20、9:1至1:9或4:1至1:4范围内的庚烷/MBTE混合物，或庚烷与MBTE体积比为9:1、4:1、2:1、1:1、2:5、1:2、1:4或1:9的庚烷/MBTE混合物)到在有机溶剂(例如，二氯甲烷(DCM)或乙酸乙酯(EtOAc))中包含粗产物和一种或多种杂质的溶液中以沉淀出产物。或者，可将包含粗产物和一种或多种杂质的溶液添加到非极性或极性较小的溶剂或溶剂混合物中以沉淀出产物。可根据产物的疏水性确定合适的共溶剂。在某些实施方案中，共溶剂的极性低于产物溶解于其中的有机溶剂的极性。
如本文所用，“萃取”是指通过以下操作将所需产物与溶液中的一种或多种杂质分离的纯化方法：使溶液与产物可溶于其中的溶剂接触；而所述一种或多种杂质是不溶的。或者，含有产物和一种或多种杂质的溶液可与所述一种或多种杂质可溶于其中的溶剂接触；而产物是不溶的。在某些实施方案中，可使在有机溶剂(例如，DCM、EtOAc或THF)或有机溶剂混合物中含有产物和一种或多种杂质的溶液(例如，反应混合物或粗产物的溶液)与水或水溶液(例如NaHCO3/H2O溶液或NaCl/H2O溶液)接触(萃取或洗涤)以去除亲水性杂质。
如本文所用，术语“强酸”是指在溶液中完全离解的酸，如下所示：
S代表溶剂分子。示例性强酸包括但不限于HCl、HBr、HI、三氟甲磺酸、高氯酸、CCl3COOH、CHCl2COOH和CH2ClCOOH。在某些实施方案中，强酸是强有机酸，诸如CF3COOH、CHCl2COOH和CH2ClCOOH。
如本文所用，术语“碱”是指可在水溶液中产生氢氧根离子(OH-)的物质或可提供一对非成键电子的物质。示例性碱包括但不限于碱金属氢氧化物、碱土金属氢氧化物、烷基胺(例如叔丁胺、仲丁胺、三甲胺、三乙胺、二异丙基乙胺、2-甲基丙-2-胺)、8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯(DBU)、咪唑、N-甲基咪唑、吡啶和3-甲基吡啶。
如本文所用，术语“盐”是指本文所述的化合物、核苷酸或寡核苷酸的有机盐或无机盐。在某些实施方案中，盐是其药学上可接受的盐。短语“药学上可接受的”表示物质或组合物在化学上和/或毒理学上必须与构成制剂的其他成分和/或用其治疗的哺乳动物是相容的。在某些实施方案中，本文所述的化合物、核苷酸或寡核苷酸的盐是钠盐、钾盐或铵盐。在某些实施方案中，盐是钠盐或铵盐。
本公开的方法
I.片段合成：
本文所述的方法包括在液(溶液)相中逐步添加核苷酸，以形成所需的寡核苷酸片段。在某些实施方案中，每次核苷酸添加涉及至少三个反应(偶联、硫化或氧化和脱保护)以将核苷酸添加到生长的寡核苷酸上。首先，第一核苷的5'端与第二核苷酸的3'端偶联以形成二聚体。然后二聚体被硫化或氧化形成硫代磷酸酯(即，P＝S键)或磷酸二酯(即，P＝O键)。然后将第二核苷酸的5'-羟基脱保护，并且重复该过程以添加下一个核苷。
a.5'-脱保护反应：
在第一方面，本公开提供了一种去除核苷酸、核苷或寡核苷酸上的5'-羟基保护基的脱保护方法。在一个实施方案中，脱保护方法是用于去除5'-三苯甲基的脱三苯甲基化方法。发现当脱三苯甲基化反应在无水或基本上无水条件下进行时，可显著减少副反应(例如，常用于寡核苷酸合成的核碱基胞嘧啶或5-甲基胞嘧啶或其衍生物的脱氨基)(参见实施例3)。本发明的脱三苯甲基化方法还包括添加阳离子清除剂以促进反应的完成。因此，无需色谱法(例如柱色谱法)即可获得高纯度的产物。脱三苯甲基化反应的水含量可通过使用干燥剂(例如分子筛)、共沸蒸馏或本领域已知的其他合适的方法来控制。或者，脱三苯甲基化反应中使用的溶剂、酸和其他试剂、要进行脱三苯甲基化反应的底物及反应容器可在用于脱三苯甲基化反应之前干燥以满足残留水含量。
第一方面的第一实施方案是一种用于制备式(AIa)化合物或其盐的液相方法：
其包括将式(AIIa)化合物或其盐脱保护：
其中脱保护反应在无水或基本上无水的溶液中进行，且其中：
R1在每次出现时独立地为核碱基，其中核碱基的NH2(如果存在的话)受胺保护基的保护；
R2在每次出现时独立地选自由H、卤基和任选被C1-6烷氧基取代的C1-6烷氧基组成的组；
R4在每次出现时独立地为H或与R2的烷氧基形成环；
R15为羟基保护基；
R16每次出现时独立地为C1-6烷基、C2-6烯基、苯基或苄基，其各自任选地被-CN、-NO2或卤素取代；或者
R16为
z为0或1至200的整数；
X在每次出现时独立地为O或S；
W为H、Y或Z；
Y为含有烷基链的疏水性羟基保护基；且
Z为羟基保护基。
第一方面的第一实施方案还包括一种用于制备式(AI)化合物或其盐的液相方法：
其包括将化(AII)化合物或其盐脱保护：
其中脱保护反应在无水或基本上无水的溶液中进行，且其中变量如上针对式(AIa)和(AIIa)所定义。
第一实施方案还包括一种用于制备式(AI')化合物或其盐的液相方法：
其包括将式(AII’)化合物或其盐脱保护：
其中脱保护反应在无水或基本上无水的溶液中进行，且其中W为H或Z；Z为甲硅烷基羟基保护基；且其余变量如上针对式(AIa)和(AIIa)所定义。
在一个特定实施方案中，R16为以下中的一个：
参见Nat Biotechnol.2017年9月；35(9):845-851；J.Org.Chem.1999,64,7515-7522；Biopolymers(Peptide Science),2001,60,3，各自以引用的方式并入本文。
在第二实施方案中，脱保护反应在干燥剂存在下进行。在脱保护反应中可使用任何合适的干燥剂。在一些实施方案中，干燥剂选自氯化钙、氯化钾、硫酸钠、硫酸钙、硫酸镁和分子筛。
在第三实施方案中，第二实施方案中使用的干燥剂是分子筛。
在第四实施方案中，第三实施方案的分子筛的尺寸为或在一个优选实施方案中，分子筛的尺寸为
你好在第五实施方案中，通过在脱保护反应之前使用共沸蒸馏去除水来获得用于脱保护反应的无水或基本上无水的溶液。
或者，溶剂、酸或酸溶液和包含待用于脱三苯甲基化反应中的试剂的其他试剂或溶液、待进行脱三苯甲基化反应的底物或底物溶液以及反应容器可在脱三苯甲基化反应之前单独或组合进行干燥。
在第六实施方案中，脱保护反应在选自以下的清除剂存在下进行：包含-SH基团的阳离子清除剂、硅烷清除剂(例如HSiPh3、HSiBu3、三异丙基硅烷等)、硅氧烷、聚苯乙烯、呋喃、吡咯和吲哚。
在一个特定实施方案中，脱保护反应在选自以下的清除剂存在下进行：1-十二烷硫醇、环己硫醇、1-辛硫醇、三异丙基硅烷、吲哚、2,3-二甲基呋喃、二苯基硅烷、2-巯基咪唑、二苯基甲基硅烷、苯基硅烷、5-甲氧基吲哚、甲基苯基硅烷、氯二甲基硅烷、1,1,3,3-四甲基二硅氧烷、1-硫代甘油、三苯基硅烷、叔丁基二甲基硅烷、丁基硅烷、甲基二乙氧基硅烷、1,1,3,3,5,5-六甲基三硅氧烷、己基硅烷、(巯甲基)聚苯乙烯或二甲基苯基硅烷。
在第七实施方案中，第六实施方案的阳离子清除剂为式RSH化合物，其中R为烷基、环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基，其各自任选地被取代。
在第八实施方案中，第七实施方案的RSH基团为CH3(CH2)5SH、CH3(CH2)11SH、环己硫醇(CySH)或CH3CH2OC(＝O)CH2CH2SH。
本公开的第九实施方案是如第一至第八实施方案的任一个中所述的方法，其中R15为4,4'-二甲氧基三苯甲基(DMT)基团。
在第十实施方案中，通过使式(AII)化合物与脱三苯甲基化试剂反应来进行脱保护反应。可使用任何合适的脱三苯甲基化试剂。
在第十一实施方案中，第十实施方案的脱三苯甲基化试剂为强有机酸。
在第十二实施方案中，脱三苯甲基化试剂选自CF3COOH、CCl3COOH、CHCl2COOH、CH2ClCOOH、H3PO4、甲磺酸(MSA)、苯磺酸(BSA)、CClF2COOH、CHF2COOH、PhSO2H(苯基亚磺酸)等。在一个优选实施方案中，脱三苯甲基化试剂是CH2ClCOOH。在另一特定实施方案中，脱三苯甲基化试剂是CF3COOH。在又一特定实施方案中，脱三苯甲基化试剂是CHCl2COOH。
在某些实施方案中，脱三苯甲基化试剂是柠檬酸。在某些实施方案中，脱三苯甲基化试剂是饱和柠檬酸溶液。
第一方面的第十三实施方案是如以上公开的实施方案的任一个中所述的方法，其中W为Z。
在第十四实施方案中，Z基团为甲硅烷基羟基保护基。示例性甲硅烷基保护基包括但不限于三甲基甲硅烷基、三乙基甲硅烷基、三异丙基甲硅烷基、二甲基异丙基甲硅烷基、二乙基异丙基甲硅烷基、二甲基叔己基甲硅烷基、叔丁基二甲基甲硅烷基、叔丁基二苯基甲硅烷基、三苄基甲硅烷基、三对二甲苯基甲硅烷基、三苯基甲硅烷基、二苯基甲基甲硅烷基、二叔丁基甲基甲硅烷基、三(三甲基甲硅烷基)甲硅烷基、叔丁基甲氧基苯基甲硅烷基和叔丁氧基二苯基甲硅烷基。
在第十五实施方案中，第十四实施方案的甲硅烷基羟基保护基选自TBDPS、TBoDPS和TBDAS。
其中R5、R6和R7各自独立地为H、C1-30烷基或C1-30烷氧基。
在第十六实施方案中，第十四实施方案的甲硅烷基保护基为：
其中s为1至30的整数。
在第十七实施方案中，第十四实施方案的Z基团为TBDPS。
第十八实施方案公开了如第一至第十二实施方案的任一个中所述的方法，其中W为由下式表示的Y：
其中X0为C1-10烷基，其中一个或多个CH2基团独立地被C(O)、C(O)NH2、环烷基或杂环基置换；且X1为C1-25烷基或C1-25烷氧基。在一个特定实施方案中，Y由下式表示：
其中p为1至10的整数；Het为饱和杂环；且其余变量如上所述。在一个更特定的实施方案中，Het为哌嗪。
在第十九实施方案中，第十八实施方案的Y由下式表示：
第二十实施方案公开了第一至第十九实施方案的任一个中所述的方法，其中式(AI)或(AI')的化合物或其盐不通过色谱法(例如柱色谱法)来纯化。
第二十一实施方案公开了第一至第二十实施方案中所述的方法，其中式(AI)或(AI')的化合物或其盐通过选择性沉淀和/或萃取来纯化。在某些实施方案中，式(AI)化合物或其盐通过选择性沉淀来纯化。在某些实施方案中，式(AI)化合物或其盐的选择性沉淀可通过将乙腈添加到粗产物的DCM溶液中来实现。或者，可将粗产物溶液添加到乙腈中以沉淀出所需产物。
在某些实施方案中，式(AI’)化合物或其盐是通过选择性沉淀来纯化。在某些实施方案中，式(AI')化合物或其盐除了选择性沉淀之外还通过用水溶液(例如NaHCO3/H2O或NaCl/H2O)萃取包含在有机溶剂(MBTE、EtOAc、庚烷/MBTE混合物、DCM等)中的式(AI')化合物或其盐来纯化。在某些实施方案中，萃取在选择性沉淀之前进行。或者，萃取在选择性沉淀之后进行。在某些实施方案中，式(AI')化合物或其盐的选择性沉淀可通过将庚烷或庚烷/MBTE混合物添加粗产物在DCM或EtOAc中的溶液中来实现。或者，可将粗产物溶液添加庚烷或庚烷/MBTE混合物中以沉淀出所需产物。可使用具有合适体积比(例如，本文所述的体积比)的庚烷/MBTE混合物。
在一些实施方案中，对于第一方面或其中描述的任何实施方案的方法(例如，在第一至第二十一实施方案的任一个中所述的方法)，z为1至150、1至100、1至50、1至20、1至10或1至5。
在一些实施方案中，对于第一方面或其中描述的任何实施方案的方法(例如，在第一至第二十一实施方案的任一个中所述的方法)，R16在每次出现时独立地为C1-6烷基、C2-6烯基、苯基或苄基，其各自任选地被-CN、-NO2或卤素取代；或R16为 在一个特定实施方案中，R16为以下中的一个：
在一些实施方案中，对于第一方面或其中描述的任何实施方案的方法(例如，在第一至第二十一实施方案的任一个中所述的方法)：
每个R2独立地选自H、卤素或任选被C1-4烷氧基取代的C1-4烷氧基；
R4为H；且
R16为-CH2CH2CN。
在一个特定实施方案中，R2为-OCH2CH2OMe。
b.3'-脱保护反应：
在第二方面，本公开描述了一种去除寡核苷酸上的3'-羟基保护基的液相脱保护方法。在一个实施方案中，脱保护方法是脱甲硅烷基化过程。发现本公开的脱甲硅烷基化过程可以选择性地去除3'-羟基的甲硅烷基保护基，而不会影响寡核苷酸上的其他敏感基团，诸如5'-三苯甲基、核碱基的各种保护基(例如，苯甲酰基或异丁酰基)、氰乙基和-OCH2CH2OMe(也称为甲氧基乙基(MOE))。
在第二十二实施方案中，本公开的第二方面涉及一种制备式(BI)化合物或其盐的液相方法：
其包括将式(BII)化合物或其盐：
脱保护以形成式(BI)化合物或其盐，其中：
R1在每次出现时独立地为核碱基，其中核碱基的NH2(如果存在的话)受胺保护基的保护；
R2在每次出现时独立地选自由H、卤基和任选被C1-6烷氧基取代的C1-6烷氧基组成的组；
R4在每次出现时独立地为H或与R2的烷氧基形成环；
R15为羟基保护基；
R16在每次出现时独立地为C1-6烷基、C2-6烯基、苯基或苄基，其各自任选地被-CN、-NO2或卤素取代；或
R16为
q为1至200的整数；
X在每次出现时独立地为O或S；且
Z为羟基保护基(例如，甲硅烷基羟基保护基)。
在第二十三实施方案中，本公开的第二方面涉及一种制备式(B2I)化合物或其盐的液相方法：
其包括将式(B2II)化合物或其盐脱保护：
以形成式(B2I)化合物或其盐，其中：
R1在每次出现时独立地为核碱基，其中核碱基的NH2(如果存在的话)受胺保护基的保护；
R2在每次出现时独立地选自由H、卤基和任选被C1-6烷氧基取代的C1-6烷氧基组成的组；
R4在每次出现时独立地为H或与R2的烷氧基形成环；
R16在每次出现时独立地为C1-6烷基、C2-6烯基、苯基或苄基，其各自任选地被-CN、-NO2或卤素取代；或
R16为
q为1至200的整数；
X在每次出现时独立地为O或S；
Y为含有烷基链的疏水性羟基保护基；且
Z为羟基保护基。
在第二十四实施方案中，第二十三实施方案的Y由下式表示：
其中Xa为C1-10烷基，其中一个或多个CH2基团独立地被C(O)、C(O)NH2、环烷基或C1-6杂环基置换，且X1为C1-25烷基或C1-25烷氧基。在一个特定实施方案中，Y由下式表示：
其中p为1至10的整数；Het为饱和杂环；且其余变量如上所述。在一个更特定的实施方案中，Het为哌嗪。
在第二十五实施方案中，第二十三实施方案的Y由下式表示：
在第二十六实施方案中，通过在碱存在下使式(BII)或(B2II)的化合物或其盐与HF反应来进行脱保护反应。
在第二十七实施方案中，第二十六实施方案中的碱为咪唑或吡啶，其中咪唑或吡啶任选地被取代。
第二十八实施方案公开了在第二十二至第二十七实施方案的任一个中所述的方法，其中使用相对于HF过量的碱。
在第二十九实施方案中，通过在吡啶和咪唑存在下使式(BII)或(B2II)的化合物或其盐与HF反应来进行脱保护反应。
在第三十实施方案中，第二十九实施方案的咪唑与HF的摩尔比在1.1:1至5:1的范围内。在一些实施方案中，咪唑与HF的摩尔比在1.1:1至3:1、1.5:1至3:1或1.5:1至2.5:1的范围内。
在第三十一实施方案中，第三十实施方案中咪唑与HF的摩尔比为2:1。
在第三十二实施方案中，对于第二十九至第三十一实施方案的任一个中所述的方法，吡啶与HF的摩尔比在1.1:1至20:1的范围内。在一些实施方案中，吡啶与HF的摩尔比在5:1至20:1或5:1至15:1的范围内。在一个特定实施方案中，吡啶与HF的摩尔比为10:1。
第三十三实施方案公开了在第二十二至第三十二实施方案的任一个中所述的方法，其中Z为甲硅烷基羟基保护基。在某些实施方案中，甲硅烷基保护基包括但不限于以上在第十四实施方案中所述的那些。
在第三十四实施方案中，甲硅烷基羟基保护基是如第十五、第十六或第十七实施方案中所述的TBDPS、ToBDPS或TBDAS。在某些实施方案中，甲硅烷基保护基为TBDPS。
在某些实施方案中，以上(例如，在第二十三至第三十四实施方案的任一个中)所述的脱保护反应在合适的有机溶剂例如THF中进行。
第三十五实施方案公开了在第二十二至第三十四实施方案的任一个中所述的方法，其中式(BI)或(B2I)的化合物或其盐不通过色谱法(例如柱色谱法)来纯化。
在第三十六实施方案中，式(BI)或(B2I)的化合物或其盐通过选择性沉淀和/或萃取来纯化。在某些实施方案中，式(B2I)化合物或其盐通过选择性沉淀来纯化。在某些实施方案中，式(B2I)化合物或其盐的选择性沉淀可通过将乙腈添加粗产物的DCM溶液中来实现。或者，可将粗产物溶液添加到乙腈中以沉淀出所需产物。
在某些实施方案中，式(BI)化合物或其盐通过选择性沉淀来纯化。在某些实施方案中，式(BI)化合物或其盐除了选择性沉淀之外还通过用水溶液(例如，NaHCO3/H2O或NaCl/H2O)萃取包含在有机溶剂(MBTE、EtOAc、庚烷/MBTE混合物、DCM等)中的式(BI)化合物或其盐来纯化。在某些实施方案中，萃取在选择性沉淀之前进行。或者，萃取在选择性沉淀之后进行。在某些实施方案中，式(BI)化合物或其盐的选择性沉淀可通过将庚烷或庚烷/MBTE混合物添加到粗产物在DCM或EtOAc中的溶液中来实现。或者，可将粗产物溶液添加到庚烷或庚烷/MBTE混合物中以沉淀出所需产物。可使用具有合适体积比(例如，本文所述的体积比)的庚烷/MBTE混合物。
在一些实施方案中，对于在第二方面或其中描述的任何实施方案(例如第二十二、第二十六至第三十六实施方案)中所述的方法，R15为4,4'-二甲氧基三苯甲基(DMT)基团。
在一些实施方案中，对于在第二方面或其中描述的任何实施方案(例如第二十二至第三十六实施方案)中所述的方法，每个R2独立地选自H或任选地被C1-4烷氧基取代的C1-4烷氧基；R4为H；且R16为-CH2CH2CN。
在一些实施方案中，对于在第二方面或其中描述的任何实施方案(例如第二十二、第二十六至第三十六实施方案)中所述的方法，每个R2独立地选自H、卤基或任选地被C1-4烷氧基取代的C1-4烷氧基；R4为H；R15为4,4’-二甲氧基三苯甲基；且R16为-CH2CH2CN。在一个特定实施方案中，R2为MOE。
在一些实施方案中，对于在第二方面或其中描述的任何实施方案(例如第二十二至第三十六实施方案)中所述的方法，每个R2独立地选自H、卤基(例如F)或任选地被C1-4烷氧基取代的C1-4烷氧基；R4为H；且R16为-CH2CH2CN。在一个特定实施方案中，R2为-OCH2CH2OCH3(MOE)。
c.亚磷酰化反应
本公开的第三方面提供了本文所述的寡核苷酸的液相亚磷酰化方法。所述方法包括使3'-OH基团与亚磷二酰胺或H-膦酸酯(HO)P(O)H反应。本公开的亚磷酰化方法可用于合成高纯度的具有3个或更多个核苷酸的寡核苷酸片段，而无需色谱纯化。
第三十七实施方案公开了一种制备式(CI)或(CI')的化合物或其盐的液体方法：
其包括使式(CII)化合物或其盐：
分别与亚磷二酰胺(R16O)P(NR17aR17b)2或H-膦酸酯(HO)P(O)H反应以形成式(CI)或(Cl')的化合物，其中：
R1在每次出现时独立地为核碱基，其中核碱基的NH2(如果存在的话)受胺保护基的保护；
R2在每次出现时独立地选自由H、卤基和任选地被卤素或C1-6烷氧基取代的C1-6烷氧基组成的组；
R4在每次出现时独立地为H或与R2的烷氧基形成环；
R15为羟基保护基；
R16在每次出现时独立地为C1-6烷基、C2-6烯基、苯基或苄基，其各自任选地被-CN、-NO2或卤素取代；或
R16为
R17a和R17b独立地为C1-6烷基
q1为2至200的整数；
X在每次出现时独立地为O或S；且
Z为甲硅烷基羟基保护基。
第三十八实施方案公开了一种制备式(C2I)化合物或其盐的液体方法：
其包括使式(C2II)化合物或其盐：
与亚磷二酰胺(R16O)P(NR17aR17b)2反应以形成式(C2I)化合物或其盐，其中：
R1在每次出现时独立地为核碱基，其中核碱基的NH2(如果存在的话)受胺保护基的保护；
R2在每次出现时独立地选自由H、卤基和任选地被卤素或C1-6烷氧基取代的C1-6烷氧基组成的组；
R4在每次出现时独立地为H或与R2的烷氧基形成环；
R16在每次出现时独立地为C1-6烷基、C2-6烯基、苯基或苄基，其各自任选地被-CN、-NO2或卤素取代；或
R16为
R17a和R17b独立地为C1-6烷基
q1为2至200的整数；
X在每次出现时独立地为O或S；且
Z为甲硅烷基羟基保护基。
在一些实施方案中，对于第三十八实施方案中所述的方法，每个R2独立地选自H、F或任选地被C1-4烷氧基取代的C1-4烷氧基；R4为H；R16为-CH2CH2CN；R17a和R17b独立地为C1-6烷基；且Z为本文所述的甲硅烷基羟基保护基。在一些实施方案中，Z选自TBDPS、TBoDPS和TBDAS。在一个特定实施方案中，R2为H，R4为H；R16为-CH2CH2CN；R17a和R17b均为-CH(CH3)2；且Z为TBDPS。在另一特定实施方案中，R2为MOE，R4为H；R16为-CH2CH2CN；R17a和R17b均为-CH(CH3)2；且Z为TBDPS。
第三十九实施方案公开了在第三方面或其中描述的任何实施方案(例如第三十七或第三十八实施方案)中所述的方法，其中反应在活化剂的存在下进行。如本文所用，活化剂是促进亚磷二酰胺或H-膦酸酯与寡核苷酸(例如，式(CII)或(C2II)的化合物)的3'-羟基之间反应的化学试剂。示例性活化剂包括但不限于以下试剂：
在第四十实施方案中，本公开提供了如第三十九实施方案中所述的方法，其中活化剂是三氟乙酸吡啶(Py·TFA)或三氟甲磺酸N-甲基咪唑鎓。
第四十一实施方案公开了在第三十四至第三十六实施方案的任一个中所述的方法，其中式(CI)、(CI’)或(C2I)的化合物不通过色谱法(例如，柱色谱法)来纯化。
第四十二实施方案公开了第三十四至第三十六实施方案的任一个中所述的方法，其中式(CI)、(CI’)或(C2I)的化合物或其盐通过选择性沉淀和/或萃取来纯化。在某些实施方案中，式(CI)、(CI’)或(C2I)的化合物或其盐通过选择性沉淀来纯化。在某些实施方案中，式(CI)、(CI’)或(C2I)的化合物或其盐除了选择性沉淀之外还通过用水溶液(例如NaHCO3/H2O或NaCl/H2O)萃取包含在有机溶剂(MBTE、EtOAc、庚烷/MBTE混合物、DCM等)中的式(CI)、(CI’)或(C2I)的化合物或其盐来纯化。在某些实施方案中，萃取在选择性沉淀之前进行。或者，萃取在选择性沉淀之后进行。在某些实施方案中，式(CI)、(CI’)或(C2I)的化合物或其盐的选择性沉淀可通过将庚烷或庚烷/MBTE混合物添加到粗产物在DCM或EtOAc中的溶液中来实现。或者，可将粗产物溶液添加到庚烷或庚烷/MBTE混合物中以沉淀出所需产物。可使用具有合适体积比(例如，本文所述的体积比)的庚烷/MBTE混合物。
在一些实施方案中，对于第三方面或其中描述的任何实施方案(例如，第三十七实施方案)中所述的方法，式(CI)、(CI’)或(CII)的变量定义如下：
每个R2独立地选自H、F或任选地被C1-4烷氧基取代的C1-4烷氧基；
R4为H；
R15为4,4'-二甲氧基三苯甲基；
R16为-CH2CH2CN；且
R17a和R17b独立地为C1-6烷基。
在一个特定实施方案中，R2为MOE。在另一特定实施方案中，R2为H；R4为H；R16为-CH2CH2CN；且R17a和R17b均为-CH(CH3)2。在另一特定实施方案中，R2为MOE，R4为H；R16为-CH2CH2CN；且R17a和R17b均为-CH(CH3)2。
第四十三实施方案公开了一种制备式(CI’)化合物或其盐的液体方法：
其包括以下步骤：
1)使式(CI’A)化合物或其盐：
与式(A1)化合物或其盐：
反应以形成式(CI’B)化合物或其盐：
及
3)用硫化剂或氧化剂硫化或氧化式(CI'B)化合物或其盐以形成式(CI’C)化合物或其盐：
4)将式(CI'C)化合物或其盐脱保护以形成式(CI’D)化合物或其盐：
5)从式(CI’D)化合物开始，重复步骤1)、2)、3)和4)q1-3次，然后重复步骤1)、2)和3)，得到式(CI’)的片段或其盐，其中：
R1在每次出现时独立地为核碱基，其中核碱基的NH2(如果存在的话)受胺保护基的保护；
R2在每次出现时独立地选自由H、卤基和任选被C1-6烷氧基取代的C1-6烷氧基组成的组；
R4在每次出现时独立地为H或与R2的烷氧基形成环；
R15为羟基保护基(例如DMT基团)；
R16在每次出现时独立地为C1-6烷基、C2-6烯基、苯基或苄基，其各自任选地被-CN、-NO2或卤素取代；或
R16为
R17a和R17b独立地为C1-6烷基；
q1为2至200的整数；且
X在每次出现时独立地为O或S。
第四十四实施方案公开了一种制备式(CIc)的寡核苷酸或其盐的液相方法：
其包括使式(CIa)的寡核苷酸片段或其盐：
与式(CIb)的寡核苷酸片段或其盐：
偶联以形成式(CIc)的寡核苷酸或其盐，其中：
R1在每次出现时独立地为核碱基，其中核碱基的NH2(如果存在的话)受胺保护基的保护；
R2在每次出现时独立地选自由H、卤基和任选被C1-6烷氧基取代的C1-6烷氧基组成的组；
R4在每次出现时独立地为H或与R2的烷氧基形成环；
R15为羟基保护基；
R16在每次出现时独立地为C1-6烷基、C2-6烯基、苯基或苄基，其各自任选地被-CN、-NO2或卤素取代；或
R16为
q1a为2至20的整数；
q1b为2至20的整数；
X在每次出现时独立地为O或S；且
Z为羟基保护基。
在某些实施方案中，第四十四实施方案的偶联反应在酰氯的存在下进行。在一个特定实施方案中，式(CIa)的寡核苷酸与式(CIb)的寡核苷酸之间的偶联反应在新戊酰氯存在下进行。在另一特定实施方案中，偶联反应在新戊酰氯和碱(例如，吡啶)的存在下进行。
在某些实施方案中，对于第四十三或第四十四实施方案中所述的方法，不使用色谱法来纯化其中描述的任一反应步骤的反应产物。在某些实施方案中，其中描述的任一反应步骤的反应产物通过如本文所述(例如，如第二十一、三十五或四十二实施方案中所述)的选择性沉淀和/或萃取来纯化。
d.3'-寡核苷酸片段的合成
在第四方面，本公开描述了一种制备在3'-端带有疏水性羟基保护基的寡核苷酸片段(在本文中称为“3'-片段”)的液相方法。令人惊讶地发现，本公开的用于合成3'-片段的方法可用于制备高纯度的具有3至20个(例如，3至10、3至8、3至5或4至5个)核苷酸的寡核苷酸片段，而无需色谱纯化。在一些实施方案中，使用疏水性3'-羟基保护基，这有助于通过选择性沉淀分离寡核苷酸片段产物。在一些实施方案中，液相方法包括(1)5'-OH脱保护步骤、(2)偶联步骤及(3)氧化或硫化步骤，其中重复步骤(1)、(2)和(3)直到所需数量的核苷酸连接在一起形成3'-寡核苷酸片段。
第四十五实施方案公开了一种制备式(I)的寡核苷酸片段或其盐的液相方法，
其包括以下步骤：
1)将式(I’A)化合物或其盐：
脱保护，以形成式(IA)化合物或其盐：
2)使式(IA)化合物或其盐与式(A1)化合物：
反应，以形成式(IB)化合物或其盐：
及
3)用硫化剂或氧化剂硫化或氧化式(IB)化合物或其盐以形成式(IC)化合物或其盐：
4)将式(IC)化合物或其盐脱保护以形成式(ID)化合物或其盐：
5)从式(ID)化合物开始，重复步骤2)、3)和4)n-2次，得到式(I)的片段或其盐，其中：
R1在每次出现时独立地为核碱基，其中核碱基的NH2(如果存在的话)受胺保护基的保护；
R2在每次出现时独立地选自由H、卤基和任选被C1-6烷氧基取代的C1-6烷氧基组成的组；
R4在每次出现时独立地为H或与R2的烷氧基形成环；
R15为羟基保护基；
R16在每次出现时独立地为C1-6烷基、C2-6烯基、苯基或苄基，其各自任选地被-CN、-NO2或卤素取代；或
R16为
R17a和R17b独立地为C1-6烷基；
n为2至20的整数；
X在每次出现时独立地为O或S；
Y为含有烷基链的疏水性羟基保护基。
第四十六实施方案公开了第四十五实施方案中所述的方法，其中式(I)的片段不通过色谱法(例如柱色谱法)来纯化。
第四十七实施方案公开了第四十五或第四十六实施方案中所述的方法，其中式(I)的片段通过选择性沉淀和/或萃取来纯化。在某些实施方案中，式(I)的片段通过选择性沉淀来纯化。在一个特定实施方案中，式(I)的片段通过将CH3CN添加到含有粗产物的反应混合物中，然后过滤以分离片段产物来纯化。
第四十八实施方案公开了第四十五、第四十六或第四十七实施方案的任一个中所述的方法，其中不使用色谱法(例如柱色谱法)来纯化步骤1)、2)、3)和4)中任一个的反应产物。
第四十九实施方案公开了第四十五至四十八实施方案的任一个中所述的方法，其中步骤1)、2)、3)和4)中任一个的反应产物通过选择性沉淀(例如，如第二十一、第三十五或第四十二实施方案中所述)来纯化。
在第五十实施方案中，对于第四十五至第四十九实施方案的任一个中所述的方法，Y由下式表示：
其中X0为C1-10烷基，其中一个或多个CH2基团独立地被C(O)、C(O)NH2、环烷基或杂环基置换；且X1为C1-25烷基或C1-25烷氧基。在一个特定实施方案中，Y由下式表示：
其中p为1至10的整数；Het为饱和杂环；且其余变量如上所述。在一个更特定的实施方案中，Het为哌嗪。
第五十一实施方案公开了第四十五至第四十九实施方案的任一个中所述的方法，其中Y为：
在某些实施方案中，对于第四方面或其中描述的任何实施方案(例如，第四十五至第五十一实施方案)中所述的方法，步骤1)和/或步骤4)的脱保护反应如在第一方面或其中描述的任何实施方案(例如，第二至第十二实施方案)中所述来进行。
在某些实施方案中，对于第四方面或其中描述的任何实施方案(例如，第四十五至第五十一实施方案)中所述的方法，步骤2)的偶联反应可在本文所述的活化剂(例如第三十九实施方案中所述的活化剂)的存在下进行。在某些实施方案中，活化剂是4,5-二氰基咪唑(DCI)或5-乙硫基-1H-四唑(ETT)。
在某些实施方案中，对于第四方面或其中描述的任何实施方案(例如，第四十五至第五十一实施方案)中所述的方法，步骤3的硫化反应)使用硫化剂，诸如3-氨基-1,2,4-二噻唑-5-硫酮(氢化黄原素或ADTT)、3-(N,N-二甲氨基-亚甲基)氨基)-3H-1,2,4-二噻唑(DDTT)、苯乙酰二硫化物(PADS)、3H-1,2-苯并二硫醇-3-酮1,1-二氧化物(Beaucage试剂)或苯基-3H-1,2,4-二噻唑-3-酮(POS)来进行。在一个特定实施方案中，硫化剂是DDTT。在一个特定实施方案中，硫化剂是氢化黄原素。在某些实施方案中，硫化反应在如本文所述的碱存在下进行。在某些实施方案中，碱是吡啶或咪唑。在某些实施方案中，步骤3)的硫化反应在DDTT和4,5-二氰基咪唑(DCI)的存在下进行。
在某些实施方案中，对于第四方面或其中描述的任何实施方案(例如，第四十五至第五十一实施方案)中所述的方法，步骤3)的氧化反应通过使用文献中已知的标准氧化剂进行。示例性氧化剂包括但不限于叔丁基过氧化氢(t-BuOOH)、(1S)-(+)-(10-樟脑磺酰基)氧杂吖丙啶(CSO)、I2和碘-吡啶-水氧化剂溶液。在一个特定实施方案中，氧化剂是t-BuOOH。
e.5'-寡核苷酸片段的合成
在第五方面，本公开描述了一种制备具有可与上述3'-片段偶联的亚磷酰胺基团的寡核苷酸片段(5'-片段)的液相方法。令人惊讶地发现，用于制备5'-片段的本公开方法可用于合成高纯度的具有3至20个(例如，3至10、3至8、3至5或4至5个)核苷酸的寡核苷酸片段，而无需色谱纯化。在一些实施方案中，所述方法涉及3'-羟基保护基的选择性脱保护。在一些实施方案中，液相方法包括(1)5'-OH脱保护步骤，(2)偶联步骤，及(3)氧化或硫化步骤，其中重复步骤(1)、(2)和(3)直到所需数量的核苷酸连接在一起形成5'-寡核苷酸片段。
第五十二实施方案公开了一种制备式(II)的寡核苷酸片段或其盐的液相方法，
其包括以下步骤：1’)将式(IIA’)化合物或其盐:
脱保护，以形成式(IIA)化合物或其盐：
2’)使式(IIA)化合物或其盐与式(A2)化合物或其盐：
反应，以形成式(IIB)化合物或其盐：
及
3’)用硫化剂或氧化剂硫化或氧化式(IIB)化合物或其盐以形成式(IIC)化合物或其盐：
4’)将式(IIC)化合物或其盐脱保护，以形成式(IID)化合物或其盐：
5')当m为3时，从式(IID)化合物或其盐开始，重复步骤2')和步骤3')以形成式(IIE)化合物或其盐，或
当m大于3时，从式(IID)化合物或其盐开始，重复步骤2')、3')和4')m-3次，然后进行步骤2')和步骤3')以形成式(IIE)化合物或其盐：
6’)将式(IIE)化合物或其盐脱保护，以形成式(IIF)化合物或其盐：
及
7')使式(IIF)化合物或其盐与亚磷二酰胺(R16O)P(NR17aR17b) 2反应，得到式(II)的片段或其盐：
其中：
R1在每次出现时独立地为核碱基，其中核碱基的NH2(如果存在的话)受胺保护基的保护；
R2在每次出现时独立地选自由H、卤基和任选被C1-6烷氧基取代的C1-6烷氧基组成的组；
R4在每次出现时独立地为H或与R2的烷氧基形成环；
R15为羟基保护基；
R16在每次出现时独立地为C1-6烷基、C2-6烯基、苯基或苄基，其各自任选地被-CN、-NO2或卤素取代；或
R16为
R17a和R17b独立地为C1-6烷基；
m为2至20的整数；
X在每次出现时独立地为O或S；且
Z为羟基甲硅烷基保护基。
在第五十三实施方案中，对于第五十二实施方案中所述的方法，式(II)的片段不通过色谱法(例如柱色谱法)纯化。
第五十四实施方案公开了如第五十二或第五十三实施方案中所述的方法，其中式(II)的片段通过如本文所述(例如，如第二十一、第三十五或第四十二实施方案中所述)的萃取和/或选择性沉淀来纯化。
第五十五实施方案公开了如第五十二至第五十四实施方案中所述的方法，其中不使用色谱法来纯化步骤1')、2')、3')、4')、5')、6')和7')中任一个的反应产物。
第五十六实施方案公开了如第五十二至第五十五实施方案中所述的方法，其中步骤1')、2')、3')、4')、5')、6')和7')中任一个的反应产物通过如本文所述(例如，如第二十一、第三十五或第四十二实施方案中所述)的萃取和/或选择性沉淀来纯化。
在一些实施方案中，步骤1')和步骤4')的脱保护反应如第一方面或其中描述的任何实施方案(例如，第二至第十二实施方案的任一个)中所述进行。
在一些实施方案中，步骤2')的偶联反应如第四方面中所述进行。在某些实施方案中，偶联反应在本文所述的活化剂(例如，第三十九实施方案中所述的活化剂)存在下进行。在某些实施方案中，活化剂是4,5-二氰基咪唑(DCI)或5-乙硫基-1H-四唑(ETT)。
在一些实施方案中，步骤3')的硫化或氧化反应如第四方面中所述进行。
在一些实施方案中，步骤6')的脱保护反应如第二方面或其中描述的任何实施方案(例如，第二十六至第三十四实施方案的任一个)中所述进行。
在一些实施方案中，步骤7')的亚磷酰化反应如第三方面或其中描述的任何实施方案(例如，第三十九至第四十二实施方案的任一个)中所述进行。
II.靶寡核苷酸的合成
i)3'-5’延伸：
在第六方面，本公开描述了一种靶寡核苷酸的液相汇聚合成，其中靶寡核苷酸在3'-端至5'-端的方向(3'-5'方向)上组装。已经证明，本公开的汇聚液相方法成功地用于大量合成靶寡核苷酸。此外，可通过本公开的方法获得高纯度的受保护靶寡核苷酸，而无需色谱纯化。
在某些实施方案中，本文所述的汇聚液相方法包括逐步添加液(溶液)相中的寡核苷酸片段以合成靶寡核苷酸。例如，首先将5聚体与4聚体片段偶联以合成9聚体片段，所述9聚体片段进一步与另一个5聚体片段反应以合成14聚体寡核苷酸。14聚体寡核苷酸可进一步与另一个片段偶联，直到获得所需长度的靶寡核苷酸。在某些实施方案中，具有3'-疏水性羟基保护基(3'-LHPG)(3'-端片段)的5聚体片段首先与5聚体片段偶联以形成具有3'-LHPG基团的10聚体片段，然后所述10聚体片段进一步与4聚体片段反应以形成14聚体片段，该片段又与另一个4聚体片段偶联形成靶18聚体寡核苷酸。在某些实施方案中，具有n个核苷酸的3’-端片段(例如5聚体片段)是通过将具有3'-LHPG基团的单个核苷酸与具有n-1个核苷酸的片段(例如4聚体片段)偶联来合成。
第五十七实施方案公开了一种制备靶寡核苷酸的汇聚液相方法，其包括以下步骤：
a)将式(I)的寡核苷酸片段或其盐：
与式(II)的寡核苷酸片段或其盐：
在溶液中偶联以形成式(III)的寡核苷酸或其盐：
及
b)硫化或氧化式(III)的寡核苷酸或其盐，以形成式(IV)的寡核苷酸或其盐：
其中：
R1在每次出现时独立地为核碱基，其中核碱基的NH2(如果存在的话)受胺保护基的保护；
R2在每次出现时独立地选自由H、卤基和任选被C1-6烷氧基取代的C1-6烷氧基组成的组；
R4在每次出现时独立地为H或与R2的烷氧基形成环；
R15为羟基保护基；
R16在每次出现时独立地为C1-6烷基、C2-6烯基、苯基或苄基，其各自任选地被-CN、-NO2或卤素取代；或
R16为
R17a和R17b独立地为C1-6烷基；
n为2至200的整数；
m为2至20的整数
X在每次出现时独立地为O或S；
Y为含有烷基链的疏水性羟基保护基。
第五十七实施方案还包括一种用于制备靶寡核苷酸的汇聚液相方法，其包括以下步骤：
a)使式(I)的寡核苷酸片段或其盐：
与式(IIa)的寡核苷酸片段或其盐：
在溶液中偶联以形成式(IIIa)的寡核苷酸片段或其盐：
其中：
R1在每次出现时独立地为核碱基，其中核碱基的NH2(如果存在的话)受胺保护基的保护；
R2在每次出现时独立地选自由H、卤基和任选被C1-6烷氧基取代的C1-6烷氧基组成的组；
R4在每次出现时独立地为H或与R2的烷氧基形成环；
R15为羟基保护基；
R16在每次出现时独立地为C1-6烷基、C2-6烯基、苯基或苄基，其各自任选地被-CN、-NO2或卤素取代；或
R16为
n为2至200的整数；
m为2至20的整数
X在每次出现时独立地为O或S；
Y为含有烷基链的疏水性羟基保护基。
第五十八实施方案公开了第五十七实施方案中所述的方法，其中式(I)的片段可通过使式(Ia1)的核苷酸或其盐：
与式(Ia2)的寡核苷酸片段或其盐：
在溶液中偶联以形成式(I)的寡核苷酸片段或其盐。
在某些实施方案中，对于第五十八实施方案中所述的方法，n为3至20的整数。在一个特定实施方案中，n为3至6。在另一特定实施方案中，n为5。
在某些实施方案中，对于第五十八实施方案中所述的方法，片段(I)不通过色谱法纯化。在另一实施方案中，片段(I)通过选择性沉淀和/或萃取(例如，如第四十六和第四十七实施方案中所述)来纯化。
第五十九实施方案公开了如第五十七或第五十八实施方案中所述的方法，其进一步包括步骤c)：将式(IV)的寡核苷酸或其盐脱保护以形成式(V)的寡核苷酸或其盐：
第五十九实施方案还提供了如第五十七或第五十八实施方案中所述的方法，其进一步包括步骤b)：将式(IIIa)的寡核苷酸或其盐脱保护以形成式(Va)的寡核苷酸或其盐：
第六十实施方案公开了第五十九实施方案中所述的方法，其进一步包括：
d)使式(V)的寡核苷酸或其盐与式(II')的寡核苷酸片段或其盐：
偶联以形成式(VI)的寡核苷酸或其盐：
e)硫化或氧化式(VI)的寡核苷酸以形成式(VII)的寡核苷酸或其盐：
f)将式(VII)的寡核苷酸或其盐脱保护以形成式(VIII)的寡核苷酸或其盐：
g)重复步骤d)、e)和f)r-1次，然后重复步骤d)和e)以形成式(IX)的寡核苷酸或其盐：
其中：
r为1至50的整数；
pi在每次出现时独立地为2至20的整数，
i为1至r的整数；且
第六十一实施方案公开了如第六十实施方案中所述的方法，其中r为2且式(IX)的寡核苷酸由式(X)表示：
其中p1和p2各自独立地为2至20的整数。在某些实施方案中，m、n、p1和p2各自独立地为3至10、3至6或4至6的整数。在某些实施方案中，m、n、p1和p2各自独立地为4或5。在某些实施方案中，m和n均为5；且p1和p2均为4。
第六十二实施方案公开了第五十七至第六十一实施方案中所述的方法，其中不使用色谱法(例如柱色谱法)来纯化步骤a)、b)、c)、d)、e)、f)和g)中任一个的反应产物。
第六十三实施方案公开了第五十七至第六十二实施方案中所述的方法，其中步骤a)、b)、c)、d)、e)、f)和g)中任一个的反应产物通过如本文所述(例如，如第二十一、第三十五、第四十二、第四十六和第四十七实施方案中所述)的萃取和/或选择性沉淀来纯化。
在某些实施方案中，对于第六十至六十三实施方案中所述的方法，所述方法进一步包括以下步骤：
h1)将寡核苷酸(IX)或(X)脱保护以形成式(IXA)或(XA)的寡核苷酸：
或其盐。
在某些实施方案中，对于第六十至六十三实施方案中所述的方法，所述方法进一步包括以下步骤：
h1)将寡核苷酸(IX)或(X)或其盐脱保护以形成式(IXA)或(XA)的寡核苷酸：
或其盐；
h2)将寡核苷酸(IXA)或(XA)或其盐脱保护以形成式(IXB)或(XB)的寡核苷酸：
或其盐。
在某些实施方案中，对于上述步骤h1)，式(IXA)或(XA)的寡核苷酸通过使式(IX)或(X)的寡核苷酸与NH4OH反应来获得。在某些实施方案中，用NH4OH的处理还去除寡核苷酸中的其他保护基，诸如在任何核碱基中的保护基(例如，核碱基上的NH2保护基)。在某些实施方案中，用NH4OH的处理产生式(IXA)或(XA)的寡核苷酸或其盐，其中R1在每次出现时独立地为核碱基，其中核碱基的NH2(如果存在的话)不受保护。
在第六十四实施方案中，对于第六十至第六十三实施方案中所述的方法，其中当R16为-CH2CH2CN时，寡核苷酸(IX)或(X)或其盐的脱保护形成式(IXAb)或(XAb)的寡核苷酸：
或其盐。在某些实施方案中，脱保护反应通过使寡核苷酸(IX)或(X)或其盐与NH4OH反应以形成式(IXAb)或(XAb)的寡核苷酸来进行。在某些实施方案中，用NH4OH的处理还去除寡核苷酸中的其他保护基，诸如任何核碱基中的保护基(例如，核碱基上的NH2保护基)。在某些实施方案中，用NH4OH的处理产生式(IXAb)或(XAb)的寡核苷酸或其盐，其中R1在每次出现时独立地为核碱基，其中核碱基的NH2(如果存在的话)不受保护。
在某些实施方案中，在第六十四实施方案中所述的方法中，所述方法进一步包括以下步骤：
将寡核苷酸(IXAb)或(XAb)或其盐脱保护以形成式(IXBa)或(XBa)的寡核苷酸：
或其盐。在某些实施方案中，寡核苷酸(IXA)或(XA)与柠檬酸反应以形成式(IXBa)或(XBa)的寡核苷酸。
在第六十五实施方案中，在第六十至第六十三实施方案中所述的方法中，其中R16为-CH2CH2CN，所述方法进一步包括以下步骤：
h1)将寡核苷酸(IX)或(X)脱保护以形成式(IXAa)或(XAa)的寡核苷酸：
或其盐。
在某些实施方案中，在第六十五实施方案的方法中，脱保护反应通过寡核苷酸(IX)或(X)或其盐与碱反应来进行。在某些实施方案中，碱选自1,8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯、烷基胺(例如，叔丁胺、仲丁胺、二异丙基乙胺、三甲胺)及其他合适的有机碱。
第六十六实施方案公开了第六十五实施方案中所述的方法，其中所述方法进一步包括以下步骤：将寡核苷酸(IXAa)或(XAa)或其盐脱保护以形成式(IXAb)或(XAb)的寡核苷酸：
或其盐。
在某些实施方案中，在第六十六实施方案中所述的方法中，寡核苷酸(IXAa)或(XAa)或其盐的脱保护通过使寡核苷酸(IXAa)或(XAa)或其盐与NH4OH反应来进行。在某些实施方案中，用NH4OH的处理还去除寡核苷酸中的其他保护基，诸如任何核碱基中的保护基(例如，核碱基上的NH2保护基)。在某些实施方案中，用NH4OH的处理产生式(IXAb)或(XAb)的寡核苷酸或其盐，其中R1在每次出现时独立地为核碱基，其中核碱基的NH2(如果存在的话)不受保护。
在某些实施方案中，寡核苷酸(IXAb)或(XAb)或其盐可进一步与脱保护试剂(例如脱三苯甲基化试剂)反应以形成式(IXBa)或(XBa)的寡核苷酸或其盐。
在一个实施方案中，对于在第六方面或其中描述的任何实施方案(例如，第五十七至第六十六实施方案)中所述的方法，Y为：
在某些实施方案中，从步骤h1)获得的式(IXA)或(XA)的寡核苷酸或式(IXAb)或(XAb)的寡核苷酸通过深层过滤来纯化。在一个实施方案中，步骤h1)的反应混合物在进行深层过滤之前用硫酸铵溶液稀释。用硫酸铵的稀释可以防止寡核苷酸粘在过滤器上。
在某些实施方案中，硫酸铵溶液的浓度介于100mM与5M之间、介于500mM与2M之间、介于500mM与1500mM之间、或介于1000mM与1200mM之间。
任何合适的深层过滤器均可用于深层过滤。如本文所用，术语“深层过滤器”是指使用多孔过滤介质来保留颗粒穿过介质而不是仅在介质表面上的过滤器。当要过滤的流体含有大量颗粒时，通常使用这些过滤器，因为相对于其他类型的过滤器，它们可以在堵塞之前保留大量颗粒。令人惊讶地发现，深层过滤可以有效地从反应混合物中去除副产物LHPG-OH(例如Y-OH)，然后对混合物进行HIC纯化。
在某些实施方案中，深层过滤器包含助滤剂，诸如硅藻土、纤维素、聚丙烯酸纤维和二氧化硅、以及活性炭。
在某些实施方案中，从步骤h1)获得的式(IXA)、(IXAb)、(XA)或(XAb)的寡核苷酸通过深层过滤，继之疏水相互作用色谱法(HIC)来纯化。
在某些实施方案中，对于上述步骤h2)，式(IXA)、(IXAa)、(IXAb)、(XA)、(XAa)或(XAb)的寡核苷酸与本文所述的脱三苯甲基化试剂反应以形成式(IXB)、(IXBa)、(XB)或(XBa)的寡核苷酸。在一个实施方案中，脱三苯甲基化试剂是有机酸。在一个实施方案中，有机酸是乙酸或柠檬酸。在一个特定实施方案中，脱三苯甲基化试剂是柠檬酸。在一个实施方案中，式(IXA)、(IXAa)、(IXAb)、(XA)、(XAa)或(XAb)中的R15为4,4'-二甲氧基三苯甲基。在某些实施方案中，步骤h2)的脱三苯甲基化反应在水溶液中进行。
在某些实施方案中，从步骤h2)获得的式(IXB)、(IXBa)、(XB)或(XBa)的寡核苷酸通过阴离子交换色谱法纯化。
第六十七实施方案公开了第五十七至六十六实施方案中所述的方法，其中片段(I)通过以下步骤获得：
1)将式(I’A)化合物或其盐：
脱保护，以形成式(IA)化合物或其盐：
2)使式(IA)化合物或其盐与式(A1)化合物或其盐：
反应，以形成式(IB)化合物或其盐：
及
3)用硫化剂或氧化剂硫化或氧化式(IB)化合物或其盐以形成式(IC)化合物或其盐：
4)将式(IC)化合物或其盐脱保护以形成式(ID)化合物或其盐：
5)从式(ID)化合物开始，重复步骤2)、3)和4)n-2次，得到式(I)的片段或其盐。
第六十八实施方案公开了第六十七实施方案中所述的方法，其中不使用色谱法(例如柱色谱法)来纯化步骤1)、2)、3)、4)和5)中任一个的反应产物。
第六十九实施方案公开了第六十七或第六十八实施方案中所述的方法，其中步骤1)、2)、3)、4)和5)中任一个的反应产物通过如本文所述(例如，如在第二十一、第三十五、第四十二、第四十六或第四十七实施方案中所述)的萃取和/或选择性沉淀来纯化。
第七十实施方案公开了第五十七至第六十九实施方案中所述的方法，其中Y由下式表示：
其中X0为C1-10烷基，其中一个或多个CH2基团独立地被C(O)、C(O)NH2、环烷基或杂环基置换；且X1为C1-25烷基或C1-25烷氧基。在一个特定实施方案中，Y由下式表示：
其中p为1至10的整数；Het为饱和杂环；且其余变量如上所述。在一个更特定的实施方案中，Het为哌嗪。
第七十一实施方案公开了第五十七至第六十九实施方案中所述的方法，其中Y为：
第七十二实施方案公开了第五十七至第七十一实施方案中所述的方法，其中式(II)的片段通过以下步骤获得：
1’)将式(IIA’)化合物或其盐:
脱保护，以形成式(IIA)化合物或其盐：
2’)使式(IIA)化合物或其盐与式(A2)化合物或其盐：
反应，以形成式(IIB)化合物或其盐：
及
3’)用硫化剂或氧化剂硫化或氧化式(IIB)化合物或其盐以形成式(IIC)化合物或其盐：
4’)将式(IIC)化合物或其盐脱保护，以形成式(IID)化合物或其盐：
5’)当m为3时，从式(IID)化合物或其盐开始，重复步骤2')和步骤3')以形成式(IIE)化合物或其盐，或
当m大于3时，从式(IID)化合物或其盐开始，重复步骤2')、3')和4')m-3次，然后进行步骤2')和步骤3')以形成式(IIE)化合物或其盐：
6’)将式(IIE)化合物或其盐脱保护，以形成式(IIF)化合物或其盐：
及
7’)使式(IIF)化合物或其盐与亚磷二酰胺(R16O)P(NR17aR17b)2反应，得到式(II)的片段或其盐，其中Z为羟基保护基。
第七十三实施方案公开了第七十二实施方案中所述的方法，其中式(II)的片段在与式(I)的片段反应之前不通过色谱法纯化。
第七十四实施方案公开了第七十二或第七十三实施方案中所述的方法，其中步骤1')、2')、3')、4')、5')、6')和7')中任一个的反应产物通过萃取和/或选择性沉淀(例如，如第二十一、第三十五、第四十二、第四十六或第四十七实施方案中所述)来纯化。
第七十五实施方案公开了第五十九至第七十四实施方案中所述的方法，其中式(II')的片段通过以下步骤来制备：
1”)将式(II’A’)化合物或其盐：
脱保护以形成式(II’A)化合物或其盐：
2”)使式(II’A)化合物或其盐与式(A2)化合物或其盐：
反应以形成式(II’B)化合物或其盐：
及
3”)用硫化剂或氧化剂硫化或氧化式(II’B)化合物或其盐以形成式(II’C)化合物或其盐：
4”)将式(II’C)化合物或其盐脱保护，以形成式(II’D)化合物或其盐：
5”)从式(II'D)化合物或其盐开始，重复步骤1')、2')和3')pi-2次，接着进行步骤1')和步骤2')以形成式(II'E)化合物或其盐：
6”)将式(II’E)化合物或其盐脱保护，以形成式(II’F)化合物或其盐：
7”)使式(II’F)化合物或其盐与亚磷二酰胺(R16O)P(NR17aR17b)2反应，得到式(II’)的片段或其盐，其中Z为羟基保护基。
第七十六实施方案公开了第七十五实施方案中所述的方法，其中式(II')的片段在与式(V)的寡核苷酸反应之前不通过色谱法(柱色谱法)来纯化。
第七十七实施方案公开了第七十五或第七十六实施方案中所述的方法，其中步骤1”)、2”)、3”)、4”)、5”)、6”)和7”)中任一个的反应产物通过本文所述(例如，如第二十一、第三十五、第四十二、第四十六或第四十七实施方案中所述)的萃取和/或选择性沉淀来纯化。
第七十八实施方案公开了第五十七至第七十七实施方案中任一个的方法，其中n为3、4、5或6。
第七十九实施方案公开了第五十七至第七十八实施方案中任一个的方法，其中m为3、4、5或6。
第八十实施方案公开了第五十九至第七十九实施方案中任一个的方法，其中pi每次出现时独立地为3、4、5或6。
第八十一实施方案公开了第六十至第七十九实施方案中任一个的方法，其中p1和p2各自独立地为3、4、5或6。
第八十二实施方案公开了第六十至第八十一实施方案中任一个的方法，其中r为1、2、3、4、5或6。
在一些实施方案中，步骤c)、f)、1)、4)、1')、4')、1”)和4”)的脱保护反应或脱三苯甲基化反应如第一方面或其中描述的任何实施方案(例如，第二至第十二实施方案)中所述进行。
在一些实施方案中，步骤a)、d)、2)、2')和2”)的偶联反应可通过向含有3'-OH保护的核苷酸片段和5'-OH保护的亚磷酰胺或膦酸酯片段的有机溶液中添加活化剂来进行。
在一些实施方案中，步骤b)、e)、3)、3')和3”)的硫化反应可通过使用硫化剂(例如3-氨基-1,2,4-二噻唑-5-硫酮(XH或ADTT)、3-(N,N-二甲氨基-亚甲基)氨基)-3H-1,2,4-二噻唑(DDTT)、苯乙酰二硫化物(PADS)、3H-1,2-苯并二硫醇-3-酮1,1-二氧化物(Beaucage试剂)或苯基-3H-1,2,4-二噻唑-3-酮(POS)来进行。在一个特定实施方案中，硫化剂是DDTT。在某些实施方案中，碱是吡啶或咪唑。
在某些实施方案中，步骤b)、e)、3)、3')和3”)的氧化反应可通过使用文献中已知的标准氧化剂进行。示例性氧化剂包括但不限于叔丁基过氧化氢(t-BuOOH)、(1S)-(+)-(10-樟脑磺酰基)氧杂吖丙啶(CSO)、I2和碘-吡啶-水氧化剂溶液。在一个特定实施方案中，氧化剂是t-BuOOH。
在一些实施方案中，步骤6’)或6”)的脱保护反应如第二方面或其中描述的任何实施方案(例如，第二十三至第三十一实施方案)中所述。
在一些实施方案中，步骤7')或7”)的亚磷酰化反应如第三方面或其中描述的任何实施方案(例如，第三十五至第三十八实施方案)中所述。
ii)5'-3’延伸：
在第七方面，本公开描述了一种靶寡核苷酸的液相汇聚合成，其中靶寡核苷酸在5’-端至3’-端的方向(5’-3’方向)上组装。已经证明，本公开的5’-3’方向汇聚液相方法成功地用于合成靶寡核苷酸。此外，可通过本公开的方法获得高纯度的受保护靶寡核苷酸，而无需色谱纯化。
在某些实施方案中，本文所述的汇聚液相方法包括逐步添加液(溶液)相中的寡核苷酸片段以合成靶寡核苷酸。例如，具有5'-疏水性羟基保护基的5聚体片段(5'-LHPG)(5'-端片段)首先与5聚体片段偶联以形成具有5'-LHPG基团的10聚体片段，然后该10聚体片段进一步与另一个5聚体片段反应以形成15聚体寡核苷酸。在某些实施方案中，具有n个核苷酸的5’-端片段(例如，5聚体片段)通过使具有5’-LHPG基团的单个核苷酸与具有n-1个核苷酸的片段(例如，4聚体片段)偶联来合成。
第八十三实施方案公开了一种用于制备靶寡核苷酸的汇聚液相方法，其包括以下步骤：
a)使式(II2)的寡核苷酸片段或其盐：
与式(I2)的寡核苷酸片段或其盐：
在溶液中偶联以形成式(III2)的寡核苷酸或其盐：
及
b)硫化或氧化式(III2)的寡核苷酸或其盐，以形成式(IV2)的寡核苷酸或其盐：
其中：
R1在每次出现时独立地为核碱基，其中核碱基的NH2(如果存在的话)受胺保护基的保护；
R2在每次出现时独立地选自由H、卤基和任选被C1-6烷氧基取代的C1-6烷氧基组成的组；
R4在每次出现时独立地为H或与R2的烷氧基形成环；
R16在每次出现时独立地为C1-6烷基、C2-6烯基、苯基或苄基，其各自任选地被-CN、-NO2或卤素取代；或
R16为
R17a和R17b独立地为C1-6烷基；
n1为2至20的整数；
m1为2至200的整数；
X在每次出现时独立地为O或S；
Y为含有烷基链的疏水性羟基保护基；
Z为甲硅烷基羟基保护基。
第八十四实施方案公开了第八十三实施方案中所述的方法，其中片段(II2)通过以下步骤制备：
ia)使式(II2a1)的核苷酸或其盐：
与式(II2a2)的寡核苷酸片段或其盐：
在溶液中偶联以形成式(II2a3)的寡核苷酸或其盐：
iia)硫化或氧化式(II2a3)的寡核苷酸或其盐以形成式(II2a4)的寡核苷酸或其盐：
iia)将式(II2a4)的寡核苷酸或其盐脱保护以形成式(II2)的寡核苷酸或其盐。
第八十五实施方案公开了第八十四实施方案中所述的方法，其中片段(II2a2)通过使式(II2a5)的寡核苷酸或其盐：
与亚磷二酰胺(R16O)P(NR17aR17b)2反应以形成化合物(II2a2)而获得。
第八十六实施方案公开了第八十五实施方案中所述的方法，其中式(II2a3)的寡核苷酸通过以下步骤获得：
iA)将式(II2A’)化合物或其盐：
脱保护，以形成式(II2A)化合物或其盐：
iiA)使式(II2A)化合物或其盐与式(A12)化合物或其盐：
反应，以形成式(II2B)化合物或其盐：
及
iiiA)用硫化剂或氧化剂硫化或氧化式(II2B)化合物或其盐以形成式(II2C)化合物或其盐：
ivA)将式(II2C)化合物或其盐脱保护，以形成式(IID)化合物或其盐：
vA)当m1大于3时，从式(IID)化合物开始，重复ii)、iii)和iv)的步骤m1-3次，形成式(II2a3)化合物或其盐。
在某些实施方案中，在第八十四至第八十六实施方案的任一个中公开的方法中，m1为3至20的整数。在一个特定实施方案中，m1为3至6。在另一特定实施方案中，m1为4。在又一特定实施方案中，m1为5。
第八十七实施方案公开了如第七方面或第八十三至第八十六实施方案的任一个中所述的方法，其中片段(I2)通过使式(I2a1)的寡核苷酸或其盐：
与亚磷二酰胺(R16O)P(NR17aR17b)2反应以形成式(I2)的片段而获得。
第八十八实施方案公开了如第八十七实施方案中所述的方法，其中式(I2a1)的寡核苷酸通过以下步骤获得：
i’)将式(I2A’)化合物或其盐：
脱保护，以形成式(I2A)化合物或其盐：
ii’)使式(I2A)化合物或其盐与式(A11)化合物或其盐：
反应，以形成式(I2B)化合物或其盐：
及
iii’)用硫化剂或氧化剂硫化或氧化式(I2B)化合物或其盐以形成式(I2C)化合物或其盐：
iv’)将式(I2C)化合物或其盐脱保护以形成式(I2D)化合物或其盐：
v')当n1大于2时，从式(I2D)化合物开始，重复ii')、iii')和iv')的步骤n1-2次以形成式(I2a1)化合物或其盐。
第八十九实施方案公开了如第八十三至第八十八实施方案中所述的方法，其进一步包括，进一步包括步骤c)：将式(IV2)的寡核苷酸或其盐脱保护以形成式(V2)的寡核苷酸或其盐：
第九十实施方案公开了如第八十九实施方案中所述的方法，其进一步包括：
d)使式(V2)的寡核苷酸或其盐与式(II2’)的寡核苷酸片段或其盐
偶联，以形成式(VI2)的寡核苷酸或其盐：
e)硫化或氧化式(VI2)的寡核苷酸以形成式(VII2)的寡核苷酸或其盐：
f)将式(VII2)的寡核苷酸或其盐脱保护，以形成式(VIII2)的寡核苷酸或其盐：
g)重复步骤d)、e)和f)r1-1次，接着重复步骤d)和e)，以形成式(IX2)的寡核苷酸或其盐：
其中：
r1为1至50的整数；
si在每次出现时独立地为2至20的整数，
i为1至r1的整数；并且
第九十一实施方案公开了如第九十实施方案中所述的方法，其中r1为2且式(IX2)的寡核苷酸由式(X2)或其盐表示：
其中s1和s2各自独立地为2至20的整数。
第九十二实施方案公开了如第九十实施方案中所述的方法，其中r1为1且式(IX2)的寡核苷酸由式(X2’)或其盐表示：
其中s1为2至20的整数。
在某些实施方案中，对于第九十一或第九十二实施方案的方法，s1、s2、m1和n1各自独立地为3至10、3至6或4至6的整数。在某些实施方案中，s1、s2、m1和n1各自独立地为4或5。
第九十三实施方案公开了如第九十、第九十一或第九十二实施方案中所述的方法，其中式(II2')的寡核苷酸片段通过使式(II2a1')的寡核苷酸或其盐：
与亚磷二酰胺(R16O)P(NR17aR17b)2反应以形成式(II2’)的片段或其盐而获得。
第九十四实施方案公开了如第九十三实施方案中所述的方法，其中式(II2a1')的寡核苷酸通过以下步骤获得：
i”)将式(II’2A’)化合物或其盐：
脱保护，以形成式(II’2A)化合物或其盐：
ii”)使式(II’2A)化合物或其盐与式(A12’)化合物或其盐：
反应，以形成式(II’2B)化合物或其盐：
及
iii”)用硫化剂或氧化剂硫化或氧化式(II’2B)化合物或其盐以形成式(II’2C)化合物或其盐：
iv”)将式(II’2C)化合物或其盐脱保护，以形成式(II’2D)化合物或其盐：
v”)当si大于2时，从(II'2D)化合物开始，重复步骤ii”)、iii”)和iv”)si-2次以形成式(II2a1')化合物或其盐。
第九十五实施方案公开了如第八十三至第九十四实施方案中所述的方法，其中不使用色谱法来纯化步骤a)、b)、c)、d)、e)、f)和g)中任一个的反应产物。
第九十六实施方案公开了如第八十三至第九十四实施方案中所述的方法，其中步骤a)、b)、c)、d)、e)、f)和g)中任一个的反应产物通过如本文所述(例如，如第二十一、第三十五、第四十二、第四十六或第四十七实施方案中所述)的萃取和/或选择性沉淀来纯化。
第九十七实施方案公开了如第九十至第九十六实施方案中所述的方法，其中所述方法进一步包括将式(IX2)、(X2)或(X2')的寡核苷酸或其盐脱保护以形成式(IX2A)、(X2A)或(X2A')的寡核苷酸或其盐：
在某些实施方案中，Z为式(IX2)、(X2)或(X2')中选自TBDPS、ToBDPS和TBDAS的基团。在某些实施方案中，脱保护反应如第二方面或其中描述的任何实施方案中(例如，在第二十六至第三十二实施方案中)所述进行。
第九十八实施方案公开了如第八十三至第九十七实施方案的任一个中所述的方法，其中，当R16为-CH2CH2CN时，所述方法进一步包括以下步骤：
h1)将寡核苷酸(IX2A)、(X2A)或(X2A')或其盐脱保护以形成式(IX2Aa)、(X2Aa)或(X2Aa')的寡核苷酸：
或其盐。
第九十九实施方案公开了如第九十八实施方案中所述的方法，其中脱保护反应通过使寡核苷酸(IX2A)、(X2A)或(X2A')或其盐与碱反应来进行。在某些实施方案中，碱选自1,8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯、烷基胺(例如，叔丁胺、仲丁胺、二异丙基乙胺和三乙胺)及其他合适的有机碱。
第100实施方案公开了如第九十八或第九十九实施方案中所述的方法，其中所述方法进一步包括以下步骤：将寡核苷酸(IX2Aa)、(X2Aa)或(X2Aa')或其盐脱保护以形成式(IX2B)、(X2B)或(X2B')的寡核苷酸：
或其盐。
第101实施方案公开了如第100实施方案中所述的方法，其中脱保护通过使寡核苷酸(IX2Aa)或(X2Aa)或其盐与NH4OH反应来进行。在某些实施方案中，用NH4OH的处理还去除寡核苷酸中的其他保护基，诸如任何核碱基中的保护基(例如，核碱基上的NH2保护基)。在某些实施方案中，用NH4OH的处理产生式(IX2B)、(X2B)或(X2B’)的寡核苷酸或其盐，其中R1每次出现时独立地为核碱基，其中核碱基的NH2(如果存在的话)不受保护。
第102实施方案公开了如第八十三至第101实施方案的任一个中所述的方法，其中n1为3、4、5或6。
第103实施方案公开了如第九十至第101实施方案的任一个中所述的方法，其中s i在每次出现时独立地为3、4、5或6。
第104实施方案公开了如第九十一至第101实施方案的任一个中所述的方法，其中s1和s2 ae各自独立地为3、4、5或6。
第105实施方案公开了如第八十三至第101实施方案的任一个中所述的方法，其中r1为1、2、3、4、5或6。
第106实施方案公开了如第一至第105实施方案的任一个中所述的方法，其中所述化合物或寡核苷酸中的所有P＝X基团均为P＝S。
第107实施方案公开了如第一至第105实施方案的任一个中所述的方法，其中所述化合物或寡核苷酸中的所有P＝X基团均为P＝O。
第108实施方案公开了如第一至第105实施方案的任一个中所述的方法，其中所述化合物或寡核苷酸中大于10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的P＝X基团为P＝S。
第109实施方案公开了如第一至第105实施方案的任一个中所述的方法，其中所述化合物或寡核苷酸中10-90％、20-80％、30-70％或40-60％的P＝X基团为P＝S。
第110实施方案公开了如第一至第105实施方案的任一个中所述的方法，其中所述化合物或寡核苷酸中10-90％、20-80％、30-70％或40-60％的P＝X基团为P＝O。
在一些实施方案中，第八十四至第九十实施方案和第九十六实施方案中任一个的步骤iia)、步骤c)和f)的脱保护反应可如第一方面或其中描述的任何实施方案(例如第二十六至第三十四实施方案)中所述进行
在一些实施方案中，第七方面的iA)、ivA)、i')、iv')、i”)和iv”)的脱保护步骤可如第一方面或其中描述的任何实施方案(例如，第二至第十二实施方案)中所述进行。
在一些实施方案中，步骤a)、ia)、ii)、iiA)、ii’)、d)和ii”)的偶联反应可通过将活化剂添加到含有3’-OH保护的核苷酸片段和5’-OH保护的亚磷酰胺或膦酸酯片段的有机溶液中来进行。
在一些实施方案中，步骤b)、iii)、iiiA)、iii’)、e)和iii”)的硫化反应可通过使用硫化剂(例如，3-氨基-1,2,4-二噻唑-5-硫酮(XH或ADTT)、3-(N,N-二甲氨基-亚甲基)氨基)-3H-1,2,4-二噻唑(DDTT)、苯乙酰二硫化物(PADS)、3H-1,2-苯并二硫醇-3-酮1,1-二氧化物(Beaucage试剂)或苯基-3H-1,2,4-二噻唑-3-酮(POS)来进行。在一个特定实施方案中，硫化剂是DDTT。在某些实施方案中，碱是吡啶或咪唑。
在某些实施方案中，步骤b)、iii)、iiiA)、iii’)e)和iii”)的氧化反应可通过使用文献中已知的标准氧化剂进行。示例性氧化剂包括但不限于叔丁基过氧化氢(t-BuOOH)、(1S)-(+)-(10-樟脑磺酰基)氧杂吖丙啶(CSO)、I2和碘-吡啶-水氧化剂溶液。在一个特定实施方案中，氧化剂是t-BuOOH。
在一些实施方案中，第八十五、第八十七和第九十二实施方案的亚磷酰化反应可如第三方面或其中描述的任何实施方案(例如，第三十九至第四十二实施方案)中所述进行。
在一个实施方案中，Y为：
在某些实施方案中，从脱保护反应获得的式(IX2B)、(X2B)或(X2B')的寡核苷酸通过深层过滤来纯化。在一个实施方案中，脱保护反应的反应混合物在进行深层过滤之前用硫酸铵溶液稀释。用硫酸铵的稀释可以防止寡核苷酸粘在过滤器上。
在某些实施方案中，硫酸铵溶液的浓度介于100mM与5M之间、介于500mM与2M之间、介于500mM与1500mM之间、或介于1000mM与1200mM之间。
任何合适的深层过滤器都可用于深层过滤，例如本文所述的合适的深层过滤器。
在某些实施方案中，式(IX2A)、(IX2Aa)、(IX2Aa')、(X2A)、(X2A')、(X2Aa)、(X2Aa')、(X2B)或(X2B')的寡核苷酸可通过深层过滤，继之疏水相互作用色谱法(HIC)来纯化。
在某些实施方案中，在第一至第八方面或其中描述的任何实施方案(例如，第一至第135实施方案)中所述的任何反应均可在合适的溶剂或合适的溶剂的混合物中进行。在某些实施方案中，反应可在合适的有机溶剂或合适的有机溶剂的混合物中进行。可用于本公开中的示例性有机溶剂包括但不限于二氯甲烷(DCM)、乙腈(ACN)、四氢呋喃(THF)、丙酮、2-甲基四氢呋喃、甲基叔丁基醚、乙酸乙酯等。
在某些实施方案中，在第一至第八方面或其中描述的任何实施方案(例如，第一至第135实施方案)中所述的任何反应均可在合适的温度下进行。在某些实施方案中，反应在室温下进行。在某些实施方案中，反应在20℃与30℃之间的温度下进行。在某些实施方案中，反应在-10℃与10℃之间、-5℃与5℃之间的温度下进行。在某些实施方案中，反应在25±2℃下进行。在某些实施方案中，反应在0±2℃下进行。
第111实施方案公开了本文所述的实施方案(例如，第一至第135实施方案)中任一个的方法，其中核碱基选自由以下组成的组：胞嘧啶、鸟嘌呤、腺嘌呤、胸腺嘧啶、尿嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、5,6-二氢尿嘧啶、5-甲基胞嘧啶和5-羟甲基胞嘧啶，其中核碱基的NH2基团(如果存在的话)受PhCO-、CH3CO-、iPrCO-、Me2N-CH＝或Me2N-CMe＝的保护。
第112实施方案公开了本文所述的实施方案(例如，第一至第135实施方案)中任一个的方法，其中R1选自由以下组成的组：胞嘧啶、鸟嘌呤、腺嘌呤、胸腺嘧啶、尿嘧啶和5-甲基胞嘧啶，其中核碱基的NH2基团(如果存在的话)受PhCO-、CH3CO-、iPrCO-、Me2N-CH＝或Me2N-CMe＝的保护。
第113实施方案公开了本文所述的实施方案(例如，第一至第135实施方案)中任一个的方法，其中：
每个R2独立地选自由H、F和任选被C1-4烷氧基取代的C1-4烷氧基组成的组；
每个R4独立地为H或与R2的烷氧基形成环，其中所述环为任选被1至3个C1-4烷基取代的5或6元环；
R16为-CH2CH2CN；且
R17a和R17b独立地为C1-4烷基。
在一个特定实施方案中，所述方法为第113实施方案中所述的方法，其中：
每个R2独立地为H或-OCH2CH2OMe；
每个R4为H；
R16为-CH2CH2CN；且
R17a和R17b均为-CH(CH3)2。
第114实施方案公开了如第五十一至第135实施方案的任一个中所述的方法，其中所述靶寡核苷酸为包含16至30个核苷酸的反义寡核苷酸。
第115实施方案公开了第114实施方案中所述的方法，其中反义寡核苷酸仅包含修饰的RNA。
第116实施方案公开了第114实施方案中所述的方法，其中反义寡核苷酸包含DNA和修饰的RNA。
第117实施方案公开了第114实施方案中所述的方法，其中反义寡核苷酸是缺口聚体。
第118实施方案公开了第114实施方案中所述的方法，其中反义寡核苷酸仅包含DNA。
在某些实施方案中，本文描述的具有5'-DMT基团(由R15表示)的靶寡核苷酸通过色谱法(例如疏水相互作用色谱法(HIC))纯化，然后进行脱三苯甲基化反应以去除5'-DMT基团。
III.具有手性硫代磷酸酯键的寡核苷酸的合成
在第八方面，本公开描述了使用P(V)-PSI试剂合成立体特异性寡核苷酸的液相方法(K.W.Knouse,J.N.deGruyter,M.A.Schmidt,等人Science,第361卷,第6408期,第1234-1238页(2018))。线性合成的寡核苷酸片段可以使用本文所述的液相汇聚合成方法组合以产生立体选择性靶寡核苷酸(例如反义寡核苷酸(ASO))。
第119实施方案公开了用于制备式(PI1)或(PI2)的寡核苷酸或其盐的液相方法，
其包括以下步骤：
1)使式(PIB)化合物或其盐：
与式(PI1A)或(PI2A)的化合物或其盐：
偶联以形成式(PI1C)或(PI2C)的化合物或其盐：
2)将式(PI1C)或(PI2C)的化合物或其盐脱保护以形成式(PI1D)或(PI2D)的化合物或其盐：
3)从式(PI1D)或(PI2D)的化合物或其盐开始，重复步骤1)和2)t-3次，接着进行步骤1)，得到式(PI')或其盐，其中：
R1在每次出现时独立地为核碱基，其中核碱基的NH2(如果存在的话)受胺保护基的保护；
R2在每次出现时独立地选自由H、卤基和任选被C1-6烷氧基取代的C1-6烷氧基组成的组；
R4在每次出现时独立地为H或与R2的烷氧基形成环；
R15为羟基保护基；
t为3至20的整数；且
Z为甲硅烷基羟基保护基。
在第120实施方案中，对于第119实施方案中所述的方法，式(PI1A)化合物通过以下操作来制备：使式(PIA1)化合物或其盐：
与式(1)化合物：
反应以形成式(PI1A)化合物或其盐；并且
式(PI2A)化合物通过以下操作来制备：使式(PIA1)化合物或其盐与式(2)化合物：
反应以形成式(PI2A)化合物或其盐。
第121实施方案公开了如第119或第120实施方案的方法中所述的方法，其中式(PIB)的片段通过将式(PIB1)化合物或其盐
脱保护来制备。
第122实施方案公开了如第119、第120或第121实施方案的方法中所述的方法，其中步骤1)的偶联反应在碱的存在下进行。在某些实施方案中，碱选自8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯(DBU)、烷基胺(例如，叔丁胺、仲丁胺、二异丙基乙胺、三甲胺、三乙胺、2-甲基丙-2-胺等)及其他合适的有机碱。在一个特定实施方案中，碱是DBU。
在某些实施方案中，步骤1)的偶联反应在无水或基本上无水的溶液中在碱存在下进行。在某些实施方案中，无水或基本上无水的溶液通过在反应之前使用共沸蒸馏去除水而获得。在某些实施方案中，无水或基本上无水的溶液是通过添加干燥剂而获得。
第123实施方案公开了如第122实施方案的方法中所述的方法，其中偶联反应在碱和干燥剂的存在下进行。可以使用任何合适的干燥剂。在一些实施方案中，干燥剂选自氯化钙、氯化钾、硫酸钠、硫酸钙、硫酸镁和分子筛。在一个特定实施方案中，干燥剂是分子筛。
在某些实施方案中，碱是DBU且干燥剂是分子筛。在一个特定实施方案中，分子筛的尺寸为
第124实施方案公开了如第119至第121实施方案的任一个中所述的方法，其中脱保护反应通过使所述化合物与脱三苯甲基化试剂反应来进行。在某些实施方案中，脱三苯甲基化试剂是有机酸。在某些实施方案中，脱三苯甲基化试剂是CF3COOH、CCl3COOH、CHCl2COOH、CH2ClCOOH、柠檬酸、甲磺酸、苯磺酸、CClF2COOH、CHF2COOH或PhSO2H。在一个特定实施方案中，脱三苯甲基化试剂是CHCl2COOH。在另一优选实施方案中，脱三苯甲基化试剂是柠檬酸。
第125实施方案公开了如第119实施方案至第124实施方案的任一个中所述的方法，其中R15为4,4'-二甲氧基三苯甲基。
第126实施方案公开了如第120至第125实施方案的任一个中所述的方法，其中式(PIA1)化合物与式(1)或(2)化合物之间的反应在无水或基本上无水的溶液中在碱存在下进行。
在某些实施方案中，无水或基本上无水的溶液通过在反应之前使用共沸蒸馏去除水而获得。在某些实施方案中，无水或基本上无水的溶液是通过添加干燥剂而获得。
在某些实施方案中，碱选自1,8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯(DBU)、烷基胺(例如，叔丁胺、仲丁胺、二异丙基乙胺、三甲胺、三乙胺等)及其他合适的有机碱。在一个特定实施方案中，碱是DBU。
第127实施方案公开了如第119至126实施方案的任一个中所述的方法，其中所述方法进一步包括将式(PI1)或(PI2)的寡核苷酸或其盐脱保护以形成式(PI1’)或(PI2’)的寡核苷酸或其盐：
第128实施方案公开了如第127实施方案中所述的方法，其中甲硅烷基保护基选自TBDPS、TBoDPS和TBDAS。
其中R5、R6和R7各自独立地为H、C1-30烷基或C1-30烷氧基。在一个特定实施方案中，Z为TBDPS。
第129实施方案公开了如第128实施方案中所述的方法，其中脱保护反应是通过使式(PI1)或(PI2)的寡核苷酸或其盐与脱甲硅烷基化试剂(例如，如第二方面或其中描述的任何实施方案中所述)反应进行的反应。在某些实施方案中，二甲硅烷基化试剂为四-正丁基氟化铵(TEAF)。
第130实施方案公开了如第119至第129实施方案的任一个中所述的方法，其中：每个R2独立地选自H、F或任选被C1-4烷氧基取代的C1-4烷氧基；且R4为H。在一个特定实施方案中，R2为H。在另一特定实施方案中，R2为-OCH2CH2OCH3。
第131实施方案公开了如第119至第130实施方案的任一个中所述的方法，其中式(PI1A)、(PI2A)、(PIB)、(PI1C)、(PI2C)、(PI1D)、(PI2D)、(PI1)、(PI2)、(PI1')和/或(PI2')通过柱色谱法来纯化。
本公开还提供了一种用于制备寡核苷酸的汇聚液相方法，其中寡核苷酸中的硫代磷酸酯键的至少一部分是非对映特异性硫代磷酸酯。
第132实施方案公开了一种用于制备寡核苷酸的汇聚液相方法，其包括以下步骤：使式(P1F1)或(P2F2)的寡核苷酸片段或其盐：
与式(P1F2)或(P2F2)的寡核苷酸或其盐：
偶联，以形成式(PIII1)或(PIII2)的寡核苷酸或其盐：
其中：
R1在每次出现时独立地为核碱基，其中核碱基的NH2(如果存在的话)受胺保护基的保护；
R2在每次出现时独立地选自由H、卤基和任选被C1-6烷氧基取代的C1-6烷氧基组成的组；
R4在每次出现时独立地为H或与R2的烷氧基形成环；
R15为羟基保护基；
X在每次出现时独立地为O或S；
t1为3至20的整数；
x1为3至20的整数；且
Z为甲硅烷基羟基保护基。
具体地，式(PIII1)的寡核苷酸或其盐通过式(P1F1)的寡核苷酸片段或其盐与式(P1F2)的寡核苷酸或其盐之间的偶联反应形成。类似地，式(PIII2)的寡核苷酸或其盐通过式(P2F1)的寡核苷酸片段或其盐与式(P2F2)的寡核苷酸或其盐之间的偶联反应形成。
在某些实施方案中，式(PIII1)或(PIII2)的寡核苷酸或其盐通过色谱法来纯化。
第133实施方案公开了一种用于制备寡核苷酸的汇聚液相方法，其包括以下步骤：使式(P1F3)或(P2F3)的寡核苷酸片段或其盐：
与式(PF4)的寡核苷酸片段或其盐：
偶联，以形成式(PIV1)或(PIV2)的寡核苷酸或其盐：
其中：
R1在每次出现时独立地为核碱基，其中核碱基的NH2(如果存在的话)受胺保护基的保护；
R2在每次出现时独立地选自由H、卤基和任选被C1-6烷氧基取代的C1-6烷氧基组成的组；
R4在每次出现时独立地为H或与R2的烷氧基形成环；
R15为羟基保护基；
X在每次出现时独立地为O或S
t2为3至20的整数；
x2为3至20的整数；且
Z为甲硅烷基羟基保护基。
具体地，式(PIV1)的寡核苷酸或其盐通过式(P1F3)的寡核苷酸片段或其盐与式(PF4)的寡核苷酸片段或其盐之间的偶联反应形成。类似地，式(PIV2)的寡核苷酸或其盐通过式(P2F3)的寡核苷酸片段或其盐与式(PF4)的寡核苷酸片段或其盐之间的偶联反应形成。
在某些实施方案中，式(PIV1)或(PIV2)的寡核苷酸或其盐通过色谱法来纯化。
第134实施方案公开了如第133实施方案中所述的方法，其中所述方法进一步包括以下步骤：
a)将式(PIV1)或(PIV2)的寡核苷酸或其盐脱保护以形成式(PIV1')或(PIV2')的寡核苷酸或其盐：
及
b)使式(PIV1')或(PIV2')的寡核苷酸或其盐与式(P1F5)或(P2F5)的寡核苷酸片段或其盐：
偶联，以形成式(PV1)或(PV2)的寡核苷酸或其盐：
其中y1为3至20的整数。
具体地，式(PV1)的寡核苷酸或其盐通过式(PIV1’)的寡核苷酸或其盐与式(P1F5)的寡核苷酸片段或其盐之间的偶联反应形成。类似地，式(PV2)的寡核苷酸或其盐通过式(PIV2’)的寡核苷酸或其盐与式(P2F5)的寡核苷酸片段或其盐之间的偶联反应形成。
在某些实施方案中，式(PIV1')或(PIV2')的寡核苷酸或其盐和/或式(PV1)或(PV2)的寡核苷酸或其盐通过色谱法来纯化。
在某些实施方案中，式(P1F5)或(P2F5)的寡核苷酸片段或其盐通过使式(PF5a)的寡核苷酸片段或其盐：
与PSI试剂(即式(1)或(2)的化合物或其盐)反应来制备。
在某些实施方案中，式(PF5a)的寡核苷酸或其盐通过使式(PF5b)的寡核苷酸或其盐：
与碱反应来制备，其中R16为-CH2CH2CN。在某些实施方案中，碱选自DBU、烷基胺(例如，叔丁胺、仲丁胺、二异丙基乙胺、三甲胺、三乙胺、2-甲基丙-2-胺等)及其他合适的有机碱。在一个特定实施方案中，碱是三乙胺或2-甲基丙-2-胺。在另一特定实施方案中，碱是三乙胺。
第135实施方案公开了如第133实施方案中所述的方法，其中所述方法进一步包括以下步骤：
a)将式(PIV1)或(PIV2)的寡核苷酸或其盐脱保护以形成式(PIV1')或(PIV2')的寡核苷酸或其盐：
b)使式(PIV1')或(PIV2')的寡核苷酸或其盐与式(P1F6)或(P2F6)的寡核苷酸片段或其盐：
偶联，以形成式(PVI1)或(PVI2)的寡核苷酸或其盐：
c)将式(PVI1)或(PIV2)的寡核苷酸或其盐脱保护以形成(PVI1’)或(PVI2’)的寡核苷酸或其盐：
c)使式(PVI1’)或(PVI2’)的寡核苷酸或其盐与式(P1F5)或(P2F5)的寡核苷酸或其盐:
偶联，以形成式(PVII1)或(PVII2)的寡核苷酸或其盐：
其中y1为3至20的整数；且z1为3至20的整数。
具体地，式(PVI1)的寡核苷酸或其盐通过式(PIV1')的寡核苷酸或其盐与式(P1F6)的寡核苷酸片段或其盐的偶联反应形成，且式(PVII1)的寡核苷酸或其盐通过式(PVI1')的寡核苷酸或其盐与式(P1F5)的寡核苷酸片段或其盐的偶联反应形成。类似地，式(PVI2)的寡核苷酸或其盐通过式(PIV2’)的寡核苷酸或其盐与式(P2F6)的寡核苷酸片段或其盐的偶联反应形成，且式(PVII2)的寡核苷酸或其盐通过式(PVI2’)的寡核苷酸或其盐与式(P2F5)的寡核苷酸片段或其盐的偶联反应形成。
在某些实施方案中，式(PIV1')、(PIV2')、(PVI1)、(PVI2)、(PVI1')、(PVI2')、(PVII1)和(PVII2)的寡核苷酸中的任一个或其盐通过色谱法来纯化。
在某些实施方案中，第132至第135实施方案的任一个中所述的偶联反应如第122或第123实施方案中所述进行。在一个特定实施方案中，偶联反应在碱存在下进行。在另一特定实施方案中，偶联反应在碱和干燥剂存在下进行。在又一特定实施方案中，偶联反应在DBU和分子筛存在下进行。
在某些实施方案中，第132至第135实施方案的任一个中所述的脱保护反应如第124实施方案所述进行。
在某些实施方案中，本文公开的方法涉及以下寡核苷酸的制备：
1.ASO 1(BIIB 058)(SEQ ID NO:1)，18聚体硫代磷酸酯寡核苷酸，其中每个核寡核苷酸在2'位处包括甲氧基-乙基(MoE)。
2.ASO 2(BIIB 067)(SEQ ID NO:2)，5-10-5缺口聚体硫代磷酸酯和磷酸二酯混合骨架寡核苷酸。缺口聚体的中心块是10个脱氧核糖核苷酸，其侧接有2'-MoE核糖核苷酸块。
3.硫代磷酸酯寡核苷酸A、B、C、D和E，如下表2所示。
4.ASO 8(SEQ ID NO:8)，4-8-6缺口聚体硫代磷酸酯和磷酸二酯混合骨架寡核苷酸。缺口聚体的中心块是8个脱氧核糖核苷酸，其侧接有2’-MoE核糖核苷酸块。
5′-G Me U P＝O Me U P＝O Me U P＝O MeUMeCATMeCAATATCMe U P＝O G P＝O Me CAA-3′(SEQ ID NO:8)
5.ASO 9(SEQ ID NO:9)，5-8-5缺口聚体硫代磷酸酯和磷酸二酯混合骨架寡核苷酸。缺口聚体的中心块是8个脱氧核糖核苷酸，其侧接有2’-MoE核糖核苷酸块。
5’-Me C Me C P＝O GUUTTMeCTTAMeCMeCA Me C P＝O M eC Me CU-3’(SEQ ID NO:9)
5’Me C P＝O Me C P＝O G P＝O UU P＝OTP＝OTP＝O MeCP＝OTP＝OTP＝OAP＝O MeCP＝O Me CP＝O A P＝O Me C P＝O M eC P＝O Me C P＝ O U-3’(ASO 9-1)
5’-Me C P＝O Me C P＝O G P＝O UUTTMeCTP＝OTP＝OAP＝O MeCP＝O MeCP＝O A P＝O Me C P＝O Me C P＝O Me C P＝O U-3’(ASO9-2)
其中：下划线：MOE核糖核苷酸
P＝O：磷酸二酯
任何其他：硫代磷酸酯
表1.硫代磷酸酯寡核苷酸A、B、C、D和E
在某些实施方案中，靶反义寡核苷酸是硫代磷酸酯寡核苷酸，具有以下序列(从5’至3’)
TCACTTTCATAATGCTGG(SEQ ID NO:1)，
其中寡核苷酸的每个核苷间键是硫代磷酸酯键，寡核苷酸的每个核苷是2'-O-甲氧基乙基(MOE)核苷，且每个胞嘧啶是5-甲基胞嘧啶。SEQ ID NO:1也称为BIIB058，并且描述于WO2007/002390、WO2010/148249和US8,980,853中，各自的教导以引用的方式并入本文。
在某些实施方案中，反义寡核苷酸的序列是5-10-5MOE缺口聚体，具有以下序列(从5’至3')
CAGGATACATTTCTACAGCT(SEQ ID NO:2)，
其中核苷1-5和16-20中的每个是2'-O-甲氧基乙基核糖修饰的核苷，且核苷6-15中的每个是2'-脱氧核苷，其中核苷2至3、4至5、16至17和18至19之间的核苷间键是磷酸二酯键并且核苷1至2、3至4、5至6、6至7、7至8、8至9、9至10、10至11、11至12、12至13、13至14、14至15、15至16、17至18和19至20之间的核苷间键是硫代磷酸酯键，且其中每个胞嘧啶是5'-甲基胞嘧啶。SEQ ID NO:2由以下化学符号描述：mCes Aeo Ges Geo Aes Tds Ads mCdsAds Tds Tds Tds mCds Tds Ads mCeo Aes Geo mCes Te；其中，A＝腺嘌呤，
mC＝5'-甲基胞嘧啶
G＝鸟嘌呤，
T＝胸腺嘧啶，
e＝2'-O-甲氧基乙基核糖修饰的糖，
d＝2'-脱氧核糖，
s＝硫代磷酸酯核苷间键，且
o＝磷酸二酯核苷间键。
SEQ ID NO:2被称为BIIB067或ISIS 666853并且描述于WO2015153800中，其教导以引用的方式并入本文。
在某些实施方案中，所述方法如以上实施方案的任一个或其任何方面中所述，其中反义寡核苷酸是4-8-6缺口聚体，具有以下序列(从5’至3')：
GUUUUCATCAATATCUGCAA(SEQ ID NO:8)
其中核苷1-4和13-18中的每个是2'-O-甲氧基乙基核糖修饰的核苷，且核苷5-12中的每个是2'-脱氧核苷酸，其中核苷2至3、3至4、13至14、14至15和15至16之间的核苷间键是磷酸二酯键并且核苷1至2、4至5、5至6、6至7、7至8、8至9、9至10、10至11、11至12、12至13、16至17和17至18之间的核苷间键是硫代磷酸酯键，其中每个胞嘧啶是5-甲基胞嘧啶，且其中尿嘧啶是5-甲基尿嘧啶。SEQ ID NO:8由以下化学符号描述：
5′-G Me U P＝O Me U P＝O Me U P＝O MeUMeCATMeCAATATCMe U P＝O G P＝O Me CAA-3′
下划线＝MoE核糖核苷酸
G＝鸟嘌呤
MeC＝5-甲基胞嘧啶
T＝胸腺嘧啶
A＝腺嘌呤
MeU＝5-甲基尿嘧啶(也称为胸腺嘧啶)
P＝O＝磷酸二酯核苷间键
任何其他核苷间键都是硫代磷酸酯键。
在某些实施方案中，所述方法如以上实施方案的任一个或其任何方面中所述，其中反义寡核苷酸是5-8-5缺口聚体(ASO 9)，具有以下序列(从5’至3')：
CCGUUTTCTTACCACCCU(SEQ ID NO:9)
其中核苷1-5和14-18中的每个是2'-O-甲氧基乙基核糖修饰的核苷，且核苷6-13中的每个是2'-脱氧核苷酸，其中核苷3至4和16至17之间的核苷间键是磷酸二酯键并且核苷1至2、2至3、4至5、5至6、6至7、7至8、8至9、9至10、10至11、11至12、12至13、13至14、14至15、15至16和17至18之间的核苷间键是硫代磷酸酯键，其中每个胞嘧啶是5-甲基胞嘧啶，且其中尿嘧啶是5-甲基尿嘧啶。
SEQ ID NO:9由以下化学符号描述：
5’-Me C Me C P＝O G M U M UTTMeCTTAMeCMeCA Me C P＝O M eC Me C M U-3’(SEQ ID NO:9)
下划线＝MoE核糖核苷酸
G＝鸟嘌呤
MeC＝5-甲基胞嘧啶
T＝胸腺嘧啶
A＝腺嘌呤
MeU＝5-甲基尿嘧啶(也称为胸腺嘧啶)
P＝O＝磷酸二酯核苷间键
在某些实施方案中，ASO 9使用本公开的寡核苷酸合成的汇聚液相方法制备如下：
在某些实施方案中，ASO 9使用本公开的寡核苷酸合成的汇聚液相方法来制备。在某些实施方案中，所述方法涉及在片段DMTrO-TsTsAsCsCs-OH的3'-羟基处添加亚磷酰胺，得到片段DMTrO-TsTsAs CsCs-OP。片段DMTrO-TsTsAsCsCs-OP与HO-AsCoCsCsU-LHPG偶联，然后硫化，得到DMTrO-TsTsAsCsCsAsCoCsCsU-LHPG。此DMT保护的片段经过5'-羟基脱保护(脱三苯甲基化)，得到HO-TsTsAsCsCsAsCo CsCsU-LHPG，其进一步与亚磷酰胺片段DMTrO-UsTsTsC-OP偶联(合成方法类似于上面讨论的DMTrO-TsTsAsCsCs-OP合成)，然后硫化得到DMTrO-UsTsTsCsTsTsAsCsCsAsCoCsCsU-LHPG。此DMT保护的片段经过5'-羟基脱保护(脱三苯甲基化)，得到HO-UsTsTsCsTsTsAsCsCsA sCoCsCsU-LHPG，其与DMTrO-CsCoGsU-OP偶联((合成方法类似于上面讨论的DMTrO-TsTsAsCsCs-OP合成))，然后硫化得到DMTrO-CsCoGsUsUsTsTsCsTsTsAsCsCsAsCoCsCsU-LHPG(完全受保护的ASO 9)。在某些实施方案中，片段HO-AsCoCsCsU-LHPG可通过以下操作来制备：使HO-U-LHPG与DMTrOAsCoCsCP偶联，接着硫化和5’-羟基脱保护(脱三苯甲基化)。片段DMTrOAsCoCsCP可通过在片段DMTr OAsCoCsC-OH的3'羟基处添加亚磷酰胺来制备。如本文所用，O是磷酸二酯键，且s是硫代磷酸酯键。
实施例
缩写
ACN＝乙腈
DBU＝8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯
DCA＝CHCl2COOH或二氯乙酸
DCM＝二氯甲烷
DDTT＝3-(N,N-二甲氨基-亚甲基)氨基)-3H-1,2,4-二噻唑
DCI＝4,5-二氰基咪唑DI＝
DIEA＝N,N-二异丙基乙胺
DMT或DMTr＝4,4'-二甲氧基三苯甲基或双-(4-甲氧基苯基)苯基甲基
DMSO＝二甲亚砜
EtOAc或EA＝乙酸乙酯
ETT＝5-乙硫基-1H-四唑
h或hr＝小时
HBTU＝3-[双(二甲氨基)甲基鎓基]-3H-苯并三唑-1-氧化物六氟磷酸盐
HOBt＝羟基苯并三唑
imid＝咪唑
iPrOH＝异丙醇
MOE＝甲氧基乙基
MS＝分子筛
MTBE或TBME＝甲基叔丁基醚
Py＝吡啶
RT＝保留时间
TBAF＝四正丁基氟化铵
TBuAA＝醋酸三丁胺
TBDPSCl＝叔丁基(氯)二苯基硅烷
TCA＝三氯乙酸
TEA＝三乙胺
TEAB＝溴化四乙铵
TFA＝三氟乙酸
THF＝四氢呋喃
实施例1.ASO 9的合成
A.3'-片段的制备：
1.5'-OH-ACCCU-LHPG片段(片段1)的合成
制备化合物1-2的一般程序
在0℃下向化合物1-1(176g,103mmol,1.00eq)在DCM(1800mL)中的溶液中添加DCA(66.8g,518mmol,42.6mL,5.00eq)和CySH(24.1g,207mmol,25.3mL,2.00eq)。在0℃下搅拌混合物1h。TLC(二氯甲烷:乙酸乙酯:甲醇＝10:10:1，产物Rf＝0.43)指示化合物1-1被完全消耗并形成一个新斑点。根据TLC，反应是干净的。通过添加NaHCO3(2.50％,2000mL)淬灭反应混合物并收集二氯甲烷(DCM)层。在25℃下缓慢添加无水乙腈(ACN)(5000mL,30.0V)以沉淀产物。得到白色固体状的化合物1-2(144g,103mmol,99.5％产率)。
制备化合物1-3的一般程序
将化合物1-2(125g,89.6mmol,1.00eq)和5'-DMT-MOE C-3'-P亚酰胺(124g,134mmol,1.50eq)与ACN(300mL)和DCM(700mL)共蒸发。向化合物1-2(125g,89.6mmol,1.00eq)和5'-DMT-MOE C-3'-P亚酰胺(124g,134mmol,1.50eq)在DCM/ACN＝3:1(1800mL)中的溶液中添加分子筛3A(54.0g)。在25℃下搅拌混合物1h。向混合物中添加DCI(21.1g,179mmol,2.00eq)。在25℃下搅拌混合物1h。TLC(二氯甲烷:乙酸乙酯:甲醇＝10:10:1，产物Rf＝0.55)指示化合物1-2被完全消耗并形成一个新斑点。根据TLC，反应是干净的。
向混合物中添加DDTT(36.7g,178mmol,2.00eq)和丙-2-醇(3.22g,53.6mmol,4.11mL,0.600eq)。在25℃下搅拌混合物0.5h。TLC(二氯甲烷:乙酸乙酯:甲醇＝10:10:1，产物Rf＝0.55)指示形成一个新斑点。根据TLC，反应是干净的。
在0℃下向混合物中添加CySH(20.6g,178mmol,21.7mL,2.00eq)和TFA(101g,890mmol,65.9mL,10.0eq)。在0℃下搅拌混合物2h。TLC(二氯甲烷:乙酸乙酯:甲醇＝10:10:1，产物Rf＝0.51)指示形成一个新斑点。根据TLC，反应是干净的。
将吡啶(Py)(84.4g,1.07mol,86.2mL,12.0eq)添加到混合物中。通过过滤去除分子筛，并将固体滤饼用DCM(500mL)洗涤。用2.5％NaHCO3水溶液(1000mL)将反应混合物的pH值调节至6～7。将合并的有机层用Mg2SO4干燥，过滤并浓缩。将粗制品重新溶解于DCM(450mL)中并在剧烈搅拌下滴入ACN(4000ml,30.0V)中。沉淀出所需产物。得到白色固体状的化合物1-3(173g,88.9mmol,99.9％产率)。
制备化合物1-4的一般程序
将化合物1-3(123g,63.2mmol,1eq)和5'-DMT-MOE C-3'-P亚酰胺(87.4g,94.8mmol,1.50eq)与ACN(500mL)和DCM(1500mL)共蒸发。向化合物1-3(123g,63.2mmol,1.00eq)和5'-DMT-MOE C-3'-P亚酰胺(87.4g,94.8mmol,1.50eq)于DCM/ACN＝3:1(1600mL)中的溶液中添加分子筛3A(48.0g)。在25℃下搅拌混合物1h。向混合物中添加DCI。(14.9g,126mmol,2.00eq)。在25℃下搅拌混合物1h。TLC(二氯甲烷:乙酸乙酯:甲醇＝10:10:1，产物Rf＝0.64)指示化合物1-3被完全消耗并形成一个新斑点。根据TLC，反应是干净的。
向混合物中添加DDTT(25.9g,126mmol,2.00eq)。在25℃下搅拌混合物0.5h。在25℃下向混合物中添加丙-2-醇(2.28g,37.95mmol,2.91mL,0.6eq)。TLC(二氯甲烷:乙酸乙酯:甲醇＝10:10:1，产物Rf＝0.68)指示形成一个新斑点。根据TLC，反应是干净的。
在0℃下向混合物中添加三氟乙酸(TFA)(86.5g,758mmol,56.1mL,12.0eq)和CySH(14.7g,126mmol,15.4mL,2.00eq)。在0℃下搅拌混合物1h。TLC(二氯甲烷:乙酸乙酯:甲醇＝10:10:1，产物Rf＝0.56)指示形成一个新斑点。根据TLC，反应是干净的。
将Py(70.03g,885.31mmol,71.46mL,14eq)添加到混合物中。通过过滤去除分子筛，并将固体滤饼用DCM(1000mL)洗涤。用2.5％NaHCO3水溶液(2000mL)将反应混合物的pH值调节至6～7。将合并的有机层经Mg2SO4干燥。将粗制品重新溶解于DCM(600mL)中并在剧烈搅拌下滴入ACN(5000ml,30V)中。沉淀出所需产物。得到白色固体状的化合物1-4(143g，57.31mmol，90.63％产率)。
制备化合物1-5的一般程序
将化合物1-4(290g,116mmol,1.00eq)和5'-DMT-MOE C-3'-P亚酰胺(160g,174mmol,1.50eq)与ACN(500mL)和DCM(1500mL)共蒸发。向化合物1-4(290g,116.23mmol,1eq)和5'-DMT-MOE C-3'-P亚酰胺(160g,174mmol,1.50eq)于DCM/ACN＝3:1(2300mL)中的溶液中添加分子筛(69.0g)。在25℃下搅拌混合物1h。向混合物中添加DCI(34.3g,290mmol,2.50eq)。在25℃下搅拌混合物1h。TLC(二氯甲烷:乙酸乙酯:甲醇＝10:10:1，产物Rf＝0.70)指示化合物1-4被完全消耗并形成一个新斑点。根据TLC，反应是干净的。
向混合物中添加t-BuOOH(H2O,31.8mL,70.0％纯度,2.00eq)并将所得混合物在25℃下搅拌1h。TLC(二氯甲烷:乙酸乙酯:甲醇＝10:10:1，产物Rf＝0.72)指示形成一个新斑点。根据TLC，反应是干净的。通过过滤去除分子筛，并将固体滤饼用DCM(1000mL)洗涤。在剧烈搅拌下将粗制品滴入ACN(9000ml,30.0V)中。沉淀出所需产物。得到白色固体状的化合物1-5(386g,116mmol,99.8％产率)。
制备化合物1-6的一般程序
在0℃下向化合物1-5(386g,115mmol,1.00eq)于DCM(5700mL)中的溶液中添加CySH(40.3g,347mmol,42.5mL,3.00eq)和二氯乙酸(DCA)(298g,2.32mol,190mL,20.0eq)。在0℃下搅拌混合物1h。TLC(二氯甲烷:乙酸乙酯:甲醇＝10:10:1，产物Rf＝0.46)指示化合物1-5被完全消耗并形成一个新斑点。根据TLC，反应是干净的。将Py(201g,2.55mol,205mL,22.0eq)添加到混合物中。通过过滤去除分子筛，并将固体滤饼用DCM(800mL)洗涤。用2.5％NaHCO3水溶液(4000mL)将反应混合物的pH值调节至6～7。将合并的有机层经Mg2SO4干燥。将粗制品重新溶解于DCM(500mL)中并在剧烈搅拌下滴入ACN(12000ml,30V)中。沉淀出所需产物。得到白色固体状的化合物1-6(310g,102mmol,88.3％产率)。
制备化合物1-7(5'-OH-ACCCU-LHPG)的一般程序
将化合物1-6(154g,50.8mmol,1.00eq)和5'-DMT-MOE A-3'-P亚酰胺(71.0g,76.2mmol,1.50eq)与ACN(500mL)和DCM(1500mL)共蒸发。
向化合物1-6(154g,50.8mmol,1.00eq)和5'-DMT-MOE A-3'-P亚酰胺(71.0g,76.2mmol,1.50eq)于DCM/ACN＝3:1(1200mL)中的溶液中添加分子筛3A(36.0g)。在25℃下搅拌混合物1h。向混合物中添加DCI(15.0g,127mmol,2.50eq)。在25℃下搅拌混合物1h。TLC(二氯甲烷:乙酸乙酯:甲醇＝10:10:1，产物Rf＝0.57)指示化合物1-6被完全消耗并形成一个新斑点。根据TLC，反应是干净的。向混合物中添加DDTT(17.7g,86.3mmol,1.70eq)和丙-2-醇(iPrOH)(1.83g,30.4mmol,2.33mL,0.600eq)。在25℃下搅拌混合物0.5h。TLC(二氯甲烷:乙酸乙酯:甲醇＝10:10:1，产物Rf＝0.59)指示形成一个新斑点。根据TLC，反应是干净的。
在0℃下向混合物中添加TFA(75.2g,659mmol,48.8mL,13.0eq)和CySH(11.7g,101mmol,12.4mL,2.00eq)。在0℃下搅拌混合物1h。TLC(二氯甲烷:乙酸乙酯:甲醇＝10:10:1，产物Rf＝0.47)指示形成一个新斑点。根据TLC，反应是干净的。
将Py(58.5g,739mmol,59.7mL,15.0eq)添加到混合物中。通过过滤去除分子筛，并将固体滤饼用DCM(300mL)洗涤。用2.5％NaHCO3水溶液(2000mL)将反应混合物的pH值调节至6～7。将合并的有机层经Mg2SO4干燥。将粗制品重新溶解于DCM(400mL)中并在剧烈搅拌下滴入ACN(4500ml,30.0V)中。沉淀出所需产物。获得白色固体状的化合物1-7(5'-OH-ACCCU-LHPG)(169g,47.0mmol,92.7％产率)。对于化合物1-7的HPLC和LC-MS分析，使用氨解(NH3/H2O)程序将其脱保护，该程序类似于以下公开的用于化合物1的氨解程序，以获得1-7-a(5'-OH-ACCCU-OH)。化合物1-7-a的HPLC和LC-MS示于图1中。
化合物1-7-a的HPLC-MS方法描述如下：
●柱-ACQUITY UPLC BEH Shield RP18柱，1.7μm,2.1mm X 150mm；
●柱温：65℃
●质谱扫描范围：300-2000m/z；
●MS极性：负
●溶液A：5mM醋酸三丁胺(TBuAA)，于10％ CH3CN，1μmEDTA中；溶液B：5mM TBuAA，于80％ CH3CN，1μm EDTA中
●梯度：
时间A B流率压力
min％％mL/min巴
-------------------------------------
0.00 84.00 16.00 0.45---
0.50 84.00 16.00 0.45---
1.50 84.00 16.00 0.45---
30.0 68.00 32.00 0.45---
35.0 15.00 85.00 0.45
36.0 15.00 85.00 0.45
37.0 84.00 16.00 0.45
41.0 84.00 16.00 0.45
2.5'-OH-ACCCU-LHPG片段(片段1)的替代合成
5'-DMT-ACCC-3'OH的制备
5'-DMT-ACCC-3'-OH(1-8)是基于上述方案，使用与针对以上化合物1-3所述的类似程序来制备。
制备5'-DMT-ACCC-3'-P亚酰胺(1-8a)的一般程序
在N2保护下将5’-DMT-ACCC-3’-OH(280.0g,1.0eq.)装入反应器(R1)中。在N2保护下将DCM(1000mL 3.57V)装入烧瓶中。在25-30℃下，在真空下将化合物与DCM共蒸发。与DCM的共蒸发重复3次，直至残留水含量低于0.01％。在N2保护下将THF(1400mL 5V)装入R1中。收集样品用于分析。R1的温度在-5℃至5℃之间调整。在N2保护下将P-试剂(106.7g,2.992eq.)装入R1中。将(吡啶；2,2,2-三氟乙酸45.7g,2.001eq.)在N2保护下添加到R1中，并将反应混合物在-5℃至5℃下搅拌1小时。
在N2保护下将甲基叔丁基醚(MTBE)(10080mL 36V)装入另一烧瓶(R2)中。将Py(70mL 0.25V)在N2保护下装入R2中。将庚烷(3920mL 14V)在N2保护下装入R1中。在-5℃至5℃下将R2用N2吹扫30分钟。在N2保护下，将来自R1的溶液缓慢装入R2的溶液中。将R2在-5℃至5℃下搅拌1小时。过滤反应混合物。将滤饼用MTBE:庚烷(5:2，700mL)溶液洗涤两次。收集滤液样品用于分析。将滤饼在25℃至30℃下干燥24小时，获得5'-DMT-ACCC-3'-P亚酰胺1-8a(292.3g，产率：96.25％，纯度：98％)。
制备5’-DMT-ACCCU-3’-LHPG(1-9)的一般程序
将5'-HO-U-3'-LHPG(120.0g)装入反应器中，然后添加分子筛(300.0g)、5'-DMT-ACCC-P-亚酰胺(280.68g,1.27eq.)和DCM(3000mL,25V)。将反应混合物在20℃～30℃下搅拌1小时。将DCI(20.33g,2.00eq.)装入反应混合物中并将混合物在20℃～30℃下搅拌30分钟。收集样品用于分析。将DDTT(35.35g,2.0eq.)装入反应混合物中。收集样品用于分析。将反应混合物过滤，浓缩并用DCM(720mL,6V)溶解。将DCM溶液逐滴添加到ACN(9000mL,75V)溶液中，然后通过旋转蒸馏去除大部分DCM。过滤混合物，并将滤饼用ACN(600mL,10V)洗涤两次。将湿滤饼在20℃～30℃下干燥16小时，得到5'-DMT-ACCCU-3'-LHPG(287.15g，85.7％产率)。
制备5’-OH-ACCCU-3’-LHPG(1-7)的一般程序
将5’-DMT-ACCCC-3’-LHPG(285.54g)、分子筛(3A)(142.77g)和DCM(2855mL,10V)装入反应器中。将反应混合物在20℃～30℃下搅拌1小时，并将反应温度调节至-5℃～5℃。将十二烷-1-硫醇(51.97g,3.5eq.)装入反应器中，然后添加TFA(58.55g,7.0eq.)，并将反应混合物在-5℃～5℃下搅拌1小时。将1-甲基咪唑(NMI)(54.21g,9.0eq.)装入反应器中，并将反应混合物在20℃～30℃下搅拌5分钟。过滤反应混合物并浓缩溶液以去除DCM。将粗产物溶解于DCM(427.5mL,1.5V)中，并将此溶液逐滴添加到ACN(8566mL,30V)的溶液中。所得混合物通过旋转蒸馏去除大部分DCM而浓缩，并过滤。将滤饼用ACN(571mL,4V)洗涤两次，并在20℃～30℃下干燥，得到化合物1-7(239.92g；91.1％产率)。
B.制备5'-片段的一般程序：
1.脱氧-TTACC 5聚体片段(片段2)的合成
制备化合物2-2的一般程序
在25℃下向化合物2-1(300g,463mmol,1.00eq)于DCM(2300mL)中的溶液中添加咪唑(94.6g,1.39mol,3.00eq)。混合物为淡黄色均质溶液。在25℃下添加TBDPSCl(叔丁基(氯)二苯基硅烷)(166g,602mmol,155mL,1.30eq)。在25℃下搅拌混合物12小时。注意：在添加TBDPSCl期间温度升高了5℃。HPLC显示反应物被完全消耗。添加丙-2-醇(27.8g,463mmol,35.5mL,1.00eq)并将混合物在25℃下搅拌0.5小时。
在0℃下向上述溶液中添加环己硫醇(70.0g,602mmol,73.7mL,1.30eq)。将混合物在0℃下搅拌15分钟。在0℃下经45分钟逐滴添加TFA(264.06g,2.32mol,171.47mL,5eq)。将混合物在0℃下搅拌1小时。溶液颜色由淡黄色变为深红色，添加TFA期间观察到白色固体。HPLC显示反应完成。
将反应混合物倒入Na2CO3溶液(245g Na2CO3，在1.5L水中)中，用甲基叔丁基醚(TBME或MTBE)(1.5L)稀释并分离两层。将有机层用盐水(750mL x 2)洗涤，用无水MgSO4(232g)干燥，通过硅藻土过滤并浓缩。注意在添加Na2CO3水溶液期间观察到一些白色固体，并且在浓缩过程中的产物直到蒸发至干燥才沉淀出来，得到呈黄色泡沫固体状的粗产物。
将粗产物溶解于DCM(300mL)中并装入1000mL分液漏斗中。从漏斗向庚烷/TBME(v/v 9:1,3.0L)的溶剂混合物中缓慢滴加粗产物溶液以进行沉淀过程。此过程大约需要30分钟。用布氏漏斗收集白色固体状的纯产物，用庚烷(100mL x 2)的溶剂混合物洗涤产物滤饼并浓缩至干燥。得到白色固体状的化合物2-2(235g,395mmol,85.2％产率,98.0％纯度)。
制备化合物2-4的一般程序
将化合物2-2(10.0g,17.1mmol,1.00eq)和化合物单体2-3(17.4g,20.6mmol,1.20eq)与CH3CN(20mL x 2)在Ar2下在250mL单颈圆瓶中共蒸发。
在25℃下将化合物2-2(10.0g,17.1mmol,1.00eq)和化合物单体2-3(17.4g,20.6mmol,1.20eq)溶于ACN(80mL)和DCM(80mL)(CH3CN/DCM＝1/1)中。添加ETT(3.34g,25.7mmol,1.50eq)并将混合物溶液在Ar2下在25℃下搅拌30分钟。需要注意的是，反应中使用的乙腈纯度为99.9％，并用分子筛进一步干燥，使水含量≤50ppm。所用的DCM也是无水DCM。混合物由淡黄色均质溶液变为淡黄色混浊的。HPLC显示化合物2-2被完全消耗。
在25℃下向上述溶液中添加氢化黄原素(2.83g,18.8mmol,1.10eq)。在25℃下搅拌混合物0.5小时。注意：混合物由淡黄色均质溶液变为黄色混浊的。HPLC显示反应完成。
将上述溶液在冰水浴中冷却至0℃并保持30分钟。在0℃下将TFA(13.7g,120mmol,8.88mL,7.00eq)添加到反应混合物中。在0℃下搅拌混合物2.5小时。混合物的颜色从黄色混浊变为红色。HPLC显示反应完成。
将Na2CO3溶液(12.7g Na2CO3，于83mL水中)缓慢添加到反应混合物中(观察CO2释放的速度以避免反应溶液的碰撞)。自然化过程在约12小时内完成，然后通过旋转蒸发器去除反应混合物的所有溶剂，得到粗产物的乳白色水悬浮液。
将粗产物溶解于EtOAc/TBME(v/v 1:3,800mL)的混合物溶剂中并分离两层。将有机层用水(400mL)、盐水(2x 400mL)洗涤，并由无水MgSO4(～42.0g)干燥，经由硅藻土过滤并浓缩。
将粗产物溶解于DCM(55mL)中并装入100mL分液漏斗中。从漏斗向庚烷/TBME(v/v9:1,1600mL)的溶剂混合物中缓慢添加粗产物溶液以进行沉淀过程。此过程大约需要60分钟。淬灭步骤的时间延长1小时。
用布氏漏斗收集到呈白色固体状的纯产物。将产物滤饼用庚烷(50mL x 2)的溶剂混合物洗涤并浓缩至干燥。获得淡黄色固体状的化合物二聚体2-4(25.5g,16.6mmol,96.6％产率,68.2％纯度)。
制备化合物2-6的一般程序
将化合物二聚体2-4(10.0g,9.43mmol,1.00eq)和化合物单体2-5(8.90g,10.4mmol,1.10eq)与ACN(100mL x 3)在500mL单颈圆瓶中共蒸发，然后在25℃下溶解于ACN(30mL)和DCM(30mL)(CH3CN/DCM＝1/1)中。在25℃下添加5-乙基硫烷基-2H-四唑(1.84g,14.2mmol,1.5eq)并将混合物在25℃下搅拌30分钟。HPLC指示反应物二聚体2-4被完全消耗。
在25℃下向上述溶液中添加5-氨基-1,2,4-二噻唑-3-硫酮(1.56g,10.4mmol,1.10eq)。将混合物在25℃下搅拌0.5小时。混合物由淡黄色均质溶液变为黄色混浊的。HPLC显示反应完成。
将上述溶液冷却至0℃。在0℃下逐滴添加TFA(6.45g,56.6mmol,4.20mL,6.00eq)。在0-25℃下搅拌混合物3小时。混合物的颜色从黄色混浊变为橙黄色悬浮液。HPLC显示反应完成。
将Na2CO3溶液(6.00g,Na2CO3，于46.6mL水中)缓慢添加到反应混合物中(观察CO2释放的速度以避免反应溶液的碰撞)。自然化过程在约1小时内完成，然后通过旋转蒸发器去除反应混合物的所有溶剂，得到粗产物的乳白色水悬浮液。
将粗产物溶解于EtOAc/TBME(v/v 3:1,622mL)的混合物溶剂中并分离两层。将有机层用水(155mL)、盐水(2x 155mL)洗涤，并由无水MgSO4(～15.5g)干燥，过滤并在真空下浓缩。注意在此过程中，没有沉淀出黄色凝胶固体。将粗产物溶解于DCM(70mL)中并装入100mL分液漏斗中。
向TBME(1.24L)的溶剂中缓慢添加来自漏斗的粗产物溶液用于沉淀过程。此过程大约需要1.5小时。用布氏漏斗收集到呈白色固体状的纯产物，用庚烷(50mL x 2)的溶剂混合物洗涤产物滤饼并浓缩至干燥。得到淡黄色固体状的化合物三聚体2-6(11.4g，6.63mmol，70.3％产率，90.0％纯度)。
制备化合物2-8的一般程序
向化合物三聚体2-6(4.20g,2.72mmol,1.00eq)于CH3CN(10mL)中的溶液中添加单体2-7(3.03g,4.07mmol,1.50eq)并将该溶液与CH3CN(10mL x 2)在Ar2下在100mL单颈圆瓶中共蒸发。
在25℃下将化合物三聚体2-6(4.20g,2.72mmol,1.00eq)和单体2-7(3.03g,4.07mmol,1.50eq)溶于CH3CN(12mL)和DCM(12mL)(CH3CN/DCM＝1/1)中。添加分子筛(4.00g,1.00eq)并将混合物溶液在Ar2下于25℃下搅拌1小时。在25℃下添加5-乙基硫烷基-2H-四唑(530mg,4.07mmol,1.50eq)。将混合物在25℃下搅拌0.5小时。混合物由淡黄色均质溶液变为淡黄色混浊的。过滤反应混合物以去除分子筛。
需要注意的是，乙腈和DCM都是新鲜再蒸馏的。HPLC显示三聚体被完全消耗。
在25℃下向以上溶液中添加5-氨基-1,2,4-二噻唑-3-硫酮(449mg,2.99mmol,1.10eq)。将混合物在25℃下搅拌0.5小时。混合物由淡黄色均质溶液变为黄色混浊的。HPLC显示反应完成。
在0℃下向上述混合物中逐滴添加TFA(2.48g,21.7mmol,1.61mL,8.00eq)。在0℃下搅拌混合物4.5小时。混合物由黄色混浊变为橙黄色悬浮液。HPLC显示反应完成。
将Na2CO3溶液(2.88g Na2CO3，于20mL水中)缓慢添加到反应混合物中(观察CO2释放的速度以避免反应溶液的碰撞)。自然化过程在约1小时内完成，然后通过旋转蒸发器去除反应混合物的所有溶剂，得到粗产物的乳白色水悬浮液。
将粗产物溶解于EtOAc/TBME(v/v 3:1,260mL)的混合物溶剂中并分离两层。将有机层用水(64mL)、盐水(2x 64mL)洗涤，并由无水MgSO4(～6.44g)干燥，经由硅藻土过滤并浓缩。
将粗产物溶解于DCM(28mL)中并装入100mL分液漏斗中。从漏斗向溶剂TBME(518mL)中缓慢滴加粗产物溶液以进行沉淀过程。此过程大约需要30分钟。
用布氏漏斗收集到呈白色固体状的纯产物。将产物滤饼用庚烷(20mL x 2)的溶剂混合物洗涤并浓缩至干燥。获得淡黄色固体状的化合物四聚体2-8(4.37g,2.07mmol,76.2％产率,91.0％纯度)。
制备化合物2-9(脱氧-TTACC 5聚体)的一般程序
将四聚体2-8(120g,62.5mmol,1.00eq)与ACN(500mL x 2)共蒸发，然后添加单体2-7(51.2g,68.8mmol,1.10eq)并将溶液在Ar2下与ACN(500mL x 2)在3L单颈圆瓶中共蒸发。
在25℃下向四聚体2-8(120g,62.5mmol,1.00eq)和单体2-7(51.2g,68.8mmol,1.10eq)在ACN(485mL)中的混合物溶液中添加分子筛3A(36g)。在25℃下搅拌混合物1h。在25℃下添加Py·TFA(1M,93.8mL,1.50eq)。将所得混合物在25℃下搅拌30分钟。需要注意的是，乙腈是新鲜再蒸馏的。HPLC指示四聚体2-8被完全消耗。
在25℃下向上述混合物中添加DDTT(14.1g,68.8mmol,1.10eq)。在25℃下搅拌混合物0.5小时。硫化完成后，将上述混合物用再蒸馏的MeCN(480mL)稀释，然后冷却至0℃。在0℃下添加Py(49.4g,625mmol,50.5mL,10.0eq)。
同时，在1L三颈圆底烧瓶中装入咪唑(85.1g,1.25mol,20.0eq)和无水THF(240mL)并置于冰浴中30分钟。缓慢添加HF(17.9g,625mmol,16.3mL,70％纯度，10.0eq)，然后再搅拌15分钟(由这个步骤获得均质溶液)。在0℃下通过注射泵(2mL/min滴速)将溶液添加到上述悬浮液中。在0℃下搅拌混合物3h。HPLC显示反应完成。
将反应混合物溶解于EtOAc(2.8L)中。将有机层用饱和NaHCO3(1.4L x 2)、水(1.4L x 3)、盐水(1.4L)洗涤并由无水MgSO4(～208g)干燥，过滤并在真空下浓缩。在此过程中，没有沉淀出黄色凝胶固体。
将粗产物溶解于DCM(840mL)中并将ACN(240mL)装于1L分液漏斗中。从漏斗向TBME(8.5L)的溶剂中缓慢添加粗产物的溶液以进行沉淀过程。此过程大约需要3小时。用布氏漏斗收集到呈白色固体状的纯产物，用TBME(1L x 2)的溶剂混合物洗涤产物滤饼并浓缩至干燥。得到白色固体状的脱氧-TTACC 5聚体(145.5g,57.8mmol,92.4％产率,93.6％纯度)。脱氧-TTACC 5聚体(2-9)的HPLC-MS(RT＝7.174min)示于图2中。
化合物2-9的HPLC-MS方法：
●柱：ACQUITY UPLC BEH Shield RP18柱,1.7μm,2.1mm X 150mm；
●柱温：60℃
●MS分析是在Thermo Orbitrap Fusion上完成的，分辨率为60k，且质量范围为700至2000；
●MS极性：正
●流动相A：20mM醋酸铵，于ACN:水＝25:75中；流动相B：乙腈；
●梯度：
时间A B流率压力
min％％mL/min巴
-------------------------------------
0.00 64.00 36.00 0.50---
1.00 64.00 36.00 0.50---
29.0 54.00 46.00 0.50---
30.0 20.00 80.00 0.50---
31.0 20.00 80.00 0.50
32.0 64.00 36.00 0.50
35.0 64.00 36.00 0.50
36.0 64.00 36.00 0.50
2.UTTC 4聚体(片段3)的合成
制备化合物3-2的一般程序
向化合物3-1(500g,772mmol,1.00eq)在DCM(3800mL)中的溶液中添加咪唑(158g,2.32mol,3.00eq)。添加TBDPSCl(276g,1.00mol,258mL,1.30eq)。在25℃下搅拌混合物16h。TLC(石油醚/乙酸乙酯＝5/1，产物：Rf＝0.40)指示化合物3-1被完全消耗。添加丙-2-醇(46.4g,59.1mL,1.00eq)并将混合物搅拌30分钟。
在0℃下向上述溶液中添加CySH(117g,1.00mol,123mL,1.30eq)。将混合物在0℃下搅拌15分钟。在0℃下经30分钟逐滴添加TFA(440g，3.86mol，286mL，5.00eq)。将混合物在0℃下搅拌1小时。HPLC显示反应完成。注意在添加TFA过程中观察到溶液颜色从淡黄色变为深红色
将反应混合物倒入Na2CO3溶液(410g Na2CO3，于2.5L水中)中，用TBME(2.5L)稀释并分离两层。将有机层用盐水(1.3L x 2)洗涤，由无水MgSO4(321g)干燥，经由硅藻土过滤并浓缩。
将粗产物溶解于DCM(600mL)中并装入1000mL分液漏斗中。从漏斗向庚烷/TBME(v/v 9:1,5.0L)的溶剂混合物中缓慢添加粗产物溶液以进行沉淀过程。此过程大约需要30分钟。用布氏漏斗收集到呈白色固体状的纯产物，用庚烷(500mL x 2)的溶剂混合物洗涤产物滤饼并浓缩至干燥。得到白色固体状的化合物3-2(390g,660mmol,85.5％产率,98.8％纯度)。
制备化合物3-3的一般程序
将化合物3-2(110g,188mmol,1.00eq)和dT亚酰胺(168g,226mmol,1.20eq)与CH3CN(1.0L x 3)共蒸发。将混合物在25℃下溶解于CH3CN(500mL)和DCM(500mL)中。在搅拌下添加5-(乙硫基)-1H-四唑(ETT)(1.67g,12.8mmol,1.50eq)并将混合物溶液在Ar2气氛下在25℃下搅拌30分钟。注意，乙腈和DCM都是新鲜再蒸馏的。HPLC指示化合物3-2被完全消耗。注意，dT亚酰胺是DMT-2'-脱氧胸苷-亚磷酰胺：
在25℃下向上述溶液中添加氢化黄原素(31.1g,207mmol,1.10eq)。在25℃下搅拌混合物0.5h。HPLC指示反应完成。
将上述溶液在冰水中冷却至0℃。在0℃下将CySH(24.1g,207mmol,25.4mL,1.10eq)添加到反应混合物中。在0℃下将TFA(215g,1.88mol,140mL,10.0eq)添加到反应混合物中。在25℃下搅拌混合物2h。HPLC指示反应完成。混合物的颜色从黄色混浊变为红色。
将Na2CO3溶液(254g,Na2CO3，于3.4L水中)缓慢添加到反应混合物中(观察CO2释放的速度以避免反应溶液的碰撞)。自然化过程在约1小时内完成，然后通过旋转蒸发器去除反应混合物的所有溶剂，得到粗产物的乳白色水悬浮液。
两个反应在这里合并，并且将所得粗产物的水溶液用7.5L MeCN稀释(添加MeCN可以溶解粗产物滤饼)并用TBME/庚烷(3x 3.4L,v/v,1:4)萃取3次以去除非极性杂质(诸如CySH和DMTrSCy等)。将水层级分收集在3.0L圆底烧瓶中，并通过旋转蒸发器施加减压以去除所有MeCN，再次得到粗产物的黄色凝胶滤饼的水溶液。
将粗产物的水溶液用EtOAc/TBME的混合物溶剂(v/v＝1:3,5.1L)稀释(确保溶液中没有凝胶固体)并分离两层。将有机层用DI水(3x2.5L)、盐水(2.5L)洗涤3次，并由无水MgSO4(～500g)干燥，浓缩至干燥，得到黄色泡沫状的粗产物，其无需进一步处理即可直接用于下一步。得到淡黄色固体状的化合物3-3(420g,330mmol,88.5％产率,76.0％纯度)。
制备化合物3-4的一般程序
将化合物3-3(200g,208mmol,1.00eq)和dT亚酰胺(186g,250mmol,1.20eq)与ACN(1.0L x 3)在Ar2下在3L单颈圆瓶中共蒸发。在25℃下，向以上在ACN(525mL)和DCM(525mL)中的溶液中添加分子筛3A(52.0g)。在25℃下搅拌混合物1h。在25℃下添加ETT(40.8g,313mmol,1.50eq)。将所得混合物在25℃下搅拌30分钟。注意，乙腈和DCM都是新鲜再蒸馏的。HPLC指示化合物3-3被完全消耗。
在25℃下向上述溶液中添加氢化黄原素(34.5g,229mmol,1.10eq)。在25℃下搅拌混合物0.5h。HPLC指示反应完成。
将上述溶液在冰水中冷却至0℃。将CySH(26.7g,229mmol,28.1mL,1.10eq)在0℃下添加到反应混合物中并保持10分钟。在0℃下将TFA(238g,2.09mol,154mL,10.0eq)添加到反应混合物中。在25℃下搅拌混合物2h。HPLC指示反应完成。注意混合物的颜色从黄色混浊变为红色。
将Na2CO3溶液(156g,Na2CO3，于2100mL水中)缓慢添加到反应混合物中(观察CO2释放的速度以避免反应溶液的碰撞)。自然化过程在约1小时内完成，然后通过旋转蒸发器去除反应混合物的所有溶剂，得到粗产物的乳白色水悬浮液。
将粗产物溶解于EtOAc/TBME(v/v 1:2,6400mL)的混合物溶剂中并分离两层。将有机层用水(3x 3200mL)、盐水(3200mL)洗涤，并由无水MgSO4(～520g)干燥，过滤并在真空下浓缩。
两个反应在这里合并，并将粗产物溶解于DCM(1.0L x 2)中并装入1000mL分液漏斗中。从漏斗向TBME/庚烷(v/v＝9:1,21L)的溶剂中缓慢添加粗产物溶液以进行沉淀过程。此过程大约需要3小时。用布氏漏斗收集到呈白色固体状的纯产物，用庚烷(800mL x 2)的溶剂混合物洗涤产物滤饼并浓缩至干燥。得到淡黄色固体状的化合物3-4(301g,216mmol,51.8％产率,95.8％纯度)。HPLC显示化合物2-4：RT＝6.778min。
制备3-5(UTTC 4聚体)的一般程序
将化合物3-4(200g,150mmol,1.00eq)和MOE U亚酰胺(129g,157.85mmol,1.05eq)与CH3CN(500mL x 3)共蒸发。向化合物3-4(200g,150mmol,1.00eq)和MOE U亚酰胺(129g,157mmol,1.05eq)于无水CH3CN(800mL)中的溶液中添加分子筛(MS)(40.0g,150mmol,1.00eq)。在25℃下搅拌混合物1h。然后在25℃下将Py-TFA(1.00M,225mL,1.50eq)添加到混合物反应中。将所得混合物在25℃下搅拌30min。注意乙腈和DCM都是新鲜再蒸馏的。HPLC指示化合物2-4被完全消耗。注意，MOE U亚酰胺是：
在25℃下向上述溶液中添加DDTT(33.9g,165mmol,1.10eq)。在25℃下搅拌混合物0.5h。然后将混合物在冰浴中冷却至0℃并保持30分钟。HPLC指示反应完成。注意混合物从黄色混浊变为黄色均质溶液。
同时，向1L三颈圆底烧瓶中装入咪唑(204g,3.01mol,20.0eq)和无水THF(400mL)并置于冰浴中30分钟。缓慢添加HF(43.0g,1.50mol,39.1mL,70.0％纯度，10.0eq)，然后再搅拌15分钟。将混合物在0℃下添加到上述悬浮液中并保持1小时。在0℃下搅拌混合物1h。HPLC指示反应完成。
将反应混合物溶解于EtOAc(5.2L)中。将有机层用饱和NaHCO3(3.6L x 2)、水(2.6L x 3)、盐水(2.6L)洗涤并由无水MgSO4(～440g)干燥，过滤并在真空下浓缩。注意在此过程中，没有沉淀出黄色凝胶固体。
将粗产物溶解于DCM(2.0L)中并装入1L分液漏斗中。从漏斗向TBME(17.6L)的溶剂混合物中缓慢添加粗产物溶液以进行沉淀过程。此过程大约需要30分钟。用布氏漏斗收集到呈白色固体状的纯产物，用TBME(500mL x 2)的溶剂混合物洗涤产物滤饼并浓缩至干燥。得到淡黄色固体状的化合物3-5(UTTC 4聚体)(258g,134mmol，89.0％产率，95.6％纯度)。化合物UTTC 4聚体(3-5)的HPLC-MS示于图3中。
化合物3-5的HPLC-MS方法：
●柱：ACQUITY UPLC BEH Shield RP18柱,1.7μm,2.1mm X 150mm；
●柱温：60℃
●MS分析是在Thermo Orbitrap Fusion上完成的，分辨率为60k，且质量范围为300至2000；
●MS极性：正；
●流动相A：20mM醋酸铵，于ACN:水＝25:75中；流动相B：乙腈；
●梯度：
时间A B流率压力
min％％mL/min巴
-------------------------------------
0.00 70.00 30.00 0.50---
1.00 70.00 30.00 0.50---
28.0 55.00 45.00 0.50---
30.0 10.00 90.00 0.50---
31.0 10.00 90.00 0.50
32.0 70.00 30.00 0.50
35.0 70.00 30.00 0.50
36.0 70.00 30.00 0.50
3.5'DMT-MOE CCGU-OH(片段4)的合成
制备化合物4-2的一般程序
在25℃下，向化合物4-1(200g,323mmol)在DCM(1600mL)中的溶液中添加咪唑(66.0g,969mmol)和TBDPSCl(115g,420mmol,107mL)。在25℃下搅拌混合物12小时。TLC(石油醚/乙酸乙酯＝1/1，Rf＝0.63min)指示化合物4-1以及一个具有较低极性的主要新斑点。将丙-2-醇(19.4g,323mmol,24.7mL)添加到混合物中并在25℃下搅拌0.5小时。
在0℃下向最后一步的溶液中逐滴添加CySH(48.8g,420mmol)和TFA(184g,1.62mol)。在0℃下搅拌混合物1小时。TLC(石油醚/乙酸乙酯＝1/1，Rf＝0.50)显示反应完成。通过在25℃下添加Na2CO3溶液(185g,1600mL DI H2O)使反应混合物淬灭，然后用TBME(500mL)稀释并分离两层。将合并的有机层用盐水(500mL)洗涤，经MgSO4干燥，过滤并在减压下浓缩，得到残余物。将粗产物化合物4-2溶解于ACN(2000mL)和DI H2O(300mL)中并用庚烷/TBME(4/1,8L,1.6L x5)萃取。用DCM(3.2L)稀释ACN层，分离水，经无水MgSO4干燥，过滤并在减压下浓缩，得到残余物。得到白色泡沫状的化合物4-2(176g,98.1％产率,95.8％纯度)。1H NMR:400MHz DMSO:11.30(s,1H),7.69(m,J＝6.4Hz,3H),7.61(dd,J＝7.73,1.47Hz,2H),7.44(m,6H),5.97(d,J＝5.87Hz,1H),5.12(t,J＝4.89,4.89Hz,1H),4.31(m,1H),3.9(q,J＝2.8,2.8,2.8Hz,1H),3.76(t,J＝5.38,5.38Hz,1H),3.46(m,2H),3.28(m,2H),3.21(ddd,J＝12.23,4.4,3.13Hz，1H),3.14(s,3H),1.73(s,3H),1.05(s,9H)
制备化合物4-4的一般程序
将化合物4-3(164g,179mmol)和化合物4-2(90.5g,163mmol)与ACN(450mL x 3)在Ar2下在3000mL单颈圆瓶中共蒸发，并将分子筛(10.0g)添加到单颈瓶中，在Ar2压力下添加ACN(1000mL)。将混合物在25℃下搅拌1小时，然后将DCI(28.9g,244mmol)添加到混合物中。在25℃下搅拌混合物0.5h。HPLC显示起始材料被完全消耗。
偶联反应完成后，向混合物中添加DDTT(37.7g,183mmol)。将反应混合物在25℃下搅拌0.5小时，然后向混合物中添加DI H2O(0.12mL)、PPh3(4.38g,16.7mmol)，并且在25℃下搅拌混合物0.5小时。HPLC显示起始材料被完全消耗。
通过旋转蒸发器去除大部分ACN，然后用tBuOMe/EtOAc(3/1,1500mL)稀释反应。沉淀出黄色固体。过滤并用DI H2O(1000mLx2)、盐水(600mL x 2)洗涤滤液。干燥有机层并浓缩至干燥。获得淡黄色固体状的化合物4-4(233.8g,粗制品,80.1％纯度)，其无需进一步纯化即可用于下一步。
制备化合物4-5的一般程序
将化合物4-4(234g,167mmol)溶解于无水DCM(1600mL)中，然后在0℃下添加TCA(81.8g,501mmol)和CySH(29.1g,250mmol)。在0℃下搅拌混合物0.5小时。HPLC显示起始材料被完全消耗。
通过缓慢添加NaHCO3/H2O(84.0g NaHCO3，于1200mL DI H2O中)淬灭反应。将混合物剧烈搅拌10分钟并分离两层。用DCM(600mL)萃取H2O层，干燥合并的有机层并浓缩至干燥。将混合物再溶解于CH3CN/DI H2O(2/1,1200mL)中，并将CH3CN/H2O层用庚烷/tBuOMe(4/1,1000mL x 5)洗涤.通过旋转蒸发器去除大部分CH3CN，然后用tBuOMe/EtOAc(2/1，1500mL)稀释混合物，用NaHCO3/H2O(1000mL x 2，去除DCI)、盐水(600mL x2)洗涤混合物。将有机层用MgSO4干燥，过滤并浓缩至干燥。粗产物无需进一步纯化即可用于下一步。获得淡黄色固体状的粗产物化合物4-5(180g，98.2％产率，94.6％纯度)，其无需进一步纯化即可用于下一步。
制备化合物4-7的一般程序
将化合物4-5(115g,104mmol)和化合物4-6(106g,115mmol)与ACN(500mL x3)在Ar2下在2000mL单颈圆瓶中共蒸发，并向单颈瓶中添加分子筛(45.0g)，在Ar2压力下添加ACN(1050mL)。在25℃下搅拌混合物1小时，然后将DCI(18.6g,157mmol)添加到混合物中。HPLC显示起始材料被完全消耗。
偶联反应完成后，将tBuOOH(5.5M,38.1mL)和H2O(10mL)添加到反应混合物中。在25℃下搅拌反应混合物30分钟。HPLC显示起始材料被完全消耗。
氧化完成后，将反应混合物在冰水浴中冷却至0℃并保持5分钟，并将商业级I2氧化溶液(628.87mL 0.05M，在吡啶/H2O中，v/v 9:1)在20分钟内添加到混合物中。在0℃下再搅拌反应混合物5分钟。HPLC显示起始材料被完全消耗。
将反应混合物缓慢倒入Na2S2O3/H2O溶液(Na2S2O333.1 g，在2300mL H2O中)中并将溶液剧烈搅拌10分钟。然后将混合物用3000mL EtOAc/tBuOMe(1/3)的混合物溶剂稀释。将有机层分离并用NaHCO3/H2O(2000mL)、盐水(1000mL)洗涤。干燥有机层并浓缩至干燥。将粗产物再溶解于DCM/tBuOMe(1/1,460mL)中。将粗溶剂缓慢滴入庚烷/tBuOMe(2/1,2300mL)的溶剂混合物中。沉淀出所需产物。过滤后收集呈淡黄色固体状的产物，将固体滤饼用庚烷/tBuOMe(1/1,230mL x 2)洗涤。获得淡黄色固体状的化合物7(217g，粗制品，87.6％纯度)，其无需进一步纯化即可用于下一步。
制备化合物4-8的一般程序
将化合物4-7(204g,104mmol)溶解于无水DCM(2000mL)中，然后在0℃下添加DCA(67.5g,524mmol)和CySH(18.2g,157mmol)。将混合物温至25℃，并搅拌2小时。HPLC显示起始材料被完全消耗。
通过缓慢添加Na2CO3/H2O(77.4g Na2CO3，于1200mL DI H2O中)淬灭反应。将混合物剧烈搅拌10分钟并分离两层。用DCM(600mL)萃取H2O层，干燥合并的有机层并浓缩至干燥。将混合物再溶解于CH3CN/H2O(2/1,900mL)中，并由庚烷/tBuOMe＝(4/1,800mL x 5)洗涤CH3CN/H2O层。通过旋转蒸发器去除大部分CN3CN，然后用tBuOMe/EtOAc(1/3,1800mL)稀释混合物，用NaHCO3/H2O(900mL x 2)、盐水(600mL)洗涤混合物。干燥有机层并浓缩至干燥。粗产物无需进一步纯化即可用于下一步。获得淡黄色固体状的化合物4-8(130g,75.3％产率,92.4％纯度)，其无需进一步纯化即可用于下一步。
制备5'DMT-MOE CCGU-OH的一般程序
将化合物4-8(153g,92.8mmol)和化合物4-6(89.9g,97.5mmol)与ACN(400mL x 3)在Ar2下在3000mL单颈圆瓶中共蒸发，并向单颈瓶中添加3A分子筛(45.0g)，在Ar2压力下添加ACN(928mL)。将混合物在25℃下搅拌1小时，然后将Py-TFA(1M,139mL)添加到混合物中。HPLC显示起始材料被完全消耗。
偶联反应完成后，向混合物中添加DDTT(20.0g,97.5mmol)。将反应混合物在25℃下搅拌0.5小时，并从黄色混浊变为黄色均质溶液，提示反应完成，然后在冰浴中冷却至0℃并保持30分钟。
同时，向500mL圆底烧瓶中装入咪唑(127g，1.87mol)和无水THF(232mL)并置于冰浴中30分钟。缓慢添加HF-Py(24.3mL,70.0％纯度)，然后再搅拌15分钟(由这个步骤获得均质溶液)。将上一步的溶液通过蠕动泵(1mL/5min滴速)缓慢添加到来自上一反应混合物的反应混合物中，并在0℃下搅拌1-2小时。反应的完成可通过HPLC监测。HPLC显示起始材料被完全消耗。将混合物用EA(4500mL)稀释并在0℃下用NaHCO3/H2O(2500mL)缓慢中和。分离有机层并用NaHCO3/H2O(2500mL)、盐水(2000mL)洗涤。干燥有机层并浓缩至干燥。将粗制品再溶解于DCM(600mL)中。将粗溶剂缓慢滴加到tBuOMe(6000mL)的溶剂中。沉淀出所需产物。过滤后收集淡黄色固体状的产物，并将固体滤饼用tBuOMe(600mL x2)洗涤。获得淡黄色固体状的4-9(5'DMT-MOE CCGU-OH)(190g，90.5％产率，94.8％纯度)。MOE-CCGU 4聚体(4-9)的HPLC-MS示于图4中。
化合物4-9的HPLC-MS方法：
●柱：ACQUITY UPLC BEH Shield RP18柱,1.7μm,2.1mm X 150mm；
●柱温：60℃
●MS分析是在Thermo Orbitrap Fusion上完成的，分辨率为60k，且质量范围为400至2000；
●MS极性：正
●流动相A：20mM醋酸铵，于ACN:水＝25:75中；流动相B：乙腈；
●梯度：
时间A B流率压力
min％％mL/min巴
-------------------------------------
0.00 60.00 40.00 0.50---
1.00 60.00 40.00 0.50---
28.0 40.00 60.00 0.50---
30.0 10.00 90.00 0.50---
31.0 10.00 90.00 0.50
32.0 60.00 40.00 0.50
35.0 60.00 40.00 0.50
36.0 60.00 40.00 0.50
C.靶寡核苷酸的汇聚合成
制备化合物5-1的一般程序
在0℃下向亚酰胺试剂(Amidite Reagent)(63.9g,212mmol,67.3mL,5.0eq)和化合物2-9(100g,42.4mmol,1.0eq)在THF(400mL)中的溶液中添加Py-TFA(24.5g,127mmol,15.9mL,3.0eq)。在0℃下搅拌混合物1小时。HPLC显示化合物2-9被完全消耗。
将反应混合物转移到500mL分液漏斗中(与DCM洗涤体积合并后约20mL)。从漏斗向溶剂TBME/py(v/v 100:0.7,15L)中缓慢滴加粗产物溶液以进行沉淀过程.此过程大约需要90分钟。从前一步骤收集灰白色固体状的纯产物，将产物滤饼用纯TBME(1.0L x 3)洗涤并真空干燥。得到白色固体状的化合物5-1(106g,90.8％产率,93％纯度)。请注意，使用无水THF。将化合物2-9和Py-TFA与THF共蒸发3次。添加吡啶以维持碱性环境，从而使亚酰胺产物的水解最少。
制备化合物5-2的一般程序
向在DCM/ACN＝2/1(900mL)中的化合物5-1(122g,48.0mmol,1.5eq)、分子筛(45.0g)和化合物1-7(115g,32.0mmol,1.0eq)中添加DCI(9.46g,80.08mmol,2.5eq)。在10℃下搅拌混合物1h。
通过TLC监测反应(60分钟完全转化)。在偶联反应完成后，将DDTT(9.87g,48.05mmol,1.5eq)添加到混合物中。在10℃下搅拌反应混合物30分钟。过滤反应混合物并将滤液浓缩至1/2体积。将残余溶液添加到ACN(5.0L)中。沉淀出产物。过滤并收集滤饼。将滤饼用ACN(1L)洗涤并在真空下干燥。得到淡黄色固体状的化合物5-2(194g,99.6％产率)。请注意乙腈和DCM都是新鲜再蒸馏的。将化合物5-1和化合物1-7与DCM/ACN共蒸发3次。
对于化合物5-2的HPLC和LC-MS分析，使用氨解(NH3/H2O)程序将其脱保护，该程序类似于以下公开的用于化合物1的氨解程序，以获得5-2-a(DMTrO-TsTsAsCsCsAsCoCsCsU-OH)。化合物5-2-a的HPLC和LC-MS示于图5中。
制备化合物5-3的一般程序
将化合物5-2(194g,31.9mmol,1.0eq)和分子筛(65.0g)添加到圆烧瓶中，在Ar压力下添加无水DCM(1.3L)。在15℃下搅拌混合物1小时，然后在0℃下将CySH(7.42g,63.8mmol,7.81mL,2.0eq)和TCA(52.1g,319mmol,32.1mL,10.0eq)添加到混合物中。
在0℃下搅拌反应90分钟(通过TLC检查反应)，然后将Py(30.2g,382mmol,30.9mL,12.0eq)添加到混合物中。在15℃下搅拌混合物5分钟。通过过滤去除3A分子筛。将DCM溶剂缓慢添加到CH3CN(7.0L)中，沉淀出淡黄色固体。通过旋转蒸发器去除大部分DCM，收集白色沉淀并用CH3CN(500ml x 3)洗涤。得到淡黄色固体状的化合物5-3(180g,97.6％产率)。请注意，DCM是新鲜再蒸馏的。将化合物5-2与DCM共蒸发3次。产物在DCM中具有良好的溶解性，过滤前去除大部分DCM很重要。对于化合物5-3的HPLC和LC-MS分析，使用氨解(NH3/H2O)程序将其脱保护，该程序类似于以下公开的用于化合物1的氨解程序，以获得5-3-a(HO-TsTsAsCsCsAsCoCsCsU-OH)。化合物5-3-a的HPLC和LC-MS示于图6中。
5-3-a的HPLC-MS方法
●柱：ACQUITY UPLC BEH C18柱,1.7μm,2.1mm X 50mm；
●柱温：50℃
●电离模式：API-ES；
●质量范围从1350至2300；
●MS极性：负；
●流动相A：5mM TBuAA，于10％ CH3CN,1μm EDTA中；溶液B：5mM TBuAA，于80％CH3CN,1μm EDTA中；
●梯度
时间A B流率压力
min％％mL/min巴
-------------------------------------
0.14 60.00 40.00 0.51---
3.70 20.00 80.00 0.51---
4.00 10.00 90.00 0.51---
4.20 60.00 40.00 0.51---
5.00 60.00 40.00 0.51
制备化合物5-4的一般程序
将化合物3-5(102g,55.3mmol,1.0eq)与THF(300mL x 3)共蒸发。将Py-TFA(32.0g,166mmol,3.0eq)与THF(300mL x 3)共蒸发。向2000mL圆底烧瓶中，添加于无水THF(400mL)中的化合物3-5(102g,55.3mmol,1.0eq)和亚酰胺试剂(83.4g,276mmol,87.9mL,5.0eq)并在冰浴中冷却至0℃并保持30分钟。添加活化剂Py-TFA(32.0g,166mmol,3.0eq)，然后在0℃下搅拌反应混合物1小时。HPLC显示起始材料被完全消耗。
从漏斗向溶剂TBME/庚烷/Py(95/5/1,15.8L)中缓慢滴加粗产物溶液以进行沉淀过程。此过程大约需要30分钟。从前一步骤收集呈灰白色固体状的纯产物，用纯TBME(500mLx 3)洗涤产物滤饼并通过高真空干燥3小时。
得到白色固体状的化合物5-4(107g，52.4mmol，94.6％产率)。请注意，THF是无水的，并且将化合物3-5和Py-TFA与无水THF共蒸发3次。
制备化合物5-5的一般程序
将化合物5-3(177g,30.6mmol,1.0eq)、化合物5-4(106g,52.0mmol,1.7eq)和分子筛(60g)添加到圆烧瓶中，在Ar压力下添加无水DCM(850mL，H2O<50ppm)、ACN(425mL，H2O<50PPM)。在15℃下搅拌混合物1小时，然后将DCI(9.05g,76.6mmol,2.5eq)添加到混合物中。在15℃下搅拌混合物0.67h。TLC(DCM:MeOH＝10:1)指示化合物5-3被完全消耗。
偶联反应完成后，将DDTT(10.7g,52.0mmol,1.7eq)添加到混合物中。在15℃下搅拌反应混合物10分钟。
通过过滤去除分子筛，并用6000ml CH3CN稀释反应(沉淀出白色固体)。通过旋转蒸发器去除DCM，收集白色固体并用CH3CN(500mL x 3)洗涤。该淡黄色固体无需进一步纯化即可直接用于下一步。得到淡黄色固体状的化合物5-5(237g,99.6％产率)。
对于化合物5-5的HPLC和LC-MS分析，使用氨解(NH3/H2O)程序将其脱保护，该程序类似于以下公开的用于化合物1的氨解程序，以获得5-5-a(DMTrO-UsTsTsCsTsTsAsCsCsAsCoCsCsU-OH)。化合物5-5-a的HPLC和LC-MS示于图7中。
5-5-a的HPLC-MS方法
●柱：ACQUITY UPLC BEH C18柱,1.7μm,2.1mm X 50mm；
●柱温：50℃
●电离模式：API-ES；
●质量范围从1350至2300；
●MS极性：负；
●流动相A：5mM TBuAA，于10％ CH3CN,1μm EDTA中；溶液B：5mM TBuAA，于80％CH3CN,1μm EDTA中；
●梯度：
时间A B流率压力
min％％mL/min巴
-------------------------------------
0.14 60.00 40.00 0.51---
3.70 20.00 80.00 0.51---
4.00 10.00 90.00 0.51---
4.20 60.00 40.00 0.51---
5.00 60.00 40.00 0.51
制备化合物5-6的一般程序
将化合物5-5(234g,30.2mmol,1.0eq)和分子筛(12.5g)添加到圆烧瓶中，在Ar压力下添加无水DCM(1500mL,H2O<50ppm)。在15℃下搅拌混合物1小时，然后将CySH(10.5g,90.5mmol,11.1mL,3.0eq)和TCA(59.2g,362mmol,12.0eq)添加到混合物中。
在0℃下搅拌反应60min(通过TLC检查反应)，然后将Py(35.8g,452mmol,36.5mL,15.0eq)添加到混合物中。在15℃下搅拌混合物5分钟，
通过过滤去除分子筛。将DCM溶剂缓慢添加到CH3CN 10L中，沉淀出淡黄色固体。通过旋转蒸发器去除大部分DCM，收集白色沉淀并用CH3CN(500ml x 3)洗涤。得到淡黄色固体状的化合物5-6(210g,93.3％产率)。
对于化合物5-6的HPLC和LC-MS分析，使用氨解(NH3/H2O)程序将其脱保护，该程序类似于以下公开的用于化合物1的氨解程序，以获得5-6-a(HO-UsTsTsCsTsTsAsCsCsAsCoCsCsU-OH)。化合物5-6-a的HPLC和LC-MS示于图8中。
5-6-a的HPLC-MS方法
●柱：ACQUITY UPLC BEH C18柱,1.7μm,2.1mm X 50mm；
●柱温：50℃
●电离模式：API-ES；
●质量范围从1350至2300；
●MS极性：负；
●流动相A：5mM TBuAA，于10％ CH3CN,1μm EDTA中；溶液B：5mM TBuAA，于80％CH3CN,1μm EDTA中；
●梯度：
时间A B流率压力
min％％mL/min巴
-------------------------------------
0.14 60.00 40.00 0.51---
3.70 20.00 80.00 0.51---
4.00 10.00 90.00 0.51---
4.20 60.00 40.00 0.51---
5.00 60.00 40.00 0.51
制备化合物5-7的一般程序
向2000mL圆底烧瓶中添加在无水THF(520mL)中的化合物4-9(130g,57.8mmol,1.0eq)、亚酰胺试剂(87.2g,289mmol,91.9mL,5.0eq)，并且在冰浴中冷却至0℃并保持30min。添加活化剂Py-TFA(33.5g,173mmol,34.2mL,3.0eq)，然后在0℃下搅拌反应混合物1小时。HPLC显示起始材料被完全消耗。
从漏斗向溶剂TBME/庚烷/Py(95/5/1,15850mL)中缓慢添加粗产物溶液以进行沉淀过程。此过程大约需要30分钟。从前一步骤收集灰白色固体状的纯产物，将产物滤饼用纯TBME(500mL x 3)洗涤并在高真空下干燥3小时。
获得白色固体状的化合物5-7(133g，93.9％产率)。
制备化合物1、完全受保护的ASO 9的一般程序
在Ar压力下向圆烧瓶中的化合物5-6(242g,32.5mmol,1.0eq)、化合物5-7(135g,55.2mmol,1.7eq)和分子筛(80.0g)中添加无水DCM(1200mL,H2O<50ppm)和ACN(600mL，H2O<50PPM)。在15℃下搅拌混合物1小时，然后将DCI(9.60g,81.2mmol,2.5eq)添加到混合物中。在15℃下搅拌混合物1小时。用TLC确认反应完成。
偶联反应完成后，将DDTT(11.3g,55.2mmol,1.7eq)添加到混合物中。在15℃下搅拌反应混合物10分钟。通过过滤去除分子筛，并将反应用10L CH3CN稀释(沉淀出淡黄色固体)。通过旋转蒸发器去除DCM，收集淡黄色固体并用CH3CN(500mL x 3)洗涤。获得淡黄色固体状的化合物1(264g，82.8％产率)。
对于化合物1的HPLC和LC-MS分析，使用下述氨解(NH3/H2O)程序将其脱保护以获得1-a(DMTrO-CsCoGsUsUsTsTsCsTsTsAsCsCsAsCoCsCsU-OH)。化合物1-a的HPLC和LC-MS示于图9中。
1-a的HPLC-MS方法
●柱：ACQUITY UPLC BEH C18柱,1.7μm,2.1mm X 50mm；
●柱温：50℃
●电离模式：API-ES；
●质量范围从1350至2300；
●MS极性：负；
●流动相A：5mM TBuAA，于10％ CH3CN,1μm EDTA中；溶液B：5mM TBuAA，于80％CH3CN,1μm EDTA中；
●梯度：
时间A B流率压力
min％％mL/min巴
-------------------------------------
0.14 60.00 40.00 0.51---
3.70 20.00 80.00 0.51---
4.00 10.00 90.00 0.51---
4.20 60.00 40.00 0.51---
5.00 60.00 40.00 0.51
化合物1、完全受保护的ASO 9的脱保护和氨解
向1-L烧瓶中添加化合物1(64g)和CH3CN:Et3N(640ml,v/v)。在25℃下搅拌混合物两小时，然后通过旋转蒸发器去除溶剂。向烧瓶中添加500ml NH4OH(～30％wt)并在25℃下搅拌混合物约30分钟。将所得溶液转移到1-L玻璃压力烧瓶中并将混合物加热至65℃并保持5小时。将混合物冷却至环境温度用于下游纯化。
ASO 9纯化过程：
将来自氨解(2L)的ASO 9上的DMT用1111mM硫酸铵溶液(18L)稀释至最终硫酸铵浓度～1000mM。然后将悬浮液通过深层过滤器过滤，将其润湿，冲洗并用3个床体积的溶液(1000mM硫酸铵，50mM tris，pH 8.5)平衡。
对于疏水相互作用色谱(HIC)步骤，将20cm床高(BH)x 14cm内径(ID)的HIC柱用4个柱体积(CV)的平衡缓冲液(1000mM硫酸铵，50mM tris，pH 8.5)平衡。来自深层过滤器的滤液被装入柱上。用4个CV的缓冲液(1000mM硫酸铵，50mM tris，pH 8.5)追踪柱，用缓冲液(800mM硫酸铵，50mM tris，pH 8.5)以100cm/hr洗涤，直到UV门(2mm流通池)达到0.5AU。一旦UV门达到0.5AU，就用2个以上CV的相同缓冲液(800mM硫酸铵，50mM tris，pH 8.5)洗涤柱。对于洗涤步骤，流率为100cm/hr。用8个CV的缓冲液(50mM硫酸铵，50mM tris，pH 8.5)洗脱柱以提供ASO 9上的DMT。用4个CV的去离子水对柱进行汽提。将柱用3个CV的1N氢氧化钠清洗并储存在0.1N氢氧化钠中。HIC过程以200cm/hr的速度运行，但洗涤以100cm/hr的速度运行。
将含有ASO 9上的DMT的HIC洗脱液(～9L)冷却至10℃，并添加25％(w/w)柠檬酸溶液(0.9L)以使混合物的pH值为2.7。在10℃下搅拌此混合物4.5小时并添加5N氢氧化钠(0.8L)以使pH值为8.5。然后使用0.22μm除菌过滤器过滤混合物以去除DMT-OH副产物。随后通过阴离子交换色谱纯化滤液。
对于阴离子交换色谱(AEX)，15cm BH x 14cm ID AEX柱装有2个CV的高盐缓冲溶液(2000mM氯化钠，250mM tris，pH 8.5)并用4个CV的平衡缓冲溶液(100mM氯化钠，50mMtris，pH 8.5)平衡。将来自脱三苯甲基化步骤的滤液用水稀释至电导率为约20mS并加载到柱上。用缓冲溶液(300mM氯化钠，50mM tris，pH 8.5)洗涤柱，直到UV门(2mm流通池)达到0.4AU。用4个以上CV的相同缓冲液(300mM氯化钠，50mM tris，pH 8.5)连续洗涤柱。用7个CV的缓冲液(525mM氯化钠，50mM tris，pH 8.5)洗脱柱以提供ASO 9溶液。用4个CV的缓冲液(2000mM氯化钠，250mM tris，pH 8.5)对柱进行汽提，然后用3个CV的1N氢氧化钠清洗并储存在0.1N氢氧化钠中。AEX过程以200cm/hr运行。ASO 9的HPLC-MS示于图12中。
实施例2.使用5'端至3'端延伸策略合成ASO(10聚体)
1.5'P亚酰胺片段(5聚体)的一般合成
从1-2A和亚磷酰胺开始，使用与上述合成化合物1-8a类似的程序以>98％的产率获得化合物2-2A。
2.ASO 6聚体的合成
使用与上述合成片段1-9类似的程序，将化合物4-2A与化合物3-2A偶联，以>98％的产率得到6聚体(化合物5-2A)，然后进行4-9合成的步骤3中所述的脱甲硅烷基化程序。脱甲硅烷基化前的ASO 6聚体的质谱示于图13中。
3.ASO 10聚体的合成
使用与上述合成片段1-9类似的程序，将ASO 5聚体6-2A与5聚体片段2-2A偶联，以>98％的产率得到ASO 10聚体。ASO 10聚体的质谱示于图14中。
4.ASO 15聚体5'-ACoAGATATTTTTGTT-3'-OH的汇聚合成
ASO 15聚体是基于上述方案中所示的汇聚合成方法，使用与上述类似的程序合成的。汇聚合成中使用的三个片段是：5'-LHPG-ACoAGA-3'-OH(片段1)；5'-P-TATTT-3'-OTBDPS(片段2)；及5'-P-TTGTT-3'-OTBDPS(片段3)。
1)片段1的合成：5'-LHPG-ACoAGA-3'-OH(1-3A)
片段1(化合物1-3A)如以上方案中所示，使用与上述类似的程序合成。脱保护的片段1(化合物1-3A-H)的质谱示于图15中。
2)片段2的合成：5'-P-TATTT-3'-OTBDPS(化合物2-3A)
使用与上述2-2A合成类似的程序合成片段2。
3)片段3的合成：5'-P-TTGTT-3'-OTBDPS(化合物3-3A)
也使用与上述2-2A合成类似的程序合成片段3。
4)ASO 15聚体的汇聚合成：
使用本文所述的液相汇聚合成方法合成ASO 15聚体。使片段1与片段2偶联，然后硫化以形成化合物4-3A。化合物4-3A的脱甲硅烷基化去除3'-TBDPS基团，产生化合物5-3A，然后将其与片段3偶联，接着硫化以产生ASO 15聚体6-3A。4-3A和5-3A的形成通过相应的脱保护产物4-3A-H和5-3A-H的LC-MS分析来证实，它们通过用NH3/H2O处理化合物4-3A或5-3A而形成。化合物4-3A-H和5-3A-H的质谱分别示于图16和图17中。化合物4-3A和5-3A的氨解反应如下所示：
5)ASO 15聚体6-3A的脱保护和氨解
使用与上述ASO 9上的DMT合成类似的脱保护和氨解程序，用NH4OH处理ASO 15聚体6-3A，得到6a与6b的混合物，表明完全去除了5'-LHPG保护基且部分去除了3'-端处的TBDPS基团(参见图18)。
实施例3：5'OH脱保护过程中的脱氨基研究：
UCC三聚体和CC二聚体的脱三苯甲基化研究
1.UCC三聚体脱氨基研究：
在不同反应条件下研究UCC三聚体的脱三苯甲基化，以找出使脱氨基副反应最小化所需的最佳条件和试剂。表1示出了不同反应条件和在这些条件下不希望有的脱氨基产物的量的比较。如图9可见，使用分子筛并用吡啶淬灭反应产生<0.5％的脱氨基，相比之下，无筛时有7％脱氨基，而无筛且无吡啶淬灭时有10％脱氨基。
表1：UCC三聚体的反应条件和脱氨基产物的比较
2.CC二聚体脱氨基研究：
与对UCC三聚体进行的上述研究类似，使用各种试剂和条件对CC二聚体进行脱三苯甲基化，以最小化或避免脱氨基反应。如表2和图11可见，当使用DCA、硫醇和分子筛时，在室温下14小时后，即使添加水，也未检测到脱氨基产物。另一方面，当不添加分子筛和水时，得到4.46％的脱氨基产物，且在室温下搅拌14小时，加水但不加分子筛的话得到49％的脱氨基产物
表2：CC二聚体的反应条件和脱氨基产物的比较
3.来自片段合成的脱三苯甲基化的脱氨基研究结果
五聚体MOE DMTO-ACoCCU-OH(来自DMTO-ACCCU-OLHPG)含有约10％的脱氨基杂质(Ia、Ib和Ic合并的，比例尚未确定)(方案A)。
方案A.DMTO-ACCCU-OLHPG中高含量的脱氨基杂质
然后使用相同程序完成其类似物HO-CCC-OTBDPS的合成，发现此三聚体产物含有至少10％的总脱氨基杂质(方案B)。
方案B：HO-CCC-OTBDPS中高含量的脱氨基杂质
MOE片段-LHPG(I)：在上述结果下，五聚体MOE DMTO-ACoCCU-OH，重复进行，其中修改了脱三苯甲基化程序。在此合成中，将溶液经分子筛干燥，然后在每次脱三苯甲基化反应中添加酸。脱氨基副产物被完全抑制(表3)。
表3.干燥对MOE DMTO-ACoCCU-OH中脱氨基杂质的影响
实施例4.ASO 8的合成
使用实施例1中针对ASO 9所述的类似程序制备在5'-端具有DMT基团且在3'-端具有LHPS基团的完全受保护的ASO 8。用于合成的寡核苷酸片段示于以下方案中。
1.通过5+6+(4+5)偶联合成ASO 8
2.通过5+6+4+5偶联合成ASO 8
使用与实施例1中针对ASO 9所述的相似程序将ASO 8上的DMT脱三苯甲基化和纯化。ASO 8的HPLC-MS示于图19中。
ASO 8的HPLC-MS方法：
●柱：ACQUITY UPLC BEH C18柱,1.7μm,2.1mm X 50mm；
●柱温：50℃
●电离模式：API-ES；
●质量范围从1350至2300；
●MS极性：负；
●流动相A：5mM TBuAA，于10％ CH3CN,1μm EDTA中；溶液B：5mM TBuAA，于80％CH3CN,1μm EDTA中；
●梯度：
时间A B流率压力
min％％mL/min巴
-------------------------------------
0.14 60.00 40.00 0.51---
3.70 20.00 80.00 0.51---
4.00 10.00 90.00 0.51---
4.20 60.00 40.00 0.51---
5.00 60.00 40.00 0.51
实施例5.脱甲硅烷基化研究
开发了一种新型、简便、温和且清洁的3'-OTBDPS脱保护方法，以最少化杂质的形成。发现咪唑的存在极大地加速了TBDPS的脱保护并产生最少量的杂质。下面描述的比较研究显示，使用已知条件进行脱甲硅烷基化会导致形成各种副产物，诸如N-2和二醇副产物。相比之下，新的脱甲硅烷基化方法显著减少这些副产物。
a.使用已知的脱甲硅烷基化条件对CCGU四聚体进行脱甲硅烷基化：
在0℃下，将250mg CCGU四聚体用20当量HF和30当量吡啶处理7小时。观察到N-2和二醇副产物。使用其他已知方法(诸如TBAF或CsF)进行的脱甲硅烷基化反应产生复杂的混合物。
N-2和二醇副产物的存在可显著影响最终靶寡核苷酸的纯度。
b.CCGU四聚体在HF/咪唑脱甲硅烷基化条件下的脱甲硅烷基化：
与用上述已知条件进行的脱甲硅烷基化反应相反，用HF/咪唑的脱甲硅烷基化导致在2小时内完成脱甲硅烷基化反应，观察到少于0.5％的二醇和N-2副产物。此外，与使用已知脱甲硅烷基化条件所需的20当量HF相比，仅需要5当量HF即可实现起始材料的完全转化。
实施例6.通过H膦酸酯化学合成5'-DMT-GUUUUUGCAA-NO2-苯甲酰基
将SM 1(3.78g)和SM 2(2.64g)溶解于20ml CH3CN中。在0℃下将吡啶2.4ml和新戊酰氯0.62ml缓慢添加到混合物中。在0℃下搅拌40分钟后，向混合物中添加I2/py(0.05M40ml)。在0℃下搅拌30分钟后，用Na2S2O3/H2O溶液淬灭反应，得到淡黄色固体状的5'-DMT-GUUUUUGCAA-NO2-苯甲酰基。5'-DMT-GUUUUUGCA A-NO2-苯甲酰基的结构通过MS确认(参见图20)。
实施例7.具有各种PO/PS键的ASO 9类似物的汇聚液相合成的可行性评估
HPLC方法(A).
柱：Xbridge Shield RP18 5μm,2.1mm X 50mm柱。
柱温：40℃；
流动相：
溶液A：10mM NH4HCO3水溶液
溶液B：100％乙腈
梯度：
时间A B流率压力
min％％mL/min巴
-------------------------------------
0.01 90.00 10.00 0.80---
8.00 20.00 80.00 0.80---
9.00 20.00 80.00 0.80---
9.01 90.00 10.00 1.20---
10.00 90.00 10.00 1.20---
HPLC方法(B).
柱:Xbridge C18 3.5μm,4.6mm X 150mm柱。
柱温：40℃；
流动相：
溶液A：10mM NH4HCO3水溶液
溶液B：100％乙腈
梯度：
时间A B流率压力
min％％mL/min巴
-------------------------------------
0.00 50.00 50.00 1.00---
15.00 0.00 100.00 1.00---
15.01 50.00 50.00 1.00---
20.00 50.00 50.00 1.00---
HPLC方法(C).
柱：Xbridge Shield RP18 5μm,2.1mm X 50mm柱。
柱温：40℃；
流动相：
溶液A：10mM NH4HCO3水溶液
溶液B：100％乙腈
梯度：
时间A B流率压力
min％％mL/min巴
-------------------------------------
0.01 100.00 0.00 0.80---
4.50 70.00 30.00 0.80---
5.30 70.00 30.00 0.80---
5.31 100.00 0.00 1.20---
6.00 100.00 0.00 1.20---
HPLC-MS方法(D).
柱：Xbridge Shield RP18 5μm,2.1mm X 50mm柱。
柱温：40℃；
质量范围从100至1000；
MS极性：负
流动相：
溶液A：10mM NH4HCO3水溶液
溶液B：100％乙腈
梯度：
时间A B流率压力
min％％mL/min巴
-------------------------------------
0.01 95.00 5.00 1.00---
1.00 5.00 95.00 1.00---
1.80 0.00 100.00 1.00---
1.81 95.00 5.00 1.00---
2.20 95.00 5.00 1.00---
HPLC-MS方法(E).
柱：Luna C18 3.0μm,2.0mm X 30mm柱。
柱温：40℃；
质量范围从100至2000；
MS极性：正
流动相：
溶液A：0.037％ TFA(v/v)水溶液溶液B：0.018％ TFA(v/v)乙腈溶液
梯度：
时间A B流率压力
min％％mL/min巴
-------------------------------------
0.01 95.00 5.00 1.00---
1.00 5.00 95.00 1.00---
1.80 0.00 100.00 1.00---
1.81 95.00 5.00 1.20---
2.00 95.00 5.00 1.20---
HPLC-MS方法(F).
柱：Xbridge Shield RP18 5μm,2.1mm X 50mm柱。
柱温：40℃；
质量范围从100至1000；
MS极性：正
流动相：
溶液A：10mM NH4HCO3水溶液
溶液B：100％乙腈
梯度：
时间A B流率压力
min％％mL/min巴
-------------------------------------
0.01 95.00 5.00 1.00---
1.00 5.00 95.00 1.00---
1.80 0.00 100.00 1.00---
1.81 95.00 5.00 1.00---
2.20 95.00 5.00 1.00---
亚酰胺化合物7-1-6a、7-3-10a和7-4-8a的HPLC-MS方法(G).柱：ACQUITY UPLCBEH C18 1.7μm,2.1mm X 50mm柱。
柱温：50℃；
质量范围从500至2200；
MS极性：负
流动相：
溶液A：5mM醋酸三丁胺(TBuAA)，于10％ CH3CN,1μm EDTA溶液B：5mM TBuAA，于80％ CH3CN,1μm EDTA中
梯度：
时间A B流率压力
min％％mL/min巴
-------------------------------------
0.20 92.50 7.50 0.51---
9.00 5.00 95.00 0.51---
10.00 5.00 95.00 0.51---
合成了具有不同数量的P＝O/S键的ASO 9类似物。
A.5’片段的制备
1.5'-DMTr-CCGU-OH或5'-OH-CCGU-TBDPS 4聚体(片段4)的制备
合成化合物7-1-2
向化合物7-1-1(8.50g,13.7mmol,1.00eq)和咪唑(4.68g,68.7mmol,5.00eq)于DCM(85mL)中的溶液中添加TBDPSCl(4.15g,15.1mmol,3.88mL,1.10eq)。在25℃下搅拌混合物16h。TLC(石油醚:乙酸乙酯＝1:2，产物：Rf＝0.55)指示化合物7-1-1被完全消耗并形成一个新斑点。根据TLC，反应是干净的。添加丙-2-醇(825mg,13.7mmol,1.00eq)并在25℃下搅拌混合物0.5小时。
向上述溶液中添加冷却至0℃的十二烷-1-硫醇(7.23g,35.7mmol,8.56mL,1.30eq)，然后在0℃下向反应混合物中添加TFA(25.0g,219mmol,16.2mL,8.00eq)。在0℃下搅拌混合物1h。TLC(石油醚:乙酸乙酯＝1:2，产物：Rf＝0.28)指示起始材料被完全消耗并形成一个新斑点。根据TLC，反应是干净的。
通过添加NaHCO3(500mL)淬灭反应混合物，然后用DCM(100mL)稀释并用NaHCO3(200mL)萃取。将合并的有机层用盐水200mL(100mL x 2)洗涤、经MgSO4干燥，过滤并在减压下浓缩，得到残余物。将粗产物溶解于DCM(600mL)中并装入1000mL分液漏斗中。
将粗产物溶解于ACN 100mL和50mL DI水中，将混合物用庚烷:TBME＝4:1(120mL x4)萃取。(TLC指示产物在ACN和DI水中是干净的)。产物在ACN和水中。将混合物用TBME(100mL)萃取，并且干燥有机层并浓缩至干燥，得到白色固体。得到白色泡沫状的化合物7-2(14.0g，23.4mmol，85.1％产率，92.7％纯度)。
HPLC(方法A)：RT＝3.446min；LCMS(方法F)：RT＝1.371min；
m/z：化合物7-1-2的[M+H]+＝555.3。
合成化合物7-1-3
将化合物7-1-2(12.0g，21.6mmol，1.00eq和MOE G亚酰胺(21.7g，23.8mmol，1.10eq)与ACN(10mL x 3)在氩气下在250mL单颈圆瓶中共蒸发，并且在氩气压力ACN(60mL)下，将分子筛(3.00g)添加到单颈瓶中。在25℃下搅拌混合物1小时，然后将DCI(3.83g,32.4mmol,1.50eq)添加到混合物中。在25℃下搅拌反应混合物1小时。TLC(二氯甲烷:甲醇＝15:1，产物：Rf＝0.39)指示化合物7-1-2被完全消耗并形成一个新斑点。根据TLC，反应是干净的。HPLC(产物：RT＝7.199min；起始材料：RT＝5.194min)指示化合物2被完全消耗。
向上述溶液中添加BuOOH(3.90g,43.2mmol,4.15mL,2.00eq)。在25℃下搅拌混合物0.5h。HPLC(7-1-3，产物：RT＝6.869min；起始材料：RT＝7.199min)指示反应完成。将反应混合物倒入NaHCO3和Na2SO3溶液(10.0eq NaHCO3和5.00eq Na2SO3，于400mL DI水中)中，然后用DCM(100mL)稀释混合物，并分离两层，将有机层用NaHCO3(200mL)、盐水(200mL)洗涤，干燥，过滤并浓缩。得到淡黄色泡沫状的化合物7-1-3(32.0g，18.9mmol，87.6％产率，82.0％纯度)。
HPLC(方法A)：RT＝6.868min；LCMS(方法F)：RT＝1.501，1.520min；m/z：化合物7-1-3的[M+H]+＝1383.5。
制备化合物7-1-3a的一般程序
在0℃下将在DCM(120mL)中的化合物7-1-3(25.0g,18.0mmol,1.00eq)添加到十二烷-1-硫醇(4.75g,23.4mmol,5.63mL,1.30eq)中，然后在0℃下将TFA(16.4g,144mmol,10.7mL,8.00eq)添加到反应混合物中。在0℃下搅拌混合物1h。TLC(二氯甲烷:甲醇＝10:1，产物：Rf＝0.24)指示化合物7-1-3被完全消耗并形成一个新斑点。根据TLC，反应是干净的。
将反应混合物倒入NaHCO3溶液(10.0eq NaHCO3，于300mL DI水中)中，然后用DCM(100mL)稀释混合物，并分离两层，将有机层用NaHCO3(100mL)、盐水(100mL)洗涤，干燥，过滤并浓缩。
将混合物再溶解于CH3CN:H2O(2:1,70mL)中，并将CH3CN/H2O层用庚烷:MTBE＝4:1(100mL x 4)洗涤，然后用EtOAc(100mL)稀释CH3CN和H2O层，用盐水(100mL)洗涤有机层，干燥，过滤并浓缩。得到淡黄色泡沫状的化合物7-1-3a(17.0g，15.0mmol，83.3％产率，95.8％纯度)。
HPLC(方法A)：RT＝6.778min；LCMS(方法F)：RT＝1.322min；
m/z：化合物7-1-3a的[M+H]+＝1081.4。
合成化合物7-1-4
将化合物7-1-3a(17.0g,15.7mmol,1.00eq)和MOE C亚酰胺(15.9g,17.2mmol,1.10eq)与ACN(50mL x 3)在250mL单颈圆瓶中在Ar下共蒸发，并在单颈瓶中添加分子筛(4.00g)，在Ar压力下添加ACN(85mL)。在25℃下搅拌混合物1h，然后将DCI(2.78g,23.5mmol,1.50eq)添加到混合物中。在25℃下搅拌反应混合物1小时。HPLC(产物：RT＝7.932，8.001min；起始材料：RT＝5.111，5.169min)显示起始材料被完全消耗。
向上述溶液中添加BuOOH(4.05g,31.4mmol,4.31mL,70.0％纯度，2.00eq)。在25℃下搅拌混合物0.5h。HPLC(7-1-4，产物：RT＝7.746,7.832,7.916min；起始材料：RT＝7.932,8.001min)显示起始材料被完全消耗。
将反应混合物倒入NaHCO3和Na2SO3溶液(10.0eq NaHCO3和5.00eq Na2SO3，于400mLDI水中)中，然后用EtOAc(100mL)稀释混合物，并分离两层，将有机层用NaHCO3(200mL)、盐水(200mL)洗涤，干燥，过滤并浓缩。得到白色固体状的化合物7-1-4(33.4g，12.7mmol，81.3％产率，73.5％纯度)。
HPLC(方法A)：RT＝7.746、7.832、7.916min；LCMS(方法F)：
RT＝1.603min；m/z：化合物7-1-4的[M+H]+＝1917.7。
合成化合物7-1-4a
在0℃下向于ACN(120mL)中的化合物7-1-4(23.0g，11.9mmol，1.00eq)中添加十二烷-1-硫醇(3.15g，15.5mmol，3.73mL，1.30eq)，然后在0℃下将TFA(10.9g,95.8mmol,7.10mL,8.00eq)添加到反应混合物中。在0℃下搅拌混合物1h。TLC(二氯甲烷:甲醇＝7:1，产物：Rf＝0.40)指示化合物7-1-4被完全消耗并形成一个新斑点。根据TLC，反应是干净的。
将反应混合物倒入NaHCO3(10.0eq NaHCO3，于400mL DI水中)中，然后用EtOAc(200mL)稀释混合物，并分离两层，将有机层用NaHCO3水溶液(150mL)、盐水(150mL)洗涤，干燥，过滤并浓缩。将粗制品再溶解于DCM(50mL)中。将粗溶剂缓慢滴加到异丙醚(500mL)溶剂中。沉淀出所需产物。过滤后收集到淡黄色固体状的产物，并将固体滤饼用异丙醚(50mL x2)洗涤。得到淡黄色固体状的化合物7-1-4a(22.0g，11.1mmol，93.0％产率，81.9％纯度)。
HPLC纯化后得到白色泡沫状的化合物7-1-4a(13.0g，8.04mmol，86.9％产率，98.3％纯度)。HPLC(方法A)：RT＝6.127,6.193,6.277分钟，和LCMS(方法F)：RT＝1.431分钟；m/z：[M+H]+＝1615.5。
CCGU 4聚体的制备
将化合物7-1-4a(13.0g,8.04mmol,1.00eq)和MOE C亚酰胺(8.17g,8.84mmol,1.10eq)与ACN(30mL x 3)在Ar下在250mL单颈圆瓶中共蒸发，并将分子筛(3.50g)添加到单颈瓶中，在Ar压力下添加ACN(65mL)。在25℃下搅拌混合物1h，然后将DCI(1.42g,12.0mmol,1.50eq)添加到混合物中。在25℃下搅拌混合物1h。
HPLC(产物：RT＝8.547min；起始材料：RT＝6.127,6.193,6.277min)显示起始材料被完全消耗。
在25℃下向上述溶液中添加BuOOH(2.07g,16.0mmol,2.20mL,70.0％纯度,2.00eq)。在25℃下搅拌混合物0.5h。HPLC(7-5,产物：RT＝8.400min；起始材料：RT＝8.547min)显示起始材料被完全消耗。
将反应混合物倒入NaHCO3和Na2SO3溶液(10.0eq NaHCO3和5.00eq Na2SO3，于500mLDI水中)中，然后用EtOAc(300mL)稀释混合物，并分离两层，将有机层用NaHCO3(200mL)、盐水(200mL)洗涤，干燥，过滤并浓缩。将粗制品再溶解于DCM(50mL)中。将粗溶剂缓慢滴加到异丙醚(600mL)溶剂中。沉淀出所需产物。过滤后收集到淡黄色固体状的产物，并将固体滤饼用异丙醚(50mL x 2)洗涤。HPLC纯化后得到黄色固体状的化合物7-1-5(CCGU)(15.0g,5.94mmol,73.9％产率，97.3％纯度)。HPLC(方法B)：RT＝8.400min，LCMS(方法F)：RT＝1.665min；m/z:[M+2H]2+/2＝1226.4
DMTr-CCGU-OH的制备(7-1-6)
在0℃下向7-1-5(6.00g，2.44mmol，1.00eq)在ACN(35mL)和继之吡啶中的溶液中逐滴添加在THF(8mL)中的氢氟酸(698mg，24.4mmol，634uL，70.0％纯度，10.0eq)和咪唑(3.33g,48.8mmol,20.0eq)。在0℃下搅拌混合物3h。TLC(二氯甲烷:甲醇＝10:1，产物：Rf＝10:1)指示化合物7-1-5被完全消耗并形成两个新斑点。根据TLC，显示反应混乱。
将反应混合物溶解于EtOAc(20mL)中。将有机层用饱和NaHCO3水溶液(20mL x 2)、盐水(20mL)洗涤并用无水Na2SO4干燥，过滤并在真空下浓缩。将粗制品再溶解于DCM(5mL)中。将粗溶剂缓慢滴加到MTBE(50mL)的溶剂中。沉淀出所需产物。过滤后收集到白色固体状的产物，并将固体滤饼用异丙醚MTBE(50mL x 2)洗涤。得到白色固体状的化合物7-1-6(4.90g，2.07mmol，84.5％产率，93.5％纯度)。HPLC(方法B)：RT＝10.986、11.182、11.264分钟，LCMS(方法F)：RT＝1.502分钟；m/z：[M+2H]2+/2＝1107.4。
DMTr-CCGU-OH(7-1-6a)的制备
7-1-6a是使用与上述亚磷酰胺合成类似的程序由7-1-6合成的。HPLC-MS(方法G)：RT＝9.740、9.843、9.949分钟；m/z：化合物7-1-6a的[M-2H]2-/2＝1205.8。
HO-CCGU-OTBDPS(7-1-7)的制备
在0℃下向7-1-5(6.20g,2.52mmol,1.00eq)在ACN(30mL)中的溶液中添加十二烷-1-硫醇(766mg,3.79mmol,906uL,1.50eq)，然后在0℃下逐滴添加TFA(2.30g,20.1mmol,1.49mL,8.00eq)。在0℃下搅拌混合物1h。TLC(DCM:MeOH＝10:1，产物：Rf＝0.35)指示化合物7-1-5被完全消耗并形成两个新斑点。根据TLC，显示反应混乱。
将反应混合物倒入NaHCO3(100mL DI水中的10.0eq NaHCO3)中，然后用EtOAc 50mL稀释并用NaHCO3水溶液100mL萃取。将合并的有机层用盐水200mL(100mL x 2)洗涤，经Na2SO4干燥，过滤并在减压下浓缩，得到残余物。将粗制品再溶解于DCM(80mL)中。将粗溶剂缓慢滴加到MTBE(300mL)的溶剂中。沉淀出所需产物。过滤后收集到白色固体状的产物，并将固体滤饼用异丙醚MTBE(50mL x 2)洗涤。
用HPLC纯化得到白色固体状的化合物7-1-7(4.86g,2.18mmol,86.4％产率，96.6％纯度)。HPLC(方法B)：RT＝0.664,10.794,10.917min，LCMS(方法F)：RT＝1.431min；m/z：[M+2H]2+/2＝1075.9。
B.3’片段的制备
1.制备5'-OH-ACCCU-LHPG 5聚体(片段1)的一般程序
制备化合物7-2-1的一般程序
将化合物7-2-a与甲苯(60.0ml x 3)共蒸发。向化合物7-2-a(10.0g,16.1mmol,1.00eq)在DCM(100mL)中的溶液中添加N,N-二乙基乙胺(8.18g,80.8mmol,11.2mL,5.00eq)和四氢呋喃-2,5-二酮(3.24g,32.3mmol,2.00eq)。在25℃下搅拌混合物4小时。HPLC指示化合物7-2-a被完全消耗。将反应混合物用TEAB(0.5M,300ml)洗涤，经无水Na2SO4干燥，过滤并在减压下浓缩，得到残余物。得到棕色固体状的化合物7-2-1(11.0g,15.3mmol,94.6％产率)。
HPLC(方法A)：RT＝2.405min
制备化合物7-2-2的一般程序
向化合物7-2-1a(10.1g,10.2mmol,1.00eq)在DCM(300mL)中的溶液中添加化合物7-2-2(11.0g,14.5mmol,1.43eq,HCl)、HBTU(13.1g,34.6mmol,3.40eq)、HOBt(4.69g,34.6mmol,3.40eq)和DIEA(4.48g,34.6mmol,6.04mL,3.40eq)。在25℃下搅拌混合物0.5小时。TLC(起始材料，Rf＝0.38，产物，Rf＝0.42)指示化合物7-2-1a被完全消耗。在减压下浓缩反应混合物以去除溶剂。将粗产物与ACN(700ml)一起在25℃下研磨15分钟。然后过滤并用ACN(100ml x 2)洗涤。获得棕色固体状的化合物7-2-2(16.0g，9.43mmol，92.4％产率)。
制备化合物7-2-3的一般程序
向化合物7-2-2(16.0g,9.43mmol,1.00eq)在DCM(160mL)中的溶液中添加十二烷-1-硫醇(5.73g,28.3mmol,6.78mL,3.00eq)和TFA(10.7g,94.3mmol,6.98mL,10.0eq)。在0℃下搅拌混合物1小时。TLC(DCM:MeOH＝10:1，起始材料，Rf＝0.50，产物，Rf＝0.43)指示化合物7-2-2被完全消耗。将反应混合物用饱和NaHCO3水溶液洗涤直到pH>7，用二氯甲烷(300mL)萃取，用盐水(200ml)洗涤，经无水Na2SO4干燥，过滤并在减压下浓缩，得到残余物。将粗产物与ACN(800ml)一起在25℃下研磨30分钟。然后过滤并用ACN(100ml x 2)洗涤。得到白色固体状的化合物7-2-3(11.7g,8.39mmol,88.9％产率)。
制备化合物7-2-4的一般程序
将化合物7-2-3和MOE C亚酰胺与(ACN 60.0ml x 3)和(DCM 20.0ml x 3)共蒸发。向化合物7-2-3(11.7g,8.39mmol,1.00eq)和MOE C亚酰胺(15.4g,16.7mmol,2.00eq)的溶液中添加DCM(120mL)和ACN(20mL)，然后添加3A MS，将混合物搅拌1小时，然后在混合物中添加DCI(2.98g,20.98mmol,2.50eq)，将混合物搅拌0.5小时，然后在混合物中添加2-氢过氧-2-甲基-丙烷(3.24g,25.1mmol,5.04mL,5M,3.00eq)，将混合物在25℃下搅拌0.5小时。TLC(DCM:MeOH＝20:1，起始材料，Rf＝0.43，产物，Rf＝0.48)指示化合物7-2-3被完全消耗。将反应混合物用NaHCO3水溶液和Na2SO3水溶液(200ml)洗涤，用盐水(200ml)洗涤，过滤并在减压下浓缩，得到残余物。将粗产物与ACN(350ml)一起在25℃下研磨30分钟。然后过滤并用ACN(100ml x 2)洗涤。得到白色固体状的化合物7-2-4(17.1g,7.33mmol,87.2％产率)。
制备化合物7-2-5的一般程序
向化合物7-2-4(17.1g,7.33mmol,1.00eq)在DCM(170mL)中的溶液中添加十二烷-1-硫醇(4.45g,21.9mmol,5.26mL,3.00eq)和TFA(8.35g,73.2mmol,5.42mL,10.0eq)。在0℃下搅拌混合物1小时。TLC(DCM:MeOH＝10:1，起始材料，Rf＝0.43，产物，Rf＝0.48)指示化合物7-2-4被完全消耗。将反应混合物用饱和NaHCO3水溶液洗涤，直到pH>7，用二氯甲烷(300mL)萃取，用盐水(200ml)洗涤，经Na2SO4干燥，过滤并在减压下浓缩，得到残余物。将粗产物与ACN一起在0℃下研磨30分钟。然后过滤并用ACN(100ml x 2)洗涤。得到白色固体状的化合物7-2-5(13.7g,6.74mmol,92.0％产率)。
制备化合物7-2-6的一般程序
将化合物5和MOE C亚酰胺与(ACN 80.0ml x 3)和(DCM 30.0ml x 3)共蒸发。向化合物7-2-5(13.7g,6.74mmol,1.00eq)和MOE C亚酰胺(12.4g,13.4mmol,2.00eq)中添加DCM(80.0mL)和ACN(20.0mL)，然后添加分子筛，搅拌混合物1h，然后在混合物中添加DCI(2.39g,16.8mmol,2.50eq)，搅拌混合物0.5h，然后在混合物中添加2-氢过氧-2-甲基-丙烷(5M,4.05mL,3.00eq)，在25℃下搅拌混合物0.5h。TLC(DCM:MeOH＝15:1，起始材料，Rf＝0.43，产物，Rf＝0.50)指示化合物7-2-5被完全消耗。过滤反应混合物。将滤液与ACN一起在25℃下研磨30min。然后过滤并用ACN(100ml x 2)洗涤。得到白色固体状的化合物7-2-6(17.0g,6.15mmol,91.1％产率)。
制备化合物7-2-7的一般程序
向化合物7-2-6(17.0g,6.15mmol,1.00eq)在DCM(190mL)中的溶液中添加十二烷-1-硫醇(3.73g,18.4mmol,4.42mL,3.00eq)和TFA(7.01g,61.4mmol,4.55mL,10.0eq)。在0℃下搅拌混合物1小时。TLC(DCM:MeOH＝10:1，起始材料，Rf＝0.43，产物，Rf＝0.38)指示化合物7-2-6被完全消耗。将反应混合物用饱和NaHCO3水溶液洗涤，直到pH>7，用二氯甲烷(300mL)萃取，用盐水(200ml)洗涤，经无水Na2SO4干燥，过滤并在减压下浓缩，得到残余物。将粗产物与ACN一起在0℃下研磨30分钟。然后过滤并用ACN(100ml x 2)洗涤。得到白色固体状的化合物7-2-7(14.7g,5.97mmol,97.0％产率)。
制备化合物7-2-8的一般程序
将化合物7-2-7和MOE C亚酰胺与(ACN 60.0ml x 3)和(DCM 20.0ml x 3)共蒸发。向化合物7-2-7(13.0g,5.31mmol,1.00eq)和MOE C亚酰胺(9.80g,10.6mmol,2.00eq)的溶液中添加DCM(60.0mL)和ACN(20.0mL)，然后添加分子筛(MS)，搅拌混合物1h，然后在混合物中添加DCI(1.89g,13.2mmol,2.50eq)，搅拌混合物0.5h，然后在混合物中添加2-氢过氧-2-甲基-丙烷(5M,3.19mL,3.00eq)，在25℃下搅拌混合物0.5h。TLC(DCM:MeOH＝15:1，起始材料，Rf＝0.43，产物，Rf＝0.48)指示化合物7-2-7被完全消耗。过滤反应混合物。将滤液与ACN(800ml)一起在25℃下研磨30分钟。然后过滤并用ACN(100ml x 2)洗涤。得到白色固体状的化合物7-2-8(14.4g,4.36mmol,82.1％产率)。
制备化合物7-2-9的一般程序
向化合物7-2-8(14.47g,4.39mmol,1.00eq)在DCM(70.0mL)中的溶液中添加十二烷-1-硫醇(2.66g,13.1mmol,3.15mL,3.00eq)和TFA(5.00g,43.8mmol,3.25mL,10.0eq)。在0℃下搅拌混合物1小时。TLC(DCM:MeOH＝10:1，起始材料，Rf＝0.43，产物，Rf＝0.38)指示化合物7-2-8被完全消耗。将反应混合物用饱和NaHCO3水溶液洗涤直到pH>7，用二氯甲烷(300mL)萃取，用盐水(200ml)洗涤，经无水Na2SO4干燥，过滤并在减压下浓缩，得到残余物。将粗产物与ACN(800ml)一起在25℃下研磨30分钟。然后过滤并用ACN(100ml x 2)洗涤。得到白色固体状的化合物7-2-9(11.6g,3.88mmol,88.5％产率)。
制备化合物7-2-10的一般程序
将化合物7-2-9和MOE A亚酰胺与(ACN 60ml x 3)和(DCM 20ml x 3)共蒸发。向化合物7-2-9(11.6g,3.87mmol,1.00eq)和MOE A亚酰胺(7.21g,7.74mmol,2.00eq)的溶液中添加DCM(60.0mL)和ACN(20.0mL)，然后添加搅拌混合物1h，然后在混合物中添加DCI(1.37g,9.67mmol,2.50eq)，搅拌混合物0.5h，然后在混合物中添加2-氢过氧-2-甲基-丙烷(5M,2.32mL,3.00eq)，在25℃下搅拌混合物0.5h。TLC(DCM:MeOH＝15:1，起始材料，Rf＝0.43，产物，Rf＝0.47)指示化合物7-2-9被完全消耗。过滤反应混合物。将滤液与ACN(800ml)一起在25℃下研磨30分钟。然后过滤并用ACN(100ml x 2)洗涤。得到白色固体状的化合物7-2-10(14.0g,3.64mmol,94.1％产率)。
制备片段1的一般程序
向化合物7-2-10(14.0g,3.64mmol,1.00eq)在DCM(70.0mL)中的溶液中添加十二烷-1-硫醇(2.21g,10.9mmol,2.62mL,3.00eq)。在0℃下搅拌混合物1h。TLC(DCM:MeOH＝15:1，起始材料，Rf＝0.43，产物，Rf＝0.39)指示化合物7-2-10被完全消耗。将反应混合物用饱和NaHCO3水溶液洗涤直到pH>7，用二氯甲烷(300mL)萃取，用盐水(200mL)洗涤，经无水Na2SO4干燥，过滤并在减压下浓缩，得到残余物。将粗产物与ACN(800ml)一起在25℃下研磨30分钟。然后过滤并用ACN(100ml x 2)洗涤。得到白色固体状的化合物7-2-10(片段1)(10.0g，2.82mmol，77.5％产率)。在使用氨解将LHPG基团脱保护后，通过HPLC和质谱法表征7-2-10(片段1)。HPLC(方法C)：RT＝2.11min和LCMS(方法D)：RT＝0.219min；m/z：[M-2H]2-/2＝916.6。
2.制备5'-脱氧-TTACC 5聚体或5'-DMTr-TTACC-OH或5'-OH-TTACC-TBDPS 5聚体(片段2)的一般程序
制备化合物7-3-2的一般程序
向化合物7-3-1(40.0g,61.7mmol,1.00eq)在DCM(200mL)中的溶液中添加咪唑(21.0g,308mmol,5.00eq)。混合物为淡黄色均质溶液。添加TBDPSCl(22.0g,80.2mmol,20.6mL,1.30eq)。在25℃下搅拌混合物16h。TLC(石油醚:乙酸乙酯＝2:1，产物：Rf＝0.46)指示化合物7-3-1被完全消耗并形成一个新斑点。根据TLC，反应是干净的。
添加丙-2-醇(4.73mL,1.00eq)并将混合物搅拌0.5小时。将上述混合物在冰水浴中冷却至0℃。添加十二烷-1-硫醇(16.2g,80.2mmol,19.2mL,1.30eq)并在0℃下搅拌混合物15min。在0℃下逐滴添加TFA(56.3g,494mmol,36.5mL,8.00eq)。在0℃下搅拌混合物1h。TLC(石油醚:乙酸乙酯＝2:1，Rf＝0.24)指示起始材料被完全消耗并形成一个新斑点。根据TLC，反应是干净的。将反应混合物倒入NaHCO3(10.0eq NaHCO3，在500mL DI水中)中，然后用DCM 100mL稀释并用NaHCO3水溶液200mL萃取。将合并的有机层用盐水200mL(100mL x 2)洗涤，经Na2SO4干燥，过滤并在减压下浓缩，得到残余物。
将粗产物溶解于100mL DCM中，从漏斗向庚烷/TBME(v/v 9:1,1200mL)的溶剂混合物中缓慢滴加粗产物溶液以进行沉淀过程。此过程大约需要30分钟。用布氏漏斗收集到呈白色固体状的纯产物，用庚烷(100mL x 2)的溶剂混合物洗涤产物滤饼并浓缩至干燥。
得到白色固体状的化合物7-3-2(34.8g，56.1mmol，91.0％产率，94.2％纯度)。
HPLC(方法A)：RT＝7.136min，和LCMS(方法F)：RT＝1.570min；m/z：[M+H]+＝584.2。
制备化合物7-3-3的一般程序
在Ar下，将化合物7-3-2(13.0g,22.2mmol,1.00eq)和dC亚酰胺(20.7g,24.5mmol,1.10eq)在250mL单颈圆瓶中与ACN(100mL x3)共蒸发，并向单颈瓶中添加分子筛(3.00g)，在Ar压力下添加ACN/DCM＝1:1(100mL)。在25℃下搅拌混合物1h，然后将DCI(3.94g,33.4mmol,1.50eq)添加到混合物中。在25℃下搅拌混合物1h。HPLC(产物：RT＝6.207min；起始材料：RT＝7.136min)显示起始材料被完全消耗。
偶联反应完成后，在25℃下向上述溶液中添加BuOOH(5.73g,44.5mmol,6.10mL,70.0％纯度,2.00eq)。在25℃下搅拌混合物1h。HPLC(7-3-3，产物：RT＝9.028min；起始材料：RT＝6.027min)显示起始材料被完全消耗。将反应混合物倒入NaHCO3和Na2SO3溶液(10.0eq NaHCO3和5.00eq Na2SO3，于400mL DI水中)中，然后用EtOAc(200mL)稀释混合物，并分离两层，将有机层用NaHCO3(200mL)、盐水(100mL)洗涤，干燥，过滤并浓缩。
得到白色泡沫状的化合物7-3-3(33.0g,22.0mmol,98.7％产率,89.7％纯度)。HPLC(方法A)：RT＝5.518min，和LCMS(方法D)：RT＝1.787min；m/z：[M-H]-＝1344.6。
制备化合物7-3-4的一般程序
在0℃下，向在ACN(120mL)中的化合物7-3-3(24.0g,17.8mmol,1.00eq)中添加十二烷-1-硫醇(4.69g,23.1mmol,5.55mL,1.30eq)，然后在0℃下逐滴添加TFA(16.2g,142mmol,10.5mL,8.00eq)。在0℃下搅拌混合物1h。TLC(二氯甲烷:甲醇＝10:1，产物：Rf＝0.55)指示化合物7-3-3被完全消耗并形成两个新斑点。根据TLC，显示反应混乱。将反应混合物倒入NaHCO3(10.0eq NaHCO3，于300mL DI水中)中，然后用EtOAc 100mL稀释并用NaHCO3水溶液100mL萃取。将合并的有机层用盐水200mL(100mL x 2)洗涤，经Na2SO4干燥，过滤并在减压下浓缩，得到残余物。
将混合物再溶解于CH3CN:H2O(2:1,100mL)中，并将CH3CN/H2O层用庚烷:tBuOMe＝4:1(200mL x 4)洗涤，然后用EtOAc/MTBE(1/3,120mL)稀释CH3CN和H2O层。将有机层用DI水(100mL)洗涤，将有机层用盐水(100mL)洗涤，经Na2SO4干燥，过滤并在减压下浓缩，得到残余物。得到白色固体状的化合物7-3-4(16.4g，14.3mmol，80.4％产率，91.2％纯度)。将粗产物通过反相HPLC(pH＝7条件)纯化。获得白色泡沫状的化合物7-3-4(14.7g，13.4mmol，87.4％产率，95.2％纯度)。HPLC(方法A)：RT＝7.344min，和LCMS(方法E)：RT＝1.451min；m/z：[M+H]+＝1044.7。
制备化合物7-3-5的一般程序
在Ar下将化合物7-3-4(14.7g,14.0mmol,1.00eq)和dA亚酰胺(13.2g,15.4mmol,1.10eq)与ACN(100mL x 3)在250mL单颈圆瓶中共蒸发，并向单颈瓶中添加分子筛(4.00g)，在Ar压力下添加ACN(75mL)。在25℃下搅拌混合物1h，然后将DCI(2.49g,21.1mmol,1.50eq)添加到混合物中。在25℃下搅拌混合物1h。HPLC(产物：RT＝7.344min；起始材料：RT＝8.501min)显示起始材料被完全消耗。
偶联反应完成后，在25℃下向上述溶液中添加BuOOH(3.62g,28.1mmol,3.86mL,70.0％纯度，2.00eq)。在25℃下搅拌混合物0.5h。HPLC(7-3-5，产物：RT＝8.232min；起始材料：RT＝8.501min)显示起始材料被完全消耗。将反应混合物倒入NaHCO3和Na2SO3溶液(10.0eq NaHCO3和5.00eq Na2SO3，于500mL DI水中)中，然后用EtOAc(200mL)稀释混合物，并分离两层，将有机层用NaHCO3(200mL)、盐水(100mL)洗涤，干燥，过滤并浓缩。
将粗制品再溶解于DCM(80mL)中。将粗溶剂缓慢滴加到MTBE(1000mL)的溶剂中。沉淀出所需产物。过滤后收集到白色固体状的产物，并将固体滤饼用异丙醚MTBE(50mL x 2)洗涤。得到白色固体状的化合物7-3-5(30.0g，13.4mmol，95.7％产率，81.6％纯度)。通过反相HPLC(pH＝7条件)纯化粗产物。得到白色固体状的化合物7-3-5(24.0g，13.0mmol，96.9％产率，98.8％纯度)。
HPLC(方法A)：RT＝8.233min；LCMS(方法D)：RT＝1.622min；
m/z：[M-2H]2-/2＝906.8。
制备化合物7-3-6的一般程序
在0℃下向化合物7-3-5(18.3g，10.0mmol，1.00eq)在ACN(90mL)中的溶液中添加十二烷-1-硫醇(2.65g，13.0mmol，3.14mL，1.30eq)，然后在0℃下逐滴添加TFA(9.19g,80.5mmol,5.97mL,8.00eq)。在0℃下搅拌混合物1h。TLC(DCM:MeOH＝10:1，产物：Rf＝0.43)指示化合物7-3-5被完全消耗并形成两个新斑点。根据TLC，显示反应混乱。
将反应混合物倒入NaHCO3(10.0eq NaHCO3，于300mL DI水中)中，然后用EtOAc100mL稀释并用NaHCO3水溶液100mL萃取。将合并的有机层用盐水200mL(100mL x 2)洗涤，经Na2SO4干燥，过滤并在减压下浓缩，得到残余物。将粗制品再溶解于DCM(80mL)中。将粗溶剂缓慢滴加到MTBE(1000mL)的溶剂中。沉淀出所需产物。过滤后收集到白色固体状的产物，并将固体滤饼用异丙醚庚烷(50mL x 2)洗涤。得到白色固体状的化合物7-3-6(14.3g，9.34mmol，92.7％产率，98.8％纯度)。
HPLC(方法A)：RT＝7.008min；LCMS(方法E)：RT＝1.444min；
m/z：[M+H]+＝1514.8。
制备化合物7-3-7的一般程序
在Ar下将化合物7-3-6(14.3g,9.44mmol,1.00eq)和dT亚酰胺(7.73g,10.3mmol,1.10eq)与ACN(50mL x 3)在250mL单颈圆瓶中共蒸发，并向单颈瓶中添加分子筛(4.00g)，在Ar压力下添加ACN(75mL)。在25℃下搅拌混合物1h，然后将DCI(1.67g,14.1mmol,1.50eq)添加到混合物中。在25℃下搅拌混合物1h。HPLC(产物：RT＝8.061min；起始材料：RT＝7.008min)显示起始材料被完全消耗。
偶联反应完成后，在25℃下向上述溶液中添加BuOOH(2.43g,18.8mmol,2.59mL,70.0％纯度，2.00eq)。在25℃下搅拌混合物1h。HPLC(7-3-7，产物：RT＝7.856min；起始材料：RT＝8.061min)显示起始材料被完全消耗。将反应混合物倒入NaHCO3和Na2SO3溶液(10.0eq NaHCO3和5.00eq Na2SO3，于400mL DI水中)中，然后用EtOAc(200mL)稀释混合物，并分离两层，将有机层用NaHCO3(200mL)、盐水(100mL)洗涤，干燥，过滤并浓缩。
得到白色固体状的化合物7-3-7(21.9g，8.78mmol，93.0％产率，87.1％纯度)。将粗产物通过反相HPLC(pH＝7条件)纯化。获得白色泡沫状的化合物7-3-7(19.0g,8.57mmol,97.6％产率,98.0％纯度)。
HPLC(方法A)：RT＝7.848min；LCMS(方法D)：RT＝1.569min；
m/z：[M-2H]2-/2＝1085.5。
制备化合物7-3-8的一般程序
在0℃下向化合物7-3-7(14.0g，6.44mmol，1.00eq)在ACN(70mL)中的溶液中添加十二烷-1-硫醇(1.69g，8.37mmol，2.01mL，1.30eq)，然后在0℃下逐滴添加TFA(5.87g,51.5mmol,3.81mL,8.00eq)。在0℃下搅拌混合物1h。TLC(甲醇:二氯甲烷＝10:1，产物：Rf＝0.41)指示化合物7-3-7被完全消耗并形成两个新斑点。根据TLC，显示反应混乱。将反应混合物倒入NaHCO3(10.0eq NaHCO3，于300mL去离子(DI)水中)中，然后用EtOAc 100mL稀释并用NaHCO3水溶液100mL萃取。将合并的有机层用盐水200mL(100mL x 2)洗涤，经Na2SO4干燥，过滤并在减压下浓缩，得到残余物。
将粗制品再溶解于DCM(80mL)中。将粗溶剂缓慢滴加到MTBE(1000mL)的溶剂中。沉淀出所需产物。过滤后收集到白色固体状的产物，并将固体滤饼用异丙醚MTBE(50mL x 2)洗涤。得到白色固体状的化合物7-3-8(11.5g，6.00mmol，93.1％产率，97.6％纯度)。
HPLC(方法A)：RT＝6.705min。
制备脱氧-TTACC 5聚体7-3-9的一般程序
在Ar下将化合物7-3-8(11.5g,6.14mmol,1.00eq)和dT亚酰胺(5.03g,6.76mmol,1.10eq)与ACN(50mL x 3)在250mL单颈圆瓶中共蒸发，并向单颈瓶中添加分子筛(4.00g)，在Ar压力下添加ACN(75mL)。在25℃下搅拌混合物1h，然后将DCI(1.67g,14.1mmol,1.50eq)添加到混合物中。在25℃下搅拌混合物1h。HPLC(产物：RT＝7.730min；起始材料：RT＝6.705min)显示起始材料被完全消耗。
偶联反应完成后，向上述溶液中添加BuOOH(1.58g,12.2mmol,1.68mL,70.0％纯度，2.00eq)。在25℃下搅拌混合物1h。HPLC(产物：RT＝7.517min；起始材料：RT＝7.730min)显示起始材料被完全消耗。将反应混合物倒入NaHCO3和Na2SO3溶液(10.0eq NaHCO3和5.00eq Na2SO3，于500mL DI水中)中，然后用EtOAc(200mL)稀释混合物，并分离两层，将有机层用NaHCO3(200mL)、盐水(100mL)洗涤，干燥，过滤并浓缩。
将粗制品再溶解于DCM(80mL)中。将粗溶剂缓慢滴加到MTBE(800mL)的溶剂中。沉淀出所需产物。过滤后收集到白色固体状的产物，并将固体滤饼用异丙醚MTBE(50mL x 2)洗涤。LCMS：产物：RT＝1.443min。
将粗产物通过反相HPLC(pH＝7条件)纯化。
获得淡黄色固体状的7-3-9(脱氧-TTACC 5聚体)(14.3g,5.47mmol,89.3％产率,96.8％纯度)。
HPLC(方法B)：RT＝11.993,12.120,12.240min；LCMS(方法D)：
RT＝1.443min；m/z：[M-2H]2-/2＝1263.7。
制备DMTr-TTACC-OH7-3-10的一般程序
在0℃下向化合物7-3-9(7.20g,2.84mmol,1.00eq)在ACN(35mL)和继之吡啶中的溶液中逐滴添加在THF(12mL)中的氢氟酸(813mg,28.4mmol,739uL,70.0％纯度,10.0eq)和咪唑(3.87g,56.8mmol,20.0eq)。在0℃下搅拌混合物3h。TLC(二氯甲烷:甲醇＝10:1，纯度：Rf＝0.30)指示化合物7-3-9被完全消耗并形成两个新斑点。根据TLC，显示反应混乱。
将反应混合物溶解于EtOAc(50mL)中。将有机层用饱和NaHCO3(100mL x 2)、盐水(100mL)洗涤并用无水Na2SO4干燥，过滤并在真空下浓缩。
将粗制品再溶解于DCM(5mL)中。将粗溶剂缓慢滴加到MTBE(300mL)的溶剂中。沉淀出所需产物。过滤后收集到白色固体状的产物，并将固体滤饼用异丙醚MTBE(50mL x 2)洗涤。
获得白色固体状的化合物7-3-10DMTr-TTACC-OH(6.00g,2.33mmol,82.0％产率，89.1％纯度)。
HPLC(方法B)：RT＝6.449,6.591min；LCMS(方法F)：RT＝1.312min；m/z：[M+2H]2+/2＝1147.4。
化合物7-3-10a的制备
使用与上述亚磷酰胺合成类似的程序，由7-3-10合成化合物7-3-10a。HPLC-MS(方法G)：RT＝8.174,8.251,8.420,8.494min；m/z：化合物7-3-10a的[M-2H]2-/2＝1245.4。
HO-TTACC-OTBDPS 7-3-11的制备
在0℃下向化合物7-3-9(6.60g，2.61mmol，1.00eq)在ACN(35mL)中的溶液中添加十二烷-1-硫醇(791mg，3.91mmol，936uL，1.50eq)，然后在0℃下逐滴添加TFA(2.38g,20.8mmol,1.54mL,8.00eq)。在0℃下搅拌混合物1h。TLC(DCM:MeOH＝10:1，产物：Rf＝0.35)指示化合物7-3-9被完全消耗并形成两个新斑点。根据TLC，显示反应混乱。将反应混合物倒入NaHCO3(10.0eq NaHCO3，于100mL DI水中)中，然后用EtOAc 50mL稀释并用NaHCO3水溶液100mL萃取。将合并的有机层用盐水200mL(100mL x 2)洗涤，经Na2SO4干燥，过滤并在减压下浓缩，得到残余物。
将粗制品再溶解于DCM(80mL)中。将粗溶剂缓慢滴加到MTBE(300mL)的溶剂中。沉淀出所需产物。过滤后收集到白色固体状的产物，并将固体滤饼用异丙醚MTBE(50mL x 2)洗涤。得到白色固体状的化合物7-3-11(HO-TTACC-OTBDPS)(5.35g,2.37mmol,90.7％产率，98.6％纯度)。
HPLC(方法B)：RT＝9.508,9.650min；LCMS(方法D)：RT＝1.444min；m/z：[M-2H]2-/2＝1113.3。
3.制备5'-UTTC 4聚体或5'-DMTr-UTTC-OH或5'-OH-UTTC-TBDPS 4聚体(片段3)的一般程序
制备化合物7-4-2的一般程序
向化合物7-4-1(40.0g,61.7mmol,1.00eq)于DCM(200mL)中的溶液中添加咪唑(21.0g,308mmol,5.00eq)。混合物为淡黄色均质溶液。添加TBDPSCl(22.0g,80.2mmol,20.6mL,1.30eq)。在25℃下搅拌混合物16h。TLC(石油醚:乙酸乙酯＝2:1，产物：Rf＝0.46)指示化合物7-4-1被完全消耗并形成一个新斑点。根据TLC，反应是干净的。
添加丙-2-醇(4.73mL,1.00eq)并将混合物搅拌0.5小时。将上述混合物在冰水浴中冷却至0℃。添加十二烷-1-硫醇(16.2g,80.2mmol,19.2mL,1.30eq)并在0℃下搅拌混合物15min。在0℃下逐滴添加TFA(56.3g,494mmol,36.5mL,8.00eq)。在0℃下搅拌混合物1h。TLC(石油醚:乙酸乙酯＝2:1,Rf＝0.24)指示起始混合物被完全消耗并形成一个新斑点。根据TLC，反应是干净的。将反应混合物倒入NaHCO3(10.0eq NaHCO3，于500mL DI水中)中，然后用DCM 100mL稀释并用NaHCO3水溶液200mL萃取。将合并的有机层用盐水200mL(100mL x 2)洗涤，经Na2SO4干燥，过滤并在减压下浓缩，得到残余物。
将粗产物溶解于100mL DCM中，从漏斗向庚烷/TBME(v/v 9:1,1200mL)的溶剂混合物中缓慢滴加粗产物溶液以进行沉淀过程。此过程大约需要0.5小时。用布氏漏斗收集到呈白色固体状的纯产物，用庚烷(100mL x 2)的溶剂混合物洗涤产物滤饼并浓缩至干燥。得到白色固体状的化合物7-4-2(34.8g，56.1mmol，91.0％产率，94.2％纯度)。
HPLC(方法A)：RT＝7.136min，和LCMS(方法F)：RT＝1.570min；m/z:[M+H]+＝584.2
制备化合物7-4-3的一般程序
在Ar下将化合物7-4-2(15.0g,25.7mmol,1.00eq)和dT亚酰胺(21.0g,28.2mmol,1.10eq)与ACN/DCM(1/1,100mL x 3)在250mL单颈圆瓶中共蒸发，并向单颈瓶中添加分子筛(6.50g)，在Ar压力下添加ACN(60mL)和DCM(60mL)。在25℃下搅拌混合物1h，然后将DCI(4.55g,38.5mmol,1.50eq)添加到混合物中。在25℃下搅拌混合物1h。HPLC(产物：RT＝8.233min)指示化合物7-4-2被完全消耗。
偶联反应完成后，在25℃下向上述溶液中添加BuOOH(6.62g,51.3mmol,7.04mL,70.0％纯度，2.00eq)。在25℃下搅拌混合物0.5h。HPLC(产物：RT＝7.764,7.826min)指示反应完成。将反应混合物倒入NaHCO3和Na2SO3溶液(10.0eq NaHCO3和5.00eq Na2SO3，于400mLDI水中)中，然后用DCM(200mL)稀释混合物，并分离两层，将有机层用NaHCO3(200mL)、盐水(100mL)洗涤，干燥，过滤并浓缩。
得到白色固体状的化合物7-4-3(36.0g，24.9mmol，97.1％产率，86.2％纯度)。HPLC：产物：RT＝7.764,7.826min；LCMS：化合物7-4-3，RT＝1.602min。将粗化合物3用于下一步。
将化合物7-4-3(10.0g,6.93mmol,86.2％纯度)通过反相MPLC(pH＝7条件MeCN/水)纯化。得到白色泡沫状的化合物7-4-3(8.00g，6.19mmol，89.2％收率，96.1％纯度)。HPLC(方法A)：RT＝7.792,7.845min，LCMS(方法F)：RT＝1.602min；m/z：[M+H]+＝1243.4。
制备化合物7-4-4的一般程序
向化合物7-4-3(26.0g,20.9mmol,1.00eq)在ACN(120mL)中的溶液中添加冷却至0℃的十二烷-1-硫醇(5.50g,27.18mmol,6.51mL,1.30eq)，然后在0℃下逐滴添加TFA(19.0g,167mmol,12.3mL,8.00eq)。在0℃下搅拌混合物1h。TLC(二氯甲烷:甲醇＝10:1，产物：Rf＝0.46)指示化合物7-4-3被完全消耗并形成一个新斑点。根据TLC，反应是干净的。将反应混合物倒入NaHCO3溶液(10.0eq NaHCO3，在400mL DI水中)中，然后用EtOAc(300mL)稀释混合物，并分离两层，将有机层用NaHCO3(200mL)、盐水(200mL)洗涤，经Na2SO4干燥，过滤并在减压下浓缩，得到残余物。
将混合物再溶解于CH3CN:H2O(2:1,100mL)中，并将CH3CN/H2O层通过庚烷:tBuOMe＝4:1(200mL x 4)洗涤，然后用EtOAc/MTBE(1/3,120mL)稀释CH3CN和H2O层。将有机层用DI水(100mL)洗涤，将有机层用盐水(100mL)洗涤，经Na2SO4干燥，过滤并在减压下浓缩，得到残余物。
得到白色泡沫状的化合物7-4-4(17.0g,16.7mmol,80.0％产率,92.6％纯度)。
HPLC(方法A)：RT＝5.977min，和LCMS(方法E)：RT＝1.241min；m/z：[M+H]+＝941.5。
制备化合物7-4-5的一般程序
在Ar下将化合物7-4-4(17.0g,18.0mmol,1.00eq)和dT亚酰胺(14.8g,19.8mmol,1.10eq)与ACN(100mL x 3)在250mL单颈圆瓶中共蒸发，并向单颈瓶中添加分子筛(4.50g)，在Ar压力下添加ACN(85mL)。在25℃下搅拌混合物1h，然后将DCI(3.20g,27.1mmol,1.50eq)添加到混合物中。在25℃下搅拌混合物1h。HPLC(产物：RT＝7.451min；起始材料：RT＝5.977min)显示起始材料被完全消耗。
偶联反应完成后，向上述溶液中添加BuOOH(4.65g,36.1mmol,4.95mL,70.0％纯度，2.00eq)。在25℃下搅拌混合物0.5h。HPLC(产物：RT＝7.810min；起始材料：RT＝7.451min)显示起始材料被完全消耗。将反应混合物倒入NaHCO3和Na2SO3溶液(10.0eqNaHCO3和5.00eq Na2SO3，于400mL DI水中)中，然后用EtOAc(200mL)稀释混合物，并分离两层，将有机层用NaHCO3(200mL)、盐水(100mL)洗涤，干燥，过滤并浓缩。得到白色泡沫状的化合物7-4-5(34.0g,17.2mmol,95.2％产率,81.0％纯度)。
将化合物7-4-5(24.0g,15.0mmol,81.0％纯度)通过反相HPLC(pH＝7条件；MeCN/水)纯化。得到白色泡沫状的化合物7-4-5(17.8g,11.1mmol,89.7％产率,98.2％纯度)。
HPLC(方法A)：RT＝7.179min，和LCMS(方法D)：RT＝1.530min；m/z：[M-H]-＝1599.6。
制备化合物7-4-6的一般程序
在0℃下向化合物7-4-5(12.6g，7.87mmol，1.00eq)在ACN(65mL)中的溶液中添加十二烷-1-硫醇(2.07g,10.2mmol,2.45mL,1.30eq)，然后在0℃下逐滴添加TFA(7.18g,62.9mmol,4.66mL,8.00eq)。在0℃下搅拌混合物1h。TLC(二氯甲烷:甲醇＝10:1，产物：Rf＝0.36)指示化合物7-4-5被完全消耗并形成一个新斑点。根据TLC，反应是干净的。将反应混合物倒入NaHCO3(10.0eq NaHCO3，于200mL DI水中)中，然后用EtOAc 100mL稀释并用NaHCO3水溶液100mL萃取。将合并的有机层用盐水200mL(100mL x 2)洗涤，经Na2SO4干燥，过滤并在减压下浓缩，得到残余物。
将粗产物溶解于100mL DCM中，从漏斗向庚烷/TBME(v/v 9:1,500mL)的溶剂混合物中缓慢滴加粗产物溶液以进行沉淀过程。此过程大约需要0.5小时。用布氏漏斗收集到呈白色固体状的纯产物，用庚烷(100mL x 2)的溶剂混合物洗涤产物滤饼并浓缩至干燥。
得到白色固体状的化合物7-4-6(11.0g，7.75mmol，98.4％产率，91.4％纯度)。
HPLC(方法A)：RT＝5.661min，和LCMS(方法F)：RT＝1.365min；m/z：[M+H]+＝1298.4。
制备UTTC 4聚体7-4-7的一般程序
在Ar下将化合物7-4-6(11.0g,8.47mmol,1.00eq)和MOE T亚酰胺(7.63g,9.32mmol,1.10eq)与ACN(100mL x 3)在250mL单颈圆瓶中共蒸发，并向单颈瓶中添加分子筛(3.00g)，在Ar压力下添加ACN(55mL)。在25℃下搅拌混合物1h，然后将DCI(1.50g,12.7mmol,1.50eq)添加到混合物中。在25℃下搅拌混合物1h。HPLC(产物：RT＝7.056,7.180min；起始材料：RT＝5.661min)显示起始材料被完全消耗。
偶联反应完成后，向上述溶液中添加BuOOH(2.18g,16.9mmol,2.32mL,70.0％纯度，2.00eq)。在25℃下搅拌混合物0.5h。HPLC(产物：RT＝6.897,6.961min；起始材料：RT＝7.056,7.180min)显示起始材料被完全消耗。将反应混合物倒入NaHCO3和Na2SO3溶液(10.0eq NaHCO3和5.00eq Na2SO3，于500mL DI水中)中，然后用EtOAc(200mL)稀释混合物，并分离两层，将有机层用NaHCO3(200mL)、盐水(200mL)洗涤，干燥，过滤并浓缩。
将粗制品再溶解于DCM(50mL)中。将粗溶剂缓慢滴加到MTBE(600mL)的溶剂中。沉淀出所需产物。过滤后收集到白色固体状的产物，并将固体滤饼用异丙醚MTBE(50mL x 2)洗涤。通过反相HPLC(pH＝7条件；MeCN/水)纯化粗固体。得到白色固体状的化合物7-4-7(UTTC 4聚体)(14.5g,7.06mmol,83.3％产率,98.9％纯度)。
HPLC(方法B)：RT＝10.638,10.822min，和LCMS(方法D)：RT＝1.396min；m/z：[M-H]-＝1014.3。
制备7-4-8(DMTr-UTTC-OH)的一般程序
在0℃下向7-4-7(6.60g,3.25mmol,1.00eq)在ACN(35mL)和继之吡啶中的溶液中逐滴添加在THF(8mL)中的氢氟酸(928mg,32.4mmol,844uL,70.0％纯度,10.0eq)和咪唑(4.42g,64.9mmol,20.0eq)。在0℃下搅拌混合物3h。TLC(二氯甲烷:甲醇＝10:1，产物：Rf＝0.33)指示化合物7-4-7被完全消耗并形成两个新斑点。根据TLC，显示反应混乱。
将反应混合物溶解于EtOAc(20mL)中。将有机层用饱和NaHCO3(50mL x 2)水溶液、盐水(20mL)洗涤，并通过无水Na2SO4干燥，过滤并在真空下浓缩。将粗制品再溶解于DCM(5mL)中。将粗溶剂缓慢滴加到MTBE(300mL)的溶剂中。沉淀出所需产物。过滤后收集到白色固体状的产物，并将固体滤饼用异丙醚MTBE(50mL x 2)洗涤。
获得白色固体状的化合物7-4-8(DMTr-UTTC-OH)(5.57g，2.90mmol，89.3％产率，93.4％纯度)。
HPLC(方法B)：RT＝4.461,4.761min，和LCMS(方法D)：RT＝1.237min；m/z：[M-H]-＝1791.5。
制备7-4-8a(片段3)的一般程序
使用与上述亚磷酰胺合成类似的程序，由7-4-8合成化合物7-4-8a。HPLC-MS(方法G)：RT＝7.335,7.446,7.583,7.637min；m/z：化合物7-4-8a的[M-H]-＝1991.6。
制备7-4-9(HO-UTTC-OTBDPS)的一般程序
向7-4-7(6.00g,2.95mmol,1.00eq)于ACN(30mL)中的溶液中添加十二烷-1-硫醇(896mg,4.43mmol,1.06mL,1.50eq)，然后在0℃下逐滴添加TFA(2.69g,23.6mmol,1.75mL,8.00eq)。在0℃下搅拌混合物1h。TLC(DCM:MeOH＝10:1，产物：Rf＝0.35)指示7-4-7被完全消耗并形成两个新斑点。根据TLC，显示反应混乱。
将反应混合物倒入NaHCO3(10.0eq NaHCO3，于100mL DI水中)中，然后用EtOAc50mL稀释并用NaHCO3水溶液100mL萃取。将合并的有机层用盐水200mL(100mL x 2)洗涤，经Na2SO4干燥，过滤并在减压下浓缩，得到残余物。
将粗制品再溶解于DCM(80mL)中。将粗溶剂缓慢滴加到MTBE(300mL)的溶剂中。沉淀出所需产物。过滤后收集到白色固体状的产物，并将固体滤饼用异丙醚MTBE(50mL x 2)洗涤。
得到白色固体状的化合物7-4-9(HO-UTTC-OTBDPS)(4.97g,2.86mmol,96.6％产率和99.3％纯度)。
HPLC(方法B)：RT＝6.895min；LCMS(方法F)：RT＝1.323min；m/z：[M+H]+＝1729.6。
C.靶寡核苷酸ASO 9-1的汇聚合成
用于合成ASO 9-1和9-2及其中间体7a-e的HPLC-MS方法。
柱：ACQUITY UPLC寡核苷酸BEH C18柱,1.7μm,2.1mm X 150mm；
柱温：35℃；
质量范围从200至2300；
MS极性：负
流动相：
溶液A：5mM醋酸三丁胺(TBuAA)，于10％ CH3CN,1μm EDTA中；
溶液B：5mM TBuAA，于80％ CH3CN,1μm EDTA中
梯度：
时间A B流率压力
min％％mL/min巴
-------------------------------------
0.50 75.00 25.00 0.51---
5.00 50.00 50.00 0.51---
18.00 20.00 80.00 0.51---
19.00 75.00 25.00 0.51---
20.00 75.00 25.00 0.51---
ASO 9-1是使用类似于以上针对ASO 9合成公开的方法的汇聚合成程序合成的制备化合物7-a的一般程序
使用与以上公开的类似程序将片段1与2偶联以合成7-a。在采用氨解对LHPG基团脱保护后，通过HPLC和质谱法表征7-a；HPLC-MS：RT＝7.247min且m/z＝1831.5(参见图21)。
制备化合物7-b的一般程序
使用以上公开的脱三苯甲基化方法从7-a合成化合物7-b。在使用氨解对LHPG基团脱保护后，通过HPLC和质谱法表征7-b；HPLC-MS：RT＝6.250min且m/z＝1680.4(参见图22)
制备化合物7-c的一般程序
使用如以上所公开的类似程序将片段3与7-b偶联以合成7-c。在使用氨解对LHPG基团脱保护后，通过HPLC和质谱法表征7-c；HPLC-MS：RT＝7.627min且m/z＝1650.6(参见图23)
制备化合物7-d的一般程序
使用以上公开的脱三苯甲基化方法从7-c合成7-d。在使用氨解对LHPG基团脱保护后，通过HPLC和质谱法表征7-d；HPLC-MS：RT＝7.801min且m/z＝1549.9(参见图24)。
制备化合物ASO-9-1的一般程序
ASO-9-1是通过使用与合成ASO 9所公开的类似程序将片段7-d与片段4偶联来合成的。ASO-9-1通过HPLC-MS确认：RT＝10.224min且m/z：＝2168.0(参见图25)。
D.靶寡核苷酸ASO-9-2的汇聚合成
ASO 9-2是使用与以上针对ASO 9和ASO-9-1合成所公开的方法类似的汇聚合成程序来合成的。
化合物7-e是通过使用上文公开的偶联程序使片段5-4与片段7-b偶联，继之采用上文公开的脱三苯甲基化方法来合成的。在使用氨解对LHPG基团脱保护后，通过HPLC和质谱法表征7-e；HPLC-MS：RT＝7.773min且m/z＝1570.9(参见图26)
制备化合物ASO-9-2的一般程序
ASO-9-2是通过使用与合成ASO 9和ASO-9-1所公开的类似程序将片段7-e与片段4偶联来合成的。ASO-9-2通过HPLC-MS确认：RT＝9.917min且m/z：＝2189.4(参见图27)。
实施例8.使用PSI化学合成立体特异性寡核苷酸
对于下面描述的Prep-HPLC方法，流动相溶剂以[A-B]的格式描述，其中A是指流动相A，且B是指流动相B。例如，流动相[TEAB(10mM)-ACN]意谓10mM TEAB用作流动相A，且HPLC级乙腈用作流动相B。
以下分析方法用于合成实施例8中描述的化合物和寡核苷酸。
HPLC方法：
LC-MC方法：
1.1dTdAdCdC片段的线性合成
化合物8.2的制备
将化合物dC(10g,15.44mmol,1eq)与ACN(10mL x 2)共沸。在N2下，在0℃下向化合物dC(10g,15.44mmol,1eq)和PSI试剂、化合物8.1,(8.96g,20.07mmol,1.3eq)于ACN(60mL)中的溶液中添加DBU(3.06g,20.07mmol,3.03mL,1.3eq)。在25℃下搅拌混合物0.5h。TLC(石油醚/乙酸乙酯＝2:1，Rf＝0.54)指示化合物dC被完全消耗。将混合物经由短硅胶垫过滤，然后将硅胶用EA(60mLx2)洗涤。将有机相用饱和KH2PO4(30mL)、饱和NaHCO3(30mL)、盐水(30mLx2)洗涤，经无水Na2SO4干燥，过滤并在真空下去除溶剂。通过色谱法(SiO2，石油醚/乙酸乙酯＝50/1至1/1)纯化粗产物。得到白色固体状的化合物8.2(7.3g,8.00mmol,51.83％产率,98％纯度)。IPC(过程控制)：TLC(石油醚/乙酸乙酯＝2:1，产物(Rf)＝0.54)HPLC显示RT＝8.666。
化合物8.4的制备
将化合物8.3(4g，6.85mmol，1eq)与ACN(10mL x 2)共沸。在25℃下向在ACN(24mL)中的化合物8.3(3.5g，6.00mmol，1eq)中添加分子筛3A(1g,1.00eq)。在25℃下搅拌混合物0.5h。然后在25℃下添加化合物8.2(5.90g，6.60mmol，1.1eq)和DBU(2.74g，17.99mmol，2.71mL，3eq)。在25℃下搅拌混合物0.5h。LCMS(产物：RT＝1.469min)指示化合物8.2被完全消耗。将混合物用乙酸乙酯(10mL)、20％柠檬酸(10mL)稀释。将有机相用H2O(10mL)、饱和NaHCO3(10mL)、盐水(10mL)洗涤，经无水Na2SO4干燥，过滤并在真空下去除溶剂。粗产物无需纯化即可使用。得到黄色固体状的化合物8.4[(m/z-H+)＝1307.6,9.48g,粗制]。
化合物8.4的立体选择性通过超流体色谱(SFC)(如下所述)测试。化合物8.4在RT＝2.30min处显示出单峰(参见图28)。没有检测到其他峰。立体选择性>99.5％。
SFC方法：
仪器：CAS-TJ-ANA-SFC-1(Waters SFC-MS)
柱：chiralcel OD-3,4.6*100mm,3um
流动相：A用于SFC CO2，且B用于EtOH(0.05％IPAm)
梯度：B在10分钟内为40％
流率：4.0mL/min
柱温：35℃
波长：220nm
系统背压：100巴
为了比较，外消旋样品通过亚酰胺化学合成作为标准，其中有2个保留时间：2.79min和4.33min(参见图29)。
化合物8.5的制备
在25℃下，在N2下向化合物8.4(7.85g,5.99mmol,1eq)在DCM(55mL)中的溶液中添加2,2-二氯乙酸(5.18g,40.18mmol,3.3mL,6.70eq)。在25℃下搅拌混合物1小时。LCMS(产物：RT＝1.352min)指示化合物8.4被完全消耗。将混合物用TEAB(10mL)、DCM(10mL)稀释。将有机相用H2O(10mL)、饱和NaHCO3(10mL)、盐水(10mLx2)洗涤，经无水Na2SO4干燥，过滤并在真空下去除溶剂。通过制备型HPLC(中性条件)(柱：YMC-Triart Prep C18 250*50mm*10um；流动相：[TEAB(10mM)-ACN]；B％：45％-65％，22分钟)纯化残余物。得到白色固体状的化合物8.5(3.8g，3.70mmol，61.68％产率，98％纯度)。MS(m-H+)/z＝1005.4,
化合物8.7的制备
将化合物8.5(3.5g,3.48mmol,1eq)与ACN(10mL x 2)共沸。在25℃下向化合物8.5(3.5g,3.48mmol,1eq)在ACN(25mL)中的溶液中添加分子筛(0.5g,3.48mmol,1.00eq)。在25℃下搅拌混合物0.5h。然后在25℃下添加化合物8.6(4.71g，5.21mmol，1.5eq)和DBU(1.59g,10.43mmol,1.57mL,3eq)。在25℃下搅拌混合物0.5h。LCMS(产物：RT＝1.314min，(m-H+)/z＝1740.4)指示化合物8.5被完全消耗。将混合物用DCM(10mL)、20％柠檬酸(10mLx2)稀释。将有机相用H2O(10mL)、NaHCO3(10mL)、盐水(10mL)洗涤，经无水Na2SO4干燥，过滤并在真空下去除溶剂。将粗产物通过制备型HPLC纯化(仪器：Shimadzu 20AP；柱：YMC-Actus Triart C18 150*30mm*5um；流动相：[TEAB(10mM)-ACN]；B％：20％-60％,12min)。获得黄色固体状的化合物8.7(2.7g，53.79％产率，97％纯度)。
化合物8.9的制备
将化合物8.7(1g,694.20umol,1eq)与ACN(5mLX2)共沸。在25℃下向在ACN(7mL)中的化合物8.7(1g,694.20umol,1eq)中添加分子筛(0.5g,208.26umol,1.00eq)。在25℃下搅拌混合物0.5h。然后在25℃下添加化合物8.8(1.10g,1.39mmol,2eq)和DBU(317.06mg,2.08mmol,313.92uL,3eq)。在25℃下搅拌混合物0.5h。LCMS(产物：RT＝1.254min)指示化合物8.7被完全消耗。将混合物用DCM(30mL)、pH＝3柠檬酸(20mL)稀释。将有机相用H2O(20mL)、TEAB(20mL)、盐水(20mL)洗涤，经无水Na2SO4干燥，过滤并在真空下去除溶剂。粗产物无需纯化即可使用。获得黄色固体状的化合物8.9(MS(m-2H+)/z＝807.3,2.1g,75.49％LCMS纯度)。
化合物8A的制备
在N2下，在25℃下向化合物8.9(1.43g,693.12umol,1eq)在DCM(12mL)中的溶液中添加2,2二氯乙酸(1.13g,8.77mmol,720.00uL,12.65eq)。在25℃下搅拌混合物1小时。LCMS(产物：RT＝1.168min)显示起始材料被完全消耗。将混合物用TEAB(15mL)、DCM(25mL)稀释。将有机相用H2O(20mL)、盐水(20mL)洗涤，经无水Na2SO4干燥，过滤并在真空下去除溶剂。通过制备型HPLC(中性条件)(柱：YMC-Actus Triart C18 150*30mm*5um；流动相：[TEAB(10mM)-ACN]；B％：10％-40％，10min)纯化粗产物。获得白色固体状的化合物8A[(m-2H+)/z＝879.6,522mg,41.0％两步产率,97.6％纯度)并通过HPLC和MS表征(参见图30)。
1.1.1TACC四聚体合成过程中的偶联条件：
基于偶联反应后的IPC，偶联步骤的转化完成。所总结的不同阶段的偶联步骤条件和HPLC纯度如下：
总之，使用采用PSI试剂的液相线性延伸方法合成了四聚体寡核苷酸。用DCA的脱三苯甲基化导致腺苷去修剪。三聚体的脱三苯甲基化是通过使用20％柠檬酸的酸性处理步骤实现的。随着寡核苷酸长得更长，偶联效率降低。在偶联的后期需要额外的PSI-亚酰胺和DBU当量。在偶联条件下，特别是在DBU处理下，苄基和异丁酰基保护基的存在不受干扰。
1.2使用PSI化学对MOE-片段DMTO-AGUCU-OH进行线性延伸
没有报道使用PSI试剂进行MOE-oligo的合成。将PSI化学应用于2'MOE核苷的偶联反应，并且开发了2'MOE oligo 8B延伸的液相合成方法。
化合物8.2.2的合成
在0℃下向化合物8.2.1(5.00g,6.93mmol,1eq)和PSI试剂(4.02g,9.01mmol,1.3eq)在ACN(35mL)中的溶液中添加DBU(1.37g,9.01mmol,1.36mL,1.3eq)。在25℃下搅拌混合物0.5h。TLC(石油醚:乙酸乙酯＝0:1，Rf＝0.82)指示反应物8.2.1被完全消耗。将混合物经由短硅胶垫过滤，然后将硅胶用EA(80mLx2)洗涤。将过滤物用饱和KH2PO4(100mL)、饱和NaHCO3(100mL)、盐水(100mL)洗涤，经无水Na2SO4干燥，过滤并浓缩。通过色谱法(SiO2，石油醚/乙酸乙酯＝30/1至0/1)纯化残余物。获得白色固体状的化合物8.2.2[(m-H+)/z＝966.4,5.5g,5.51mmol,79.55％产率,97％纯度]。
化合物8.2.4的合成
将化合物8.2.2(5.00g,9.01mmol,1eq)与ACN(40mL x 2)共沸，将化合物8.2.3(9.60g,9.92mmol,1.1eq)与ACN(40mL x 2)共蒸发)。在25℃下向化合物8.2.2(5g,9.01mmol,1eq)和化合物8.2.3(9.60g,9.92mmol,1.1eq)在ACN(35mL)中的溶液中添加DBU(4.12g,27.04mmol,4.08mL,3eq)。在25℃下搅拌混合物0.5h。LCMS指示化合物8.2.2被完全消耗。将混合物用EA(150mL)、20％柠檬酸(80mL)稀释。将有机层用饱和NaHCO3(150mL)、H2O(150mL)、盐水(150mL x 2)洗涤，经无水Na2SO4干燥，过滤并在真空下去除溶剂。粗产物无需纯化即可用于下一步。得到黄色固体状的化合物8.2.4[(m-H+)/z＝1353.6,12.21g，粗制品]。
化合物8.2.5的合成
在25℃下向化合物8.2.4(12.21g，9.01mmol，1eq)在DCM(85mL)中的溶液中添加2,2-二氯乙酸(8.01g,62.10mmol,5.1mL,6.89eq)。在25℃下搅拌混合物1h。LCMS指示化合物8.2.4被完全消耗。将混合物缓慢添加到TEAB(150mL)中，用DCM(150mL)萃取。然后将有机层用饱和NaHCO3(150mL)、H2O(150mL)、盐水(150mL)洗涤，经无水Na2SO4干燥，过滤并在真空下去除溶剂。通过制备型HPLC纯化粗产物：柱：Agela DuraShell C18 250*50mm*10um；流动相：[TEAB(10mM)-ACN]；B％：30％-53％，22min。获得白色固体状的化合物8.2.5[(m-H+)/z＝1050.5,6.9g,6.36mmol,70.57％产率，97％纯度]。
化合物8.2.7的合成
将化合物8.2.5(4.50g,4.28mmol,1eq)与ACN(40mL x 2)共沸，将化合物8.2.6(5.55g,6.42mmol,1.5eq)与ACN(40mL x 2)共蒸发。在25℃下向化合物8.2.5(4.5g,4.28mmol,1eq)在ACN(30mL)中的溶液中添加分子筛3A(2.40g,4.28mmol,1.00eq)。在25℃下搅拌混合物0.5h。然后在25℃下添加化合物8.2.6(5.55g,6.42mmol,1.5eq)。在25℃下缓慢添加DBU(1.95g,12.83mmol,1.93mL,3eq)。在25℃下搅拌混合物0.5h。LCMS指示8.2.5被完全消耗。将混合物用DCM(200mL)、pH～3柠檬酸(150mL)稀释。将有机相用NaHCO3(200mL)、H2O(200mL)、盐水(200mL)洗涤，经无水Na2SO4干燥，过滤并在真空下去除溶剂。粗产物无需纯化即可用于下一步。获得黄色固体状的化合物8.2.7(9.3g，粗制品)。
化合物8.2.8的合成
在25℃下向化合物8.2.7(7.48g,4.28mmol,1eq)在DCM(60mL)中的溶液中添加2,2-二氯乙酸(7.85g,60.88mmol,5mL,14.23eq)。在25℃下搅拌混合物1h。LCMS指示化合物8.2.7被完全消耗。将混合物用DCM(150mL)稀释，由TEAB(150mL)淬灭。将有机相用NaHCO3(150mL)、H2O(150mL)、盐水(150mL)洗涤，经无水Na2SO4干燥，过滤并在真空下去除溶剂。将粗产物与TBME(250mL)一起研磨，然后过滤，将固体用TEAB洗涤。将粗产物通过制备型HPLC纯化：柱：YMC-Triart Prep C18 250*50mm*10um；流动相：[TEAB(10mM)-ACN]；B％：25％-48％，22min。得到黄色固体状的化合物8.2.8[(m-H+)/z＝1444.5,3.3g,2.21mmol,51.74％产率，97％纯度]。
化合物8.2.10的合成
将化合物2.18(3.3g,2.28mmol,1eq)与ACN(20mL x 2)共沸，将化合物8.2.9(3.29g,3.42mmol,1.5eq)与ACN(20mL x 2)共蒸发。在25℃下向化合物8.2.8(3.3g,2.28mmol,1eq)在ACN(20mL)中的溶液中添加分子筛3A(1.6g,2.28mmol,1eq)。在25℃下搅拌混合物0.5h。然后在25℃下添加化合物8.2.9(3.29g,3.42mmol,1.5eq)和DBU(1.74g,11.41mmol,1.72mL,5eq)。在25℃下搅拌混合物0.5h。LCMS指示化合物8.2.8被完全消耗。将混合物用DCM(50mL)、20％柠檬酸(50mL)稀释。将有机相用TEAB(50mL)洗涤，经无水Na2SO4干燥，过滤并在真空下去除溶剂。将粗产物通过制备型HPLC纯化：柱：Agela DuraShell C18250*50mm*10um；流动相：[TEAB(10mM)-ACN]；B％：15％-45％,22min。获得白色固体状的化合物8.2.10[(m-2H+)/z＝967.1,3.1g,1.54mmol,67.38％产率，96％纯度)。
化合物8.2.12的合成
将化合物8.2.10(2.1g,1.08mmol,1eq)与ACN(20mL x 2)共沸，将化合物8.2.11(2.12g,2.17mmol,2eq)与ACN(20mL x 2)共蒸发)。在25℃下向化合物8.2.10(2.1g,1.08mmol,1eq)在ACN(14mL)中的溶液中添加分子筛(1.2g,1.08mmol,1.00eq)。在25℃下搅拌混合物0.5h。然后在25℃下添加化合物8.2.11(2.12g,2.17mmol,2eq)和DBU(495.42mg,3.25mmol,490.51uL,3eq)。在25℃下搅拌混合物0.5h。LCMS指示化合物8.2.10被完全消耗。将混合物经3A MS过滤，将滤饼用ACN(5mL)洗涤。将粗产物通过制备型HPLC(柱：YMC-Triart Prep C18 250*50mm*10um；流动相：[TEAB(10mM)-ACN]；B％：18％-50％,22min来纯化。获得白色固体状的化合物8.2.12[(m-2H+)/z＝1371.8,1.92g,678.28umol,62.53％产率,97％纯度]，并通过HPLC和LCMS来表征(参见图31)。
化合物8B的合成
在25℃下向化合物8.2.12(0.18g,65.56umol,1eq)在THF(2mL)中的溶液中添加TBAF(1M,196.67uL,3eq)。在25℃下搅拌混合物24小时。LCMS指示化合物8.2.12被完全消耗。将混合物用TEAB(10mL)洗涤，用DCM(10mL)稀释，经无水Na2SO4干燥，然后过滤并浓缩。将粗产物通过制备型HPLC(柱：YMC-Actus Triart C18150*30mm*5um；流动相：[TEAB(10mM)-ACN]；B％：30％-60％,12min)来纯化。获得白色固体状的化合物8B[(m-3H+)/z＝834.8,0.124g,47.48umol,72.42％产率,96％纯度)，并通过HPLC和LCMS来表征(参见图32)。
1.2.1MOE片段的偶联条件
基于偶联反应后的IPC，偶联步骤的转化完成。所总结的不同阶段的偶联步骤条件和HPLC纯度列出如下：
总之，使用PSI试剂对2'-MOE亚酰胺进行液相线性延伸，合成了五聚体寡核苷酸。用DCA的脱三苯甲基化导致腺苷去修剪。三聚体的脱三苯甲基化是通过使用20％柠檬酸的酸性处理步骤实现的。与脱氧寡核苷酸的延伸相似，偶联效率随着寡核苷酸的增长而降低。在偶联的后期需要额外的PSI-亚酰胺和DBU当量。
1.3片段的汇聚合成
片段8C是通过组合片段8A与8B-2合成的。片段8B-2是由8B-1合成的且片段8A的合成如上所述。
UdTdTdC片段8B-2的合成
UdTdTdC片段的形成是在ASO 9合成过程中通过用亚酰胺化学获得的四聚体片段的胺处理对氰乙基进行裂解来提供，然后在0℃下在ACN中与PSI试剂(10eq)偶联。产物8B-2对水极其敏感。如果处理暴露在空气下，则产物将被水分水解。
筛选出两种类型的用于裂解氰乙基的胺，即2-甲基丙-2-胺和TEA。结果列于下表中：
ASO 8C的汇聚合成
将化合物8A(0.05g,28.40umol,1eq)与ACN(2mL*2)共沸。将化合物8B-2(164.32mg,85.19umol,3eq)与ACN(2mL*2)共沸。在25℃下向在ACN(0.1mL)中的化合物8B-2中添加分子筛(0.015g,1.00eq)。在25℃下搅拌混合物0.5h。将化合物8A(0.05g,28.40umol,1eq)与DBU(30.26mg,198.78μmol,29.96μL,7eq)在ACN(0.2mL)中预混合制成混合物，然后在Ar下，在25℃下将上述混合物逐滴添加到在ACN(0.1mL)中的化合物8B-2(164.32mg,85.19umol,3eq)中。在25℃下搅拌混合物0.5h。LCMS和HPLC显示起始材料消耗超过90％。过滤反应混合物。将混合物通过制备型HPLC(中性条件,柱：Phenomenex Gemini-NX 80*30mm*3um；流动相：[水(10mM NH4HCO3)-ACN]；B％：25％-55％,7min来纯化。获得白色固体状的化合物8C[(m-4H+)/z＝879.4，40.0mg，9.77umol，34.4％产率，86％纯度]，并通过HPLC和LCMS来表征(参见图33)。
总之，PSI化学成功地应用于脱氧四聚体和2'-MOE五聚体的液相合成，以及立体控制的ASO的汇聚液相合成。汇聚偶联反应对水分非常敏感。H2O与ACN的预共沸是必要的，以确保反应的高转化率。此外，DBU的浓度对转化率至关重要，如为高转化率所推荐的0.64M(DBU至ACN的体积为10％)。
实施例9.ASO全长产物的脱保护
首先，通过将64克受保护的ASO 9溶解于640ml CH3CN:Et3N＝1:1溶液中，将氰乙基脱保护。将混合物在25℃下搅拌两小时后，通过旋转蒸发器去除溶剂。将粗制品带入下一步用于LHPG和胺保护基的脱保护。向粗混合物中添加500ml浓NH3/H2O，并将反应混合物在25℃下搅拌直至固体完全溶解(约20-30分钟)。将固体溶解于NH3/H2O中后，将混合物转移到1L玻璃压力烧瓶中，然后在65℃下加热5小时。将反应混合物冷却至室温，并将脱保护的ASO 9准备用于下游纯化。在此操作中，ASO 9上的所有保护基(5'-DMTr除外)都被脱保护。下游HIC纯化后去除DMTr基团。
本发明涉及：
1.一种用于制备式(AI)化合物或其盐的液相方法：
其包括将式(AII)化合物或其盐：
脱保护，其中所述脱保护反应在无水或基本上无水的溶液中进行，且其中：
R1在每次出现时独立地为核碱基，其中所述核碱基的NH2(如果存在的话)受胺保护基的保护；
R2在每次出现时独立地选自由H、卤基和任选被C1-6烷氧基取代的C1-6烷氧基组成的组；
R4在每次出现时独立地为H或与R2的烷氧基形成环；
R15为羟基保护基；
R16在每次出现时独立地为C1-6烷基、C2-6烯基、苯基或苄基，其各自任选地被-CN、-NO2或卤素取代；或
R16为
z为0或1至200的整数；
X在每次出现时独立地为O或S；且
Y为含有烷基链的疏水性羟基保护基。
2.如实施方案1所述的方法，其中R15为4,4'-二甲氧基三苯甲基。
3.如实施方案1或2所述的方法，其中所述脱保护反应在干燥剂的存在下进行。
4.如实施方案3所述的方法，其中所述干燥剂是分子筛。
5.如实施方案4所述的方法，其中分子筛的尺寸是
6.如实施方案1或2所述的方法，其中所述无水或基本上无水的溶液是通过在脱保护反应之前使用共沸蒸馏去除水而获得的。
7.如实施方案1-6中任一项所述的方法，其中所述脱保护反应在包含-SH基、硅烷基、硅氧烷基、聚苯乙烯基、呋喃、吡咯或吲哚的阳离子清除剂存在下进行。
8.如实施方案7所述的方法，其中所述阳离子清除剂为式RSH的化合物，其中R为烷基、环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基，其各自任选地被取代。
9.如实施方案8所述的方法，其中RSH为CH3(CH2)5SH、CH3(CH2)11SH、环己硫醇、CH3CH2OC(＝O)CH2CH2SH。
10.如实施方案1-9中任一项所述的方法，其中所述脱保护反应通过使式(AII)化合物与脱三苯甲基化试剂反应来进行。
11.如实施方案10所述的方法，其中所述脱三苯甲基化试剂是强有机酸。
12.如实施方案10所述的方法，其中所述脱三苯甲基试剂是CF3COOH、CCl3COOH、CHCl2COOH、CH2ClCOOH、H3PO4、甲磺酸、苯磺酸、CClF2COOH、CHF2COOH或PhSO2H。
13.如实施方案11所述的方法，其中所述脱三苯甲基化试剂是CH2ClCOOH。
14.如实施方案10所述的方法，其中所述脱三苯甲基试剂是CF3COOH或CHCl2COOH。
15.如实施方案1-14中任一项所述的方法，其中Y由下式表示：
其中X为C1-10烷基，其中一个或多个CH2基团独立地被C(O)、C(O)NH2、环烷基或C1-6杂环基置换；且X1为C1-25烷基或C1-25烷氧基。
16.如实施方案15所述的方法，其中Y由下式表示：
17.如实施方案1-16中任一项所述的方法，其中：
每个R2独立地为mj、k H、F或任选被C1-4烷氧基取代的C1-4烷氧基；
R4为H；且
R16为-CH2CH2CN。
18.如实施方案1-17中任一项所述的方法，其中所述式(AI)化合物不通过色谱法纯化。
19.如实施方案1-17中任一项所述的方法，其中所述式(AI)化合物通过选择性沉淀和/或萃取来纯化。
20.一种用于制备式(I)的寡核苷酸片段或其盐的液相方法，
其包括以下步骤：
1)将式(I’A)化合物或其盐：
脱保护，以形成式(IA)化合物或其盐：
2)使式(IA)化合物或其盐与式(A1)化合物或其盐：
反应，以形成式(IB)化合物或其盐：
及
3)用硫化剂或氧化剂硫化或氧化所述式(IB)化合物或其盐以形成式(IC)化合物或其盐：
4)将所述式(IC)化合物或其盐脱保护以形成式(ID)化合物或其盐：
5)从所述式(ID)化合物开始，重复步骤2)、3)和4)n-2次，得到式(I)的片段或其盐，其中：
R1在每次出现时独立地为核碱基，其中所述核碱基的NH2(如果存在的话)受胺保护基的保护；
R2在每次出现时独立地选自由H、卤基和任选被C1-6烷氧基取代的C1-6烷氧基组成的组；
R4在每次出现时独立地为H或与R2的烷氧基形成环；
R15为羟基保护基；
R16在每次出现时独立地为C1-6烷基、C2-6烯基、苯基或苄基，其各自任选地被-CN、-NO2或卤素取代；或
R16为
R17a和R17b独立地为C1-6烷基；
n为2至20的整数；
X在每次出现时独立地为O或S；
Y为含有烷基链的疏水性羟基保护基。
21.如实施方案20所述的方法，其中所述式(I)的片段不通过色谱法纯化。
22.如实施方案21所述的方法，其中所述式(I)的片段通过选择性沉淀和/或萃取来纯化。
23.如实施方案20-22中任一项所述的方法，其中不使用色谱法纯化步骤1)、2)、3)和4)中任一个的反应产物。
24.如实施方案20-23中任一项所述的方法，其中步骤1)、2)、3)和4)中任一个的所述反应产物通过选择性沉淀来纯化。
25.如实施方案20-24中任一项所述的方法，其中Y为
26.如实施方案20-25中任一项所述的方法，其中步骤1)和步骤4)中的任一脱保护反应如实施方案2-14中所定义进行。
27.一种用于制备靶寡核苷酸的汇聚液相方法，其包括以下步骤：
a)使式(I)的寡核苷酸片段或其盐：
与式(II)的寡核苷酸片段或其盐：
在溶液中偶联以形成式(III)的寡核苷酸或其盐：
及b)硫化或氧化所述式(III)的寡核苷酸或其盐以形成式(IV)的寡核苷酸或其盐：
其中：
R1在每次出现时独立地为核碱基，其中所述核碱基的NH2(如果存在的话)受胺保护基的保护；
R2在每次出现时独立地选自由H、卤基和任选被C1-6烷氧基取代的C1-6烷氧基组成的组；
R4在每次出现时独立地为H或与R2的烷氧基形成环；
R15为羟基保护基；
R16在每次出现时独立地为C1-6烷基、C2-6烯基、苯基或苄基，其各自任选地被-CN、-NO2或卤素取代；或
R16为
R17a和R17b独立地为C1-6烷基；
n为2至200的整数；
m为2至20的整数
X在每次出现时独立地为O或S；
Y为含有烷基链的疏水性羟基保护基。
28.如实施方案27所述的方法，其中片段(I)可通过使式(Ia1)的核苷酸或其盐：
与式(Ia2)的寡核苷酸片段或其盐：
在溶液中偶联以形成式(I)的寡核苷酸片段或其盐来合成。
29.如实施方案27或28所述的方法，其中n为3至20的整数。
30.如实施方案27或28所述的方法，其中n为3至6。
31.如实施方案27或28所述的方法，其中n为5。
32.如实施方案27-31中任一项所述的方法，其进一步包括步骤c)：将式(IV)的寡核苷酸或其盐脱保护以形成式(V)的寡核苷酸或其盐：
33.如实施方案32所述的方法，其进一步包括：
d)使式(V)的寡核苷酸或其盐与式(II')的寡核苷酸片段或其盐：
偶联以形成式(VI)的寡核苷酸或其盐：
e)硫化或氧化式(VI)的寡核苷酸以形成式(VII)的寡核苷酸或其盐：
f)将所述式(VII)的寡核苷酸或其盐脱保护以形成式(VIII)的寡核苷酸或其盐：
g)重复步骤d)、e)和f)r-1次，然后重复步骤d)和e)以形成式(IX)的寡核苷酸或其盐：
其中：
r为1至50的整数；
pi在每次出现时独立地为2至20的整数，
i为1至r的整数；且
34.如实施方案33所述的方法，其中r为2且所述式(IX)的寡核苷酸由式(X)表示：
其中p1和p2各自独立地为2至20的整数
35.如实施方案27-34中任一项所述的方法，其中不使用色谱法纯化步骤a)、b)、c)、d)、e)、f)和g)中任一个的所述反应产物。
36.如实施方案27-35中任一项所述的方法，其中步骤a)、b)、c)、d)、e)、f)和g)中任一个的所述反应产物通过萃取或选择性沉淀来纯化。
37.如实施方案33-36中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括以下步骤：
h1)将所述寡核苷酸(IX)或(X)或其盐脱保护以形成式(IXA)或(XA)的寡核苷酸或其盐：
38.如实施方案37所述的方法，其中所述方法进一步包括以下步骤：
h2)将寡核苷酸(IXA)或(XA)脱保护以形成式(IXB)或(XB)的寡核苷酸或其盐：
任选地使所述寡核苷酸(IXA)或(XA)与柠檬酸反应以形成所述式(IXB)或(XB)的寡核苷酸。
39.如实施方案37所述的方法，其中当R16为-CH2CH2CN时，所述寡核苷酸(IX)或(X)或其盐的脱保护形成式(IXAb)或(XAb)的寡核苷酸或其盐：
40.如实施方案39所述的方法，其中所述方法进一步包括以下步骤：
将所述寡核苷酸(IXAb)或(XAb)或其盐脱保护以形成式(IXBa)或(XBa)的寡核苷酸或其盐：
任选地使所述寡核苷酸(IXA)或(XA)与柠檬酸反应以形成所述式(IXBa)或(XBa)的寡核苷酸。
41.如实施方案33-36中任一项所述的方法，其中当R16为-CH2CH2CN时，所述方法进一步包括以下步骤：
h1)将所述寡核苷酸(IX)或(X)脱保护以形成式(IXAa)或(XAa)的寡核苷酸或其盐：
42.如实施方案41所述的方法，其中所述脱保护反应通过使所述寡核苷酸(IX)或(X)或其盐与碱反应来进行。
43.如实施方案42所述的方法，其中所述碱选自1,8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯、叔丁胺、仲丁胺、二异丙基乙胺和三乙胺。
44.如实施方案41、42或43所述的方法，其中所述方法进一步包括以下步骤：将所述寡核苷酸(IXAa)或(XAa)或其盐脱保护以形成式(IXAb)或(XAb)的寡核苷酸或其盐：
45.如实施方案44所述的方法，其中所述寡核苷酸(IXAa)或(XAa)或其盐的脱保护通过使所述寡核苷酸(IXAa)或(XAa)或其盐与NH4OH反应来进行。
46.如实施方案27-45中任一项所述的方法，其中n为3、4、5或6。
47.如实施方案27-46中任一项所述的方法，其中m为3、4、5或6。
48.如实施方案33-47中任一项所述的方法，其中pi在每次出现时独立地为3、4、5或6。
49.如实施方案34-47中任一项所述的方法，其中p1和p2各自独立地为3、4、5或6。
50.如实施方案33和35-48中任一项所述的方法，其中r为1、2、3、4、5或6。
51.一种用于制备靶寡核苷酸的汇聚液相方法，其包括以下步骤：
a)使式(II2)的寡核苷酸片段或其盐：
与式(I2)的寡核苷酸片段或其盐：
在溶液中偶联以形成式(III2)的寡核苷酸或其盐：
及
b)硫化或氧化所述式(III2)的寡核苷酸或其盐，以形成式(IV2)的寡核苷酸或其盐：
其中：
R1在每次出现时独立地为核碱基，其中所述核碱基的NH2(如果存在的话)受胺保护基的保护；
R2在每次出现时独立地选自由H、卤基和任选被C1-6烷氧基取代的C1-6烷氧基组成的组；
R4在每次出现时独立地为H或与R2的烷氧基形成环；
R16在每次出现时独立地为C1-6烷基、C2-6烯基、苯基或苄基，其各自任选地被-CN、-NO2或卤素取代；或
R16为
R17a和R17b独立地为C1-6烷基；
n1为2至20的整数；
m1为2至200的整数；
X在每次出现时独立地为O或S；
Y为含有烷基链的疏水性羟基保护基；
Z为甲硅烷基羟基保护基。
52.如实施方案51所述的方法，其中片段(II2)通过以下步骤来制备：
ia)使式(II2a1)的核苷酸或其盐:
与式(II2a2)的寡核苷酸片段或其盐：
在溶液中偶联以形成式(II2a3)的寡核苷酸或其盐，
iia)硫化或氧化所述式(II2a3)的寡核苷酸或其盐，以形成式(II2a4)的寡核苷酸或其盐：
iia)将所述式(II2a4)的寡核苷酸或其盐脱保护以形成所述式(II2)的寡核苷酸或其盐。
53.如实施方案51或52所述的方法，其进一步包括步骤c)：将所述式(IV2)的寡核苷酸或其盐脱保护以形成式(V2)的寡核苷酸或其盐：
54.如实施方案53所述的方法，其进一步包括：
d)使所述式(V2)的寡核苷酸或其盐与式(II2’)的寡核苷酸片段或其盐：
偶联，以形成式(VI2)的寡核苷酸或其盐：
e)硫化或氧化所述式(VI2)的寡核苷酸以形成式(VII2)的寡核苷酸或其盐：
f)将所述式(VII2)的寡核苷酸或其盐脱保护，以形成式(VIII2)的寡核苷酸或其盐：
g)重复步骤d)、e)和f)r1-1次，接着重复步骤d)和e)，以形成式(IX2)的寡核苷酸或其盐：
其中：
r1为1至50的整数；
si在每次出现时独立地为2至20的整数，
i为1至r1的整数；并且
55.如实施方案54所述的方法，其中r1为2且所述式(IX2)的寡核苷酸由式(X2)表示：
其中s1和s2各自独立地为2至20的整数。
56.如实施方案51-55中任一项所述的方法，其中不使用色谱法纯化步骤a)、b)、c)、d)、e)、f)和g)中任一个的反应产物。
57.如实施方案51-56中任一项所述的方法，其中步骤a)、b)、c)、d)、e)、f)和g)中任一个的所述反应产物通过萃取或选择性沉淀来纯化。
58.如实施方案54-57中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括将所述式(IX2)或(X2)的寡核苷酸或其盐脱保护以形成式(IX2A)或(X2A)的寡核苷酸或其盐：
59.如实施方案54-57中任一项所述的方法，其中当R16为-CH2CH2CN时，所述方法进一步包括以下步骤：
h1)将所述寡核苷酸(IX2A)或(X2A)或其盐脱保护以形成式(IX2Aa)或(X2Aa)的寡核苷酸或其盐：
60.如实施方案59所述的方法，其中所述脱保护反应通过使所述寡核苷酸(IX2A)或(X2A)或其盐与碱反应来进行。
61.如实施方案60所述的方法，其中所述碱选自1,8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯、叔丁胺、仲丁胺、二异丙基乙胺和三乙胺。
62.如实施方案59-61中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括以下步骤：将所述寡核苷酸(IX2Aa)或(X2Aa)或其盐脱保护以形成式(IX2B)或(X2B)的寡核苷酸或其盐：
63.如实施方案62所述的方法，其中所述脱保护通过使所述寡核苷酸(IX2Aa)或(X2Aa)或其盐与NH4OH反应来进行。
64.如实施方案54-63中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括以下步骤：将所述寡核苷酸(IX2)或(X2)或其盐用NH4OH脱保护以形成式(IX2B)或(X2B)的寡核苷酸或其盐：
其中当R16为-CH2CH2CN时，所述寡核苷酸(IX2)或(X2)或其盐的脱保护形成式(IX2A)或(X2A)的寡核苷酸或其盐：
65.如实施方案51-64中任一项所述的方法，其中n1为3、4、5或6。
66.如实施方案51-65中任一项所述的方法，其中m1为3、4、5或6。
67.如实施方案54-66中任一项所述的方法，其中si在每次出现时独立地为3、4、5或6。
68.如实施方案55-66中任一项所述的方法，其中s1和s2各自独立地为3、4、5或6。
69.如实施方案54-67中任一项所述的方法，其中r1为1、2、3、4、5或6。
70.如实施方案1-69中任一项所述的方法，其中所述化合物或寡核苷酸中的所有P＝X基团都是P＝S。
71.如实施方案1-69中任一项所述的方法，其中所述化合物或寡核苷酸中的所有P＝X基团都是P＝O。
72.如实施方案1-69中任一项所述的方法，其中所述化合物或寡核苷酸中大于10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的P＝X基团是P＝S。
73.如实施方案1-69中任一项所述的方法，其中所述化合物或寡核苷酸中10-90％、20-80％、30-70％或40-60％的P＝X基团是P＝S.
74.如实施方案1-73中任一项所述的方法，其中所述核碱基选自由以下组成的组：胞嘧啶、鸟嘌呤、腺嘌呤、胸腺嘧啶、尿嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、5,6-二氢尿嘧啶、5-甲基胞嘧啶和5-羟甲基胞嘧啶，其中所述核碱基的NH2基团(如果存在的话)受PhCO-、CH3CO-、iPrCO-、Me2N-CH＝或Me2N-CMe＝的保护。
75.如实施方案1-73中任一项所述的方法，其中所述核碱基选自由以下组成的组：胞嘧啶、鸟嘌呤、腺嘌呤、胸腺嘧啶、尿嘧啶和5-甲基胞嘧啶，其中所述核碱基的NH2基团(如果存在的话)受PhCO-、CH3CO-、iPrCO-、Me2N-CH＝或Me2N-CMe＝的保护。
76.如实施方案1-75中任一项所述的方法，其中
每个R2独立地选自由以下组成的组：H、F和任选被C1-4烷氧基取代的C1-4烷氧基；
每个R4独立地为H或与R2的烷氧基形成环，其中所述环为任选被1至3个C1-4烷基取代的5或6元环；
R16为-CH2CH2CN；且
R17a和R17b独立地为C1-4烷基。
77.如实施方案76所述的方法，其中
每个R2独立地选自H或-OCH2CH2OMe；
每个R4为H；
R16为-CH2CH2CN；且
R17a和R17b均为-CH(CH3)2。
78.如实施方案27-77中任一项所述的方法，其中所述靶寡核苷酸是包含16至30个核苷酸的反义寡核苷酸。
79.如实施方案78所述的方法，其中所述反义寡核苷酸仅包含修饰的RNA。
80.如实施方案78所述的方法，其中所述反义寡核苷酸包含DNA和修饰的RNA。
81.如实施方案78所述的方法，其中所述反义寡核苷酸为缺口聚体。
82.如实施方案78所述的方法，其中所述反义寡核苷酸仅包含DNA。
83一种用于制备式(AI’)化合物或其盐的液相方法：
其包括将式(AII’)化合物或其盐：
脱保护，其中所述脱保护反应在无水或基本上无水的溶液中进行，且其中：
R1在每次出现时独立地为核碱基，其中所述核碱基的NH2(如果存在的话)受胺保护基的保护；
R2在每次出现时独立地选自由H、卤基和任选被C1-6烷氧基取代的C1-6烷氧基组成的组；
R4在每次出现时独立地为H或与R2的烷氧基形成环；
R15为羟基保护基；
R16在每次出现时独立地为C1-6烷基、C2-6烯基、苯基或苄基，其各自任选地被-CN、-NO2或卤素取代；或
R16为
z为0或1至200的整数；
X在每次出现时独立地为O或S；
W为H或Z；且
Z为甲硅烷基羟基保护基。
84.如实施方案83所述的方法，其中R15为4,4’-二甲氧基三苯甲基。
85.如实施方案83或84所述的方法，其中所述脱保护反应在干燥剂存在下进行。
86.如实施方案85所述的方法，其中所述干燥剂是分子筛。
87.如实施方案86所述的方法，其中分子筛的尺寸是
88.如实施方案83或84所述的方法，其中所述无水或基本上无水的溶液是通过在脱保护反应之前使用共沸蒸馏去除水而获得的。
89.如实施方案83-88中任一项所述的方法，其中所述脱保护反应在包含-SH基、硅烷基、硅氧烷基、聚苯乙烯基、呋喃、吡咯或吲哚的阳离子清除剂存在下进行。
90.如实施方案89所述的方法，其中所述阳离子清除剂为式RSH的化合物，其中R为烷基、环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基，其各自任选地被取代。
91.如实施方案90所述的方法，其中RSH为CH3(CH2)5SH、CH3(CH2)11SH、环己硫醇、CH3CH2OC(＝O)CH2CH2SH。
92.如实施方案83-91中任一项所述的方法，其中所述脱保护反应通过使式(AII’)化合物与脱三苯甲基化试剂反应来进行。
93.如实施方案92所述的方法，其中所述脱三苯甲基化试剂是强有机酸。
94.如实施方案92所述的方法，其中所述脱三苯甲基化试剂是CF3COOH、CCl3COOH、CHCl2COOH、CH2ClCOOH、H3PO4、甲磺酸、苯磺酸、CClF2COOH、CHF2COOH或PhSO2H。
95.如实施方案93所述的方法，其中所述脱三苯甲基化试剂是CH2ClCOOH。
96.如实施方案92所述的方法，其中所述脱三苯甲基化试剂是CF3COOH或CHCl2COOH。
97.如实施方案83-96中任一项所述的方法，其中W为Z。
98.如实施方案97所述的方法，其中Z是选自TBDPS、TBoDPS和TBDAS的甲硅烷基保护基。
其中R5、R6和R7各自独立地为H、C1-30烷基或C1-30烷氧基。
99.如实施方案98所述的方法，其中所述TBDAS基团为：
其中s为1至30的整数。
100.如实施方案97所述的方法，其中Z为TBDPS。
101.如实施方案83-100中任一项所述的方法，其中z为0或1至10的整数。
102.如实施方案83-101中任一项所述的方法，其中：
每个R2独立地选自H、F或任选被C1-4烷氧基取代的C1-4烷氧基；
R4为H；且
R16为-CH2CH2CN。
103.如实施方案83-102中任一项所述的方法，其中所述式(AI’)化合物不通过色谱法纯化。
104.如实施方案83-102中任一项所述的方法，其中所述式(AI’)化合物通过选择性沉淀和/或萃取来纯化。
105.一种用于制备式(BI)化合物或其盐的液体方法：
其包括将式(BII)化合物或其盐：
脱保护以形成所述式(BI)化合物或其盐，其中：
R1在每次出现时独立地为核碱基，其中所述核碱基的NH2(如果存在的话)受胺保护基的保护；
R2在每次出现时独立地选自由H、卤基和任选被C1-6烷氧基取代的C1-6烷氧基组成的组；
R4在每次出现时独立地为H或与R2的烷氧基形成环；
R15为羟基保护基；
R16在每次出现时独立地为C1-6烷基、C2-6烯基、苯基或苄基，其各自任选地被-CN、-NO2或卤素取代；或
R16为
q为1至200的整数；
X在每次出现时独立地为O或S；且
Z为甲硅烷基羟基保护基。
106.如105所述的方法，其中所述脱保护反应通过在碱存在下使式(BII)化合物与HF反应来进行。
107.如实施方案106所述的方法，其中所述碱为咪唑或吡啶，其中咪唑或吡啶任选被取代
108.如实施方案106或107所述的方法，其中使用相对于HF过量的碱。
109.如实施方案105中任一项所述的方法，其中所述脱保护反应通过在吡啶和咪唑存在下使所述式(BII)化合物与HF反应来进行。
110.如实施方案109所述的方法，其中咪唑与HF的摩尔比在1.1:1至5:1的范围内。
111.如实施方案110所述的方法，其中咪唑与HF的摩尔比为2:1。
112.如实施方案109-111中任一项所述的方法，其中吡啶与HF的摩尔比为1.1:1至20:1。
113.如实施方案105-112中任一项所述的方法，其中Z是选自TBDPS、TBoDPS和TBDAS的甲硅烷基保护基。
其中R5、R6和R7各自独立地为H、C1-30烷基或C1-30烷氧基。
114.如实施方案113所述的方法，其中TBDAS基团为：
其中s为1至30的整数。
115.如实施方案113所述的方法，其中Z为TBDPS。
116.如实施方案105-115中任一项所述的方法，其中R15是4,4'-二甲氧基三苯甲基。
117.如实施方案105-116中任一项所述的方法，其中：
每个R2独立地选自H、F和任选被C1-4烷氧基取代的C1-4烷氧基；
R4为H；且
R16为-CH2CH2CN。
118.如实施方案105-117中任一项所述的方法，其中q为2至10的整数。
119.如实施方案105-118中任一项所述的方法，其中所述式(BI)化合物不通过色谱法纯化。
120.如实施方案105-119中任一项所述的方法，其中所述式(BI)化合物通过选择性沉淀和/或萃取来纯化。
121.一种用于制备式(CI)或(CI’)的化合物或其盐的液体方法：
其包括使式(CII)化合物或其盐：
与亚磷二酰胺(R16O)P(NR17aR17b)2或H-膦酸酯反应以形成所述式(CI)或(CI’)的化合物，其中：
R1在每次出现时独立地为核碱基，其中所述核碱基的NH2(如果存在的话)受胺保护基的保护；
R2在每次出现时独立地选自由H、卤基和任选地被卤素或C1-6烷氧基取代的C1-6烷氧基组成的组；
R4在每次出现时独立地为H或与R2的烷氧基形成环；
R15为羟基保护基；
R16在每次出现时独立地为C1-6烷基、C2-6烯基、苯基或苄基，其各自任选地被-CN、-NO2或卤素取代；或
R16为
R17a和R17b独立地为C1-6烷基
q1为2至200的整数；
X在每次出现时独立地为O或S；且
Z为甲硅烷基羟基保护基。
122.一种用于制备式(C2I)化合物或其盐的液体方法：
其包括使式(C2II)化合物或其盐：
与亚磷二酰胺(R16O)P(NR17aR17b)2反应以形成所述式(C2I)化合物或其盐，其中：
R1在每次出现时独立地为核碱基，其中所述核碱基的NH2(如果存在的话)受胺保护基的保护；
R2在每次出现时独立地选自由H、卤基和任选地被卤素或C1-6烷氧基取代的C1-6烷氧基组成的组；
R4在每次出现时独立地为H或与R2的烷氧基形成环；
R16在每次出现时独立地为C1-6烷基、C2-6烯基、苯基或苄基，其各自任选地被-CN、-NO2或卤素取代；或
R16为
R17a和R17b独立地为C1-6烷基
q1为2至200的整数；
X在每次出现时独立地为O或S；且
Z为甲硅烷基羟基保护基。
123.如实施方案121所述的方法，其中：
每个R2独立地选自H、F或任选地被C1-4烷氧基取代的C1-4烷氧基；
R4为H；
R15为4,4'-二甲氧基三苯甲基；
R16为-CH2CH2CN；且
R17a和R17b独立地为C1-6烷基。
124.如实施方案122所述的方法，其中：
每个R2独立地选自H、F或任选地被C1-4烷氧基取代的C1-4烷氧基；
R4为H；
R16为-CH2CH2CN；
R17a和R17b独立地为C1-6烷基；且
Z为甲硅烷基羟基保护基。
125.如实施方案121-124中任一项所述的方法，其中q1为2至10的整数。
126.如实施方案122、124或125所述的方法，其中Z选自TBDPS、TBoDPS和TBDAS。
127.如实施方案121-126中任一项所述的方法，其中所述反应在活化剂存在下进行。
128.如实施方案127所述的方法，其中所述活化剂是三氟乙酸吡啶或三氟甲磺酸N-甲基咪唑。
129.如实施方案121-128中任一项所述的方法，其中所述式(CI)、(CI’)或(C2I)的化合物不通过色谱法纯化。
130.如实施方案121-129中任一项所述的方法，其中所述式(CI)、(CI’)或(C2I)的化合物通过选择性沉淀和/或萃取来纯化。
131.一种用于制备式(CI’)化合物或其盐的液相方法：
其包括以下步骤：
1)使式(CI’A)化合物或其盐：
与式(A1)化合物或其盐：
反应以形成式(CI’B)化合物或其盐：
及
3)用硫化剂或氧化剂硫化或氧化所述式(CI'B)化合物或其盐以形成式(CI’C)化合物或其盐：
4)将所述式(CI'C)化合物或其盐脱保护以形成式(CI’D)化合物或其盐：
5)从所述式(CI’D)化合物开始，重复步骤1)、2)、3)和4)q1-3次，然后重复步骤1)、2)和3)，得到式(CI’)的片段或其盐，其中：
R1在每次出现时独立地为核碱基，其中所述核碱基的NH2(如果存在的话)受胺保护基的保护；
R2在每次出现时独立地选自由H、卤基和任选被C1-6烷氧基取代的C1-6烷氧基组成的组；
R4在每次出现时独立地为H或与R2的烷氧基形成环；
R15为羟基保护基；
R16在每次出现时独立地为C1-6烷基、C2-6烯基、苯基或苄基，其各自任选地被-CN、-NO2或卤素取代；或
R16为
R17a和R17b独立地为C1-6烷基；
q1为2至200的整数；且
X在每次出现时独立地为O或S。
132.一种用于制备式(CIc)的寡核苷酸或其盐的液相方法：
其包括使式(CIa)的寡核苷酸片段或其盐：
与式(CIb)的寡核苷酸片段或其盐：
偶联以形成所述式(CIc)的寡核苷酸，其中：
R1在每次出现时独立地为核碱基，其中所述核碱基的NH2(如果存在的话)受胺保护基的保护；
R2在每次出现时独立地选自由H、卤基和任选被C1-6烷氧基取代的C1-6烷氧基组成的组；
R4在每次出现时独立地为H或与R2的烷氧基形成环；
R15为羟基保护基；
R16在每次出现时独立地为C1-6烷基、C2-6烯基、苯基或苄基，其各自任选地被-CN、-NO2或卤素取代；或
R16为
q1a为2至20的整数；
q1b为2至20的整数；
X在每次出现时独立地为O或S；且
Z为羟基保护基。
133.一种用于制备式(II)的寡核苷酸片段或其盐的液相方法，
其包括以下步骤：1’)将式(IIA’)化合物或其盐:
脱保护，以形成式(IIA)化合物或其盐：
2’)使式(IIA)化合物或其盐与式(A2)化合物或其盐：
反应，以形成式(IIB)化合物或其盐：
及
3’)用硫化剂或氧化剂硫化或氧化所述式(IIB)化合物或其盐以形成式(IIC)化合物或其盐：
4’)将所述式(IIC)化合物或其盐脱保护，以形成式(IID)化合物或其盐：
5’)当m为3时，从所述式(IID)化合物或其盐开始，重复步骤2')和步骤3')以形成式(IIE)化合物或其盐，或
当m大于3时，从所述式(IID)化合物或其盐开始，重复步骤2')、3')和4')m-3次，然后进行步骤2')和步骤3')以形成式(IIE)化合物或其盐：
6’)将所述式(IIE)化合物或其盐脱保护，以形成式(IIF)化合物或其盐：
及
7’)使所述式(IIF)化合物或其盐与亚磷二酰胺(R16O)P(NR17aR17b)2反应，得到式(II)的片段或其盐：
其中：
R1在每次出现时独立地为核碱基，其中所述核碱基的NH2(如果存在的话)受胺保护基的保护；
R2在每次出现时独立地选自由H、卤基和任选被C1-6烷氧基取代的C1-6烷氧基组成的组；
R4在每次出现时独立地为H或与R2的烷氧基形成环；
R15为羟基保护基；
R16在每次出现时独立地为C1-6烷基、C2-6烯基、苯基或苄基，其各自任选地被-CN、-NO2或卤素取代；或
R16为
R17a和R17b独立地为C1-6烷基；
m为2至20的整数；
X在每次出现时独立地为O或S；且
Z为羟基甲硅烷基保护基。
134.如实施方案133所述的方法，其中m为3至10的整数。
135.如实施方案133或134所述的方法，其中所述式(II)的片段不通过色谱法纯化。
136.如实施方案133-135中任一项所述的方法，其中不使用色谱法来纯化步骤1')、2')、3')、4')、5')、6')和7')中任一个的反应产物。
137.如实施方案133-135中任一项所述的方法，其中步骤1')、2')、3')、4')、5')、6')和7')中任一个的所述反应产物通过萃取和/或选择性沉淀来纯化。
138.如实施方案133-137中任一项所述的方法，其中步骤1)和步骤4)中的任一脱保护反应如实施方案85-96任一项中所定义进行。
139.如实施方案133-138中任一项所述的方法，其中步骤6')的脱保护反应如实施方案106-112任一项中所定义进行。
140.如实施方案133-139中任一项所述的方法，其中步骤7')的亚磷酰化反应如实施方案127或128中所定义进行。
141.如实施方案83-140中任一项所述的方法，其中所述化合物或寡核苷酸中的所有P＝X基团都是P＝S。
142.如实施方案83-140中任一项所述的方法，其中所述化合物或寡核苷酸中的所有P＝X基团都是P＝O。
143.如实施方案83-140中任一项所述的方法，其中所述化合物或寡核苷酸中大于10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的P＝X基团是P＝S。
144.如实施方案83-140中任一项所述的方法，其中所述化合物或寡核苷酸中10-90％、20-80％、30-70％或40-60％的P＝X基团是P＝S.
145.如实施方案83-144中任一项所述的方法，其中所述核碱基选自由以下组成的组：胞嘧啶、鸟嘌呤、腺嘌呤、胸腺嘧啶、尿嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、5,6-二氢尿嘧啶、5-甲基胞嘧啶和5-羟甲基胞嘧啶，其中所述核碱基的NH2基团(如果存在的话)受PhCO-、CH3CO-、iPrCO-、Me2N-CH＝或Me2N-CMe＝的保护。
146.如实施方案83-144中任一项所述的方法，其中所述核碱基选自由以下组成的组：胞嘧啶、鸟嘌呤、腺嘌呤、胸腺嘧啶、尿嘧啶和5-甲基胞嘧啶，其中所述核碱基的NH2基团(如果存在的话)受PhCO-、CH3CO-、iPrCO-、Me2N-CH＝或Me2N-CMe＝的保护。
147.如实施方案83-146中任一项所述的方法，其中
每个R2独立地选自由以下组成的组：H、F和任选被C1-4烷氧基取代的C1-4烷氧基；
每个R4独立地为H或与R2的烷氧基形成环，其中所述环为任选被1至3个C1-4烷基取代的5或6元环；
R16为-CH2CH2CN；且
R17a和R17b独立地为C1-4烷基。
148.如实施方案147所述的方法，其中
每个R2独立地选自H或-OCH2CH2OMe；
每个R4为H；
R16为-CH2CH2CN；且
R17a和R17b均为-CH(CH3)2。
Claims (10)
1.一种用于制备式(AI)化合物或其盐的液相方法：
其包括将式(AII)化合物或其盐：
脱保护，其中所述脱保护反应在无水或基本上无水的溶液中进行，且其中：
R1在每次出现时独立地为核碱基，其中所述核碱基的NH2(如果存在的话)受胺保护基的保护；
R2在每次出现时独立地选自由H、卤基和任选被C1-6烷氧基取代的C1-6烷氧基组成的组；
R4在每次出现时独立地为H或与R2的烷氧基形成环；
R15为羟基保护基；
R16在每次出现时独立地为C1-6烷基、C2-6烯基、苯基或苄基，其各自任选地被-CN、-NO2或卤素取代；或
R16为
z为0或1至200的整数；
X在每次出现时独立地为O或S；且
Y为含有烷基链的疏水性羟基保护基。
2.如权利要求1所述的方法，其中R15为4,4'-二甲氧基三苯甲基。
3.如权利要求1或2所述的方法，其中所述脱保护反应在干燥剂的存在下进行。
4.如权利要求3所述的方法，其中所述干燥剂是分子筛。
5.如权利要求4所述的方法，其中分子筛的尺寸是
6.如权利要求1或2所述的方法，其中所述无水或基本上无水的溶液是通过在脱保护反应之前使用共沸蒸馏去除水而获得的。
7.如权利要求1-6中任一项所述的方法，其中所述脱保护反应在包含-SH基、硅烷基、硅氧烷基、聚苯乙烯基、呋喃、吡咯或吲哚的阳离子清除剂存在下进行。
8.如权利要求7所述的方法，其中所述阳离子清除剂为式RSH的化合物，其中R为烷基、环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基，其各自任选地被取代。
9.如权利要求8所述的方法，其中RSH为CH3(CH2)5SH、CH3(CH2)11SH、环己硫醇、CH3CH2OC(＝O)CH2CH2SH。
10.如权利要求1-9中任一项所述的方法，其中所述脱保护反应通过使式(AII)化合物与脱三苯甲基化试剂反应来进行。
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US201962845160P | 2019-05-08 | 2019-05-08 | |
| US62/845,160 | 2019-05-08 | ||
| CN202080044020.2A CN114206897B (zh) | 2019-05-08 | 2020-05-08 | 寡核苷酸的汇聚液相合成 |
| PCT/US2020/032070 WO2020227618A2 (en) | 2019-05-08 | 2020-05-08 | Convergent liquid phase syntheses of oligonucleotides |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202080044020.2A Division CN114206897B (zh) | 2019-05-08 | 2020-05-08 | 寡核苷酸的汇聚液相合成 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN119143828A true CN119143828A (zh) | 2024-12-17 |
Family
ID=70919104
Family Applications (3)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202411234221.5A Pending CN119143828A (zh) | 2019-05-08 | 2020-05-08 | 寡核苷酸的汇聚液相合成 |
| CN202411234328.XA Pending CN119462804A (zh) | 2019-05-08 | 2020-05-08 | 寡核苷酸的汇聚液相合成 |
| CN202080044020.2A Active CN114206897B (zh) | 2019-05-08 | 2020-05-08 | 寡核苷酸的汇聚液相合成 |
Family Applications After (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202411234328.XA Pending CN119462804A (zh) | 2019-05-08 | 2020-05-08 | 寡核苷酸的汇聚液相合成 |
| CN202080044020.2A Active CN114206897B (zh) | 2019-05-08 | 2020-05-08 | 寡核苷酸的汇聚液相合成 |
Country Status (13)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20220348602A1 (zh) |
| EP (1) | EP3966219A2 (zh) |
| JP (1) | JP2022531876A (zh) |
| KR (1) | KR20220007104A (zh) |
| CN (3) | CN119143828A (zh) |
| AU (1) | AU2020268415A1 (zh) |
| BR (1) | BR112021022219A2 (zh) |
| CA (1) | CA3139545A1 (zh) |
| EA (1) | EA202193010A1 (zh) |
| IL (1) | IL287798A (zh) |
| MA (1) | MA55891A (zh) |
| MX (1) | MX2021013587A (zh) |
| WO (1) | WO2020227618A2 (zh) |
Families Citing this family (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AU2013203395A1 (en) | 2012-03-30 | 2013-10-17 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Compositions and methods for modulating TAU expression for reducing seizure and modifying a neurodegenerative syndrome |
| TWI772856B (zh) | 2013-07-19 | 2022-08-01 | 美商百健Ｍａ公司 | 用於調節τ蛋白表現之組合物 |
| IL302825A (en) | 2020-11-11 | 2023-07-01 | Biogen Ma Inc | Oligonucleotides, reagents and preparation thereof |
| AU2022314802A1 (en) * | 2021-07-23 | 2024-02-08 | Biogen Ma Inc. | Methods for reducing tau expression |
| WO2024083746A1 (en) | 2022-10-17 | 2024-04-25 | Bachem Holding Ag | Method and composition for oligonucleotide synthesis |
| GB202305283D0 (en) * | 2023-04-11 | 2023-05-24 | Exactmer Ltd | Liquid-phase process for preparing oligonucleotides |
| JP7433684B1 (ja) | 2023-05-24 | 2024-02-20 | 塩野フィネス株式会社 | 疑似固相保護基、それを用いたヌクレオシド保護体又はオリゴヌクレオチド保護体、オリゴアミダイト前駆体の製造方法 |
Family Cites Families (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| HUT64554A (en) * | 1990-11-20 | 1994-01-28 | Sankyo Co | A process for preparing nucleinic acide derivatives of anesthetic effect and pharmaceutical compositions containing them as active ingredient |
| US5510476A (en) * | 1994-07-07 | 1996-04-23 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Carbocation scavenging during oligonucleotide synthesis |
| EP2548560B1 (en) | 2005-06-23 | 2015-06-03 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Compositions and methods for modulation of SMN2 splicing |
| LT3305302T (lt) | 2009-06-17 | 2018-12-10 | Biogen Ma Inc. | Junginiai ir būdai smn2 splaisingo moduliavimui subjekte |
| US20120184724A1 (en) * | 2009-09-22 | 2012-07-19 | Agilent Technologies, Inc. | Protected monomers and methods of deprotection for rna synthesis |
| CN103476784B (zh) * | 2011-05-17 | 2017-05-24 | 味之素株式会社 | 制备寡核苷酸的方法 |
| US8846885B2 (en) | 2012-02-17 | 2014-09-30 | Ajinomoto Co., Inc. | Oligonucleotide with protected base |
| EP3296306B1 (en) * | 2012-02-17 | 2022-11-09 | Ajinomoto Co., Inc. | Base-protected oligonucleotide |
| EP2857412B1 (en) * | 2012-05-30 | 2017-01-11 | Hokkaido System Science Co., Ltd. | Oligonucleotide synthesis method using highly dispersible liquid-phase support |
| ES2818236T3 (es) | 2014-04-01 | 2021-04-09 | Biogen Ma Inc | Composiciones para modular la expresión de SOD-1 |
| JP7027889B2 (ja) | 2015-12-16 | 2022-03-02 | 味の素株式会社 | オリゴヌクレオチドの製造方法、およびヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド |
| JPWO2017111137A1 (ja) | 2015-12-22 | 2018-10-18 | 味の素株式会社 | オリゴヌクレオチドの製造方法 |
-
2020
- 2020-05-08 CN CN202411234221.5A patent/CN119143828A/zh active Pending
- 2020-05-08 MA MA055891A patent/MA55891A/fr unknown
- 2020-05-08 BR BR112021022219A patent/BR112021022219A2/pt unknown
- 2020-05-08 JP JP2021565931A patent/JP2022531876A/ja active Pending
- 2020-05-08 KR KR1020217039894A patent/KR20220007104A/ko active Pending
- 2020-05-08 WO PCT/US2020/032070 patent/WO2020227618A2/en unknown
- 2020-05-08 US US17/608,802 patent/US20220348602A1/en active Pending
- 2020-05-08 CN CN202411234328.XA patent/CN119462804A/zh active Pending
- 2020-05-08 CA CA3139545A patent/CA3139545A1/en active Pending
- 2020-05-08 MX MX2021013587A patent/MX2021013587A/es unknown
- 2020-05-08 EA EA202193010A patent/EA202193010A1/ru unknown
- 2020-05-08 EP EP20729413.3A patent/EP3966219A2/en active Pending
- 2020-05-08 AU AU2020268415A patent/AU2020268415A1/en active Pending
- 2020-05-08 CN CN202080044020.2A patent/CN114206897B/zh active Active
-
2021
- 2021-11-02 IL IL287798A patent/IL287798A/en unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2020227618A2 (en) | 2020-11-12 |
| MA55891A (fr) | 2022-03-16 |
| BR112021022219A2 (pt) | 2022-03-22 |
| CN114206897A (zh) | 2022-03-18 |
| MX2021013587A (es) | 2022-02-11 |
| IL287798A (en) | 2022-01-01 |
| EA202193010A1 (ru) | 2022-03-18 |
| AU2020268415A8 (en) | 2022-01-20 |
| AU2020268415A1 (en) | 2021-12-23 |
| CN119462804A (zh) | 2025-02-18 |
| EP3966219A2 (en) | 2022-03-16 |
| US20220348602A1 (en) | 2022-11-03 |
| JP2022531876A (ja) | 2022-07-12 |
| CN114206897B (zh) | 2024-09-20 |
| WO2020227618A8 (en) | 2020-12-24 |
| CA3139545A1 (en) | 2020-11-12 |
| WO2020227618A3 (en) | 2021-01-14 |
| KR20220007104A (ko) | 2022-01-18 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN119143828A (zh) | 寡核苷酸的汇聚液相合成 | |
| JP6490133B2 (ja) | 官能化核酸の合成のための方法 | |
| JP7402696B2 (ja) | 合成のための化合物、組成物、及び方法 | |
| JP6770553B2 (ja) | アルコキシフェニル誘導体、ヌクレオシド保護体およびヌクレオチド保護体、オリゴヌクレオチド製造方法、ならびに、置換基除去方法 | |
| JP2024523237A (ja) | 官能化されたｎ－アセチルガラクトサミンヌクレオシド | |
| JP2023551647A (ja) | オリゴヌクレオチド、試薬、及びその調製 | |
| EA046382B1 (ru) | Конвергентные жидкофазные синтезы олигонуклеотидов | |
| EP3906997A2 (en) | Macroporous controlled porosity silica gel suitable for oligonucleotide synthesis | |
| EP3778616A1 (en) | Optically active segment for stereocontrolled oligonucleotide synthesis, production method for same, and stereocontrolled oligonucleotide synthesis method using same | |
| JP7433684B1 (ja) | 疑似固相保護基、それを用いたヌクレオシド保護体又はオリゴヌクレオチド保護体、オリゴアミダイト前駆体の製造方法 | |
| CN119451971A (zh) | 具有增强的稳定性的核苷酸替代物 | |
| JP2023510921A (ja) | Ｃ－ｐ結合をモジュールエナンチオダイバージェント合成するための試薬およびその使用 | |
| JP2023553069A (ja) | ホスホロジチオエートオリゴヌクレオチドの新規合成 | |
| JP2020203902A (ja) | アルコキシフェニル誘導体、ヌクレオシド保護体およびヌクレオチド保護体、オリゴヌクレオチド製造方法、ならびに、置換基除去方法 | |
| EP4308580A1 (en) | Chiral synthons for the synthesis of chiral phosphorothioates | |
| WO2023241587A1 (zh) | 环膦酸酯修饰的核苷酸 | |
| WO2022255469A1 (ja) | ホスホロチオエート及びボラノホスフェートを含むキメラ型核酸オリゴマー、及びその製造方法 | |
| WO2025015676A1 (zh) | 碳环核苷、寡核苷酸及其制备方法和医药用途 | |
| CN118339173A (zh) | 制备多核苷酸的方法 | |
| CN116848121A (zh) | 制备shp2抑制剂的方法 | |
| CN114853829A (zh) | 一种核酸配体、其缀合物、制备方法及用途 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |