CN116828988A

CN116828988A - 用于制备发酵产品的乳酸菌组合物

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Publication number: CN116828988A
Application number: CN202280012710.9A
Authority: CN
Inventors: J·布罗恩德; S·布洛赫; K·I·瑟伦森
Original assignee: Section Hansen Co ltd
Current assignee: Section Hansen Co ltd
Priority date: 2021-02-26
Filing date: 2022-02-23
Publication date: 2023-09-29

Abstract

本发明涉及包含一种或更多种新型嗜热链球菌菌株的组合物，以及所述组合物用于生产发酵产品诸如具有如甜度增加的乳制品的用途。因此本发明还涉及新型嗜热链球菌菌株。

Description

用于制备发酵产品的乳酸菌组合物

本发明的技术领域

本发明涉及包含一种或更多种新型嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)菌株的组合物，以及所述组合物用于生产发酵产品诸如具有如甜度增加的乳制品的用途。因此本发明还涉及新型嗜热链球菌菌株。

发明背景

纯发酵奶制品因发酵过程中乳酸菌将乳糖转化为乳酸而具有酸味。因此，此类产品通常通过添加水果、蜂蜜、糖或人工甜味剂来变甜，以满足消费者对甜味的需求。

食品工业对低卡甜味食品的需求越来越高，以帮助克服超重和肥胖问题，这些问题在过去20年里变得如此普遍。甜味，通常被认为是一种愉悦感，是由糖和其他物质的存在产生的。对糖的感知是非常不同的。以蔗糖为100参考，乳糖的甜度为16，半乳糖为32而葡萄糖为74(God-shall(1988).Food Technology 42(II):71-78)。因此，葡萄糖被认为比乳糖甜4倍以上，同时仍具有大致相同的卡路里水平。

发酵食品中的糖更常被阿斯巴甜、安赛蜜、三氯蔗糖和糖精等甜味剂取代，这些甜味剂可以在摄入较少的卡路里的情况下提供甜度。然而，使用人造甜味剂可能会导致异味，且一些研究表明，食用人造甜味剂伴随着一些缺点，例如增加饥饿感、过敏、癌症等，这导致消费者偏爱仅含有天然甜味剂或最好不含添加甜味剂的发酵奶制品。因此，开发天然(内在)甜度高的发酵奶制品成为一个特殊的挑战。

发酵奶制品的酸度在很大程度上取决于存在的乳酸菌和用于制备发酵奶制品的工艺参数。

由于双糖乳糖是奶中的主要碳源，因此在乳酸菌中对其发酵进行了大量研究。在许多物种中，乳糖在摄取后由β-半乳糖苷酶分解成葡萄糖和半乳糖。葡萄糖由葡萄糖激酶磷酸化为葡萄糖-6-磷酸，并经Embden-Meyerhof-Parnas途径(糖酵解)被大多数乳酸菌发酵。

嗜热链球菌(S.thermophilus)是用于商业性嗜热奶发酵的最广泛使用的乳酸菌之一，其中该生物体通常用作混合发酵剂的一部分，其它成分是乳杆菌(Lactobacillus)种，例如用于酸奶的德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillus delbrueckiisubsp.bulgaricus)(保加利亚乳杆菌(L.bulgaricus))或用于瑞士型干酪的瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus(L.helveticus))。

许多国家对酸奶的法律定义要求嗜热链球菌与保加利亚乳杆菌一起使用。在其他国家，要求嗜热链球菌与嗜酸乳杆菌(L.acidophilus)一起使用。所有物种产生适量的乙醛，乙醛是酸奶中的重要风味成分。

乳糖和蔗糖比组成其的单糖更容易被嗜热链球菌发酵。在过量半乳糖存在的情况下使用嗜热链球菌时，仅乳糖分子的葡萄糖部分被发酵，且半乳糖在发酵奶制品中积聚。在高酸浓度限制发酵的酸奶中，游离半乳糖仍然存在，而在瑞士奶酪生产的早期阶段产生的游离半乳糖后来被瑞士乳杆菌发酵。

然而，一些研究人员已经报道了嗜热链球菌的半乳糖发酵菌株(Hutkins et al.(1986)J.Dairy Sci.69(1):1-8；Vaillancourt et al.(2002)J.Bacteriol.184(3)；785-793)且在WO2011/026863(科汉森(Chr.Hansen))中描述了获得发酵半乳糖的嗜热链球菌菌株的方法。此后，科汉森发表了关于其他半乳糖发酵菌株的若干文献。

为了满足食品工业的要求，提出新的菌株，特别是嗜热链球菌菌株已经变得有意义，其通过葡萄糖的排出提供更大的天然甜度(固有甜度)而没有额外的热量直接进入发酵产品。据观察，半乳糖菌株通常表现出较慢的酸化曲线，且因此该行业需要提供能够发酵半乳糖的快速酸化菌株或与半乳糖发酵菌株配合良好的快速酸化菌株。快速酸化可以缩短发酵时间，且从而提高工艺经济性和/或微生物物种之间的相互作用。质构化性质也可能因半乳糖发酵菌株受到影响，且因此还希望开发具有改进的质构化性质的半乳糖发酵株或具有与半乳糖发酵菌株良好配合的改进的质构化性质的菌株。

发明概述

本发明实现了上述目的，尤其是，本发明涉及包含嗜热链球菌菌株的一种或更多种新型半乳糖发酵菌株的组合物。新型半乳糖发酵嗜热链球菌菌株，包含编码葡萄糖/果糖亚基IIC的manM基因、编码半乳糖激酶的galK基因、编码磷酸葡萄糖变位酶的pgm基因和/或编码半乳糖的galR基因中的一种或更多种突变。除了能够发酵半乳糖之外，当单独使用和/或与其他嗜热链球菌菌株和/或乳杆菌属菌株组合使用时，这些新型嗜热链球菌菌株显示出在发酵期间快速酸化、酸化至低pH和/或改进的质构化性质。

因此，在一个方面，本发明涉及包含在选自以下组成的组的一种或更多种基因中具有突变的嗜热链球菌菌株的组合物：

(a)编码PTS甘露糖/葡萄糖/果糖亚基IIC的manM基因，在对应于SEQ ID NO.1中的位置169的位置处；

(b)编码半乳糖激酶的galK基因，在对应于SEQ ID NO.3中的位置139的位置处；

(c)编码磷酸葡萄糖变位酶的pgm基因，在对应于SEQ ID NO.5或13中的位置490的位置处；

(d)编码磷酸葡萄糖变位酶的pgm基因，在对应于SEQ ID NO.7中的位置726的位置处；

(e)编码半乳糖操纵子阻遏物的galR基因，在对应于SEQ ID NO.9中的位置82的位置处；和

(f)编码葡萄糖激酶的glcK基因，在对应于SEQ ID NO.11中的位置805的位置处。

本发明的另一方面涉及生产发酵产品的方法，其包含使用在选自由以下组成的组的一种或更多种基因中具有突变的嗜热链球菌菌株来发酵基质：

(f)编码葡萄糖激酶的glcK基因，在对应于SEQ ID NO.11中的位置805的位置处

或根据本发明的组合物。

因此，本发明的一方面涉及通过本发明的方法获得的发酵产品。

而且，本发明的一个方面涉及包含在选自由以下组成的组的一种或更多种基因中具有突变的嗜热链球菌菌株的发酵产品：

本发明的另一方面涉及一种或更多种嗜热链球菌菌株用于制造发酵产品的用途，所述嗜热链球菌菌株在选自由以下组成的组的一种或更多种基因中具有突变：

(b)编码半乳糖激酶的galK基因，对应于SEQ ID NO.3中的位置139的位置处；

(c)编码磷酸葡萄糖变位酶的pgm基因，对应于SEQ ID NO.5或13中的位置490的位置处；

重要的是，本发明的一个方面涉及在选自由以下组成的组的一种或更多种基因中具有突变的嗜热链球菌菌株：

(a)编码PTS甘露糖/葡萄糖/果糖亚基IIC的manM基因，对应于SEQ ID NO.1中的位置169的位置处；

附图简要说明

图1：DSM 33762和DSM 33762的母株的乳酸化曲线。

图2：DSM 33720的乳酸化曲线。

图3：菌株DSM 33719的适应性实验室进化进展。

图4：DSM 33719和DSM 33719的母株的乳酸化曲线。

发明详述

在更详细地概述本发明之前，定义一组术语和惯例：

术语“属”是指在网站：www.ncbi.nlm.nih.gov/taxonomy上定义的属。如本文所用的细菌“菌株”是指生长或繁殖时在遗传上保持不变的细菌。包括多种相同的细菌。

在本上下文中，术语“突变株(mutant，mutant strain)”应理解为通过例如基因工程、辐射和/或化学处理而从本发明的菌株衍生或能够从本发明的菌株衍生的菌株。优选突变株是功能等效的突变株，例如具有与其来源菌株基本相同或改进的性质(例如质构、剪切应力、粘度、凝胶硬度、口腔包覆感、风味、后酸化、酸化速度和/或噬菌体稳健性)的突变株。此类突变株是本发明的一部分。特别地，术语“突变株”是指使本发明的菌株经历任何常规使用的诱变处理(包括用例如乙烷甲烷磺酸盐(EMS)或N-甲基-N'-硝基-N-硝基胍(NTG)等化学诱变剂、UV光处理)而获得的菌株，或自发产生的突变株。突变株可能已经经历数次诱变处理(单次处理应理解为一个诱变步骤，接着是筛选/选择步骤)，但目前优选执行不超过20次或不超过10次或不超过5次处理(或筛选/选择步骤)。在目前优选的突变株中，相比母株，细菌基因组中小于5％、或小于1％或甚至小于0.1％的核苷酸被另一种核苷酸替换，或被缺失。如本领域技术人员清楚的那样，本发明的突变株也可以是母株。

在本上下文中，术语“变异株(variant，variant strain)”应理解为功能与本发明的菌株等效的菌株，例如具有基本上相同或改进的性质或特征(例如质构、酸化速度、粘度、凝胶硬度、口腔包覆感、风味、后酸化和/或噬菌体稳健性)。可使用适当筛选技术鉴定的此类变异株是本发明的一部分。

出于本发明的目的，使用EMBOSS软件包(EMBOSS:The European MolecularBiology Open Software Suite,Rice et al.(2000)Trends in Genetics16:276-277)的Needle程序中实施的Needleman-Wunsch算法(Needleman and Wunsch(1970)J.Mol.Biol.48:443-453)，优选3.0.0或更高版本，来确定两个氨基酸序列之间的同一性程度。使用的可选参数是空位开放罚分10、空位延伸罚分0.5和EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版本)替换矩阵(substitution matrixx)。将标有“最长同一性”的Needle输出(使用-nobrief选项获得)用作同一性百分比，并如下计算：

(相同残基x 100)/(对齐部分的长度-对齐部分中的空位总数)

在本说明书和权利要求中，使用了氨基酸残基的常规一字母和三字母代码。为了便于参考，本发明的突变体和变体中的氨基酸变化通过使用以下命名法进行描述：亲代酶中的氨基酸残基；位置；取代的氨基酸残基。根据这一命名法，例如用甘氨酸残基取代第20位的丙氨酸残基表示为Ala20Gly或A20G。在同一位置上丙氨酸的缺失，则表示为Ala20*或A20*。插入额外的氨基酸残基(例如甘氨酸)表示为Ala20AlaGly或A20AG。一段连续氨基酸残基(例如第20位的丙氨酸至第21位的甘氨酸)的缺失表示为DELTA(Ala20-Gly21)或DELTA(A20-G21)。当亲代酶序列与用于编号的酶序列相比含有缺失时，在这样的位置上的插入(例如在缺失的第20位的丙氨酸)表示为*20Ala或*20A。多个突变用加号或斜线分开。例如，第20和21位的两个突变分别用甘氨酸和丝氨酸取代丙氨酸和谷氨酸，表示为A20G+E21S或A20G/E21S。当给定位置的氨基酸残基被两个或更多的可选氨基酸残基取代时，这些残基用逗号或斜线分开。例如，第30位的丙氨酸被甘氨酸或谷氨酸取代，表示为A20G,E或A20G/E，或A20G，A20E。当本文确定了适合修饰的位置而没有提出任何具体的修饰时，应理解为任何氨基酸残基都可以取代该位置上存在的氨基酸残基。因此，例如，当提到对第20位的丙氨酸进行修饰但没有具体说明时，应理解为丙氨酸可以缺失，或被任何其他氨基酸残基(即R、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y、V中的任何一个)取代。

在本发明的语境中，基因的突变(基因突变(gene mutation))应理解为，生物体基因组核苷酸序列的改变导致所述生物体的表型发生变化，其中改变可以是核苷酸缺失、一个核苷酸被另一个核苷酸取代、核苷酸插入或移码。在本发明的语境中，缺失应理解为导致生物体基因组核苷酸序列的一个或多个核苷酸去除的基因突变；插入应理解为在核苷酸序列中添加一个或多个核苷酸；取代(或点突变)应理解为核苷酸序列的核苷酸被另一个核苷酸取代的基因突变；移码应理解为由核苷酸序列中插入或缺失了不能被3整除的多个核苷酸而引起的基因突变，因此改变了阅读框，导致与原始阅读框完全不同的翻译；引入终止密码子应理解为DNA序列中导致过早终止的密码子的点突变；抑制被编码蛋白的底物结合应理解为，核苷酸序列中导致蛋白序列改变造成的任何突变，所述蛋白序列改变负责阻止底物与蛋白的催化部位结合。此外，敲除突变体应理解为导致基因去除或缺失的基因突变，例如从生物体基因组中去除或删除整个基因或整个开放读码框。

在本说明书和权利要求书中，核苷酸的常规单字母代码的使用遵循上文描述的氨基酸命名法的类似原理。

用于比对序列和确定它们之间序列同一性程度的算法是本领域公知的。出于本发明的目的，可以使用美国国家生物技术信息中心(NCBI)在https://blast.ncbi.nlm.nih.gov上应用标准参数提供的blastn进行核苷酸序列比对的方法。

如实例1中公开的那样测量酸化曲线。

如实例4中公开的那样测量剪切应力。

就乳杆菌属菌株而言，术语“CFU”是指菌落形成单位，通过于厌氧条件下37℃孵育3天在MRS琼脂平板上的生长(形成菌落)来确定。MRS琼脂的组成(g/l)如下：

Bacto示蛋白胨3号：10.0

Bacto牛肉浸膏：10.0

Bacto酵母浸膏：5.0

右旋糖：20.0

山梨醇单油酸酯复合物：1.0

柠檬酸铵：2.0

乙酸钠：5.0

硫酸镁：0.1

硫酸锰：0.05

磷酸氢二钾：2.0

Bacto琼脂：15.0

Milli-Q水：1000ml。

将pH调节至5.4或6.5：将鼠李糖乳杆菌(L.rhamnosus)、干酪乳杆菌(L.casei)和类干酪乳杆菌(L.paracasei)的pH调节至6.5。对于所有其他乳杆菌物种，将pH调节至5.4。尤其是，将德氏乳杆菌保加利亚亚种、嗜酸乳杆菌和瑞士乳杆菌的pH调节至5.4。将鼠李糖乳杆菌、干酪乳杆菌和副干酪乳杆菌的pH调节至6.5。

就嗜热链球菌而言，术语“CFU”是指通过于厌氧条件下37℃孵育3天在M17琼脂平板上的生长(形成菌落)而确定的菌落形成单位。M17琼脂的组成(g/l)如下：

胰蛋白胨：2.5g

肉的胃蛋白酶消化物：2.5g

大豆粉的木瓜蛋白酶消化物：5.0g

酵母提取物：2.5g

肉提取物：5.0g

乳糖：5.0g

甘油磷酸钠：19.0g

七水硫酸镁：0.25g

抗坏血酸：0.5g

琼脂：15.0g

Milli-Q水：1000ml。

将pH调节至最终pH7.1±0.2(25℃)

如本文所用的术语“突变使葡萄糖激酶蛋白失活”是指导致“失活的葡萄糖激酶蛋白”的突变，即如果存在于细胞中，不能发挥其正常功能的葡萄糖激酶蛋白，以及阻止葡萄糖激酶蛋白的形成或导致葡萄糖激酶蛋白降解的突变。尤其是，与功能性葡萄糖激酶蛋白相比，失活的葡萄糖激酶蛋白是不能促进葡萄糖磷酸化为葡萄糖-6-磷酸或以显著降低的速率促进葡萄糖磷酸化为葡萄糖-6-磷酸的蛋白质。与编码功能性葡萄糖激酶蛋白的基因相比，编码失活的葡萄糖激酶蛋白的基因包含该基因的开放阅读框(ORF)中的突变，其中所述突变可以包括但不限于缺失、移码突变、终止密码子的引入或导致氨基酸取代、改变了蛋白的功能性质的突变，或减少或消除基因转录或翻译的启动子突变。

本文所用的术语“功能性葡萄糖激酶蛋白”是指如果存在于细胞中则促进葡萄糖磷酸化为葡萄糖-6-磷酸的葡萄糖激酶蛋白。

本文所用的“突变细菌”或“突变株”是指天然的(自发的、天然存在的)突变细菌或诱导的突变细菌，其基因组(DNA)中包含一个或更多个野生型DNA中不存在的突变。“诱导的突变株”是其中所述突变是由人类处理(例如用化学诱变剂、UV或伽玛辐射等处理)诱导的细菌。相比之下，“自发突变株”或“天然存在的突变株”并没有被人类诱变。本文中的突变细菌是非GMO(未被遗传学修饰的生物体)，即未通过重组DNA技术修饰。

本文所用的术语“减少葡萄糖向细胞中的转运的突变”是指编码参与葡萄糖转运的蛋白质的基因突变，其导致葡萄糖在细胞环境中积聚。嗜热链球菌菌株培养基中的葡萄糖水平可容易地通过本技术人员已知的方法来测量。

本文所用的术语“突变使葡萄糖转运体失活”是指导致“失活的葡萄糖转运体”的突变，即如果存在于细胞中，不能发挥其正常功能的葡萄糖转运蛋白，以及阻止葡萄糖转运蛋白的形成或导致葡萄糖转运蛋白降解的突变。

本文所用的术语“功能性葡萄糖转运蛋白”是指如果存在于细胞中则促进葡萄糖在细胞膜上转运的葡萄糖转运蛋白。

在本发明上下文中使用术语“葡萄糖缺陷”来表征部分或完全丧失将葡萄糖用作细胞生长或维持细胞活力来源的能力的乳酸菌(LAB)。葡萄糖代谢的相应缺陷，例如可能是由抑制或灭活葡萄糖激酶蛋白和/或负责葡萄糖摄取的葡萄糖转运蛋白的表达或活性的基因突变引起的。

具有葡萄糖代谢缺陷的LAB在以乳糖为碳水化合物来源生长时，可能增加培养基中的葡萄糖浓度。葡萄糖升高是由葡萄糖缺陷的LAB分泌葡萄糖引起的。培养基中葡萄糖浓度的升高可以通过HPLC分析来确定，例如使用Dionex CarboPac PA 20 3*150mm柱(ThermoFisher Scientific，产品编号060142)。

在本发明上下文中使用术语“葡萄糖阳性”来表征部分或完全保持了使用葡萄糖作为细胞生长或维持细胞活力来源的能力的LAB。

本发明人令人惊讶地鉴定出许多满足工业需求的嗜热链球菌菌株。当作为混合培养物的一部分应用于乳制品基质中时，一种或更多种新的半乳糖发酵菌株显示出例如改进的流变性质(例如质地)。同样，当单独或作为乳制品基质中混合培养物的一部分应用时，一种或更多种新的半乳糖发酵菌株显示出例如改进的酸化特性(例如酸化速度)(实施例1-2)。此外，一种或更多种新半乳糖发酵菌株能够将发酵培养基酸化至比其母株更低的pH值，例如，这可以在实施例2中看到。

新型嗜热链球菌菌株能够用于例如乳制品培养物，如酸奶培养物中，以获得改进的甜度和改进的流变参数，例如成品的剪切应力。流变性与产品的感官品质密切相关，且因此流变性与成品味道之间的相互作用至关重要。此外，新型嗜热链球菌菌株由于其改进的酸化曲线而可能加快发酵时间。

组合物

因此，本发明的一个方面涉及包含在选自由以下组成的组的一种或更多种基因中具有突变的嗜热链球菌菌株的组合物：

(a)编码半乳糖激酶的galK基因，在对应于SEQ ID NO.3中的位置139的位置处；

(b)编码磷酸葡萄糖变位酶的pgm基因，在对应于SEQ ID NO.5或13中的位置490的位置处；

(c)编码磷酸葡萄糖变位酶的pgm基因，在对应于SEQ ID NO.7中的位置726的位置处；

(d)编码半乳糖操纵子阻遏物的galR基因，在对应于SEQ ID NO.9中的位置82的位置处；和

(b)编码葡萄糖激酶的glcK基因，在对应于SEQ ID NO.11中的位置805的位置处。

在一个实施方案中，突变导致选自由以下组成的组的编码的蛋白质发生变化：

a)PTS甘露糖/葡萄糖/果糖亚基IIC，在对应于SEQ ID NO 2中的位置57的位置处；

b)半乳糖激酶，在对应于SEQ ID NO 4中的位置47的位置处；

c)磷酸葡萄糖变位酶，在对应于SEQ ID NO 6或14中的位置242的位置处；

d)磷酸葡萄糖变位酶，在对应于SEQ ID NO 8中的位置164的位置处；

e)半乳糖操纵子阻遏物，在对应于SEQ ID NO 10中的位置28的位置处；和

f)葡萄糖激酶，在对应于SEQ ID NO 12中的位置268的位置处；

在进一步的实施方案中，突变是：

(a)在对应于SEQ ID NO.1中的位置169的位置处从C到T的取代；

(b)在对应于SEQ ID NO.3中的位置139的位置处从G到A的取代；

(c)在对应于SEQ ID NO.5或13中的位置726的位置处从A到C的取代；

(d)在对应于SEQ ID NO.7中的位置490的位置处从C到T的取代；

(e)在对应于SEQ ID NO.9中的位置82的位置处从C到T的取代；和

(f)在对应于SEQ ID NO.11中的位置805的位置处从G到T的取代。

在又一个实施方案中，编码的蛋白质中的变化是：

(a)在对应于SEQ ID NO 2中的位置57的位置处Pro被Leu取代；

(b)在对应于SEQ ID NO 4中的位置47的位置处Ile被Val取代；

(c)在对应于SEQ ID NO 6或14中的位置242的位置处Glu被Asp取代；

(d)在对应于SEQ ID NO 8中的位置164的位置处Pro被Ser取代；

(e)在对应于SEQ ID NO 10中的位置28的位置处Leu被Phe取代；和

(f)在对应于SEQ ID NO 12中的位置268的位置处Gly被Cys取代。

在一个具体实施方案中，嗜热链球菌菌株包含以下突变：

(a)在对应于SEQ ID NO.1中的位置169的位置处从C到T的取代；在对应于SEQ IDNO.3中的位置139的位置处从核苷酸G到A的取代，和在对应于SEQ ID NO.5或13中的位置726的位置处从核苷酸A到C的取代；

(b)在对应于SEQ ID NO.5或13中的位置490的位置处从C到T的取代和在对应于SEQ ID NO.7中的位置82的位置处从核苷酸C到T的取代；或

(c)在对应于SEQ ID NO.9中的位置805的位置处从G到T的取代。

就氨基酸谱而言，可以设想嗜热链球菌菌株包含编码的蛋白质中的以下变化：

(a)在对应于SEQ ID NO 2中的位置57的位置处Pro被Leu取代；在SEQ ID NO 4中的位置47处Ile被Val取代；和在对应于SEQ ID NO 6或14中的位置242的位置处Glu被Asp取代；

(b)在对应于SEQ ID NO 8中的位置164的位置处Pro被Ser取代；和在对应于SEQID NO 10中的位置28的位置处Leu被Phe取代；或

(c)在对应于SEQ ID NO 12中的位置268的位置处Gly被Cys取代。

在一个具体实施方案中，嗜热链球菌菌株是：

(a)DSM 33719或其突变株或变异株；

(b)DSM 33720或其突变株或变异株；或

(c)DSM 33762或其突变株或变异株。

嗜热链球菌菌株和上文(a)-(f)中公开的突变的进一步说明可在下文中找到，即在称为“新型嗜热链球菌突变体”的部分中找到。

本发明的组合物可以以多种形式提供。其可以是粉末、丸或片剂。其可以是冷冻形式、干燥形式、冻干形式或液体形式。因此，在一个实施方案中，组合物为冷冻、干燥、冻干或液体形式。

本发明的组合物可以还包含冷冻保护剂、冻干保护剂、抗氧化剂、营养物、填充剂、调味剂或其混合物。组合物优选包含一种或更多种冷冻保护剂、冻干保护剂、抗氧化剂和/或营养物，更优选冷冻保护剂、冻干保护剂和/或抗氧化剂，且最优选冷冻保护剂或冻干保护剂，或两者。使用本领域技术人员已知的保护剂如冷冻保护剂和冻干保护剂。合适的冷冻保护剂或冻干保护剂包括单糖、二糖、三糖和多糖(例如葡萄糖、甘露糖、木糖、乳糖、蔗糖、海藻糖、棉子糖、麦芽糖糊精、淀粉和阿拉伯树胶(金合欢胶)等)、多元醇(例如赤藓糖醇、甘油、肌醇、甘露醇、山梨醇、苏糖醇、木糖醇等)、氨基酸(例如脯氨酸、谷氨酸)、复合物质(例如脱脂乳、蛋白胨、明胶、酵母提取物)和无机化合物(例如三聚磷酸钠)。

在一个实施方案中，本发明的组合物可以包括一种或多种选自以下的冷冻保护剂：肌苷-5'-单磷酸(IMP)、腺苷-5'-单磷酸(AMP)、鸟苷-5'-单磷酸(GMP)、尿苷-5'-单磷酸(UMP)、胞苷-5'-单磷酸(CMP)、腺嘌呤、鸟嘌呤、尿嘧啶、胞嘧啶、腺苷、鸟苷、尿苷、胞苷、次黄嘌呤、黄嘌呤、次黄嘌呤、鸟苷、胸苷、肌苷以及任何此类化合物的衍生物。合适的抗氧化剂包括抗坏血酸、柠檬酸及其盐、没食子酸盐、半胱氨酸、山梨醇、甘露醇、麦芽糖。合适的养分包括糖、氨基酸、脂肪酸、矿物质、微量元素、维生素(例如维生素B族、维生素C)。组合物可以任选地包含其他物质，包括填充剂(例如乳糖、麦芽糊精)和/或调味剂。

在本发明的一个实施方案中，冷冻保护剂是一种试剂或多种试剂的混合物，它除了具有冷冻保护性外，还具有增强效应。

表述"增强效应"用于描述这样一种情况，即当将解冻或重构的培养物接种到要发酵或转化的培养基中时，冷冻保护剂赋予其增加的代谢活性(增强效应)。活力和代谢活性并不是同义概念。商业冷冻或冻干培养物可以保持其活力，但是它们可能已经失去了很大一部分代谢活性，例如，培养物在保存较短的时间内可能失去产酸(酸化)活性。因此，必须通过不同的测定来评估活力和增强效应。活力通过活力测定来评估，例如测定菌落形成单位，而增强效应则通过量化解冻或重构的培养物相对于培养物活力的相关代谢活性来评估。术语"代谢活性"是指培养物的除氧活性，其产酸活性，即产生例如乳酸、乙酸、甲酸和/或丙酸，或其产代谢物活性，例如产生芳香化合物，例如乙醛、(a-乙酰乳酸、乙偶姻、二乙酰和2,3-丁二醇(丁二醇))。

在一个实施方案中，以材料的％w/w测量，本发明的组合物含有或包含0.2％至20％的冷冻保护剂或试剂混合物。然而，优选以下述量添加冷冻保护剂或试剂混合物：按重量计，0.2％至15％、0.2％至10％、0.5％至7％和1％至6％，包括在2％至5％范围内的冷冻保护剂或试剂混合物(按冷冻材料重量的％w/w测量)。在优选的实施方案中，按材料重量的％w/w测量，培养物包含约3％的冷冻保护剂或试剂混合物。约3％的冷冻保护剂的量相当于100mM范围的浓度。应当认识到，对于本发明实施方案的每个方面，范围可以是所述范围的增量。

在本上下文中，术语“从x％到y％”是指包括终点，因此等于术语“从x％且包括x％到y％且包括y％”。

在另一个方面，本发明的组合物含有或包含铵盐(例如有机酸的铵盐(例如甲酸铵和柠檬酸铵)或无机酸的铵盐)，作为细菌细胞的加强剂(如生长加强剂或酸化加强剂)，例如属于物种嗜热链球菌的细胞，例如(实质性)尿素酶阴性细菌细胞。术语"铵盐"、"甲酸铵"等，应理解为盐的来源或离子的组合。例如术语"甲酸铵"或"铵盐"的"来源"是指，当加入到细胞的培养物中时，提供甲酸铵或铵盐的一种化合物或多种化合物的混合物。在一些实施方案中，铵源将铵释放到生长培养基中，而在其他实施方案中，铵源被代谢以产生铵。在一些优选的实施方案中，铵源是外源性的。在一些特别优选的实施方案中，铵不是由乳品基质提供的。当然，应当理解的是，可以添加氨来代替铵盐。因此，术语铵盐包括氨(NH₃)、NH₄OH、NH₄ ⁺等。

在一个实施方案中，本发明的组合物可以包含增稠剂和/或稳定剂，例如果胶(例如HM果胶、LM果胶)、明胶、CMC、大豆纤维(Soya Bean Fiber)/大豆聚合物(Soya BeanPolymer)、淀粉、改性淀粉、卡拉胶、褐藻胶和瓜尔胶。

在一个实施方案中，其中微生物产生的多糖(例如EPS)在酸化乳制品中产生高/黏性质构，所产生的酸化乳制品基本上不含或完全不含任何增稠剂和/或稳定剂，例如果胶(例如HM果胶、LM果胶)、明胶、CMC、大豆纤维/大豆聚合物、淀粉、改性淀粉、卡拉胶、褐藻胶和瓜尔胶。基本不含应理解为，产品包含0％至20％(重量比)(例如0％至10％、0％至5％或0％至2％或0％至1％)的增稠剂和/或稳定剂。

如前所述，微生物物种之间的相互作用至关重要——不仅在生长方面，在流变特性(如质构)和味觉形成方面也是如此。

在一个重要的实施方案中，组合物包含一种或更多种嗜热链球菌菌株，其选自由以下组成的组：DSM 33719、DSM 33719突变株、DSM 33719变异株、DSM 33720、DSM 33720突变株、DSM 33720变异株、DSM 33762、DSM 33762突变株和DSM 33762变异株。

在一个优选的实施方案中，组合物包括：

(a)DSM 33720、DSM 33719和DSM 33762；

(b)DSM 32227和DSM 33762；或

(c)DSM 33719和DSM 32227。

如可从实施例4和5看出，已对发酵产品的质构和酸化曲线方面测试这些菌株组合。

组合物可以作为混合物或作为成套试剂盒提供，其包含：

(a)选自由以下组成的组的嗜热链球菌菌株：DSM 33720或其突变株或变异株、DSM33719或其突变株或变异株、DSM 33762或其突变株或变异株、或其任何组合；和

(b)属于乳杆菌属的菌株。

因此，可以设想，组合物可以是混合物或作为成套试剂盒，其包含(a)包含以下基因突变的嗜热链球菌菌株：(i)在对应于SEQ ID NO 2中的位置57的位置处Pro被Leu取代；在SEQ ID NO 4中的位置47处Ile被Val取代和在对应于SEQ ID NO 6或14中的位置242的位置处Glu被Asp取代，和/或(ii)在对应于SEQ ID NO 8中的位置164的位置处Pro被Ser取代和在对应于SEQ ID NO 10中的位置28的位置处Leu被Phe取代，和/或(iii)在对应于SEQ IDNO 12中的位置268的位置处Gly被Cys取代，和(b)属于乳杆菌属的一种或更多种菌株。

在一个实施方案中，上述(i)是DSM 33762或其突变株或变异株，(ii)是DSM 33720或其突变株或变异株，和/或上述(iii)是DSM 33719或其突变株或变异株。

如果应用于例如酸奶生产中，则可优选组合物进一步包含一种或更多种属于乳杆菌属的菌株。乳杆菌属的一种或更多种菌株可选自由以下组成的组：德氏乳杆菌(Lactobacillus delbrueckii)、德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillus delbrueckiisubsp bulgaricus)、德氏乳杆菌乳酸亚种(Lactobacillus delbrueckii subsp.lactis)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)、干酪乳酪杆菌(Lacticaseibacillus casei)、副干酪乳酪杆菌副干酪亚种(Lacticaseibacillus paracasei subsp.Paracasei)和鼠李糖乳杆菌(Lacticaseibacillus rhamnosus)、发酵黏液乳杆菌(Limosilactobacillusfermentum)、植物乳植杆菌植物亚种(Lactiplantibacillus plantarumsubsp.Plantarum)和瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)

在本发明的优选实施方案中，乳杆菌属菌株选自由以下组成的组：德氏乳杆菌保加利亚亚种、植物乳植杆菌植物亚种和嗜酸乳杆菌。

在一个特定实施方案中，本发明的乳杆菌菌株是保加利亚乳杆菌。保加利亚乳杆菌是乳酸菌，其经常用于商业性乳发酵，其中该生物体通常用作混合发酵剂的一部分。

在一个具体实施方案中，德氏乳杆菌保加利亚亚种是DSM 28910或其突变株或变异株。

在本发明的一个实施方案中，本发明的乳杆菌属细菌菌株是葡萄糖缺陷的。在本发明的可选实施方案中，本发明的乳杆菌属细菌菌株是葡萄糖阳性的。

因此，在优选的实施方案中，组合物和/或混合物或成套试剂盒包含嗜热链球菌菌株DSM 32227和/或DSM 33762和属于乳杆菌属的菌株。因此，在优选的实施方案中，组合物和/或混合物或成套试剂盒包含嗜热链球菌菌株DSM 33719和/或DSM 32227和属于乳杆菌属的菌株。因此，在优选的实施方案中，组合物和/或混合物或成套试剂盒包含嗜热链球菌菌株DSM 33720和属于乳杆菌属的种的菌株。

本发明的组合物可以包含益生菌。益生菌菌株可以在发酵前或发酵后添加。如果在发酵前添加，益生菌菌株也充当发酵细菌。

术语“益生菌”是指为在消费者中达到促进健康的效果而对消费者足量施用的活细菌。益生菌在摄入后能够在胃肠道条件下存活，并在消费者的肠道中定植。

应理解，乳杆菌属分类学已于2020年更新。新的分类学在Zheng et al.2020中公开，且如果未另行指示，本文将沿用该分类学。出于本发明的目的，下表列出了与本发明相关的一些乳杆菌属的种的新名称和旧名称。

表1.与本发明相关的一些乳杆菌种的新名称和旧名称。

在本发明的具体实施方案中，本发明的益生菌菌株选自乳杆菌属的细菌，例如嗜酸乳杆菌、副干酪乳酪杆菌(Lacticaseibacillus paracasei)、鼠李糖乳酪杆菌(Lacticaseibacillus rhamnosus)、干酪乳酪杆菌(Lacticaseibacillus casei)、德氏乳杆菌(Lactobacillus delbrueckii)、乳酸乳杆菌(Lactobacillus lactis)、植物乳杆菌(Lactiplantibacillus plantarum)、罗伊氏粘液乳杆菌(Limosilactobacillus reuteri)和约氏乳杆菌(Lactobacillus johnsonii)，双歧杆菌属(Bifidobacterium)，例如长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)、青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentis)、两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)、短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)、动物双歧杆菌乳酸亚种(Bifidobacterium animalis subsp.lactis)、齿双歧杆菌(Bifidobacterium dentium)、链状双歧杆菌(Bifidobacterium catenulatum)、角双歧杆菌(Bifidobacterium angulatum)、巨大双歧杆菌(Bifidobacterium magnum)、假链状双歧杆菌(Bifidobacterium pseudocatenulatum)以及婴儿双歧杆菌(Bifidobacteriuminfantis)等。

在本发明的具体实施方案中，益生乳杆菌菌株选自嗜酸乳杆菌、副干酪乳酪杆菌、鼠李糖乳酪杆菌、干酪乳酪杆菌、德氏乳杆菌、乳酸乳杆菌、植物乳杆菌、罗伊氏粘液乳杆菌以及约氏乳杆菌。

在本发明的一个特定实施方案中，益生菌菌株是以DSM 13241保藏的嗜酸乳杆菌(LA-)。

在本发明的具体实施方案中，益生菌乳杆菌菌株选自鼠李糖乳酪杆菌菌株和副干酪乳酪杆菌菌株。在本发明的具体实施方案中，益生菌菌株是保藏为ATCC 53103的鼠李糖乳酪杆菌菌株在本发明的具体实施方案中，益生菌菌株是保藏为ATCC 55544的副干酪乳酪杆菌菌株CRL 431。

在本发明的具体实施方案中，益生菌菌株选自长双歧杆菌、青春双歧杆菌、两歧双歧杆菌、短双歧杆菌、动物双歧杆菌乳酸亚种、齿双歧杆菌、链状双歧杆菌、角双歧杆菌、巨大双歧杆菌、假链状双歧杆菌以及婴儿双歧杆菌。在本发明的具体实施方案中，益生菌双歧杆菌益生菌菌株是保藏为DSM 15954的动物双歧杆菌乳酸亚种BB-

上述混合物或成套试剂盒可以进一步与其他乳酸菌组合，例如但不限于益生菌。在一个实施方案中，至少一种或多种乳酸菌选自诸如动物双歧杆菌乳酸亚种(例如BB-)的双歧杆菌、嗜酸乳杆菌(LA-/>)、鼠李糖乳酪杆菌(例如/>)及其任意组合。使用哪种双歧杆菌、嗜酸乳杆菌和/或鼠李糖乳酪杆菌取决于其应用和要生产的食品。

相比之下，表述包含菌株的"成套试剂盒"是指，菌株或菌株培养物在物理上是分开的，但意图一起使用。因此，嗜热链球菌菌株和乳杆菌菌株的菌株或培养物位于不同的盒子或小袋中。在实施方案中，嗜热链球菌菌株和乳杆菌，例如德氏乳杆菌保加利亚亚种、嗜酸乳杆菌、干酪乳酪杆菌、副干酪乳酪杆菌和/或罗伊氏粘液乳杆菌菌株，采用相同的形式，即采用冷冻形式，采用丸剂或冷冻丸剂形式，采用粉末形式，例如干燥粉末或冻干粉末。

在本发明的具体定实施方案中，组合物包含10⁴至10¹²CFU(菌落形成单位)/g的嗜热链球菌菌株，例如10⁵至10¹¹CFU/g，10⁶至10¹⁰CFU/g，或10⁷至10⁹CFU/g的嗜热链球菌菌株。

在具体实施方案中，组合物还包含10⁴至10¹²CFU/g的乳杆菌菌株，例如10⁵至10¹¹CFU/g，例如10⁶至10¹⁰CFU/g，或例如10⁷至10⁹CFU/g的乳杆菌菌株。

在具体实施方案中，对于德氏乳杆菌保加利亚亚种、嗜酸乳杆菌、干酪乳酪杆菌、副干酪乳酪杆菌和/或罗伊氏粘液乳杆菌菌株中的每一种，组合物都包含10⁴至10¹²CFU/g，10⁵至10¹¹CFU/g，10⁶至10¹⁰CFU/g，或10⁷至10⁹CFU/g。

在各种食品的生产中，在乳制品行业，用于发酵乳制品，嗜热链球菌和乳杆菌属和乳酪杆菌属例如保加利亚乳杆菌、嗜酸乳杆菌、干酪乳酪杆菌、副干酪乳酪杆菌和/或鼠李糖乳杆菌，以及其他乳酸菌通常用作服务于技术目的的起子培养物。因此，在另一个优选的实施方案中，组合物适合作为起子培养物。

组合物可以是起子培养物诸如酸奶起子培养物。

组合物和/或起子培养物可以是冷冻的、喷雾干燥的、冻干的、真空干燥的、风干的、托盘干燥的或采用液体形式。通常，组合物和/或起子培养物的储存稳定性可以通过配制低水活性的产品来延长。通过控制水活性(Aw)，可以预测和调节水分迁移对产品的影响。因此，可能优选的是，本文的干燥组合物的水活性(Aw)的范围为0.01-0.8，优选0.05-0.4。

可以理解的是，在称为“生产发酵产品的方法”和“新型嗜热链球菌菌株”的部分中公开的方面和实施方案可以同样与说明书的本部分相关。特别是在“新型嗜热链球菌菌株”下关于本发明的特定菌株的公开适用于本说明书的这一部分，这对于本领域技术人员也是清楚的。

生产发酵产品的方法

术语“乳(milk)”应理解为通过对任何哺乳动物(如奶牛、绵羊、山羊、水牛或骆驼)挤奶而获得的乳汁分泌物。在优选的实施方案中，如是牛乳。

术语“乳基质”可以是可根据本发明的方法而进行发酵的任何生乳和/或加工乳材料。因此，有用的乳基质包括(但不限于)包含蛋白质的任何乳或乳样产品的溶液/悬浮液，例如全脂或低脂乳、脱脂乳、酪乳、重构奶粉、炼乳、干乳、乳清、乳清渗透物、乳糖、由乳糖结晶获得的母液、乳清蛋白浓缩物或乳脂。显然，乳基质可来源于任何哺乳动物，例如基本上纯的哺乳动物奶，或重构奶粉，或者乳基质可部分地来源于植物材料。优选地，乳基质中的至少部分蛋白质是(ⅰ)哺乳动物奶中天然存在的蛋白质，例如酪蛋白或乳清蛋白，或(ⅱ)植物乳中天然存在的蛋白质。然而，部分蛋白质可能是乳中非天然存在的蛋白质。

在发酵之前，乳基质可根据所属领域中已知的方法进行均质化和巴氏灭菌。

本文所用的“均质化”是指充分混合以获得可溶的悬浮液或乳液。如果均质化在发酵之前进行，这样做可以将乳脂分解成更小的尺寸，使其不再从乳中分离出来。这可通过在高压下迫使乳通过小孔来实现。

本文所用的“巴氏灭菌”是指处理乳基质以减少或消除例如微生物等活生物体的存在。优选地，巴氏灭菌是通过将指定温度维持指定时段来实现。指定温度通常通过加热来实现。可选择温度和持续时间以便杀死或灭活某些细菌，例如有害细菌。随后可进行快速冷却步骤。

用于生产发酵乳制品的发酵工艺是公知的，且所属领域技术人员将了解如何选择合适的工艺条件，例如温度、氧、微生物的量和特征以及工艺时间。显然，选择发酵条件以便支持本发明的实现，即获得发酵产品，如固体或液体形式的乳制品或乳制品类似产品(发酵乳制品)。

本文所用术语“发酵乳制品”是指食品或饲料制品，其中食品或饲料制品的制备涉及用乳酸菌发酵乳基质。本文所用的“发酵乳制品”包括但不限于酸奶和奶酪等产品。通过用嗜热链球菌和德氏乳杆菌保加利亚亚种发酵制备的奶酪的实例包括马苏里拉奶酪和比萨奶酪(Hoier et al.(2010)in The Technology of Cheese,2^nd Ed.BlackwellPublishing,Oxford；166-192)。优选地，发酵乳制品是酸奶。

在本上下文中，术语“发酵剂”是一种培养物，其是一种或更多种细菌菌株(如乳酸菌菌株)的制剂(组合物)，以在发酵产品如各种食品、饲料和饮料的制备中协助发酵工艺的开始。

在本上下文中，“酸奶发酵剂”是细菌培养物，其包含一种或更多种选自保加利亚乳杆菌菌株和/或嗜酸乳杆菌菌株的乳杆菌属菌株以及一种或更多种嗜热链球菌菌株。据此，“酸奶”是指通过用包含例如保加利亚乳杆菌和/或嗜酸乳杆菌的乳杆菌属菌株和嗜热链球菌菌株的组合物接种和发酵乳基质而获得的发酵乳制品。

本发明的另一方面涉及生产发酵产品的方法，其包括使用在选自由以下组成的组的一种或更多种基因中具有突变的嗜热链球菌菌株发酵基质：

(f)编码葡萄糖激酶的glcK基因，在对应于SEQ ID NO.11中的位置805的位置处，

或本发明的组合物。

可优选的是，基质是乳基质。乳基质可以是动物源性基质，然而，乳基质不必为纯动物源性，其可进一步包含植物源性基质。发酵产品可以是食品，也可以是乳制品。

根据要生产的产品，基质可以是乳基质。当发酵乳制品如酸奶、酪乳或开菲尔是成品时，特别优选乳基质。

乳基质可以是动物或植物源性产品。因此，在一个实施方案中，发酵产品是食品，例如乳制品。乳制品可选自由以下组成的组：发酵乳制品，例如但不限于酸奶、酪乳和开菲尔或奶酪，例如但不限于新鲜奶酪或帕斯塔菲拉塔。

尽管发酵产品和/或食品本身包含发酵期间产生的酸和风味，但可能期望发酵产品和/或乳制品包含选自由以下组成的组的成分：水果浓缩物、糖浆、益生菌菌株或培养物、着色剂、增稠剂、调味剂、防腐剂和其混合物。

同样，可以在发酵之前、期间和/或之后将酶添加到基质例如乳基质中，所述酶选自由以下组成的组：能够交联蛋白质的酶、转谷氨酰胺酶、天冬氨酸蛋白酶、乳糖酶、凝乳酶、皱胃酶(rennet)及其混合物。

在一个实施方案中，发酵产品可以是搅拌型产品、凝固型产品或可饮用产品的形式。

显然，本发明的另一方面涉及可通过本发明的方法获得的发酵产品。因此，本发明的一个方面也是包含在选自由以下组成的组的一种或更多种基因中具有突变的嗜热链球菌菌株的发酵产品：

本发明的另一方面涉及嗜热链球菌菌株用于制造发酵产品的用途，所述嗜热链球菌菌株在选自由以下组成的组的一种或更多种基因中具有突变：

(f)编码葡萄糖激酶的glcK基因，在对应于SEQ ID NO.11中的位置805的位置处。同样，发酵产品可以是食品，例如乳制品或乳制品类似产品。

应理解，在称为“组合物”和“新型嗜热链球菌菌株”的部分中公开的方面和实施方案可以同样与说明书的本部分相关。特别是在“新型嗜热链球菌菌株”下关于本发明的特定菌株的公开适用于本说明书的这一部分，这对于本领域技术人员也是清楚的。

新型嗜热链球菌菌株

本发明人惊奇地发现了在选自由以下组成的组的一种或更多种基因中具有突变的嗜热链球菌菌株：

可以设想嗜热链球菌菌株包含与SEQ ID NO：1、3、5、7、11和/或13至少50％相同的核苷酸序列。优选地，嗜热链球菌菌株包含与SEQ ID NO:1、3、5、7、11和/或13至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的核苷酸序列。

因此，在氨基酸水平上，可以进一步设想，突变导致选自由以下组成的组的编码的蛋白质发生变化：

b)半乳糖激酶，在对应于SEQ ID NO 4中的位置47的位置处；

f)葡萄糖激酶，在对应于SEQ ID NO 12中的位置268的位置处。

galK基因编码半乳糖激酶，半乳糖激酶是半乳糖代谢Leloir途径的酶，且将α-半乳糖转化为半乳糖-1-磷酸。

pgm基因编码磷酸葡萄糖变位酶，磷酸葡萄糖变位酶是β-葡萄糖-1-磷酸(G1P)和葡萄糖-6-磷酸(G6P)之间可逆转化反应的酶。

galR基因编码半乳糖操纵子阻遏物，半乳糖操纵子阻遏物在转录水平上调节链球菌属的半乳糖操纵子。

在使用本发明的一个特定实施方案中，嗜热链球菌菌株是发酵半乳糖的，并且在编码葡萄糖激酶蛋白的glcK基因的DNA序列中携带突变(更具体地，在对应于SEQ ID NO.11中位置805的位置)，其中所述突变使葡萄糖激酶蛋白失活或对基因的表达具有负面影响。

在优选的实施方案中，突变将葡萄糖激酶蛋白的活性(葡萄糖磷酸化成葡萄糖-6-磷酸的速率)降低至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％。

葡萄糖激酶活性可通过如Pool等人(2006.Metabolic Engineering8；456-464)所述的葡萄糖激酶酶法测定。

在使用本发明的一个特定实施方案中，嗜热链球菌菌株携带减少葡萄糖转运到细胞中的突变。在一个具体的实施方案中，嗜热链球菌菌株携带编码葡萄糖转运体组分的基因突变，其中所述突变使葡萄糖转运体失活或对基因的表达具有不利影响。

在一个更具体的实施方案中，嗜热链球菌菌株在编码PTS甘露糖/葡萄糖/果糖亚基IIC的manM基因的DNA序列中携带突变(也可称为葡萄糖/甘露糖磷酸转移酶系统的IIC^Man蛋白，因此两者在此互换使用)，其中所述突变使IIC^Man蛋白失活或对基因的表达具有不利影响。在优选的实施方案中，当与没有这种突变的细胞相比时，突变使葡萄糖向细胞中的转运减少了至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％。

葡萄糖向细胞中的转运可以通过Cochu等人(2003.Appl Environ Microbiol 69(9)；5423-5432)所述的葡萄糖摄取测定来确定。

优选地，嗜热链球菌菌株携带编码葡萄糖转运体组分的基因中的突变，其中所述突变使葡萄糖转运蛋白失活或对基因的表达具有不利影响。

该组分可以是葡萄糖转运蛋白的对葡萄糖的转运至关重要的任何组分。例如，设想嗜热链球菌中葡萄糖/甘露糖磷酸转移酶系统的任何组分失活将导致葡萄糖转运体功能的失活。

尤其是，失活的葡萄糖转运蛋白是一种与功能性葡萄糖转运蛋白相比不能促进葡萄糖通过质膜转运或以显著降低的速率促进葡萄糖通过质膜转运的蛋白。与编码功能性葡萄糖转运蛋白的基因相比，编码此类失活的葡萄糖转运蛋白的基因包括该基因的开放阅读框(ORF)中的突变，其中所述突变可以包括但不限于缺失、移码突变、终止密码子的引入或导致氨基酸取代、改变了蛋白的功能性质的突变，或减少或消除基因转录或翻译的启动子突变。

在优选的实施方案中，突变使葡萄糖转运蛋白的活性(葡萄糖的转运速率)降低至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％。葡萄糖转运体活性可以通过Cochu等人(2003.Appl Environ Microbiol 69(9)；5423-5432)所述的葡萄糖摄取测定来确定。

在一个特定实施方案中，当以1.0E06-1.0E07 CFU/ml的浓度接种到9.5％ B乳中并在40℃下生长20小时时，嗜热链球菌菌株可将9.5％ B乳中的葡萄糖量增加到至少5mg/ml。

在使用本发明的特定实施方案中，当以1.0E06-1.0E07 CFU/ml的浓度接种到含0.05％蔗糖的9.5％ B乳中并在40℃下生长20小时时，嗜热链球菌菌株DSM 33719和/或DSM33762可将含0.05％蔗糖的9.5％ B乳中的葡萄糖量增加到至少5mg/ml。

在本上下文中，9.5％ B乳是用复原的低脂脱脂奶粉制成的热处理乳，其干物质含量为9.5％，并在99℃下巴氏灭菌30分钟，随后冷却至40℃。

在本发明更优选的实施方案中，突变菌株导致葡萄糖量增加到至少4mg/ml、至少5mg/ml、至少6mg/ml、至少7mg/ml、至少8mg/ml、至少9mg/ml、至少10mg/ml、至少11mg/ml、至少12mg/ml、至少13mg/ml、至少14mg/ml、至少15mg/ml、至少20mg/ml或至少25mg/ml。

在另一个实施方案中，当以1.0E06-1.0E08 CFU/ml的浓度与一种或更多种另外的乳酸菌菌株一起接种并在40℃生长20小时时，嗜热链球菌菌株DSM 33719和/或DSM 33762可以将包含0.1％蔗糖、4％蛋白质(用脱脂奶粉调节)和1.5％脂肪(用9％奶油调节的1.5％全脂牛奶)的乳基中的葡萄糖量增加到至少5mg/ml。在本发明更优选的实施方案中，葡萄糖量增加到至少4mg/ml、至少5mg/ml、至少6mg/ml/、至少7mg/ml/、至少8mg/ml/、至少9mg/ml、至少10mg/ml、至少11mg/ml、至少12mg/ml、至少13mg/ml、至少14mg/ml、至少15mg/ml、至少20mg/ml或至少25mg/ml。

本文所用的术语“减少葡萄糖向细胞中转运的突变”是指编码参与葡萄糖转运的蛋白质的基因突变，其导致葡萄糖在细胞环境中积聚。

嗜热链球菌菌株的培养基中的葡萄糖水平可容易地通过技术人员已知的方法测量。

可以设想嗜热链球菌菌株包含与SEQ ID NO：2、4、6、8、10和/或12至少50％相同的氨基酸序列。优选地，嗜热链球菌菌株包含与SEQ ID NO:2、4、6、8、10和/或12至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的核苷酸序列。

在一个具体的实施方案中，核酸水平上的突变是：

(a)在对应于SEQ ID NO.1中的位置169的位置处从C到T的取代；

(b)在对应于SEQ ID NO.3中的位置139的位置处从G到A的取代；

(c)在对应于SEQ ID NO.5或13中的位置726的位置处从A到C的取代；

(d)在对应于SEQ ID NO.7中的位置490的位置处从C到T的取代；

(e)在对应于SEQ ID NO.9中的位置82的位置处从C到T的取代；和

(f)在对应于SEQ ID NO.11中的位置805的位置处从G到T的取代。

在一个具体的实施方案中，编码的蛋白质的变化是：

(a)在对应于SEQ ID NO 2中的位置57的位置处Pro被Leu取代；

(b)在对应于SEQ ID NO 4中的位置47的位置处Ile被Val取代；

(c)在对应于SEQ ID NO 6或14中的位置242的位置处Glu被Asp取代；

(d)在对应于SEQ ID NO 8中的位置164的位置处Pro被Ser取代；

(e)在对应于SEQ ID NO 10中的位置28的位置处Leu被Phe取代；和

(f)在对应于SEQ ID NO 12中的位置268的位置处Gly被Cys取代。

在一个优选的实施方案中，嗜热链球菌菌株包括以下突变：

(d)在对应于SEQ ID NO.1中的位置169的位置处从C到T的取代；

在对应于SEQ ID NO.3中的位置139的位置处从核苷酸G到A的取代，和在对应于SEQ ID NO.5或13中的位置726的位置处从核苷酸A到C的取代；

(e)在对应于SEQ ID NO.5或13中的位置490的位置处从C到T的取代和在对应于SEQ ID NO.7中的位置82的位置处从核苷酸C到T的取代；或

(f)在对应于SEQ ID NO.9中的位置805的位置处从G到T的取代。

在一个优选的实施方案中，其中所述嗜热链球菌菌株包含编码的蛋白质中的以下变化：

(c)在对应于SEQ ID NO 12中的位置268的位置处Gly被Cys取代。

表2.菌株和特定突变。

鉴定的菌株已被保藏。在一个优选的实施方案中，本发明涉及嗜热链球菌菌株：

(a)DSM 33719或其突变株或变异株；

(b)DSM 33720或其突变株或变异株；或

(c)DSM 33762或其突变株或变异株。

在一个优选的实施方案中，本发明涉及嗜热链球菌菌株DSM 33719或其突变株或变异株、嗜热链球菌菌株DSM 33720或其突变株或变异株和/或嗜热链球菌菌株DSM 33762或其突变株或变异株。在本发明的一个非常优选的实施方案中，突变株是天然存在的突变株或诱导突变株。

为了确保在工业上的适用性，可以设想DSM 33719的突变株或变异株显示出与DSM33719相同或相似的特征(例如酸化曲线和质构化性质)。同样，可以设想DSM 33720的突变株或变异株显示出与例如DSM 33720相同或相似的特征(例如酸化曲线和质构化性质)。类似，可以设想DSM33719的突变株或变异株显示出与DSM 33719相同或相似的特征(例如酸化曲线)。

为了确保在工业上的适用性，可以设想33719的突变株或变异株显示出与DSM33719相同或相似的特征(例如酸化曲线和质构化性质)。同样，可以设想33720的突变株或变异株显示出与例如DSM 33720相同或相似的特征(例如酸化曲线和质构化性质)。

在一个实施方案中，DSM 33719的突变株或变异株包含与SEQ ID NO：1、3和/或5至少50％相同的核苷酸序列。优选地，DSM 33719的突变株或变异株包含与SEQ ID NO:1、3和/或5至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的核苷酸序列。

在一个实施方案中，本发明的DSM 33720突变株或变异株包含与SEQ ID NO：7和/或9至少50％相同的核苷酸序列。优选地，DSM 33720的突变株或变异株包含与SEQ ID NO:7和/或9至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的核苷酸序列。

在一个实施方案中，DSM 33762的突变株或变异株包含与SEQ ID NO：11至少50％相同的核苷酸序列。优选地，DSM 33762的突变株或变异株包含与SEQ ID NO:11至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的核苷酸序列。

在一个实施方案中，DSM 33719的突变株或变异株包含与SEQ ID NO：1、3和/或5至少50％相同的氨基酸序列。优选地，DSM 33719的突变株或变异株包含与SEQ ID NO:1、3和/或5至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的氨基酸序列。

在一个实施方案中，本发明的DSM 33720突变株或变异株包含与SEQ ID NO：7和/或9至少50％相同的氨基酸序列。优选地，DSM 33720的突变株或变异株包含与SEQ ID NO:7和/或9至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的氨基酸序列。

在一个实施方案中，DSM 33762的突变株或变异株包含与SEQ ID NO：11至少50％相同的氨基酸序列。优选地，DSM 33762的突变株或变异株包含与SEQ ID NO:11至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的氨基酸序列。

如前所述，该行业需要开发具有甜味特性的新型嗜热链球菌菌株。因此，在优选实施方案中，根据本发明的嗜热链球菌菌株是发酵半乳糖的。

在本上下文中，本文定义的术语“发酵半乳糖”是指以至少10⁴个细胞/ml的量接种，在含有2％半乳糖(半乳糖作为唯一碳水化合物添加)的M17中于37℃孵育16小时后，pH值降低至少1.0。

有些菌株可以既发酵半乳糖，也发酵葡萄糖——例如DSM 33720就是这种情况，因为它既可以发酵葡萄糖，也可以发酵半乳糖。DSM 33720携带突变，使得葡萄糖不能或仅在有限程度上转运出细胞。因此，葡萄糖在发酵产物中的积聚程度不同于其他半乳糖发酵菌株。因此，DSM 33720是具有轻度甜味特性的菌株。

诸如“具有甜味特性的菌株”、“能够在发酵乳制品中提供所需葡萄糖积聚的菌株”和“具有增强食品天然甜味特性的菌株”等术语在本文中可互换使用，以表征在乳制品发酵中使用本发明菌株的有利方面。

在本发明的一个实施方案中，当对通过添加DSM 33720、DMS 33762和/或DSM33719和一种或更多种另外的乳酸菌菌株的组合物(混合培养物)制备的发酵产品进行测量时，嗜热链球菌菌株DSM 33720、DMS 33762和/或DSM 33719在300s^-1产生大于45Pa、50Pa、60Pa、70Pa、80Pa、90Pa或100Pa的应力。这可能是期望的，因为这类似于感官小组优选的粘度感觉/口感厚度。如实例4中所述测量剪切应力。

可以设想，本发明的嗜热链球菌菌株是2-脱氧葡萄糖抗性的。本文中与嗜热链球菌相关的术语“2-脱氧葡萄糖抗性的”定义为，在40℃孵育20小时后，在含有20mM 2-脱氧葡萄糖的M17培养基的平板上划线时，特定的突变细菌菌株具有生长成菌落的能力。培养基中2-脱氧葡萄糖的存在将阻止非突变菌株的生长，而突变菌株的生长不受影响或不受显著影响。因此，出于选择目的，可以在选择工艺中应用2-脱氧葡萄糖。

在一个实施方案中，嗜热链球菌菌株DSM 33720携带使菌株高度发酵半乳糖的突变。

应理解，在称为“组合物”和“生产发酵产品的方法”的部分中公开的方面和实施方案可以同样与说明书的本部分相关。

在描述本发明的上下文中(特别是在以下权利要求书的上下文中)，术语“一个/种(a，an)”和“所述/该(the)"以及类似代词的使用应被解释为涵盖单数和复数，除非本文另有说明或与上下文明显矛盾。除非另有说明，术语“包含”、“具有”、“包括”和“含有”应被解释为开放式术语(即，意味着“包括，但不限于，”)。除非本文另有说明，否则本文对数值范围的叙述仅旨在作为单独指该范围内的每个单独数值的简写方法，并且将每个单独值掺入说明书中，就好像其在本文中被单独叙述一样。除非本文另有说明或与上下文明显矛盾，本文所述的所有方法都可以以任何合适的顺序进行。本文提供的任一和所有实施例或示例性语言(例如，"诸如")的使用仅旨在更好地说明本发明，而不是对本发明的范围进行限制，另有要求除外。说明书中的任何语言不应被解释为指示任何未要求保护的要素对于本发明的实践是必不可少的。

在本说明书中，对显然先前已发表的文件的任何列举或讨论不一定应被视为承认该文件是现有技术的一部分或公知常识。

除非上下文另有指示，否则对于本发明的给定方面、特征或参数的优选、选择和实施方案应被视为已经结合本发明的所有其他方面、特征和参数的任何和所有优选、选择和实施方案进行了公开。对于包裹脂肪的(fat encapsulated)微生物培养物及其所有特征的描述来说尤其如此，其可能已经是通过本文所述方法获得的最终组合物或成品的一部分。本发明的实施方案和特征也在以下项目中概述。

保藏和专业人士应对方案(expert solution)

申请人要求，在专利授权日之前，下表所述的保藏的微生物样品只能向专业人士提供。

表3.保藏在根据《关于国际承认用于专利程序的微生物保存的布达佩斯条约》取得国际保藏机构地位的保藏机构进行：Leibniz Institute DSMZ-德国微生物保藏中心(German Collection of Microorganisms and Cell Cultures)Inhoffenstr.7B,38124Braunschweig,Germany(德国)。

菌株	登录号	保藏日期
			嗜热链球菌	DSM 33719	2020.11.26
嗜热链球菌	DSM 33762	2021.01.19
			嗜热链球菌	DSM 33720	2020.11.26

实施例

材料和方法

表4.培养基组成，每升H₂0的成分的量

无菌添加的碳源：

乳糖20g/l

葡萄糖20g/l、25g/l或50g/l

半乳糖20g/l、25g/l或50g/l。

如本领域所知，认为M17培养基适合嗜热链球菌的生长。在本上下文中，技术人员理解M17浓缩物可以由不同的供应商提供，而不依赖具体的供应商。人们将(在测量不确定性的标准内)针对本文相同的感兴趣细胞获得本文相关的2-脱氧葡萄糖抗性结果。

嗜热链球菌菌株DSM 33762是2-脱氧葡萄糖抗性突变株，而DSM 33720是高度发酵半乳糖的菌株，两者都来源于相同的半乳糖发酵母株(MS-1)。

DSM 33719是快速分泌葡萄糖的菌株，来源于高乳糖发酵和葡萄糖分泌母株(MS-2)。

乳酸化曲线和碳水化合物分析

将B乳用作基质。B乳由在蒸馏水中重构并在99℃下巴氏灭菌30分钟，然后冷却至30℃的干物质含量为9.5％(w/v)的脱脂奶粉组成。

随后使用CINAC现有技术硬件和软件或ICINAC系统(AMS alliance)进行酸化。该系统旨在监测乳酸发酵物的酸化活性，并可以使用电极同时跟踪和记录pH和温度的变化。

采用HPLC分析研究碳水化合物的含量。在40℃酸化约20小时后收集等份酸化的B乳。碳水化合物的量以g/l表示。

实施例1-使用2-脱氧葡萄糖分离葡萄糖排出增加的嗜热链球菌葡萄糖激酶突变株。

为了分离突变株，将来源于单菌落生长的MS-1细胞接种到10ml含有2％乳糖的M17肉汤中，并在40℃生长过夜。

次日，将培养物系列稀释地铺板在含有2％半乳糖和30mM 2-脱氧葡萄糖的M17琼脂平板上，并在40℃孵育20小时。抗性菌落首先在用于选择的相同类型琼脂平板上重新划线。使用幸存菌落接种含有2％乳糖、2％半乳糖或2％葡萄糖的新鲜M17肉汤，并测量生长。在选择的突变株中，鉴定到DSM 33762。该分离物在乳中生长时分泌葡萄糖(图1)，且基因组测序鉴定出编码葡萄糖激酶的基因突变。

从图1可以明显看出，与MS-1相比，DSM 33762具有较慢的酸化曲线。此外，DSM33762的碳水化合物分析显示，与通过MS-1制备的发酵乳相比，乳糖含量降低，而半乳糖和葡萄糖均分泌增加。

实施例2-使用适应性实验室进化来分离在含有半乳糖的培养基上具有更快生长速率的嗜热链球菌突变株。

适应性实验室进化(ALE)用于产生发酵半乳糖的突变株，与它们的母株相比，其在以半乳糖为唯一糖源的培养基中具有更快的生长速率。

用3个平行的MS-1培养物进行ALE，这些培养物在含有5％半乳糖+2％酪蛋白水解物的M17培养基中生长4周。ALE是根据基本上如Troy E.Sandberg、Michael J.Salazar、Liam L.Weng、Bernhard O.Palsson、Adam M.Feist.The emergence of adaptivelaboratory evolution as an efficient tool for biological discovery andindustrial biotechnology,Metabolic Engineering,Volume 56,2019,Pages 1-16(Sandberg et al.2019年)中所述的方案进行的。

每周对适应的培养物进行生长速率改善测试。这是通过在用于ALE工艺的相同培养基中直接测试等份适应培养物，然后也通过在含有半乳糖的M17琼脂平板上铺板适应培养物的稀释液来进行的。纯化来自这些平板的单菌落，且然后在含有半乳糖+酪蛋白水解物的M17培养基中测试优化的性能。与MS-1相比，大多数分离株的生长速度有显著提高。在3周ALE后分离出DSM 33720。

发现DSM 33720在乳中质构化极佳且具有快的酸化速率(图2)。

实施例3-使用适应性实验室进化来分离在含半乳糖和乳糖培养基上具有更快生长速率的分泌葡萄糖的嗜热链球菌突变株。

如WO2013/160413中所述，MS-2是由于双突变(glcK、Glu/Man PTS)而具有高葡萄糖分泌的菌株。然而，这种突变株通常在乳中表现出较慢的性能，且因此目的使用ALE分离更快的衍生物。使3个平行的MS-2培养物在含有5％半乳糖+2％酪蛋白水解物的M17培养基中生长3周。在第4周，将培养基换为含有2.5％半乳糖+2.5％乳糖+2％酪蛋白水解物的M17。根据基本上如Sandberg et al.2019中所述的方案进行ALE。

图3中的图代表了整个4周的生长，其中每天或每天数次稀释培养物并使其重新生长，直到达到更快的生长。从低基数的生长速率开始，4周后生长速率显著增加。4周后，对来自每3个平行培养物的稀释培养物进行铺板，并从这些琼脂平板中挑取单菌落。DSM 33719是来自图3中灰色曲线(培养物3)的一种这样的分离物。

图4显示了DSM 33719的结果。与MS-2相比，DSM 33719的酸化要快得多且DSM33719酸化至更低的pH。发酵乳的碳水化合物分析给出了为什么DSM 33719更快的指示。葡萄糖分泌减少到一半，并且还观察到DSM 33719非常适合在肽(酪蛋白水解物)上生长。对DSM 33719的进一步分析表明，除了显示更快的酸化，特别是在添加酪蛋白水解物或预培养时，还发现如果DSM 33719是混合培养物的一部分，其为乳提供了改善的质构(参见实施例4)。

实施例4-用菌株的不同组合和比例发酵的乳的酸化和碳水化合物分析。

表5.培养物的菌株组合

包括由科汉森销售的酸奶培养物Premium 1.0和YF-L904作为参考。

在发酵前生产两种不同的乳基。将脱脂奶粉和蔗糖加入乳中，随后在不搅拌的情况下水合2小时，其后进行均质化和>＝80℃巴氏消毒1分钟。

乳基1含有0.1％蔗糖、4％蛋白质(用脱脂奶粉调整)和1.5％脂肪(用9％奶油调整的1.5％全脂牛奶)。乳基2含有5％蔗糖、4％蛋白质(用脱脂奶粉调整)和1.5％脂肪(用9％奶油调整的1.5％全脂牛奶)。

将乳基移至200mL的婴儿奶瓶中。用将冷冻的丸(F-DVS)溶解在B乳中制备的100倍稀释液接种瓶子。对于每种菌株，制备单独的稀释液。为了产生混合物，将几种菌株以不同的比例和体积接种到1个CINAC瓶中。混合物的最终接种率为1E+6-1E+8CFU/mL。

除了在培养物2中使用的DSM 33762之外，所有菌株都是从由F-DVS产生的第一稀释液中接种的。为了制备DSM 33762接种材料，用少量DSM 33762接种1mL含有4％蔗糖和过量酪蛋白蛋白胨的M-17B-K培养基，并在43℃下孵育至少18小时。

将接种的瓶子放入水浴中并加热至43℃。

根据现有技术，使用CINAC硬件和软件监测43℃的pH，直到混合物达到4.55的最终pH。为了获得均匀的发酵乳凝胶，在25℃和2bar在微应用平台(MAP)中搅拌并处理每个瓶子。该MAP是小型的实验室设备，与牛奶场使用的现有技术后处理单元(PTU)相当。

制备发酵乳样品，称取1g+/-0.5g至10mL离心管中，使用HPLC进行碳水化合物分析。加入2mL冰冷的96％乙醇，将样品涡旋混合并置于-50℃，直到HPLC分析。

在质构分析(流变学)之前，将装有发酵乳样品的婴儿奶瓶在5℃储存7天。对于流变测量，将样品转移到bob杯中并分析剪切应力。

使用来自安东帕ASC流变仪DSR502型号测量剪切应力。该方法使用旋转步骤，该步骤基于样品从10-3s-1到300s-1然后回到10-3s-1的旋转变形。测量相应的剪切应力。对于这些结果，从流动曲线中提取一种剪切速率(300s-1)。测量前，将样品置于13℃1小时。用小勺从下到上轻轻搅拌每份样品5次，以确保样品均匀。填充流变杯直至界线(line)，然后放入样品匣(sample magazine)中。使用两个单独的酸奶杯测量样品，一式两份。在第+7天进行测量，并设定测量温度为13℃。在5℃储存样品直至测量当日。

表6.用培养物1、培养物3和培养物4获得的发酵时间、质构和葡萄糖水平。

试验在乳基1中进行。培养物3和培养物4的结果是从不同的混合物中获得的，即，例如，培养物3的8种混合物中的每一种包含相同的菌株，但量和比例不同。

发酵时间、质构和葡萄糖水平取决于培养物/混合物。培养物3和培养物4提供了与最佳质构化培养物Premium 1.0的质构同样好的质构，而培养物1在发酵乳制品中提供了低得多的质构。混合变化物(blend variants)中不同比例的菌株可导致例如发酵时间、质构或葡萄糖水平的变化。因此，可以相应地调整培养物和混合物的组成，以满足最终发酵产品的特定需求。

表7.用培养物1和培养物2获得的发酵时间、质地和葡萄糖水平。

上表显示了用培养物1和培养物2(混合物1-6)获得的结果。混合物1-6是包含相同菌株但量和比例不同的六种混合变化。可以看出，与培养物1相比，培养物2在两种乳基中产生相似的质构。同时，培养物2导致较短的发酵时间和较低的葡萄糖水平。

实施例5-混合物中菌株比例的改变改变了发酵乳制品的性质

如实施例4所述生产和分析发酵乳。

表8.培养物4的混合变化物的组成(占总数的％)

	混合变化物S03b	混合变化物S03	混合变化物P07
				DSM 33719	5.5	11.0	17.5
DSM 33720	89.0	83.5	78.0
				DSM 28910	5.5	5.5	4.5

表9.培养物4的混合变化物在乳基1中获得的发酵时间、质地和葡萄糖水平。

表10.培养物4的混合变化物在乳基2中获得的发酵时间、质构和葡萄糖水平。

培养物4的混合变化物(S03b、S03和P07)中菌株的不同比例导致发酵时间、质构(300×s的剪切应力)和葡萄糖水平的变化。在乳基1和乳基2中，与培养物1相比，混合变化物的质构更好。在乳基2中，与培养物1相比，培养物4的混合变化物显示出更快的发酵。因此，培养物/混合物的特征由各菌株的特性和菌株的存在量决定，产生不同的发酵产品。可以相应地调整培养物和混合物的组成，以满足最终发酵产品的特定需求。

项目

项目Y1.一种组合物，其包含在选自由以下组成的组的一种或更多种基因中具有突变的嗜热链球菌菌株：

项目Y2.根据项目Y1所述的组合物，其中所述突变导致选自由以下组成的组的编码的蛋白质发生变化：

b)半乳糖激酶，在对应于SEQ ID NO 4中的位置47的位置处；

f)葡萄糖激酶，在对应于SEQ ID NO 12中的位置268的位置处。

项目Y3.根据前述项目中任一项所述的组合物，其中所述突变是：

(a)在对应于SEQ ID NO.1中的位置169的位置处从C到T的取代；

(b)在对应于SEQ ID NO.3中的位置139的位置处从G到A的取代；

(c)在对应于SEQ ID NO.5或13中的位置726的位置处从A到C的取代；

(d)在对应于SEQ ID NO.7中的位置490的位置处从C到T的取代；

(e)在对应于SEQ ID NO.9中的位置82的位置处从C到T的取代；和

(f)在对应于SEQ ID NO.11中的位置805的位置处从G到T的取代。

项目Y4.根据前述项目中任一项所述的组合物，其中所述编码的蛋白质的变化是：

(a)在对应于SEQ ID NO 2中的位置57的位置处Pro被Leu取代；

(b)在对应于SEQ ID NO 4中的位置47的位置处Ile被Val取代；

(c)在对应于SEQ ID NO 6或14中的位置242的位置处Glu被Asp取代；

(d)在对应于SEQ ID NO 8中的位置164的位置处Pro被Ser取代；

(e)在对应于SEQ ID NO 10中的位置28的位置处Leu被Phe取代；和

(f)在对应于SEQ ID NO 12中的位置268的位置处Gly被Cys取代。

项目Y5.根据前述项目中任一项所述的组合物，其中所述嗜热链球菌菌株包含以下突变：

(c)在对应于SEQ ID NO.9中的位置805的位置处从G到T的取代。

项目Y6.根据前述项目中任一项所述的组合物，其中所述嗜热链球菌菌株包含所述编码的蛋白质的以下变化：

(c)在对应于SEQ ID NO 12中的位置268的位置处Gly被Cys取代。

项目Y7.根据前述项目中任一项所述的组合物，其中所述嗜热链球菌菌株是：

(a)DSM 33719或其突变株或变异株；

(b)DSM 33720或其突变株或变异株；或

(c)DSM 33762或其突变株或变异株。

项目Y8.根据前述项目中任一项所述的组合物，其中所述组合物包含一种或更多种选自由以下组成的组的嗜热链球菌菌株：DSM 33719、DSM 33719突变株、DSM 33719变异株、DSM 33720、DSM 33720突变株、DSM 33720变异株、DSM 33762、DSM 33762突变株和DSM33762变异株。

项目Y9.根据前述项目所述的组合物，其中所述组合物包括：

(a)DSM 33720、DSM 33719和DSM 33762；

(b)DSM 32227和DSM 33762；或

(c)DSM 33719和DSM 32227。

项目Y10.根据前述项目中任一项所述的组合物，其进一步包含一种或更多种属于乳杆菌属的菌株。

项目Y11.根据项目Y10所述的组合物，其中所述一种或更多种乳杆菌属的菌株选自由以下组成的组：德氏乳杆菌、德氏乳杆菌保加利亚亚种、德氏乳杆菌乳酸亚种、嗜酸乳杆菌、干酪乳酪杆菌、副干酪乳酪杆菌类干酪亚种和鼠李糖乳酪杆菌、发酵黏液乳杆菌、植物乳植杆菌植物亚种和瑞士乳杆菌。

项目Y12.根据Y9-Y10中任一项所述的组合物，其中所述德氏乳杆菌保加利亚亚种是DSM 28910或其突变株或变异株。

项目Y13.根据前述项目中任一项所述的组合物，其以混合物或成套试剂盒包含：

(b)属于乳杆菌属的菌株。

项目Y14.根据前述项目中任一项所述的组合物，其中所述组合物是发酵剂。

项目Y15.根据前述项目中任一项所述的组合物，其中所述组合物呈冷冻、喷雾干燥、冷冻干燥、真空干燥、风干、托盘干燥或液体形式。

项目Z1.一种生产发酵产品的方法，包括用嗜热链球菌菌株发酵基质，所述嗜热链球菌菌株在选自由项目1的(a)-(f)组成的组的一种或更多种基因中具有突变。

项目Z2.根据项目Z1所述的方法，其中所述基质是乳基质。

项目Z3.根据项目Z1-Z2中任一项所述的方法，其中所述乳基质来源于动物。

项目Z4.根据项目Z1-Z3中任一项所述的方法，其中所述乳基质还包括植物来源的基质。

项目Z5.根据项目Z1-Z4中任一项所述的方法，其中所述发酵产品是食品。

项目Z6.根据项目Z1-Z3中任一项所述的方法，其中所述食品是乳制品。

项目Z7.根据项目Z6所述的方法，其中所述乳制品选自由以下组成的组：发酵乳制品(例如酸奶、酪乳或开菲尔)或奶酪(例如新鲜奶酪或帕斯塔菲拉塔)。

项目Z8.根据项目Z1-Z7中任一项所述的方法，其中所述发酵产品还包含选自由以下组成的组的成分：水果浓缩物、糖浆、益生菌菌株或培养物、着色剂、增稠剂、调味剂、防腐剂及其混合物。

项目Z9.根据项目Z8所述的方法，其中在发酵之前、期间和/或之后将酶添加到基质中，所述酶选自由以下组成的组：能够交联蛋白质的酶、转谷氨酰胺酶、天冬氨酸蛋白酶、凝乳酶、皱胃酶、乳糖酶及其组合。

项目Z10.根据项目Z1-Z9中任一项所述的方法，其中所述发酵产品为搅拌型产品、凝固型产品或可饮用产品的形式。

项目Q1.一种可通过项目Z1-Z10中任一项所述的方法获得的发酵产品。

项目Q2.根据项目Q1所述的发酵产品，其中所述发酵产品是食品。

项目Q3.根据项目Q1-Q2中任一项所述的发酵产品，其中所述食品是乳制品。

项目P1.一种发酵产品，其包含一种或更多种在选自由项目Y1的(a)-(f)组成的组的一个或更多个基因中具有突变的嗜热链球菌菌株。

项目P2.根据项目P1所述的发酵产品，其中所述发酵产品是食品。

项目P3.根据项目P1所述的发酵产品，其中所述食品是乳制品。

项目W1.一种或更多种在选自由项目Y1的(a)-(f)组成的组的一种或更多种基因中具有突变的嗜热链球菌菌株制造发酵产品的用途。

项目W2.根据要求W1所述的用途，其中所述发酵产品是食品。

项目W3.根据W1-W2中任一项所述的用途，其中所述食品是乳制品。

项目X1.一种在选自由项目Y1的(a)-(f)组成的组的一种或更多种基因中具有突变的嗜热链球菌菌株。

项目X3.根据项目X1-X2中任一项所述的嗜热链球菌菌株，其中所述嗜热链球菌菌株是发酵半乳糖的。

项目X4.根据项目X1-X3中任一项所述的嗜热链球菌菌株，其中所述嗜热链球菌菌株是2-脱氧葡萄糖抗性的。

项目X5.根据项目X1-X4中任一项所述的嗜热链球菌菌株，其中所述嗜热链球菌携带减少葡萄糖向细胞中转运的突变。

6.根据项目X1-X5中任一项所述的嗜热链球菌菌株，其中当以1.0E06-1.0E07CFU/ml的浓度接种到9.5％ B乳中并在40℃生长20小时时，所述嗜热链球菌将9.5％ B乳中的葡萄糖量增加到至少5mg/ml。

项目X7.根据项目X1-X6中任一项所述的嗜热链球菌菌株，其中当以1.0E06-1.0E07 CFU/ml的浓度接种到含有0.05％蔗糖的9.5％ B乳中并在40℃生长20小时时，所述嗜热链球菌菌株将含有0.05％蔗糖的9.5％ B乳中的葡萄糖量增加到至少5mg/ml。

序列表

SEQ ID NO 1：编码PTS甘露糖/葡萄糖/果糖亚基IIC的manM基因-核苷酸序列。

SEQ ID NO 2：PTS甘露糖/葡萄糖/果糖亚基IIC(ManM)-氨基酸序列。

SEQ ID NO 3：编码半乳糖激酶的galK-核苷酸序列。

SEQ ID NO 4：半乳糖激酶(GalK)-氨基酸序列。

SEQ ID NO 5：编码磷酸葡萄糖变位酶的pgm-核苷酸序列。

SEQ ID NO 6：磷酸葡萄糖变位酶(Pgm)-氨基酸序列。

SEQ ID NO 7：编码磷酸葡萄糖变位酶的pgm-核苷酸序列。

SEQ ID NO 8：磷酸葡萄糖变位酶(Pgm)-氨基酸序列。

SEQ ID NO 9：编码半乳糖操纵子阻遏物的galR-核苷酸序列。

SEQ ID NO 10：半乳糖操纵子阻遏物(GalR)-氨基酸序列。

SEQ ID NO 11：编码葡萄糖激酶的glcK-核苷酸序列。

SEQ ID NO 12：葡萄糖激酶(GlcK)-氨基酸序列。

SEQ ID NO 13：编码磷酸葡萄糖变位酶的pgm-核苷酸序列。

SEQ ID NO 14：磷酸葡萄糖变位酶(Pgm)-氨基酸序列。

序列表

<110> 科·汉森有限公司

<120> 用于制备具有增加的天然甜度和风味的发酵食品的乳酸菌组合物

<130> P7527EP01

<160> 14

<170> BiSSAP 1.3.6

<210> 1

<211> 828

<212> DNA

<213> 嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus）

<220>

<223> PTS 甘露糖/葡萄糖/果糖亚基IIC基因序列 (manM)

<400> 1

atgtcagata tgtcaattat ttctgcgatt ttggtcgtag ctgttgcctt ccttgctggt 60

cttgaaagta tccttgacca attccaattc caccaaccac ttgttgcatg taccctcatc 120

ggtgctgcca caggtaacct cactgcaggt atcatgcttg gtggttctcc tcaaatgatt 180

acccttgctt gggcaaacat cggtgctgcc gtagctcctg acgttgccct tgcatctgtt 240

gccgctgcca tcattttggt taaaggtggt aaatttacag ctgaaggtat cggtgttgcg 300

attgcaatag ctatcctgct tgcagttgca ggtctcttcc taactatgcc tgttcgtaca 360

gcatctattg cctttgttca tgctgcagat aaagctgcag aacacggaaa catcgctggt 420

gttgaacgtg catactacct cgctctcctt cttcaaggtt tgcgtattgc tgtgccagca 480

gcccttcttc ttgccatccc ggcccaatct gttcaacatg cccttggctt gatgcctgac 540

tggctcaccc atggtttggt tgtcggtggt ggtatggtcg tagccgttgg ttacgccatg 600

attatcaata tgatggctac tcgtgaagtt tggccattct tcgccatcgg ttttgctttg 660

gcagcaatta gccaattgac acttatcgct cttggtacca ttggtgttgc catcgccttc 720

atctacctca acctttctaa acaaggtggc ggaaatggtg gcggaaatgg tggcggaact 780

tcatctggtt caggcgaccc aatcggcgat atcttggaag actactag 828

<210> 2

<211> 275

<212> PRT

<213> 嗜热链球菌

<220>

<223> PTS 甘露糖/葡萄糖/果糖亚基IIC蛋白序列 (ManM)

<400> 2

Met Ser Asp Met Ser Ile Ile Ser Ala Ile Leu Val Val Ala Val Ala

1 5 10 15

Phe Leu Ala Gly Leu Glu Ser Ile Leu Asp Gln Phe Gln Phe His Gln

20 25 30

Pro Leu Val Ala Cys Thr Leu Ile Gly Ala Ala Thr Gly Asn Leu Thr

35 40 45

Ala Gly Ile Met Leu Gly Gly Ser Pro Gln Met Ile Thr Leu Ala Trp

50 55 60

Ala Asn Ile Gly Ala Ala Val Ala Pro Asp Val Ala Leu Ala Ser Val

65 70 75 80

Ala Ala Ala Ile Ile Leu Val Lys Gly Gly Lys Phe Thr Ala Glu Gly

85 90 95

Ile Gly Val Ala Ile Ala Ile Ala Ile Leu Leu Ala Val Ala Gly Leu

100 105 110

Phe Leu Thr Met Pro Val Arg Thr Ala Ser Ile Ala Phe Val His Ala

115 120 125

Ala Asp Lys Ala Ala Glu His Gly Asn Ile Ala Gly Val Glu Arg Ala

130 135 140

Tyr Tyr Leu Ala Leu Leu Leu Gln Gly Leu Arg Ile Ala Val Pro Ala

145 150 155 160

Ala Leu Leu Leu Ala Ile Pro Ala Gln Ser Val Gln His Ala Leu Gly

165 170 175

Leu Met Pro Asp Trp Leu Thr His Gly Leu Val Val Gly Gly Gly Met

180 185 190

Val Val Ala Val Gly Tyr Ala Met Ile Ile Asn Met Met Ala Thr Arg

195 200 205

Glu Val Trp Pro Phe Phe Ala Ile Gly Phe Ala Leu Ala Ala Ile Ser

210 215 220

Gln Leu Thr Leu Ile Ala Leu Gly Thr Ile Gly Val Ala Ile Ala Phe

225 230 235 240

Ile Tyr Leu Asn Leu Ser Lys Gln Gly Gly Gly Asn Gly Gly Gly Asn

245 250 255

Gly Gly Gly Thr Ser Ser Gly Ser Gly Asp Pro Ile Gly Asp Ile Leu

260 265 270

Glu Asp Tyr

275

<210> 3

<211> 1167

<212> DNA

<213> 嗜热链球菌

<220>

<223> 半乳糖激酶基因序列 (galK)

<400> 3

atgaatacat cacagttaag agaaaagttt aaagaagttt ttggtgtaga agcagatcat 60

actttctttt caccaggtcg tattaatttg attggtgagc atacggacta caatggaggt 120

aacgtccttc cggtagctat taccctaggt acttacggag cggcccgcaa acgtgatgac 180

aaagttttgc gtttcttctc agctaacttt gaagagaagg gaatcatcga agtgccactt 240

gaaaatcttc gttttgaaaa agaacacaac tggacaaact atccaaaagg tgttcttcat 300

ttcttgcaag aagctgggca tacgattgat tcaggtatgg atatttacat ctatggtaac 360

attccaaacg gatcaggctt gtcatcatca tcatctttgg aattattgat tggtgttatt 420

gttgaaaaac tttatgacct taaattggaa cgcctggact tggttaaaat cggaaaacaa 480

acggaaaatg actttattgg cgttaactct ggtatcatgg accaattcgc tattggtatg 540

ggagctgatc aatgtgcgat ttacttggac acaaatactc taaagtatga cttggtaccc 600

cttgacctca aggataatgt cgtagtcatc atgaacacta acaaacgtcg tgaattggct 660

gattctaaat acaatgaacg tcgtgctgaa tgtgaaacag cagtatctga actacaagaa 720

aaattggata tccaaactct cggtgaatta gacttcttga catttgacgc atacagctat 780

ttgattaaag atgaaaaccg tatcaaacgt gcacgccatg tagttcttga aaatcaacgt 840

acacttcaag ctcgtaaagc tcttgaaaca ggagatttgg aaggctttgg acgccttatg 900

aatgcttctc atgtgtcatt ggaatatgat tacgaagtta caggtcttga acttgatact 960

ttggcacaca cagcttggga acaagaagga gtattaggag cccgcatgac aggagctggt 1020

ttcggtggat gtgccattgc acttgtaaac aaagacaaag ttgaagactt caaaaaagca 1080

gttggtcaac gctatgaaga agtcgttggt tatgcaccaa gcttctatat tgccgaagta 1140

actggtggtt cacgagtact tgattaa 1167

<210> 4

<211> 388

<212> PRT

<213> 嗜热链球菌

<220>

<223> 半乳糖激酶蛋白序列 (GalK)

<400> 4

Met Asn Thr Ser Gln Leu Arg Glu Lys Phe Lys Glu Val Phe Gly Val

1 5 10 15

Glu Ala Asp His Thr Phe Phe Ser Pro Gly Arg Ile Asn Leu Ile Gly

20 25 30

Glu His Thr Asp Tyr Asn Gly Gly Asn Val Leu Pro Val Ala Ile Thr

35 40 45

Leu Gly Thr Tyr Gly Ala Ala Arg Lys Arg Asp Asp Lys Val Leu Arg

50 55 60

Phe Phe Ser Ala Asn Phe Glu Glu Lys Gly Ile Ile Glu Val Pro Leu

65 70 75 80

Glu Asn Leu Arg Phe Glu Lys Glu His Asn Trp Thr Asn Tyr Pro Lys

85 90 95

Gly Val Leu His Phe Leu Gln Glu Ala Gly His Thr Ile Asp Ser Gly

100 105 110

Met Asp Ile Tyr Ile Tyr Gly Asn Ile Pro Asn Gly Ser Gly Leu Ser

115 120 125

Ser Ser Ser Ser Leu Glu Leu Leu Ile Gly Val Ile Val Glu Lys Leu

130 135 140

Tyr Asp Leu Lys Leu Glu Arg Leu Asp Leu Val Lys Ile Gly Lys Gln

145 150 155 160

Thr Glu Asn Asp Phe Ile Gly Val Asn Ser Gly Ile Met Asp Gln Phe

165 170 175

Ala Ile Gly Met Gly Ala Asp Gln Cys Ala Ile Tyr Leu Asp Thr Asn

180 185 190

Thr Leu Lys Tyr Asp Leu Val Pro Leu Asp Leu Lys Asp Asn Val Val

195 200 205

Val Ile Met Asn Thr Asn Lys Arg Arg Glu Leu Ala Asp Ser Lys Tyr

210 215 220

Asn Glu Arg Arg Ala Glu Cys Glu Thr Ala Val Ser Glu Leu Gln Glu

225 230 235 240

Lys Leu Asp Ile Gln Thr Leu Gly Glu Leu Asp Phe Leu Thr Phe Asp

245 250 255

Ala Tyr Ser Tyr Leu Ile Lys Asp Glu Asn Arg Ile Lys Arg Ala Arg

260 265 270

His Val Val Leu Glu Asn Gln Arg Thr Leu Gln Ala Arg Lys Ala Leu

275 280 285

Glu Thr Gly Asp Leu Glu Gly Phe Gly Arg Leu Met Asn Ala Ser His

290 295 300

Val Ser Leu Glu Tyr Asp Tyr Glu Val Thr Gly Leu Glu Leu Asp Thr

305 310 315 320

Leu Ala His Thr Ala Trp Glu Gln Glu Gly Val Leu Gly Ala Arg Met

325 330 335

Thr Gly Ala Gly Phe Gly Gly Cys Ala Ile Ala Leu Val Asn Lys Asp

340 345 350

Lys Val Glu Asp Phe Lys Lys Ala Val Gly Gln Arg Tyr Glu Glu Val

355 360 365

Val Gly Tyr Ala Pro Ser Phe Tyr Ile Ala Glu Val Thr Gly Gly Ser

370 375 380

Arg Val Leu Asp

385

<210> 5

<211> 1700

<212> DNA

<213> 嗜热链球菌

<220>

<223> 磷酸葡萄糖变位酶基因序列 (pgm)

<400> 5

atgtcttaca ctgaaaatta tcaaaaatgg ctcgattttg ctgaattgcc tgcttatctt 60

cgtgatgagt tggtttctat ggatgaaaaa actaaagaag atgccttcta tactaatctt 120

gaattcggta cagctggtat gcgtggttta attggcgctg gtaccaaccg tattaacatt 180

tatgttgttc gtcaagcaac cgaaggtttg gcgcaattga tcgactcaaa aggtgaagaa 240

gctaaaaaac gtggtgttgc tatcgcttat gacagccgtc atttctctcc tgagtttgct 300

tttgaatctg cgcaagtttt agcagctcat ggtattaaat cttatgtgtt cgagagcctt 360

cgtccaactc ctgaattatc attcgcagta cgtcatctcc acacatttgc tggtatcatg 420

ataacggcta gccacaaccc agctccattt aacggataca aagtttatgg tgaagacggt 480

ggacaaatgc cacccgctga tgccgatgca ttgacagatt acatccgtgc tatcgataat 540

cctttcactg tcaaattagc tgacctcgaa gacagcaagg ctagcggtct catcgaaatc 600

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gacttgatta atgagtatgg tcgtgacatg aagattgtat acacttcact tcatggtact 720

ggtgaaatgt tggttcgccg tgcccttgct caagctgggt ttgatgctgt tcaagtcgtt 780

gaagctcaag cggttcctca tgctgacttc ttaactgtta aatctcctaa cccagaaaac 840

caagatgcct ttgctcttgc tgaagaactc ggtcgtaatg tagatgccga cgtattggtt 900

gcaactgacc ctgacgcgga ccgtcttggc gttgaaatcc gccaaccaga tggttcatac 960

ctcaaccttt ctggtaacca aattggtgct atgaagctca caaaacagct ggtactctcc 1020

ctgctaatgc tgccctttgt aaatcaatcg tatcaactga attagttact aagattgcag 1080

aaagctacgg cgcaacaatg tttaatgtct tgactggctt caaatttatc ggtgaaaaga 1140

ttcatgaatt tgaaacacaa cacaattaca cttacatgtt tggttttgaa gaaagcttcg 1200

gttacctcat caaaccattt gtacgcgata aagacgctat ccaagccgtt cttatcgttg 1260

cagaaattgc tgcatactac cgttcacgtg gtatgacatt ggcagatggt atcgaagaaa 1320

tctacaaaca atatggttac ttctcagaaa agacaatttc agttatgctt tcaggtgttg 1380

atggtgctgc agaaatcaag aaaatcatgg acaaattccg tcgcaatgct cctaaacaat 1440

tcaacaacac tgatattgct aaaacagaag acttcttgga acaaacagct actactgctg 1500

acggcgtaga aaaattgaca actcctccaa gtaacgtttt gaaatacatc ttggctgatg 1560

attcatggtt tgccgttcgt ccttcaggta cagaaccaaa aatcaaattt tacattgcaa 1620

cagttggaga aactgaagcg gatgctaaag aaaaaattgc taacatcgaa gcagaaatca 1680

atgcttttgt aggtgaatag 1700

<210> 6

<211> 591

<212> PRT

<213> 嗜热链球菌

<220>

<223> 磷酸葡萄糖变位酶蛋白序列 (Pgm)

<400> 6

Met Ser Tyr Thr Glu Asn Tyr Gln Lys Trp Leu Asp Phe Ala Glu Leu

1 5 10 15

Pro Ala Tyr Leu Arg Asp Glu Leu Val Ser Met Asp Glu Lys Thr Lys

20 25 30

Glu Asp Ala Phe Tyr Thr Asn Leu Glu Phe Gly Thr Ala Gly Met Arg

35 40 45

Gly Leu Ile Gly Ala Gly Thr Asn Arg Ile Asn Ile Tyr Val Val Arg

50 55 60

Gln Ala Thr Glu Gly Leu Ala Gln Leu Cys Ala Thr Cys Gly Cys Cys

65 70 75 80

Ala Ala Ala Thr Ala Thr Ala Thr Cys Cys Thr Thr Ile Asp Ser Lys

85 90 95

Gly Glu Glu Ala Lys Lys Arg Gly Val Ala Ile Ala Tyr Asp Ser Arg

100 105 110

His Phe Ser Pro Glu Phe Ala Phe Glu Ser Ala Gln Val Leu Ala Ala

115 120 125

His Gly Ile Lys Ser Tyr Val Phe Glu Ser Leu Arg Pro Thr Pro Glu

130 135 140

Leu Ser Phe Ala Val Arg His Leu His Thr Phe Ala Gly Ile Met Ile

145 150 155 160

Thr Ala Ser His Asn Pro Ala Pro Phe Asn Gly Tyr Lys Val Tyr Gly

165 170 175

Glu Asp Gly Gly Gln Met Pro Pro Ala Asp Ala Asp Ala Leu Thr Asp

180 185 190

Tyr Ile Arg Ala Ile Asp Asn Pro Phe Thr Val Lys Leu Ala Asp Leu

195 200 205

Glu Asp Ser Lys Ala Ser Gly Leu Ile Glu Ile Ile Gly Glu Asn Val

210 215 220

Asp Ala Glu Tyr Leu Lys Glu Val Lys Asp Val Asn Ile Asn Gln Asp

225 230 235 240

Leu Ile Asn Glu Tyr Gly Arg Asp Met Lys Ile Val Tyr Thr Ser Leu

245 250 255

His Gly Thr Gly Glu Met Leu Val Arg Arg Ala Leu Ala Gln Ala Gly

260 265 270

Phe Asp Ala Val Gln Val Val Glu Ala Gln Ala Val Pro His Ala Asp

275 280 285

Phe Leu Thr Val Lys Ser Pro Asn Pro Glu Asn Gln Asp Ala Phe Ala

290 295 300

Leu Ala Glu Glu Leu Gly Arg Asn Val Asp Ala Asp Val Leu Val Ala

305 310 315 320

Thr Asp Pro Asp Ala Asp Arg Leu Gly Val Glu Ile Arg Gln Pro Asp

325 330 335

Gly Ser Tyr Leu Asn Leu Ser Gly Asn Gln Ile Gly Ala Ile Ile Ala

340 345 350

Lys Tyr Ile Leu Glu Ala His Lys Thr Ala Gly Thr Leu Pro Ala Asn

355 360 365

Ala Ala Leu Cys Lys Ser Ile Val Ser Thr Glu Leu Val Thr Lys Ile

370 375 380

Ala Glu Ser Tyr Gly Ala Thr Met Phe Asn Val Leu Thr Gly Phe Lys

385 390 395 400

Phe Ile Gly Glu Lys Ile His Glu Phe Glu Thr Gln His Asn Tyr Thr

405 410 415

Tyr Met Phe Gly Phe Glu Glu Ser Phe Gly Tyr Leu Ile Lys Pro Phe

420 425 430

Val Arg Asp Lys Asp Ala Ile Gln Ala Val Leu Ile Val Ala Glu Ile

435 440 445

Ala Ala Tyr Tyr Arg Ser Arg Gly Met Thr Leu Ala Asp Gly Ile Glu

450 455 460

Glu Ile Tyr Lys Gln Tyr Gly Tyr Phe Ser Glu Lys Thr Ile Ser Val

465 470 475 480

Met Leu Ser Gly Val Asp Gly Ala Ala Glu Ile Lys Lys Ile Met Asp

485 490 495

Lys Phe Arg Arg Asn Ala Pro Lys Gln Phe Asn Asn Thr Asp Ile Ala

500 505 510

Lys Thr Glu Asp Phe Leu Glu Gln Thr Ala Thr Thr Ala Asp Gly Val

515 520 525

Glu Lys Leu Thr Thr Pro Pro Ser Asn Val Leu Lys Tyr Ile Leu Ala

530 535 540

Asp Asp Ser Trp Phe Ala Val Arg Pro Ser Gly Thr Glu Pro Lys Ile

545 550 555 560

Lys Phe Tyr Ile Ala Thr Val Gly Glu Thr Glu Ala Asp Ala Lys Glu

565 570 575

Lys Ile Ala Asn Ile Glu Ala Glu Ile Asn Ala Phe Val Gly Glu

580 585 590

<210> 7

<211> 1719

<212> DNA

<213> 嗜热链球菌

<220>

<223> 磷酸葡萄糖变位酶基因序列 (pgm)

<400> 7

atgtcttaca ctgaaaatta tcaaaaatgg ctcgattttg ctgaattgcc tgcttatctt 60

cgtgatgagt tggtttctat ggatgaaaaa actaaagaag atgccttcta tactaatctt 120

gaattcggta cagctggtat gcgtggttta attggcgctg gtaccaaccg tattaacatt 180

tatgttgttc gtcaagcaac cgaaggtttg gcgcaattga tcgactcaaa aggtgaggaa 240

gctaaaaaac gtggtgttgc tatcgcttat gacagccgtc atttctctcc tgagtttgct 300

tttgaatctg cgcaagtttt agcagctcat ggtattaaat cttatgtgtt cgagagtctt 360

cgtccaactc ctgaattatc attcgcagta cgtcatctcc acacatttgc tggtatcatg 420

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ggacaaatgc cacccgctga tgccgatgca ttgacagatt acatccgtgc tattgataat 540

ccgttcactg tcaaattagc tgacctcgaa gacagcaagg ctagcggtct catcgaaatc 600

atcggtgaaa atgttgatgc tgaataccta aaagaagtta aagacgttaa catcaaccag 660

gacttgatta atgagtatgg tcgtgacatg aagattgtat acacttcact tcatggtact 720

ggtgaaatgt tggctcgccg tgcccttgct caagctgggt ttgatgctgt tcaagtcgtt 780

gaagctcaag cggttcctca tgctgacttc ttaactgtta aatctcctaa cccagaaaac 840

caagatgcct ttgctcttgc tgaagaactc ggtcgtaatg tagatgccga cgtattggtt 900

gcaactgacc ctgacgcgga ccgtcttggc gttgaaatcc gccaaccaga tggttcatac 960

ctcaaccttt ctggtaacca aattggtgct atcatcgcca aatatatcct tgaagctcac 1020

aaaacagctg gtactctccc tgctaatgct gccctttgta aatcaatcgt atcaactgaa 1080

ttagttacta agattgcaga aagctacggt gcaacaatgt ttaatgtctt gactggcttc 1140

aaatttatcg gtgaaaagat tcatgaattt gaaacacaac acaattacac ttacatgttt 1200

ggttttgaag aaagcttcgg ttacctcatc aaaccatttg tacgcgataa agacgctatc 1260

caagccgttc ttatcgttgc agaaattgct gcatactacc gttcacgtgg tatgacattg 1320

gcagatggta tcgaagaaat ctacaaacaa tatggttact tctcagaaaa gacaatttca 1380

gttacgcttt caggtgttga tggtgctgca gaaatcaaga aaatcatgga caaattccgt 1440

cgcaatgctc ctaaacaatt caacaacact gatattgcta aaacagaaga cttcttggaa 1500

caaacagcta ctactgctga cggcgtagaa aaattgacaa ctcctccaag taacgttttg 1560

aaatacatct tggctgatga ttcatggttt gccgttcgtc cttcaggtac agaaccaaaa 1620

atcaaatttt acattgcaac agttggagaa actgaagcgg atgctaaaga aaaaattgct 1680

aacatcgaag cagaaatcaa tgcctttgta ggtgaatag 1719

<210> 8

<211> 572

<212> PRT

<213> 嗜热链球菌

<220>

<223> 磷酸葡萄糖变位酶蛋白序列 (Pgm)

<400> 8

Met Ser Tyr Thr Glu Asn Tyr Gln Lys Trp Leu Asp Phe Ala Glu Leu

1 5 10 15

Pro Ala Tyr Leu Arg Asp Glu Leu Val Ser Met Asp Glu Lys Thr Lys

20 25 30

Glu Asp Ala Phe Tyr Thr Asn Leu Glu Phe Gly Thr Ala Gly Met Arg

35 40 45

Gly Leu Ile Gly Ala Gly Thr Asn Arg Ile Asn Ile Tyr Val Val Arg

50 55 60

Gln Ala Thr Glu Gly Leu Ala Gln Leu Ile Asp Ser Lys Gly Glu Glu

65 70 75 80

Ala Lys Lys Arg Gly Val Ala Ile Ala Tyr Asp Ser Arg His Phe Ser

85 90 95

Pro Glu Phe Ala Phe Glu Ser Ala Gln Val Leu Ala Ala His Gly Ile

100 105 110

Lys Ser Tyr Val Phe Glu Ser Leu Arg Pro Thr Pro Glu Leu Ser Phe

115 120 125

Ala Val Arg His Leu His Thr Phe Ala Gly Ile Met Ile Thr Ala Ser

130 135 140

His Asn Pro Ala Pro Phe Asn Gly Tyr Lys Val Tyr Gly Glu Asp Gly

145 150 155 160

Gly Gln Met Pro Pro Ala Asp Ala Asp Ala Leu Thr Asp Tyr Ile Arg

165 170 175

Ala Ile Asp Asn Pro Phe Thr Val Lys Leu Ala Asp Leu Glu Asp Ser

180 185 190

Lys Ala Ser Gly Leu Ile Glu Ile Ile Gly Glu Asn Val Asp Ala Glu

195 200 205

Tyr Leu Lys Glu Val Lys Asp Val Asn Ile Asn Gln Asp Leu Ile Asn

210 215 220

Glu Tyr Gly Arg Asp Met Lys Ile Val Tyr Thr Ser Leu His Gly Thr

225 230 235 240

Gly Glu Met Leu Ala Arg Arg Ala Leu Ala Gln Ala Gly Phe Asp Ala

245 250 255

Val Gln Val Val Glu Ala Gln Ala Val Pro His Ala Asp Phe Leu Thr

260 265 270

Val Lys Ser Pro Asn Pro Glu Asn Gln Asp Ala Phe Ala Leu Ala Glu

275 280 285

Glu Leu Gly Arg Asn Val Asp Ala Asp Val Leu Val Ala Thr Asp Pro

290 295 300

Asp Ala Asp Arg Leu Gly Val Glu Ile Arg Gln Pro Asp Gly Ser Tyr

305 310 315 320

Leu Asn Leu Ser Gly Asn Gln Ile Gly Ala Ile Ile Ala Lys Tyr Ile

325 330 335

Leu Glu Ala His Lys Thr Ala Gly Thr Leu Pro Ala Asn Ala Ala Leu

340 345 350

Cys Lys Ser Ile Val Ser Thr Glu Leu Val Thr Lys Ile Ala Glu Ser

355 360 365

Tyr Gly Ala Thr Met Phe Asn Val Leu Thr Gly Phe Lys Phe Ile Gly

370 375 380

Glu Lys Ile His Glu Phe Glu Thr Gln His Asn Tyr Thr Tyr Met Phe

385 390 395 400

Gly Phe Glu Glu Ser Phe Gly Tyr Leu Ile Lys Pro Phe Val Arg Asp

405 410 415

Lys Asp Ala Ile Gln Ala Val Leu Ile Val Ala Glu Ile Ala Ala Tyr

420 425 430

Tyr Arg Ser Arg Gly Met Thr Leu Ala Asp Gly Ile Glu Glu Ile Tyr

435 440 445

Lys Gln Tyr Gly Tyr Phe Ser Glu Lys Thr Ile Ser Val Thr Leu Ser

450 455 460

Gly Val Asp Gly Ala Ala Glu Ile Lys Lys Ile Met Asp Lys Phe Arg

465 470 475 480

Arg Asn Ala Pro Lys Gln Phe Asn Asn Thr Asp Ile Ala Lys Thr Glu

485 490 495

Asp Phe Leu Glu Gln Thr Ala Thr Thr Ala Asp Gly Val Glu Lys Leu

500 505 510

Thr Thr Pro Pro Ser Asn Val Leu Lys Tyr Ile Leu Ala Asp Asp Ser

515 520 525

Trp Phe Ala Val Arg Pro Ser Gly Thr Glu Pro Lys Ile Lys Phe Tyr

530 535 540

Ile Ala Thr Val Gly Glu Thr Glu Ala Asp Ala Lys Glu Lys Ile Ala

545 550 555 560

Asn Ile Glu Ala Glu Ile Asn Ala Phe Val Gly Glu

565 570

<210> 9

<211> 996

<212> DNA

<213> 嗜热链球菌

<220>

<223> 半乳糖操纵子阻遏物基因序列 (galR)

<400> 9

atggctacat tagcagatat cgcaaaatta gcaggtgtat ctatttcaac tgtttcacgt 60

gttcttaata aagatgaaac tctttccgta acagaggata ctagacatcg gatattaact 120

atcgctgatg aaatcggata tactaaatac aaaacaatta ataattcaaa aaaagaaaag 180

tatcaagtgg caattattca atgggttagt gaagaacacg agttagatga catctactat 240

tataatatta gacttggtat tgaaaaaaga gcctatgaac tagactacga gatgcttcac 300

tttttcaacg acattccttc aagtctagga gaggaggtcg ttggtgtact ctgtatcgga 360

aaatttagtc gtgaacaaat tgcgaaacta gaaagactaa aaaagactct ggtctttgtt 420

gatagtgata ctcttaatca aggacatcca tgtgttacta ctgattttga aaactccgta 480

caatcggcac tctgttatct taaagaacaa ggttgtaata atataggcct actcattggg 540

caagaaaaaa caacagatgc aactgaaatc atctctgatc ctcgtttacg ttcttatcgg 600

aactactgta tggaaaaggg aatctatgac cctcttttta ttctgactgg tgacttcact 660

gtccaatctg gctatgaact tcttgattct aagattaaga gtggagctac tttacctgat 720

gcttactttg cggctagtga tagtctagct attggtgcac tcagagcact tcaggaaaat 780

ggtatcaagg tccctgacga cattcaaatt atctctttta acgatacaac tctagctaaa 840

caagtgtatc ctccactttc tagtgtcact gtctatacag aagaaatggg acgaacagct 900

atggatattc tcaataaaca attattagca cctcgaaaaa taccaacact tactaaacta 960

ggaacaaaat taacattaag aaacagtaca aaatag 996

<210> 10

<211> 331

<212> PRT

<213> 嗜热链球菌

<220>

<223> 半乳糖操纵子阻遏物蛋白序列 (GalR)

<400> 10

Met Ala Thr Leu Ala Asp Ile Ala Lys Leu Ala Gly Val Ser Ile Ser

1 5 10 15

Thr Val Ser Arg Val Leu Asn Lys Asp Glu Thr Leu Ser Val Thr Glu

20 25 30

Asp Thr Arg His Arg Ile Leu Thr Ile Ala Asp Glu Ile Gly Tyr Thr

35 40 45

Lys Tyr Lys Thr Ile Asn Asn Ser Lys Lys Glu Lys Tyr Gln Val Ala

50 55 60

Ile Ile Gln Trp Val Ser Glu Glu His Glu Leu Asp Asp Ile Tyr Tyr

65 70 75 80

Tyr Asn Ile Arg Leu Gly Ile Glu Lys Arg Ala Tyr Glu Leu Asp Tyr

85 90 95

Glu Met Leu His Phe Phe Asn Asp Ile Pro Ser Ser Leu Gly Glu Glu

100 105 110

Val Val Gly Val Leu Cys Ile Gly Lys Phe Ser Arg Glu Gln Ile Ala

115 120 125

Lys Leu Glu Arg Leu Lys Lys Thr Leu Val Phe Val Asp Ser Asp Thr

130 135 140

Leu Asn Gln Gly His Pro Cys Val Thr Thr Asp Phe Glu Asn Ser Val

145 150 155 160

Gln Ser Ala Leu Cys Tyr Leu Lys Glu Gln Gly Cys Asn Asn Ile Gly

165 170 175

Leu Leu Ile Gly Gln Glu Lys Thr Thr Asp Ala Thr Glu Ile Ile Ser

180 185 190

Asp Pro Arg Leu Arg Ser Tyr Arg Asn Tyr Cys Met Glu Lys Gly Ile

195 200 205

Tyr Asp Pro Leu Phe Ile Leu Thr Gly Asp Phe Thr Val Gln Ser Gly

210 215 220

Tyr Glu Leu Leu Asp Ser Lys Ile Lys Ser Gly Ala Thr Leu Pro Asp

225 230 235 240

Ala Tyr Phe Ala Ala Ser Asp Ser Leu Ala Ile Gly Ala Leu Arg Ala

245 250 255

Leu Gln Glu Asn Gly Ile Lys Val Pro Asp Asp Ile Gln Ile Ile Ser

260 265 270

Phe Asn Asp Thr Thr Leu Ala Lys Gln Val Tyr Pro Pro Leu Ser Ser

275 280 285

Val Thr Val Tyr Thr Glu Glu Met Gly Arg Thr Ala Met Asp Ile Leu

290 295 300

Asn Lys Gln Leu Leu Ala Pro Arg Lys Ile Pro Thr Leu Thr Lys Leu

305 310 315 320

Gly Thr Lys Leu Thr Leu Arg Asn Ser Thr Lys

325 330

<210> 11

<211> 969

<212> DNA

<213> 嗜热链球菌

<220>

<223> 葡萄糖激酶基因序列 (glcK)

<400> 11

atgagtaaga aactcttagg tattgacctt ggtggaacaa ctgttaagtt tggtattttg 60

actgcagatg gtgaagttca agaaaaatgg gctattgaaa caaatacgtt tgaaaatggt 120

agccacattg ttcctgacat tgtagaatct ttgaaacacc gtttggaatt gtatggactt 180

actgctgaag attttattgg aattggtatg ggatctccag gtgcagttga ccgagaaaat 240

aaaacagtaa cgggtgcctt taacttgaac tgggcagaaa ctcaagaagt tggctctgtt 300

attgaaaaag aacttggtat tccattcgct attgataatg atgctaatgt ggctgcactg 360

ggtgaacgtt gggttggtgc tggtgctaac aatcggaatg ttgtctttat aacattgggt 420

acaggtgttg gtggcggtgt tatcgctgat ggtaacttaa ttcatggtgt tgccggtgct 480

ggtggggaaa ttggtcacat tattgttgaa cctgacacag gatttgagtg tacttgcgga 540

aacaaggggt gtctggaaac tgtagcttca gcaacaggta ttgtacgtgt agcacatcat 600

ttggcagaaa aatacgaagg aaactcttct attaaagctg ctgtagacaa tggtgagttt 660

gtgacaagta aagatattat cgtagctgct actgaaggtg ataagtttgc tgacagcatt 720

gttgataaag tctctaaata cctcggactt gcaacagcaa acatctcaaa cattcttaac 780

ccagattctg tcgttatcgg tggtggtgtt tctgccgcag gagaattctt gcgtagtcgt 840

gttgaaggat actttacacg ttatgcattc ccacaagttc gccgtacaac aaaagtgaaa 900

ttagcggagc ttggaaatga tgcaggaatc attggagctg ctagtcttgc ttatagtatt 960

gacaaataa 969

<210> 12

<211> 322

<212> PRT

<213> 嗜热链球菌

<220>

<223> 葡萄糖激酶蛋白序列 (GlcK)

<400> 12

Met Ser Lys Lys Leu Leu Gly Ile Asp Leu Gly Gly Thr Thr Val Lys

1 5 10 15

Phe Gly Ile Leu Thr Ala Asp Gly Glu Val Gln Glu Lys Trp Ala Ile

20 25 30

Glu Thr Asn Thr Phe Glu Asn Gly Ser His Ile Val Pro Asp Ile Val

35 40 45

Glu Ser Leu Lys His Arg Leu Glu Leu Tyr Gly Leu Thr Ala Glu Asp

50 55 60

Phe Ile Gly Ile Gly Met Gly Ser Pro Gly Ala Val Asp Arg Glu Asn

65 70 75 80

Lys Thr Val Thr Gly Ala Phe Asn Leu Asn Trp Ala Glu Thr Gln Glu

85 90 95

Val Gly Ser Val Ile Glu Lys Glu Leu Gly Ile Pro Phe Ala Ile Asp

100 105 110

Asn Asp Ala Asn Val Ala Ala Leu Gly Glu Arg Trp Val Gly Ala Gly

115 120 125

Ala Asn Asn Arg Asn Val Val Phe Ile Thr Leu Gly Thr Gly Val Gly

130 135 140

Gly Gly Val Ile Ala Asp Gly Asn Leu Ile His Gly Val Ala Gly Ala

145 150 155 160

Gly Gly Glu Ile Gly His Ile Ile Val Glu Pro Asp Thr Gly Phe Glu

165 170 175

Cys Thr Cys Gly Asn Lys Gly Cys Leu Glu Thr Val Ala Ser Ala Thr

180 185 190

Gly Ile Val Arg Val Ala His His Leu Ala Glu Lys Tyr Glu Gly Asn

195 200 205

Ser Ser Ile Lys Ala Ala Val Asp Asn Gly Glu Phe Val Thr Ser Lys

210 215 220

Asp Ile Ile Val Ala Ala Thr Glu Gly Asp Lys Phe Ala Asp Ser Ile

225 230 235 240

Val Asp Lys Val Ser Lys Tyr Leu Gly Leu Ala Thr Ala Asn Ile Ser

245 250 255

Asn Ile Leu Asn Pro Asp Ser Val Val Ile Gly Gly Gly Val Ser Ala

260 265 270

Ala Gly Glu Phe Leu Arg Ser Arg Val Glu Gly Tyr Phe Thr Arg Tyr

275 280 285

Ala Phe Pro Gln Val Arg Arg Thr Thr Lys Val Lys Leu Ala Glu Leu

290 295 300

Gly Asn Asp Ala Gly Ile Ile Gly Ala Ala Ser Leu Ala Tyr Ser Ile

305 310 315 320

Asp Lys

<210> 13

<211> 1719

<212> DNA

<213> 嗜热链球菌

<220>

<223> 磷酸葡萄糖变位酶基因序列 (pgm)

<400> 13

atgtcttaca ctgaaaatta tcaaaaatgg ctcgattttg ctgaattgcc tgcttatctt 60

cgtgatgagt tggtttctat ggatgaaaaa actaaagaag atgccttcta tactaatctt 120

gaattcggta cagctggtat gcgtggttta attggcgctg gtaccaaccg tattaacatt 180

tatgttgttc gtcaagcaac cgaaggtttg gcgcaattga tcgactcaaa aggtgaagaa 240

gctaaaaaac gtggtgttgc tatcgcttat gacagccgtc atttctctcc tgagtttgct 300

tttgaatctg cgcaagtttt agcagctcat ggtattaaat cttatgtgtt cgagagcctt 360

cgtccaactc ctgaattatc attcgcagta cgtcatctcc acacatttgc tggtatcatg 420

ataacggcta gccacaaccc agctccattt aacggataca aagtttatgg tgaagacggt 480

ggacaaatgc cacccgctga tgccgatgca ttgacagatt acatccgtgc tatcgataat 540

cctttcactg tcaaattagc tgacctcgaa gacagcaagg ctagcggtct catcgaaatc 600

atcggtgaaa atgttgatgc tgaataccta aaagaagtta aagacgttaa catcaaccag 660

gacttgatta atgagtatgg tcgtgacatg aagattgtat acacttcact tcatggtact 720

ggtgaaatgt tggttcgccg tgcccttgct caagctgggt ttgatgctgt tcaagtcgtt 780

gaagctcaag cggttcctca tgctgacttc ttaactgtta aatctcctaa cccagaaaac 840

caagatgcct ttgctcttgc tgaagaactc ggtcgtaatg tagatgccga cgtattggtt 900

gcaactgacc ctgacgcgga ccgtcttggc gttgaaatcc gccaaccaga tggttcatac 960

ctcaaccttt ctggtaacca aattggtgct atcatcgcca aatatatcct tgaagctcac 1020

aaaacagctg gtactctccc tgctaatgct gccctttgta aatcaatcgt atcaactgaa 1080

ttagttacta agattgcaga aagctacggc gcaacaatgt ttaatgtctt gactggcttc 1140

aaatttatcg gtgaaaagat tcatgaattt gaaacacaac acaattacac ttacatgttt 1200

ggttttgaag aaagcttcgg ttacctcatc aaaccatttg tacgcgataa agacgctatc 1260

caagccgttc ttatcgttgc agaaattgct gcatactacc gttcacgtgg tatgacattg 1320

gcagatggta tcgaagaaat ctacaaacaa tatggttact tctcagaaaa gacaatttca 1380

gttatgcttt caggtgttga tggtgctgca gaaatcaaga aaatcatgga caaattccgt 1440

cgcaatgctc ctaaacaatt caacaacact gatattgcta aaacagaaga cttcttggaa 1500

caaacagcta ctactgctga cggcgtagaa aaattgacaa ctcctccaag taacgttttg 1560

aaatacatct tggctgatga ttcatggttt gccgttcgtc cttcaggtac agaaccaaaa 1620

atcaaatttt acattgcaac agttggagaa actgaagcgg atgctaaaga aaaaattgct 1680

aacatcgaag cagaaatcaa tgcttttgta ggtgaatag 1719

<210> 14

<211> 572

<212> PRT

<213> 嗜热链球菌

<220>

<223> 磷酸葡萄糖变位酶蛋白序列 (Pgm)

<400> 14

Met Ser Tyr Thr Glu Asn Tyr Gln Lys Trp Leu Asp Phe Ala Glu Leu

1 5 10 15

Pro Ala Tyr Leu Arg Asp Glu Leu Val Ser Met Asp Glu Lys Thr Lys

20 25 30

Glu Asp Ala Phe Tyr Thr Asn Leu Glu Phe Gly Thr Ala Gly Met Arg

35 40 45

Gly Leu Ile Gly Ala Gly Thr Asn Arg Ile Asn Ile Tyr Val Val Arg

50 55 60

Gln Ala Thr Glu Gly Leu Ala Gln Leu Ile Asp Ser Lys Gly Glu Glu

65 70 75 80

Ala Lys Lys Arg Gly Val Ala Ile Ala Tyr Asp Ser Arg His Phe Ser

85 90 95

Pro Glu Phe Ala Phe Glu Ser Ala Gln Val Leu Ala Ala His Gly Ile

100 105 110

Lys Ser Tyr Val Phe Glu Ser Leu Arg Pro Thr Pro Glu Leu Ser Phe

115 120 125

Ala Val Arg His Leu His Thr Phe Ala Gly Ile Met Ile Thr Ala Ser

130 135 140

His Asn Pro Ala Pro Phe Asn Gly Tyr Lys Val Tyr Gly Glu Asp Gly

145 150 155 160

Gly Gln Met Pro Pro Ala Asp Ala Asp Ala Leu Thr Asp Tyr Ile Arg

165 170 175

Ala Ile Asp Asn Pro Phe Thr Val Lys Leu Ala Asp Leu Glu Asp Ser

180 185 190

Lys Ala Ser Gly Leu Ile Glu Ile Ile Gly Glu Asn Val Asp Ala Glu

195 200 205

Tyr Leu Lys Glu Val Lys Asp Val Asn Ile Asn Gln Asp Leu Ile Asn

210 215 220

Glu Tyr Gly Arg Asp Met Lys Ile Val Tyr Thr Ser Leu His Gly Thr

225 230 235 240

Gly Glu Met Leu Val Arg Arg Ala Leu Ala Gln Ala Gly Phe Asp Ala

245 250 255

Val Gln Val Val Glu Ala Gln Ala Val Pro His Ala Asp Phe Leu Thr

260 265 270

Val Lys Ser Pro Asn Pro Glu Asn Gln Asp Ala Phe Ala Leu Ala Glu

275 280 285

Glu Leu Gly Arg Asn Val Asp Ala Asp Val Leu Val Ala Thr Asp Pro

290 295 300

Asp Ala Asp Arg Leu Gly Val Glu Ile Arg Gln Pro Asp Gly Ser Tyr

305 310 315 320

Leu Asn Leu Ser Gly Asn Gln Ile Gly Ala Ile Ile Ala Lys Tyr Ile

325 330 335

Leu Glu Ala His Lys Thr Ala Gly Thr Leu Pro Ala Asn Ala Ala Leu

340 345 350

Cys Lys Ser Ile Val Ser Thr Glu Leu Val Thr Lys Ile Ala Glu Ser

355 360 365

Tyr Gly Ala Thr Met Phe Asn Val Leu Thr Gly Phe Lys Phe Ile Gly

370 375 380

Glu Lys Ile His Glu Phe Glu Thr Gln His Asn Tyr Thr Tyr Met Phe

385 390 395 400

Gly Phe Glu Glu Ser Phe Gly Tyr Leu Ile Lys Pro Phe Val Arg Asp

405 410 415

Lys Asp Ala Ile Gln Ala Val Leu Ile Val Ala Glu Ile Ala Ala Tyr

420 425 430

Tyr Arg Ser Arg Gly Met Thr Leu Ala Asp Gly Ile Glu Glu Ile Tyr

435 440 445

Lys Gln Tyr Gly Tyr Phe Ser Glu Lys Thr Ile Ser Val Met Leu Ser

450 455 460

Gly Val Asp Gly Ala Ala Glu Ile Lys Lys Ile Met Asp Lys Phe Arg

465 470 475 480

Arg Asn Ala Pro Lys Gln Phe Asn Asn Thr Asp Ile Ala Lys Thr Glu

485 490 495

Asp Phe Leu Glu Gln Thr Ala Thr Thr Ala Asp Gly Val Glu Lys Leu

500 505 510

Thr Thr Pro Pro Ser Asn Val Leu Lys Tyr Ile Leu Ala Asp Asp Ser

515 520 525

Trp Phe Ala Val Arg Pro Ser Gly Thr Glu Pro Lys Ile Lys Phe Tyr

530 535 540

Ile Ala Thr Val Gly Glu Thr Glu Ala Asp Ala Lys Glu Lys Ile Ala

545 550 555 560

Asn Ile Glu Ala Glu Ile Asn Ala Phe Val Gly Glu

565 570

Claims

1.一种组合物，其包含嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)菌株,所述嗜热链球菌菌株具有导致选自由以下的编码的蛋白质的变化的突变：

b)半乳糖激酶，在对应于SEQ ID NO 4中的位置47的位置处；

f)葡萄糖激酶，在对应于SEQ ID NO 12中的位置268的位置处。

2.根据权利要求2所述的组合物，其中所述编码的蛋白质的变化是：

(a)在对应于SEQ ID NO 2中的位置57的位置处Pro被Leu取代；

(b)在对应于SEQ ID NO 4中的位置47的位置处Ile被Val取代；

(c)在对应于SEQ ID NO 6或14中的位置242的位置处Glu被Asp取代；

(d)在对应于SEQ ID NO 8中的位置164的位置处Pro被Ser取代；

(e)在对应于SEQ ID NO 10中的位置28的位置处Leu被Phe取代；和

(f)在对应于SEQ ID NO 12中的位置268的位置处Gly被Cys取代。

3.根据权利要求1-2中任一项所述的组合物，其中所述嗜热链球菌菌株是

(a)DSM 33719或其突变株或变异株；

(b)DSM 33720或其突变株或变异株；或

(c)DSM 33762或其突变株或变异株。

4.根据前述权利要求所述的组合物，其中所述组合物包含：

(a)DSM 33720、DSM 33719和DSM 33762；

(b)DSM 32227和DSM 33762；或

(c)DSM 33719和DSM 32227。

5.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其进一步包含一种或更多种属于乳杆菌属(Lactobacillus)的菌株。

6.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其作为混合物或作为成套试剂盒包含：

(b)属于乳杆菌属的菌株。

7.一种生产发酵产品的方法，其包括使用嗜热链球菌菌株发酵基质，所述嗜热链球菌菌株具有导致选自权利要求1中的(a)-(f)的编码的蛋白质的变化的突变。

8.根据权利要求7所述的方法，其中所述基质是乳基质。

9.一种根据权利要求7-8中任一项所述的方法能够获得的发酵产品。

10.一种包含一种或更多种嗜热链球菌菌株的发酵产品，所述嗜热链球菌菌株具有导致选自权利要求1中的(a)-(f)的编码的蛋白质的变化的突变。

11.一种或更多种嗜热链球菌菌株用于制造发酵产品的用途，所述嗜热链球菌菌株具有导致选自权利要求1中的(a)-(f)的编码的蛋白质的变化的突变。

12.一种具有突变的嗜热链球菌菌株，

其具有导致选自权利要求1中的(a)-(f)的编码的蛋白质的变化的突变。

13.根据权利要求12所述的嗜热链球菌菌株，其中所述编码的蛋白质的变化是：

(a)在对应于SEQ ID NO 2中的位置57的位置处Pro被Leu取代；

(b)在对应于SEQ ID NO 4中的位置47的位置处Ile被Val取代；

(c)在对应于SEQ ID NO 6或14中的位置242的位置处Glu被Asp取代；

(d)在对应于SEQ ID NO 8中的位置164的位置处Pro被Ser取代；

(e)在对应于SEQ ID NO 10中的位置28的位置处Leu被Phe取代；和

(f)在对应于SEQ ID NO 12中的位置268的位置处Gly被Cys取代。

14.根据权利要求12-13中任一项所述的嗜热链球菌菌株，其中所述编码的蛋白质的变化是：

(a)在对应于SEQ ID NO 2中的位置57的位置处Pro被Leu取代；在SEQ ID NO 4中的位置47处Ile对被Val取代；和在对应于SEQ ID NO 6或14中的位置242的位置处Glu被Asp取代；

(b)在对应于SEQ ID NO 8中的位置164的位置处Pro被Ser取代；和在对应于SEQ ID NO10中的位置28的位置处Leu被Phe取代；或

(c)在对应于SEQ ID NO 12中的位置268的位置处Gly被Cys取代。

15.根据权利要求12-14中任一项所述的嗜热链球菌菌株，其中所述嗜热链球菌是：

(a)DSM 33719或其突变株或变异株；

(b)DSM 33720或其突变株或变异株；或

(c)DSM 33762或其突变株或变异株。