CN119137258A

CN119137258A - 噬菌体抗性乳酸菌

Info

Publication number: CN119137258A
Application number: CN202380037684.XA
Authority: CN
Inventors: 托马斯·简森; 迪特·埃勒高·克里斯琴森
Original assignee: Section Hansen Co ltd
Current assignee: Section Hansen Co ltd
Priority date: 2022-05-17
Filing date: 2023-05-15
Publication date: 2024-12-13
Also published as: WO2023222575A1; MX2024013357A; EP4526427A1; AR129336A1; KR20250010595A

Abstract

本发明涉及噬菌体抗性乳酸菌、包含该细菌的组合物、以及用该细菌或包含该细菌的组合物获得的发酵食品。

Description

噬菌体抗性乳酸菌

发明领域

本发明涉及噬菌体抗性乳酸菌、包含该细菌的组合物以及用该细菌制造的发酵食品。

发明背景

食品工业在发酵食品的生产中使用了大量的细菌，尤其是乳酸菌。乳酸菌的选择影响发酵食品的特性，例如，如味道、质构和保质期。

由于噬菌体感染而导致的生产失败被认为是细菌培养工业应用中的主要问题之一。对于在工业中使用的许多细菌菌株(如多个种的乳酸菌(例如乳球菌属的种(Lactococcus sp.)、乳酸菌属的种(Lactobacillus sp.)、明串珠菌属的种(Leuconostocsp.)、片球菌属的种(Pediococcus sp.)或链球菌属的种(Streptococcus sp.))，已发现噬菌体。

在食品工业中，乳酸菌发酵剂广泛用于食品发酵。导致乳酸菌发酵剂中经常发生噬菌体感染的一个因素是包括乳制品行业在内的食品工业的发酵条件通常是非无菌的。因此，在这些工业条件下，尚无法消除噬菌体污染。

噬菌体的裂解过程包括噬菌体吸附到宿主细胞表面、噬菌体DNA注入到细胞内、合成噬菌体蛋白、复制噬菌体DNA、组装子代噬菌体和从宿主释放子代。干扰任何这些事件的细胞介导机制可以防止噬菌体感染。在工业使用期间，细菌培养物抗噬菌体感染的能力在很大程度上取决于宿主菌株影响上述一种或更多种机制的特征。

为了满足行业的要求，有必要提出新型噬菌体抗性乳酸菌菌株，特别是嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)。

发明概述

在第一方面，本发明涉及乳酸菌，与其母本菌株相比，其对DSM 34256和/或DSM34257具有增强的噬菌体抗性。

在第二方面，本发明涉及包含本发明的乳酸菌的组合物。

在第三方面，本发明涉及生产发酵食品的方法，其包括用本发明的乳酸菌或本发明的组合物对基质发酵。

在第四方面，本发明涉及包含本发明的乳酸菌的发酵食品或可通过本发明的方法获得的发酵食品。

发明详述

在更详细地概述本发明之前，先定义一组术语和惯例：

术语“属”是指在网站：www.ncbi.nlm.nih.gov/taxonomy上定义的属。如本文所用的细菌“菌株”是指生长或繁殖时在遗传上保持不变的细菌。包括多种相同的细菌。

在本上下文中，术语“突变体”或“突变株”应理解为衍生的菌株或可以通过例如基因工程、辐射和/或化学处理而从本发明的菌株衍生的菌株。突变体优选是功能等效的突变体，例如具有与其来源的菌株基本相同或改善的性质(例如质构、剪切应力、粘度、凝胶硬度、口腔包覆感、风味、后酸化、酸化速度和/或噬菌体稳健性)的突变体。此类突变体是本发明的一部分。特别地，术语“突变体”是指使本发明的菌株经历任何常规使用的诱变处理(包括用例如乙烷甲烷磺酸盐(EMS)或N-甲基-N'-硝基-N-硝基胍(NTG)等化学诱变剂、UV光处理)而获得的菌株，或自发产生的突变体。突变体可能已经历数次诱变处理(单次处理应理解为一个诱变步骤，接着是筛选/选择步骤)，但目前优选执行不超过20次或不超过10次或不超过5次处理(或筛选/选择步骤)。在目前优选的突变体中，相比母本菌株，细菌基因组中小于5％、或小于1％或甚至小于0.1％的核苷酸被另一种核苷酸替换，或被缺失。如本领域技术人员清楚的那样，本发明的突变体也可以是母本菌株。

在本上下文中，术语“变体”或“变株”应理解为功能与本发明的菌株等效的菌株，例如具有基本上相同或改善的性质或特征(例如质构、酸化速度、粘度、凝胶硬度、口腔包覆感、风味、后酸化和/或噬菌体稳健性)。可使用适当的筛选技术鉴定的此类变体是本发明的一部分。

就乳杆菌属的菌株而言，术语“CFU”是指菌落形成单位，通过在厌氧条件下37℃孵育3天的MRS琼脂平板上的生长(形成菌落)来确定。MRS琼脂具有如下组成(g/l)：

Bacto示蛋白胨3号：10.0

Bacto牛肉浸膏：10.0

Bacto酵母浸膏：5.0

右旋糖：20.0

山梨醇单油酸酯复合物：1.0

柠檬酸铵：2.0

醋酸钠：5.0

硫酸镁：0.1

硫酸锰：0.05

磷酸氢二钾：2.0

Bacto琼脂：15.0

Milli-Q水：1000ml。

将pH调节至5.4或6.5：将鼠李糖乳杆菌(L.rhamnosus)、干酪乳杆菌(L.casei)和副干酪乳杆菌(L.paracasei)的pH调节至6.5。对于所有其他乳杆菌种，将pH调节至5.4。尤其是，将德氏乳杆菌保加利亚亚种(L.delbrueckii subsp.bulgaricus)、嗜酸乳杆菌(L.acidophilus)和瑞士乳杆菌(L.helveticus)的pH调节至5.4。将鼠李糖乳杆菌、干酪乳杆菌和副干酪乳杆菌的pH调节至6.5。

就嗜热链球菌而言，术语“CFU”是指菌落形成单位，通过于厌氧条件下37℃孵育3天在M17琼脂平板上的生长(形成菌落)来确定。M17琼脂具有如下组成(g/l)：

胰蛋白胨：2.5g

肉胃酶消化物：2.5g

大豆粉木瓜蛋白酶消化物：5.0g

酵母浸膏：2.5g

肉浸膏：5.0g

乳糖：5.0g

甘油磷酸钠：19.0g

七水硫酸镁：0.25g

抗坏血酸：0.5g

琼脂：15.0g

Milli-Q水：1000ml。

将pH调节至最终pH7.1±0.2(25℃)

噬菌体抗性乳酸菌。

噬菌体抗性突变株可以通过将噬菌体敏感的母本菌株暴露于所需的一种或多种噬菌体来产生，例如通过在所需噬菌体的浓度足以在所述菌株上诱导选择压力的情况下培养噬菌体敏感的母本菌株。产生噬菌体抗性突变体的方法之前已经描述过。本发明的噬菌体抗性突变体可以通过实施例中所述的方法获得。在第一方面，本发明涉及与其母本菌株相比对DSM 34256和/或DSM 34257具有增强的噬菌体抗性的乳酸菌。

此外，可能希望增加由这种菌株提供的质构。在这种情况下，应选用具有增强质构特性的噬菌体抗性突变体。具有增强质构特性(如粘度)的本发明的噬菌体抗性突变体可以通过实施例中所述的方法获得。在一个实施方案中，本发明涉及本发明的乳酸菌，其中该细菌与其母本菌株相比具有增加的粘度。

应理解，噬菌体抗性可以通过使用源自许多种的菌株通过所述方法获得。然而，在本发明中优选的种是嗜热链球菌。在一个实施方案中，本发明涉及本发明的乳酸菌，其中该细菌属于嗜热链球菌的种。

任何嗜热链球菌菌株可以用作母本菌株。本发明的母本菌株优选为嗜热链球菌菌株DSM 34236或其突变体和变体。在一个实施方案中，本发明涉及本发明的乳酸菌，其中母本菌株是DSM 34236。

来源于母本菌株的优选突变体可以是与其母本菌株相比具有改进的噬菌体抗性和任选增加的粘度的任何突变体。在一个实施方案中，本发明涉及本发明的乳酸菌，其中该细菌选自DSM 34235及其突变体和变体。

如本文所使用，缩写为“LAB”的术语“乳酸菌”表示革兰氏阳性、微需氧或厌氧细菌，其通过产生酸来发酵糖，包括乳酸(其为主要产生的酸)、乙酸和丙酸。工业上最有用的乳酸菌属于“乳杆菌目”，其包括乳球菌属的种(Lactococcus spp.)、链球菌属的种(Streptococcus spp.)、乳杆菌属的种(Lactobacillus spp.)、明串珠菌属的种(Leuconostoc spp.)、假明串珠菌属的种(Pseudoleuconostoc spp.)、片球菌属的种(Pediococcus spp.)、短杆菌属的种(Brevibacterium spp.)、肠球菌属的种(Enterococcus spp.)和丙酸杆菌属的种(Propionibacterium spp.)。此外，产乳酸的细菌属于严格厌氧细菌群的组，双歧杆菌，即双歧杆菌属，通常被包括在乳酸菌群中。这些常单独用作食物培养物或与其他乳酸菌结合使用。乳酸菌(包括乳杆菌的种的细菌和嗜热链球菌)通常冷冻或冻干培养物(以获得大量发酵剂增殖)或所谓的“直投式酸奶发酵剂(DirectVat Set)”(DVS)培养物供应给乳品行业，旨在直接接种到发酵容器或缸中以生产乳制品，例如发酵乳制品。这种培养物通常称为“发酵剂(starter cultures)”或“发酵剂(starters)”。

术语“提高的噬菌体抗性”表示，当在噬斑试验(例如实施例中所述的“通过琼脂覆盖(overlay)法测定噬菌体抗性”)中测试时，该菌株对至少一种噬菌体具有改进的噬菌体抗性，其表示为与相同噬菌体在亲本菌株上获得的pfu/mL相比，使用所述至少一种噬菌体在给定菌株上可获得的pfu/mL(每mL空斑形成单位)的差异。具有改进的噬菌体抗性的菌株优选显示pfu/mL降低至少50倍、至少100倍、至少500倍、至少1000倍、至少5000倍、至少10000倍或更多。

组合物

如本文所述，本发明的乳酸菌可用于组合物中，更具体地用于制备发酵食品或饲料产品的发酵剂中。在一方面，本发明涉及包含本发明的乳酸菌的组合物。

由于在乳酸菌发酵工艺的生产中应用乳酸菌的混合培养物是正常的，因此该组合物在一些实施方案中将包含属于同一物种或属于不同物种的多种菌株。

在一个实施方案中，本发明的组合物，作为混合物或作为成套试剂盒还包含属于乳酸菌属的一种或更多种菌株。

在一个实施方案中，属于乳酸菌属的一种或更多种菌株可选自德氏乳杆菌(L.delbrueckii)、德氏乳杆菌保加利亚亚种(L.delbrueckii subsp bulgaricus)、德氏乳杆菌乳酸亚种(L.delbrueckii subsp.lactis)。

在一个实施方案中，本发明的乳杆菌菌株是德氏乳杆菌保加利亚亚种。德氏乳杆菌是经常用于商业性乳发酵的乳酸菌，其中生物体通常用作混合发酵剂的一部分。在一个实施方案中，本发明的组合物中的至少一种乳酸菌菌株是德氏乳杆菌保加利亚亚种。

在本发明的组合物的一个实施方案中，其中保加利亚乳杆菌菌株选自DSM 19251；DSM 19252；DSM 22586；DSM 26419；DSM 28910；DSM 32092；DSM 33515以及其突变体和变体。

在一个实施方案中，组合物和/或混合物或成套试剂盒包含嗜热链球菌菌株DSM34235或其突变体和变体和属于乳杆菌种的菌株。因此，在优选的实施方案中，组合物和/或混合物或成套试剂盒包含嗜热链球菌菌株DSM 34235或其突变体或变体和属于德氏乳杆菌保加利亚亚种种的菌株。因此，在优选的实施方案中，组合物和/或混合物或成套试剂盒包含嗜热链球菌菌株DSM 34235或其突变体或变体和选自以下的属于保加利亚乳杆菌的种的菌株：DSM 19251；DSM 19252；DSM 22586；DSM 26419；DSM 28910；DSM 32092；DSM 33515；以及其突变体和变体。

除了本发明的乳酸菌外，组合物还可以包含嗜热链球菌菌株。在一个实施方案中，组合物作为混合物或作为成套试剂盒还包含一种或更多种嗜热链球菌菌株。在一个实施方案中，本发明的组合物作为混合物或作为成套试剂盒包含一种或更多种选自以下的嗜热链球菌菌株：DSM 17876；DSM 18111；DSM 19242；DSM 21408；DSM 22585；DSM 22587；DSM22588；DSM 22589；DSM 22935；DSM 24023；DSM 25012；DSM 26562；DSM 32503；DSM 32826；DSM 33869；以及其突变体和变体。

在一个实施方案中，组合物和/或混合物或成套试剂盒包含嗜热链球菌菌株DSM34235或其突变体和变体和属于链球菌属的种的菌株。因此，在优选的实施方案中，组合物和/或混合物或成套试剂盒包含嗜链球菌菌株DSM 34235或其突变体或变体和属于嗜热链球菌的种的菌株。因此，在优选的实施方案中，组合物和/或混合物或成套试剂盒包含嗜热链球菌菌株DSM 34235或其突变体或变体和选自以下的属于嗜热链球菌的种的菌株：DSM17876；DSM 18111；DSM 19242；DSM 21408；DSM 22585；DSM 22587；DSM 22588；DSM 22589；DSM 22935；DSM 24023；DSM 25012；DSM 26562；DSM 32503；DSM 32826；DSM 33869；以及其突变体和变体。

在一个实施方案中，本发明的组合物，作为混合物或作为成套试剂盒还包含属于乳球菌属的种的一种或更多种菌株。在一个实施方案中，属于乳球菌属的一种或更多种菌株可选自由以下组成的组：乳酸乳球菌(L.lactis)；乳酸乳球菌乳酸亚种(L.lactis subsplactis)；乳酸乳球菌乳脂亚种(L.lactis subsp.cremoris)。在一个实施方案中，本发明的组合物作为混合物或作为成套试剂盒还包含一种或更多种乳球菌属的菌株，其选自DSM21404；DSM 33192；DSM 21405；及其突变体和变体。

在一个实施方案中，本发明的组合物作为混合物或作为成套试剂盒还包含属于片球菌属的种的一种或更多种菌株。

在一个实施方案中，属于片球菌属的一种或更多种菌株可以是乳酸片球菌(Pediococcus acidilactis)菌株。在一个实施方案中，本发明的组合物作为混合物或作为成套试剂盒还包含一种或更多种乳酸片球菌菌株，其选自DSM 28307和其突变体和变体。

本发明的组合物可以包含益生菌。益生菌菌株可以在发酵前或发酵后添加。如果在发酵前添加，益生菌菌株也充当发酵细菌。术语“益生菌”是指为在消费者中达到促进健康的效果而对消费者足量施用的活细菌。益生菌在摄入后能够在胃肠道条件下存活，并在消费者的肠道中定植。

应理解，乳杆菌属分类学已于2020年更新。新的分类学在Zheng et al.2020中公开，且如果未另行指示，本文将沿用该分类学。出于本发明的目的，下表列出了与本发明相关的一些乳杆菌种的新名称和旧名称。

表1.与本发明相关的一些乳杆菌种的新名称和旧名称。

在本发明的一个实施方案中，益生菌菌株选自由以下组成的组：乳杆菌属细菌，如嗜酸乳杆菌、副干酪乳酪杆菌、鼠李糖乳酪杆菌、干酪乳酪杆菌、德氏乳杆菌、发酵黏液乳杆菌、乳酸乳杆菌、植物乳植杆菌、罗伊氏粘液乳杆菌和约氏乳杆菌，双歧杆菌属细菌，如长双歧杆菌、青春双歧杆菌、两岐双岐杆菌、短双歧杆菌、动物双歧杆菌乳酸亚种、齿双歧杆菌、链状双歧杆菌、角双歧杆菌、大双歧杆菌、假链状双歧杆菌和婴儿双歧杆菌等。

在本发明的一个实施方案中，益生菌乳杆菌菌株选自由以下组成的组：嗜酸乳杆菌、副干酪乳酪杆菌、鼠李糖乳酪杆菌、干酪乳酪杆菌、德氏乳杆菌、乳酸乳杆菌、植物乳植杆菌、罗伊氏粘液乳杆菌和约氏乳杆菌。在本发明的一个实施方案中，益生菌菌株是以DSM13241保藏的嗜酸乳杆菌

在本发明的一个实施方案中，益生菌乳杆菌菌株选自由鼠李糖乳杆菌菌株、副干酪乳酪杆菌菌株和发酵黏液乳杆菌菌株组成的组。在本发明的一个实施方案中，益生菌菌株是鼠李糖乳杆菌菌株DSM 33870或以ATCC 53103保藏的在本发明的一个实施方案中，益生菌菌株是副干酪乳酪杆菌菌株DSM 19465或以ATCC 55544保藏的CRL 431。在本发明的一个实施方案中，益生菌菌株是发酵黏液乳杆菌菌株DSM 22584。

在本发明的一个实施方案中，益生菌双歧杆菌菌株选自由以下组成的组：长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)、青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentis)、两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)、短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)、动物双歧杆菌乳亚种(Bifidobacterium animalis subsp.lactis)、齿双歧杆菌(Bifidobacteriumdentium)、链状双歧杆菌(Bifidobacterium catenulatum)、角双歧杆菌(Bifidobacteriumangulatum)、大双歧杆菌(Bifidobacterium magnum)、假链状双歧杆菌(Bifidobacteriumpseudocatenulatum)和婴儿双歧杆菌(Bifidobacteriuminfantis)。在本发明的一个实施方案中，益生菌双歧杆菌菌株是动物双歧杆菌乳酸亚种。在本发明的一个实施方案中，动物双歧杆菌乳亚种是DSM 33868或以DSM 15954保藏的

上述混合物或成套试剂盒可进一步与其他乳酸菌组合，例如但不限于益生菌。在一个实施方案中，一种或更多种乳酸菌选自由以下组成的组：双歧杆菌如动物双歧杆菌乳酸亚种(例如)、嗜酸乳杆菌(例如

)、鼠李糖乳酪杆菌(例如及其任何组合。应用哪种双歧杆菌、嗜酸乳杆菌和/或鼠李糖乳酪杆菌取决于它们的应用和待生产的食物。

包含菌株的表述“成套试剂盒”是指菌株或菌株培养物是物理分离的，但意在一起使用。因此，嗜热链球菌菌株和乳酸杆菌菌株的菌株或培养物在不同的盒子或密封小袋中。在一个实施方案中，嗜热链球菌菌株和乳杆菌，例如德氏乳杆菌保加利亚亚种、嗜酸乳杆菌、干酪乳酪杆菌、副干酪乳酪杆菌和/或罗伊氏粘液乳杆菌菌株处于相同的形式，即以冷冻形式、以丸或冷冻丸形式、粉末形式，例如干燥或冻干粉末。

在一个实施方案中，本发明涉及本发明的组合物，其作为混合物或作为成套试剂盒包含一种或多种益生菌菌株，其选自双歧杆菌、嗜酸乳杆菌、干酪乳酪杆菌(曾为干酪乳杆菌)、副干酪乳酪杆菌(曾为副干酪乳杆菌)、鼠李糖乳酪杆菌(曾为鼠李糖乳杆菌)和发酵黏液乳杆菌(曾为发酵乳杆菌)。

在一个实施方案中，本发明的组合物包含浓缩形式的细菌，其中活细胞的总浓度在每克组合物10⁴至10¹²cfu(集落形成单位)的范围内，包括每克组合物至少10⁴cfu，例如至少10⁵cfu/g，例如至少10⁶cfu/g，例如至少10⁷cfu/g，例如至少10⁸cfu/g，例如至少10⁹cfu/g，例如至少10¹⁰cfu/g，例如至少10¹¹cfu/g。

在一个实施方案中，本发明的组合物包含浓缩形式的细菌，其中每种活细胞菌株的浓度在每克组合物10⁴至10¹²cfu(菌落形成单位)的范围内，包括每克组合物至少10⁴cfu，例如至少10⁵cfu/g，例如至少10⁶cfu/g，例如至少10⁷cfu/g，例如至少10⁸cfu/g，例如至少10⁹cfu/g，例如至少10¹⁰cfu/g，例如至少10¹¹cfu/g。

在本发明的一个实施方案中，组合物包含10⁴至10¹²CFU(菌落形成单位)/g的嗜热链球菌菌株，10⁵至10¹¹CFU/g、10⁶至10¹⁰CFU/g或10⁷至10⁹CFU/g的嗜热链球菌菌株。

在一个实施方案中，组合物还包含10⁴至10¹²CFU/g的乳杆菌菌株，10⁵至10¹¹CFU/g、10⁶至10¹⁰CFU/g或10⁷至10⁹CFU/g的乳杆菌菌株。

在一个实施方案中，组合物包含10⁴至10¹²CFU/g、10⁵至10¹¹CFU/g、10⁶至10¹⁰CFU/g、或10⁷至10⁹CFU/g的德氏乳杆菌保加利亚亚种、嗜酸乳杆菌、干酪乳酪杆菌、副干酪乳酪杆菌和/或罗伊氏粘液乳杆菌菌株中的每一种。

嗜热链球菌、乳杆菌和乳酪杆菌，例如德氏乳杆菌保加利亚亚种、嗜酸乳杆菌、干酪乳酪杆菌、副干酪乳酪杆菌和/或鼠李糖乳杆菌和其他乳酸菌通常用作发酵剂，用于各种食品生产中的技术目的，例如在乳制品工业中，例如用于发酵乳制品。因此，在另一个优选实施方案中，组合物是发酵剂。组合物可以是发酵剂，例如酸奶发酵剂。

组合物和/或发酵剂可以是冷冻、喷雾干燥、冷冻干燥、真空干燥、风干、托盘干燥或液体形式。通常，通过配制具有低水活度的产品，可以延长组合物和/或发酵剂的储存稳定性。通过控制水活度(Aw)，可以预测和调节水分迁移对产品的影响。因此，可能优选的是，本文干燥组合物的水活度(Aw)在0.01-0.8的范围内，优选在0.05-0.4的范围内。

该组合物可以包含其它组分，例如冷冻保护剂和/或常规添加剂，包括营养物，例如酵母提取物、糖和维生素。

本发明的组合物可以以多种形式提供。其可以是粉末、丸或片剂。其可以是冷冻形式、干燥形式、冻干形式或液体形式。因此，在一个实施方案中，组合物为冷冻、干燥、冻干或液体形式。在一个实施方案中，本发明的组合物，其中所述组合物为冷冻、冻干或液体形式。

本发明的组合物可以还包含冷冻保护剂、冻干保护剂、抗氧化剂、营养物、填充剂、香料或其混合物。组合物优选包含冷冻保护剂、冻干保护剂、抗氧化剂和/或营养物中的一种或更多种，更优选冷冻保护剂、冻干保护剂和/或抗氧化剂，且最优选冷冻保护剂或冻干保护剂，或两者。使用所属领域技术人员已知的保护剂如冷冻保护剂和冻干保护剂。合适的冷冻保护剂或冻干保护剂包括单糖、二糖、三糖和多糖(例如葡萄糖、甘露糖、木糖、乳糖、蔗糖、海藻糖、棉子糖、麦芽糖糊精、淀粉和阿拉伯树胶(金合欢胶)等)、多元醇(例如赤藓糖醇、甘油、肌醇、甘露醇、山梨醇、苏糖醇、木糖醇等)、氨基酸(例如脯氨酸、谷氨酸)、混合物质(例如脱脂乳、蛋白胨、明胶、酵母提取物)和无机化合物(例如三聚磷酸钠)。

在一个实施方案中，根据本发明的组合物可包含选自由以下组成的组的一种或更多种冷冻保护剂：肌苷-5'-单磷酸(IMP)、腺苷-5'-单磷酸(AMP)、鸟苷-5'-单磷酸(GMP)、尿苷(uranosine)-5'-单磷酸(UMP)、胞苷-5'-单磷酸(CMP)、腺嘌呤、鸟嘌呤、尿嘧啶、胞嘧啶、腺苷、鸟苷、尿苷、胞苷、次黄嘌呤、黄嘌呤、次黄嘧啶、乳清苷、胸苷、肌苷和任何此类化合物的衍生物。合适的抗氧化剂包括抗坏血酸、柠檬酸及其盐、没食子酸盐、半胱氨酸、山梨醇、甘露醇、麦芽糖。合适的营养素包括糖类、氨基酸、脂肪酸、矿物质、微量元素、维生素(如维生素B族、维生素C)。组合物可以任选地包含另外的物质，包括填充剂(如乳糖、麦芽糖糊精)和/或香料。

在本发明的一个实施方案中，冷冻保护剂是剂或剂的混合物，除了其冷冻保护性之外，其具有增强效应。词语“增强效应”用于描述这样的情况，其中当将冷冻保护剂接种到待发酵或转化的培养基中时，冷冻保护剂赋予解冻或复溶的培养物增加的代谢活性(增强效应)。活力和代谢活性并非同义概念。商业性冷冻培养物或冻干培养物可保持其活力，但是它们可能失去了很大一部分代谢活性，例如，即使保存时间较短，培养物可能失去其产酸(酸化)活性。因此，活力和增强效应必须通过不同的测定来评价。活力通过活力测定(如测定集落形成单位)进行评估，而增强效应通过相对于培养物的活力量化解冻或复溶培养物的相关代谢活性进行评估。术语“代谢活性”是指培养物的除氧活性、其产酸活性，即产生例如乳酸、乙酸、甲酸和/或丙酸，或其产生代谢产物的活性，例如产生芳香化合物如乙醛、(α-乙酰乳酸、乙偶姻、二乙酰和2,3-丁二醇(丁二醇))。

在一个实施方案中，本发明的组合物含有或包含以材料的％w/w计0.2％至20％的冷冻保护剂或剂混合物。然而，优选按重量以0.2％至15％、0.2％至10％、0.5％至7％和1％至6％范围内的量添加冷冻保护剂或剂混合物，包括按重量以冷冻材料的％w/w计2％至5％范围内的冷冻保护剂或剂混合物。在一个优选的实施方案中，培养物包含约3％的冷冻保护剂或剂混合物，按重量以材料的％w/w计。大约3％的冷冻保护剂的量对应于100mM范围内的浓度。应当认识到，对于本发明实施方案的每个方面，范围可为所述范围的增量。

在本上下文中，术语“从x％到y％”是指包括终点，因此等于术语“从x％到y％,包括x％和y％”。

在另一方面，本发明的组合物含有或包含铵盐(例如有机酸的铵盐(例如甲酸铵和柠檬酸铵)或无机酸的铵盐)作为细菌细胞，例如属于嗜热链球菌种的细胞，例如(实质上)脲酶阴性细菌细胞的增强剂(例如生长增强剂或酸化增强剂)。术语“铵盐”、“甲酸铵”等应理解为盐的来源或离子的组合。例如“甲酸铵”或“铵盐”的术语“来源”是指当添加到细胞培养物中时提供甲酸铵或铵盐的化合物或化合物的混合物。在一些实施方案中，铵源将铵释放到生长培养基中，而在其他实施方案中，铵源代谢以产生铵。在一些优选的实施方案中，铵源是外源性的。在一些特别优选的实施方案中，铵不是由乳基质提供的。当然应当理解，可以添加氨而不是铵盐。因此，术语铵盐包括氨(NH₃)、NH₄OH、NH₄ ⁺等。

在一个实施方案中，本发明的组合物可以包含增稠剂和/或稳定剂，例如果胶(例如HM果胶、LM果胶)、明胶、CMC、大豆纤维/大豆聚合物、淀粉、改性淀粉、角叉菜胶、藻酸盐和瓜尔胶。

在一个实施方案中，其中所述微生物产生多糖(如EPS)，多糖导致酸化乳制品中的高/粘稠质构，生产的酸化乳制品基本不添加或完全不添加任何增稠剂和/或稳定剂，例如果胶(例如HM果胶、LM果胶)、明胶、CMC、大豆纤维/大豆聚合物、淀粉、改性淀粉、角叉菜胶、藻酸盐和瓜尔胶。基本上没有应理解为产品包含0％至20％(w/w)(例如从0％至10％、从0％至5％或从0％至2％或从0％至1％)的增稠剂和/或稳定剂。

如前所述，微生物物种之间的相互作用至关重要——不仅在生长方面，在流变特性(如质构)和味觉开发方面也是如此。

生产发酵产品的方法。

本发明的一个方面涉及生产发酵食品的方法，其包括将本文所述的发酵剂组合物添加到食品起始原料中，并将如此接种的起始原料保持在乳酸菌有代谢活性的条件下。

有用的食品起始原料，即基质，包括通常经受乳酸菌发酵的任何材料，如乳、蔬菜材料、肉制品、果汁、未发酵葡萄汁(must)、生面团和面糊。

通过该方法获得的发酵产品包括作为典型实例的乳制品，例如包括新鲜奶酪制品的奶酪和酪乳。

根据本发明的乳酸菌的另一个重要应用是将细菌培养物用作所谓的益生菌。在本上下文中，术语“益生菌”是指微生物培养物，当其以活细胞的形式被人或动物摄入时，其通过抑制胃肠道中的有害微生物、通过增强免疫系统或通过促进营养物的消化，从而改善健康状况。

术语“乳”应理解为通过给任何哺乳动物，例如奶牛、绵羊、山羊、水牛或骆驼挤奶而获得的乳分泌物。在优选的实施方案中，乳是牛乳。术语乳还包括由植物材料制成的蛋白质/脂肪溶液。合适的植物材料可以是豆类、坚果或谷物。首选的豆类包括大豆、豌豆、菜豆、羽扇豆和扁豆。首选坚果包括椰子、杏仁、腰果和核桃。首选谷物包括燕麦、小麦、黑麦和小米。乳可来自哺乳动物、植物材料或其任意组合。

术语“乳基质”可以是可根据本发明的方法而进行发酵的任何生乳和/或加工乳材料。因此，有用的乳基质包括(但不限于)包含蛋白质的任何乳或乳状产品的溶液/悬浮液，例如全脂或低脂乳、脱脂乳、酪乳、复原奶粉、炼乳、干乳、乳清、乳清渗透物、乳糖、由乳糖结晶获得的母液、乳清蛋白浓缩物或乳脂。显然，乳基质可来源于任何哺乳动物，例如基本上纯的哺乳动物乳，或复原奶粉，或者乳基质可以全部或部分来源于植物材料，即如上所述的植物乳。优选地，乳基质中的至少部分蛋白质是(ⅰ)哺乳动物乳中天然存在的蛋白质，例如酪蛋白或乳清蛋白，或(ⅱ)植物乳中天然存在的蛋白质。然而，部分蛋白质可能是乳中天然不存在的蛋白质。

在发酵之前，乳基质可根据所属领域中已知的方法进行均质化和巴氏灭菌。

本文所用的“均质化”是指充分混合以获得可溶的悬浮液或乳液。如果均质化在发酵之前进行，这样做可以将乳脂分解成更小的尺寸，使其不再与乳分离。这可通过在高压下迫使乳通过小孔来实现。

本文所用的“巴氏灭菌”是指处理乳基质以减少或消除例如微生物等活生物体的存在。优选地，巴氏灭菌是通过将指定温度维持指定时段来实现。指定温度通常通过加热来实现。可选择温度和持续时间以便杀死或灭活特定细菌，例如有害细菌。随后可进行快速冷却步骤。

本发明方法中的“发酵”是指通过微生物的作用将碳水化合物转化为醇或酸。优选地，本发明方法中的发酵包括将乳糖转化为乳酸。

用于生产发酵乳制品的发酵工艺是公知的，且所属领域技术人员将了解如何选择合适的工艺条件，例如温度、氧、微生物的量和特征以及工艺时间。显然，要选择支持本发明的实现，即获得发酵产品，如固体或液体形式的乳制品或乳制品类似物(发酵乳制品)的发酵条件。

在本上下文中，术语“发酵剂”是培养物，其是一种或更多种细菌菌株(如乳酸菌菌株)的制剂(组合物)，以在发酵产品如各种食品、饲料和饮料的制备中协助发酵工艺的开始。

在本上下文中，“酸奶发酵剂”是细菌培养物，其包括一种或更多种选自德氏乳杆菌菌株和/或嗜酸乳杆菌菌株的乳杆菌以及一种或更多种嗜热链球菌菌株。据此，“酸奶”是指通过用包含乳杆菌菌株例如保加利亚乳杆菌和/或嗜酸乳杆菌和嗜热链球菌菌株的组合物对乳基质接种和发酵而获得的发酵乳制品。

可能优选的是，基质是乳基质。乳基质可来自动物，优选哺乳动物，或来自植物。然而，乳基质不必为纯动物源性，其还可包含植物源性基质。发酵产品可以是食品，食品也可以是乳制品。

根据要生产的产品，基质可以是乳基质。当发酵乳制品如酸奶、酪乳或开菲尔是终产品时，特别优选乳基质。

乳基质可以是动物或植物源性产品。因此，在一个实施方案中，发酵产品是食品，例如乳制品。乳制品可选自由以下组成的组：发酵乳制品，例如但不限于酸奶、酪乳和开菲尔或奶酪，例如但不限于新鲜奶酪或帕斯塔菲拉塔。

同样，可以在发酵之前、期间和/或之后将酶添加到基质例如乳基质中，所述酶选自由以下组成的组：能够交联蛋白质的酶、转谷氨酰胺酶、天冬氨酸蛋白酶、乳糖酶、凝乳酶、皱胃酶及其混合物。

在第一方面，本发明涉及生产发酵食品的方法，其包括用本发明的乳酸菌对基质或本发明的组合物发酵。

发酵产品。

本文所用术语“发酵乳制品”是指食品或饲料制品，其中食品或饲料制品的制备涉及用乳酸菌发酵乳基质。本文所用的“发酵乳制品”包括但不限于酸奶和奶酪等产品。发酵产品的其他实例可以是例如酪乳、开菲尔、夸克、酸奶酪、法式酸奶油和酸奶油。

在本发明的发酵食品的一个实施方案中，其中所述产品是酸奶、酪乳、开菲尔、夸克、酸奶酪、法式酸奶油、酸奶油或奶酪。优选地，发酵乳制品是酸奶。

通过用嗜热链球菌和德氏乳杆菌保加利亚亚种发酵制备的奶酪的实例包括马苏里拉奶酪和比萨奶酪(Hoier et al.(2010)in The Technology of Cheesemaking,2^ndEd.Blackwell Publishing,Oxford；166-192)。

术语“搅拌型产品”特指发酵乳制品，其在发酵后经受机械处理，导致在发酵阶段形成的凝结物的破坏和液化。机械处理通常是搅拌、泵送、过滤或均质化凝胶，或者通过将其与其他成分混合来获得，但不排除其他。搅拌型产品通常但非全部具有9％-15％的非脂肪乳固体含量。

术语“凝固型产品”包括基于乳的产品，其已经接种了发酵剂，例如发酵剂，并在接种步骤后包装，且然后在包装中发酵。

在一个实施方案中，发酵产品可以是搅拌型产品、凝固型产品或可饮用产品的形式。

尽管发酵产品和/或食品本身包含发酵期间产生的酸和风味，但可能需要发酵产品和/或乳制品包含选自由以下组成的组的成分：水果浓缩物、糖浆、益生菌菌株或培养物、着色剂、增稠剂、调味剂、防腐剂和其混合物。在本发明的一个实施方案中，发酵食品包含选自由以下组成的组的成分：水果浓缩物、糖浆、益生菌菌株或培养物、着色剂、增稠剂、调味剂、防腐剂及其混合物。

应理解，在称为“噬菌体抗性乳酸菌”、“组合物”、“生产发酵产品的方法”和“发酵产品”的部分中公开的方面和实施方案可能同样与说明书的其他部分相关。特别是关于本发明特定菌株的公开适用于本说明书的所有部分，这对本领域技术人员来说是清楚的。

在描述本发明的上下文中(特别是在以下权利要求的上下文中)，术语“一种(a，an)”和“所述(the)"以及类似指代的使用应被解释为涵盖单数和复数，除非本文另有指示或与上下文明显矛盾。除非另有说明，术语“包含”、“具有”、“包括”和“含有”应被解释为开放式术语(即，意味着“包括，但不限于”)。除非本文另有指示，否则本文对数值范围的叙述仅旨在作为单独指该范围内的每个单独数值的简写方法，并且将每个单独值并入说明书中，就好像其在本文中单独叙述一样。除非本文另有指示或与上下文明显矛盾，本文所述的所有方法可以以任何合适的顺序进行。本文提供的任何和所有实例或示例性语言(例如，"诸如")的使用仅旨在更好地说明本发明，而不是对本发明的范围进行限制，除非另有要求。说明书中的任何语言不应被解释为指示任何未要求的要素对于本发明的实践是必不可少的。

在本说明书中，对显然先前已发表的文件的任何列举或讨论不一定应被视为承认该文件是现有技术的一部分或公知常识。

除非上下文另有指示，否则对于本发明的给定方面、特征或参数的偏好、选项和实施方案应被视为已经结合本发明的所有其他方面、特征和参数的任何和所有偏好、选项和实施方案进行了公开。对于脂肪包封的微生物培养物及其所有特征的描述来说尤其如此，其可以容易地成为通过本文所述方法获得的最终组合物或终产品的一部分。本发明的实施方案和特征也在以下条目中概述。

保藏和专家解决方案

申请人要求，在授予专利权之日之前，下表所述保藏微生物的样品只可以提供给专家。

表2.在根据《国际承认用于专利程序的微生物保藏布达佩斯条约》获得国际保藏机构地位的保藏机构进行的保藏：莱布尼茨DSMZ研究所-德国微生物保藏中心，德国布伦瑞克因霍芬街7B,38124。

保藏微生物	登录号	保藏日期
			嗜热链球菌	DSM 34236	2022年4月7日
嗜热链球菌	DSM 34235	2022年4月7日
			pac型噬菌体	DSM 34256	2022年4月7日
cos型噬菌体	DSM 34257	2022年4月7日

参考文献

本专利文件中引用的所有参考文献在此通过引用以其整体并入本文。

Hoier et al.(2010)The Technology of Cheesemaking,2^nd Ed.BlackwellPublishing,Oxford,p.166-192.

Zheng et al.(2020.04.15)Int J Syst Evol Microbiol.Vol.70(4),p.2782-2858.实施例

实施例1-噬菌体抗性突变体的制备。

噬菌体抗性菌株的分离

在将0.1mL DSM 34236的M17-2％乳糖过夜培养物和0.1mL每mL含有1×10⁹个噬菌体颗粒的DSM 34256噬菌体铺板并在37℃孵育过夜后，在含有10mM MgCl₂/CaCl₂的M17-2％乳糖琼脂平板上从母本菌株DSM 34236产生噬菌体抗性突变体。为此，将噬菌体和宿主菌株与2.5mL上层(top)琼脂溶液(保持在46℃-50℃的具有一半(0.75％)标准琼脂浓度的熔融琼脂)混合，并向下层(bottom)倒入M17-2％乳糖琼脂。底层和顶层琼脂都包含10mM MgCl₂/CaCl₂。当顶层琼脂凝固时，在上述条件下进行孵育。

在孵育后出现在琼脂平板上的许多噬菌体抗性突变体中，菌株DSM 34235经过三次菌落纯化，并在37℃的M17乳糖琼脂平板上使用噬菌体DSM 34256进行噬菌体攻击的噬斑试验中重新测试。

噬斑试验中未观察到单个噬斑，证实了对DSM 34256的噬菌体抗性。还观察到对噬菌体DSM 34257的噬菌体抗性。

实施例2-噬菌体抗性突变体的粘度。

移液管测试

基于粘度进一步选择本发明的噬菌体抗性突变体。通过移液管测试测量许多纯化的噬菌体抗性突变体的粘度。在该测试中，测定了从一定容量的移液管流出的时间。流出时间越长，粘度越高。将200mL脱脂乳接种1％的待测细菌菌株(来自在37℃脱脂乳中生长的过夜培养物)制成凝固乳，并在37℃下孵育20h。凝固乳的粘度用25mL容量的移液管测量，其中分三次测量所述凝固乳从移液管的流出时间。用勺子小心搅拌凝固乳，使其均质化。然后填充25mL容量移液管，并测量在重力作用下排空移液管的时间。从移液管中排空25mL凝固乳所需的时间以秒为单位。

DSM 34235提供了比其母本菌株DSM 34236更高的粘度，因为其使通过下表所示的移液管测试测量的流出时间增加了15％。

表3.DSM 34235、其母本菌株DSM 34236和现有技术菌株的粘度。

在另一个实验中，与DSM 22589相比，DSM 34235显示通过移液管测试测得的流出时间增加了39％，如下表中明显的。

表4.DSM 34235和现有技术菌株的粘度。

本文描述了本发明的优选实施方案，包括发明人已知的实施本发明的最佳方式。在阅读了前面的描述后，那些优选实施方案的变化对于本领域普通技术人员来说可以是明显的。发明人期望熟练的技术人员适当地采用这些变化，并且发明人期望以不同于本文具体描述的方式实施本发明。因此，本发明包括所附权利要求中所述主题的适用法律所允许的所有修改和等同物。此外，除非本文另有说明或与上下文明显矛盾，上述要素以其所有可能的变化的任何组合被涵盖在本发明中。

实施例3-噬菌体抗性突变体的酸化曲线。

酸化测定

在酸化试验中，将200mL脱脂乳接种1％待测菌株(来自37℃下孵育的M17-2％乳糖中生长的过夜培养物)，且37℃下孵育18h。使用CINAC系统(Scientific Solutions)随时间跟踪pH。

菌株DSM 34235的酸化曲线与其母本菌株的酸化曲线相似，表明菌株DSM 34235的酸化活性与其母本菌株的酸化活性相当。

Claims

1.一种与其母本菌株相比对DSM 34256和/或DSM 34257具有增强的噬菌体抗性的乳酸菌。

2.根据权利要求1所述的乳酸菌，其中所述乳酸菌与其母本菌株相比具有增加的粘度。

3.根据权利要求1-2中任一项所述的乳酸菌，其中所述乳酸菌属于嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)的种。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的乳酸菌，其中所述母本菌株是DSM 34236。

5.根据权利要求1-4中任一项所述乳酸菌，其中所述乳酸菌选自DSM 34235及其突变体和变体。

6.一种组合物，其包含权利要求1-5中任一项所述的乳酸菌。

7.根据权利要求6所述的组合物，其作为混合物或作为成套试剂盒还包含一种或更多种属于乳杆菌属(Lactobacillus)的种的菌株。

8.根据权利要求6-7中任一项所述的组合物，其中至少一种乳杆菌属菌株是德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillus delbrueckii subsp.

bulgaricus)。

9.根据权利要求6-8中任一项所述的组合物，其中保加利亚乳杆菌(Lactobacillusbulgaricus)菌株选自：DSM 19251；DSM 19252；DSM

22586；DSM 26419；DSM 28910；DSM 32092；和DSM 33515。

10.根据权利要求6-9中任一项所述的组合物，其作为混合物或作为成套试剂盒包含一种或更多种选自DSM 17876；DSM 18111；DSM 19242；DSM 21408；DSM 22585；DSM 22587；DSM22588；DSM

22589；DSM 22935；DSM 24023；DSM 25012；DSM 26562；DSM

32503；DSM 32826和DSM 33869的嗜热链球菌菌株。

11.根据权利要求6-10中任一项所述的组合物，其作为混合物或作为成套试剂盒包含一种或多种益生菌菌株，所述益生菌菌株选自双歧杆菌属(Bifidobacterium)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)、干酪乳酪杆菌(Lacticaseibacillus casei)、副干酪乳酪杆菌(Lacticaseibacillus paracasei)、鼠李糖乳酪杆菌(Lacticaseibacillusrhamnosus)和发酵黏液乳杆菌(Limosilactobacillus fermentum)。

12.一种生产发酵食品的方法，其包括用权利要求1-5中任一项所述的乳酸菌或权利要求6-11中任一项所述的组合物对基质发酵。

13.一种发酵食物产品，所述发酵食物产品包含权利要求1-5中任一项所述的乳酸菌或所述发酵食物产品能够通过权利要求12所述的方法获得。

14.根据权利要求13所述的发酵食物产品，其中所述产品是乳制品。

15.根据权利要求13-14中任一项所述的发酵食物产品，其中产品是酸奶、酪乳、开菲尔、夸克、酸奶酪、法式酸奶油、酸奶油或奶酪。

16.根据权利要求15所述的发酵食物产品，其中所述酸奶为搅拌型产品、凝固型产品或可饮用产品的形式。