CN119125393A - 二硬脂酰磷脂酰甘油钠有关物质的分析检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种二硬脂酰磷脂酰甘油钠有关物质的分析检测方法，采用以辛烷基键合硅胶为填料的色谱柱；以乙酸铵缓冲液调节pH值2.9~3.1或甲酸铵缓冲液调节pH值1.9~2.1为流动相A；以乙酸铵甲醇溶液、甲酸铵甲醇溶液、甲酸的甲醇溶液或甲醇为流动相B，进行梯度洗脱。本发明的高效液相色谱电喷雾检测器法能够同时对多种待测杂质同时进行分离检测，溶剂简单，使用试剂低毒性；本发明的方法灵敏度高、稳定性好，可以定量的准确检测硬脂酰磷脂酰甘油钠中的杂质。

Description

二硬脂酰磷脂酰甘油钠有关物质的分析检测方法

技术领域

本发明属于化学分析技术领域，涉及二硬脂酰磷脂酰甘油钠有关物质的分析检测方法。

背景技术

二硬脂酰磷脂酰甘油钠（DSPG-NA）是一种磷脂类化合物，化学名称为1，2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸甘油钠盐，CAS为124011-52-5，化学结构式为：

二硬脂酰磷脂酰甘油钠大多用于脂质体的制备，同时也应用于制备胶束、纳米粒子等纳米技术。

二硬脂酰磷脂酰甘油钠没有紫外吸收，无法通过高效液相色谱-紫外检测法（HPLC-UV）对其有关物质进行测定。目前，在原进口注册标准中，该物质的有关物质测定使用薄层色谱测定法，分为两个系统检测（第一法为测定溶血磷脂酰甘油、磷脂酸、磷脂酰胆碱与其他未知物；第二法为测定游离脂肪酸），需要用不同的展开剂分离测定，检测结果不够直观，检测用试剂品种多、毒性大、过程操作繁琐，且通过该薄层色谱测定法只能实现限度检查，不能进行定量检测。

发明内容

本发明的目的是提供一种二硬脂酰磷脂酰甘油钠有关物质的分析检测方法。

本发明开发了用于二硬脂酰磷脂酰甘油钠有关物质检测的高效液相色谱法联合电喷雾检测器法（HPLC-CAD），本发明所建立的检测方法能够同时对以下多种二硬脂酰磷脂酰甘油钠杂质进行测定：

杂质Ⅰ：溶血磷脂酰甘油（LSPG-Na）

化学名称为1.2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸甘油钠盐；CAS为326495-23-2；化学结构式如下：

杂质Ⅱ：硬脂酸

化学名称为十八烷酸；CAS为57-11-4

化学结构式为：

杂质Ⅲ：磷脂酸（DSPA-Na）

化学名称为1，2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸钠盐

CAS为108321-18-2

化学结构式为：

杂质Ⅳ：磷脂酰胆碱（DSPC）

化学名称为1，2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱

英文名称为1 ，2-Distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine

CAS为816-94-4

分子式为C44H88NO8 P，

化学结构式为：

本发明的色谱条件为：

采用以辛烷基键合硅胶为填料的色谱柱；以乙酸铵缓冲液（调节pH值2.9~3.1）或甲酸铵缓冲液（调节pH值1.9~2.1）为流动相A；以乙酸铵甲醇溶液、甲酸铵甲醇溶液、甲酸的甲醇溶液或甲醇为流动相B：梯度洗脱程序为：

0min→10min，23％~27%流动相A、77%~73%流动相B；

10min→30min，23％~27%流动相A、77%~73%流动相B线性变化为12%流动相A、88％流动相B；

30min→80min，12％流动相A、88％流动相B线性变化为8%流动相A、92％流动相B；

80min→85min，8%流动相A、92％流动相B；

85min→86min，8％流动相A、92％流动相B线性变化为23％~27%流动相A、77%~73%流动相B；

86min→100min，23％~27%流动相A、77%~73%流动相B。

为优化上述技术方案，采取的具体限定还包括：

电喷雾检测器的雾化温度为 35~50 ℃。

所述的分析检测方法能够同时分离检测二硬脂酰磷脂酰甘油钠与杂质Ⅰ：溶血磷脂酰甘油、杂质Ⅱ：硬脂酸、杂质Ⅲ：磷脂酸以及杂质Ⅳ：磷脂酰胆碱。

所述色谱柱采用Luna^®5μm C₈(2)100Å，250×4.6mm。

所述流动相A为0.14~0.16 mol/L的乙酸铵缓冲液，用乙酸调节pH值至2.9~3.1，或0.09~0.11 mol/L甲酸铵缓冲液，用甲酸调节pH值1.9~2.1；优选地，所述流动相A为0.15mol/L的乙酸铵缓冲液，用乙酸调节pH值至3.0。

所述流动相B采用0.009~0.011 mol/L的乙酸铵甲醇溶液，或采用0.009~0.011mol/L的甲酸铵甲醇溶液，或采用0. 09%~0.11%甲酸的甲醇溶液；优选地，所述流动相B采用0.010 mol/L的乙酸铵甲醇溶液。

梯度洗脱程序为：

0min→10min，25%流动相A、75%流动相B；

10min→30min，25%流动相A、75%流动相B线性变化为12%流动相A、88％流动相B；

30min→80min，12％流动相A、88％流动相B线性变化为8%流动相A、92％流动相B；

80min→85min，8%流动相A、92％流动相B；

85min→86min，8％流动相A、92％流动相B线性变化为25%流动相A、75%流动相B；

86min→100min，25%流动相A、75%流动相B。

供试品溶液的配制为称取二硬脂酰磷脂酰甘油钠，加溶剂溶解并定量稀释制成3.2~4.0mg mg/ml的溶液；

柱温为28~32°C；检测流速为0.9~1.1ml/min。优选地，柱温为30℃，流动相流速为1.0ml/min。

溶剂为：叔丁醇-水，45~55：45~55 v/v；进样量为20~50μl。优选地，进样量为50μl。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明开发并优化得到了二硬脂酰磷脂酰甘油钠有关物质分析检测的高效液相色谱-电喷雾检测器法（HPLC-CAD），能够直观有效并准确的检测二硬脂酰磷脂酰甘油钠（DSPG-NA）有关物质。

本发明的分析检测方法能够对进口药品注册标准分在两个薄层色谱法的第一法、第二法进行检测的4种待测杂质同时进行分离检测。

本发明能有效的分离二硬脂酰磷脂酰甘油钠和其杂质，并定量检测二硬脂酰磷脂酰甘油钠中的相关杂质。

本发明采用的检测试剂简单，其中采用乙酸铵、乙酸和甲醇等，均为低毒性，该方法适于推广应用。

本发明的方法弥补了目前缺少适合二硬脂酰磷脂酰甘油钠有关物质分析检测的有效定量方法的空白。

经验证，本发明的方法专属性好、准确度高、灵敏度高，稳定性好，可以准确检测出硬脂酰磷脂酰甘油钠中的杂质。

附图说明

图1为实施例1中加标样品溶液HPLC图谱。

图2为实施例2中对照品溶液HPLC图谱。

图3为实施例2中供试品溶液HPLC图谱。

图4为实施例2中对照溶液HPLC图谱。

图5为实施例3中系统适用性溶液HPLC图谱。

图6为实施例4中混合溶液HPLC图谱。

图7为实施例5中混合溶液HPLC图谱。

图8为对比例1中第一法的薄层检测图。

图9为对比例1中第二法的薄层检测图。

图10为对比例2中DSPG-Na的HPLC图。

图11为对比例3中混合溶液的HPLC图。

图12为对比例4中混合溶液的HPLC图。

图13为对比例5中混合溶液的HPLC图。

具体实施方式

以下通过实施例的形式对本发明的上述内容再作进一步的详细说明，但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例，凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

下述实施例中所使用的实验方法，如无特殊说明均为常规方法，所用的试剂、方法和设备，如无特殊说明均为本技术领域常规试剂、方法和设备。

关于本申请中的缩写简称：

DSPG-Na是二硬脂酰磷脂酰甘油钠的缩写；

DSPC是磷脂酰胆碱的缩写；

LSPG-Na是溶血磷脂酰甘油的缩写；

DSPA-Na是磷脂酸的缩写。

本申请的方法采用以辛烷基键合硅胶为填料的色谱柱，如Luna^®5μm C₈(2)100Å，250×4.6mm或与其效能相当的色谱柱；Luna^®5μm C₈(2)100Å为商品型号，其中(2)表示第2代C₈硅烷基柱、Å表示色谱柱填充物颗粒孔隙大小。

以下实施例所用待测液配制溶剂为，叔丁醇：水=50：50体积比的混合溶液。

实施例1

仪器：赛默飞U3000配备电喷雾检测器。

色谱条件：Luna^®5μm C₈(2)100Å，250×4.6mm；以0.15mol/L乙酸铵缓冲液（冰乙酸调节pH值至3.0）为流动相A，以0.01mol/L乙酸铵甲醇溶液为流动相B，流速为1.0ml/min，CAD检测器雾化温度为35℃，柱温为30℃，进样盘温度为25℃，进样体积50μl；按下表进行梯度洗脱。

表1 实施例1的洗脱梯度方式

流动相配制：

流动相A：取乙酸铵11.56g加水至1L水中，用冰乙酸调节pH值至3.0。

流动相B：称取乙酸铵3.08g至4L甲醇中，溶解混匀后，即得。

溶液制备：

溶血磷脂酰甘油（LSPG-Na）定位溶液：称取溶血磷脂酰甘油（LSPG-Na）适量，加溶剂溶解稀释制成合适浓度的溶液。

硬脂酸定位溶液：称取硬脂酸适量，加溶剂溶解稀释制成合适浓度的溶液。

二硬脂酰磷脂酰甘油钠（DSPG-Na）定位溶液：称取二硬脂酰磷脂酰甘油钠（DSPG-Na）适量，加溶剂溶解稀释制成合适浓度的溶液。

磷脂酸（DSPA-Na）定位溶液：称取磷脂酸（DSPA-Na）适量，加溶剂溶解稀释制成合适浓度的溶液。

磷脂酰胆碱（DSPC）定位溶液：称取磷脂酰胆碱（DSPC）适量，加溶剂溶解稀释制成合适浓度的溶液。

加标样品溶液（系统适用性溶液）：取本品适量，加各杂质定位溶液适量，用溶液溶解并定量稀释制成每1ml中含溶血磷脂酰甘油（LSPG-Na）约36μg、硬脂酸约36μg、磷脂酸（DSPA-Na）约36μg、磷脂酰胆碱（DSPC）约36μg、二硬脂酰磷脂酰甘油钠（DSPG-Na）约3.6mg的混合溶液。

方法：精密量取系统适用性溶液和各定位溶液各50μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。

结果见表2，加标样品溶液见图1。

表2 分离度试验结果

实施例2

二硬脂酰磷脂酰甘油钠（DSPG-NA）有关物质的测定

对照品溶液：精密称取溶血磷脂酰甘油（LSPG-Na）对照品约18mg与硬脂酸对照品约18mg，置同一25ml容量瓶中，加溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀，为LSPG-Na对照品、硬脂酸对照品混合储备液。精密称取磷脂酸（DSPA-Na）对照品约18mg与磷脂酰胆碱（DSPC）对照品约18mg，置同一50ml容量瓶中，加溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀，为DSPA-Na对照品、DSPC对照品混合储备液。精密量取LSPG-Na对照品、硬脂酸对照品混合储备液0.5ml与DSPA-Na对照品、DSPC对照品混合储备液1.0ml至同一10ml量瓶中，用溶剂溶解稀释至刻度，摇匀。供试品溶液：精密称取本品约36mg，置10ml容量瓶中，加溶剂溶解并稀释至刻度。摇匀。对照溶液：精密量取供试品溶液1.0ml，置50ml量瓶中，用溶剂稀释至刻度，摇匀。

按照实施例1的色谱条件进行液相色谱分析，供试品溶液色谱图中，如有与溶血磷脂酰甘油（LSPG-Na）、硬脂酸、磷脂酸（DSPA-Na）、磷脂酰胆碱（DSPC）峰保留时间一致的色谱峰，均按外标法以峰面积计算其含量，其他单个杂质按自身对照法计算其含量。

有关物质对照品溶液的测定见图2，有关物质供试品溶液的测定见图3，有关物质对照溶液的测定见图4。

实施例3：

参照实施例1的试验操作和条件参数，分别改变色谱条件中的流速、柱温、流动相A中pH值和初始流动相的比例值和色谱柱的批次，其它条件及参数不变，考察混合加标供试品中溶液之间的之杂质和主峰之间分离情况。结果见表3，最小分离度为系统适用性溶液中主峰（DSPG-Na）及已知杂质与相邻杂质之间分离度最小值，最小值为1.6，为初始B相（有机相）27%，见图5。

表3 二硬脂酰磷脂酰甘油钠（DSPG-Na）有关物质耐用性试验结果

备注：最小分离度为系统适用性溶液中主峰（DSPG-Na）及已知杂质与相邻杂质之间分离度最小值。

实施例4：

仪器：赛默飞U3000配备电喷雾检测器。

色谱条件：辛烷基硅烷键合硅胶柱（Luna^®5μm C₈(2)100Å，250×4.6mm）；以0.10mol/L甲酸铵缓冲液（甲酸调节pH值至2.0）为流动相A，以甲醇为流动相B，流速为1.0ml/min，CAD检测器雾化温度为35℃，柱温为30℃，进样体积20μl。按下表梯度洗脱。

表4 实施例4的洗脱梯度方式

流动相配制：

流动相A：取甲酸铵6.3g加水至1L水中，用甲酸调节pH值至2.0。

流动相B：甲醇。

溶液制备：

取LSPG-Na、硬脂酸、DSPA-Na、DSPC和DSPG-Na加溶剂溶解并定量稀释制成每1ml含LSPG-Na、硬脂酸、DSPA-Na、DSPC各约0.12mg、DSPG-Na约0.5mg的混合溶液，作为混合溶液，进样。结果见图6。LSPG-Na、硬脂酸、DSPA-Na、DSPG-Na和DSPC依次出峰，分离度均符合要求。

实施例5：

仪器：赛默飞U3000配备电喷雾检测器。

色谱条件：辛烷基硅烷键合硅胶柱（Luna^®5μm C₈(2)100Å，250×4.6mm）或效能相当的色谱柱；以0.10mol/L甲酸铵缓冲液（甲酸调节pH值至2.0）为流动相A，以0.1%甲酸的甲醇溶液为流动相B，流速为1.0ml/min，CAD检测器雾化温度为35℃，柱温为30℃，进样体积20μl。按下表梯度洗脱。

表5 实施例5的洗脱梯度方式

流动相配制：

流动相A：取甲酸铵6.3g加水至1L水中，用甲酸调节pH值至2.0。

流动相B：取甲酸1.0ml加水至1L，混匀。

溶液制备：

取LSPG-Na、硬脂酸、DSPA-Na、DSPC和DSPG-Na加溶剂溶解并定量稀释制成每1ml含LSPG-Na、硬脂酸、DSPA-Na、DSPC各约0.12mg、DSPG-Na约0.5mg的混合溶液，作为混合溶液，进样。结果见图7。LSPG-Na、硬脂酸、DSPA-Na、DSPG-Na和DSPC依次出峰，分离度符合要求。

对比例1薄层色谱法（进口药品注册标准，标准号为JF20220011））

进口药品注册标准将上述4个已知杂质分在两个薄层色谱法（第一法为测定溶血磷脂酰甘油、磷脂酸、磷脂酰胆碱与其他未知物；第二法为测定游离脂肪酸）中，运用不同的展开剂分离测定。

第一法：测定溶血磷脂酰甘油、磷脂酸、磷脂酰胆碱与其他未知物

具体方法为：

溶剂为三氯甲烷-甲醇-水（65：25：4）；

展开剂为氯仿-甲醇-水-浓氨溶液（65：25：4：0.4）；

硫酸铜磷酸溶液（显色剂）为取磷酸8ml，置已加入水约60ml的烧杯中，摇匀，加入无水硫酸铜10g，使溶解，加水至100ml；

溶液配制：

精密称取本品适量，用溶剂溶解稀释制成每1ml中含10mg的溶液，作为供试品溶液；精密量取供试品溶液适量，用溶剂分别稀释制成每1ml约含0.025mg、0.05mg与0.1mg的溶液，作为对照溶液（1）、对照溶液（2）与对照溶液（3）；取溶血磷脂酰甘油、磷脂酸、磷脂酰胆碱对照品适量，精密称定，用溶剂溶解稀释制成每1ml中各含0.05mg的混合溶液，作为对照品混合溶液（1），取对照品混合溶液（1）和溶剂等量体积混合为对照品混合溶液（2）。

分别吸取上述溶液各10μl，分别点于同一硅胶G铝板上，置内壁贴有展开剂湿润滤纸的层析缸中，展开，晾干。喷以硫酸铜磷酸溶液，在170℃加热10分钟。观察对照品混合溶液、供试品溶液和对照溶液（1）、对照溶液（2）与对照溶液（3）的斑点颜色供试品溶液如显杂质斑点和对应的杂质斑点比较，计算其含量。取供试品3批测定，结果见下表和图8。

表6 DSPG-Na的溶血磷脂酰甘油、磷脂酸、磷脂酰胆碱与其他未知物检测结果

第二法：测定游离脂肪酸

具体方法为：

溶剂为三氯甲烷-甲醇-水（65：25：4）；

展开剂为正己烷-乙醚-冰醋酸（70：30：1）；

硫酸铜磷酸溶液（显色剂）为取磷酸8ml，置已加入水约60ml的烧杯中，摇匀，加入无水硫酸铜10g，使溶解，加水至100ml；

溶液配制：

精密称取硬脂酸对照品适量，用溶剂溶解并定量稀释制成每1ml中含0.03mg和0.01mg的溶液，分别作为对照品溶液；精密称取本品适量，用溶剂溶解并定量稀释制成每1ml中含10mg的溶液，作为供试品溶液；精密称取本品适量，用对照品溶液（0.03mg/ml）溶解并定量稀释制成每1ml中含10mg的溶液，作为加标供试品溶液；分别吸取上述对照品溶液、供试品溶液和加标供试品溶液0时和室温放置18小时样品各20ul，分别以条状点于同一硅胶Gs铝板上，置内壁贴有展开剂湿润滤纸的层析缸中展开，晾干。喷以硫酸铜磷酸溶液，在170℃加热10分钟。观察对照品溶液、供试品溶液和加标供试品溶液的斑点颜色。结果见下表及典型图谱见图9。

表7 DSPG-Na的游离脂肪酸检测结果

对比例2 文献方法

参照文献“HPLC-电雾式检测器(CAD)检测法测定脂质体中磷脂含量”来源于《中国药学杂志》2007年12月第42卷第23期

仪器：赛默飞U3000配备电喷雾检测器

色谱条件：

色谱柱为Thermo scientific Hypersil GOLD C18 4.6*250mm，5um；以水为流动相A， 以甲醇为流动相B；CAD雾化温度35℃；柱温30℃；流速1ml/min；进样体积10ul，按下表梯度洗脱：

表8 对比例2中洗脱梯度表

溶液配制：溶剂为水-叔丁醇（1：1），称取DSPG-Na约24mg置20ml量瓶中，加溶剂溶解并稀释至刻度摇匀，取10ul注入色谱仪，记录色谱图。结果见图10，DSPG-Na峰形拖尾。

以下对比例3-5为采用其他条件的高效液相色谱法联合电喷雾检测器法（HPLC-CAD）方法；这些对比例试验并非穷举，本申请通过多种试验条件、参数的摸索研究，最终得出实施例1、实施例4、实施例5建立的方法是最适于二硬脂酰磷脂酰甘油钠有关物质的分析检测方法。

对比例3

仪器：赛默飞U3000配备电喷雾检测器。

色谱条件：

辛烷基硅烷键合硅胶柱（Luna®5μm C8(2)100Å，250×4.6mm）；以0.1mol/L乙酸铵溶液（乙酸调节pH值至3.0）：甲醇（75：25）流动相A，以甲醇为流动相B，流速为1.0ml/min，CAD检测器雾化温度为35℃，柱温为30℃，进样体积50μl。进样盘温度25℃，按下表梯度洗脱。

表9 对比例3的洗脱梯度方式

混合溶液［在DSPG-Na及相关杂质的基础上加入制剂处方成分，即赋形剂和二棕榈酰磷脂酰胆碱（DPPC）及相关杂质溶血磷脂酰胆碱（LPPC）和棕榈酸]的制备：

取甘露醇（赋形剂）、溶血磷脂酰胆碱（LPPC）、LSPG-Na、棕榈酸、硬脂酸、二棕榈酰磷脂酰胆碱（DPPC）、DSPG-Na、DSPA-Na、和DSPC加溶剂［水-叔丁醇（1：1）］溶解并定量稀释制成每1ml含甘露醇14mg、LPPC约25μg、LSPG-Na约36μg、棕榈酸约16μg、硬脂酸约36μg、磷脂酸约36μg和磷脂酰胆碱约36μg 、DPPC 约0.8mg、DSPG-Na 约3.6mg的混合溶液。进样。结果见图11。甘露醇（赋形剂）、溶血磷脂酰胆碱（LPPC）、LSPG-Na、棕榈酸、硬脂酸、二棕榈酰磷脂酰胆碱（DPPC）、DSPG-Na、DSPA-Na、和DSPC依次出峰，DSPA-Na峰和DSPC峰重合，没有分离。

对比例4

仪器：赛默飞U3000配备电喷雾检测器。

色谱条件：

辛烷基硅烷键合硅胶柱（Luna®5μm C8(2)100Å，250×4.6mm）；以0.1mol/L乙酸铵溶液（乙酸调节pH值至3.0）：甲醇（75：25）流动相A，以0.1mol/L乙酸铵溶液（乙酸调节pH值至3.0）：甲醇（5：95）为流动相B，流速为1.0ml/min，CAD检测器雾化温度为35℃，柱温为30℃，进样体积50μl。进样盘温度25℃，按下表梯度洗脱。

表10 对比例4的洗脱梯度方式

混合溶液制备：

取甘露醇（赋形剂）、溶血磷脂酰胆碱（LPPC）、LSPG-Na、棕榈酸、硬脂酸、二棕榈酰磷脂酰胆碱（DPPC）、DSPG-Na、DSPA-Na、和DSPC加溶剂［水-叔丁醇（1：1）］溶解并定量稀释制成每1ml含甘露醇14mg、LPPC约25μg、LSPG-Na约36μg、棕榈酸约16μg、硬脂酸约36μg、磷脂酸约36μg和磷脂酰胆碱约36μg 、DPPC 约0.8mg、DSPG-Na 约3.6mg的混合溶液。进样。结果见图12。甘露醇（赋形剂）、溶血磷脂酰胆碱（LPPC）、LSPG-Na、棕榈酸、硬脂酸、二棕榈酰磷脂酰胆碱（DPPC）、DSPG-Na、DSPA-Na、和DSPC依次出峰，DSPA-Na峰和DSPC峰之间的锋分离度不符合要求。混合溶液DSPG-Na后仅有2个杂质峰，分别为DSPA-Na和DSPC，有DSPG-Na的未知杂质未洗脱出。

对比例5

仪器：赛默飞U3000配备电喷雾检测器。

色谱条件：

辛烷基硅烷键合硅胶柱（Luna®5μm C8(2)100Å，250×4.6mm）；以0.1mol/L乙酸铵溶液（乙酸调节pH值至3.0）：甲醇（75：25）流动相A，以0.1mol/L乙酸铵溶液（乙酸调节pH值至3.0）：甲醇（5：95）为流动相B，流速为1.0ml/min，CAD检测器雾化温度为35℃，柱温为30℃，进样体积50μl。进样盘温度25℃，按下表梯度洗脱。

表11 对比例5的洗脱梯度方式

混合溶液制备：

取甘露醇（赋形剂）、溶血磷脂酰胆碱（LPPC）、LSPG-Na、棕榈酸、硬脂酸、二棕榈酰磷脂酰胆碱（DPPC）、DSPG-Na、DSPA-Na、和DSPC加溶剂［水-叔丁醇（1：1）］溶解并定量稀释制成每1ml含甘露醇14mg、LPPC约25μg、LSPG-Na约36μg、棕榈酸约16μg、硬脂酸约36μg、磷脂酸约36μg和磷脂酰胆碱约36μg 、DPPC 约0.8mg、DSPG-Na 约3.6mg的混合溶液。进样。结果见图13。甘露醇（赋形剂）、溶血磷脂酰胆碱（LPPC）、LSPG-Na、棕榈酸、硬脂酸、二棕榈酰磷脂酰胆碱（DPPC）、DSPG-Na、DSPA-Na、和DSPC依次出峰，DSPA-Na峰和DSPC峰之间的锋分离度不符合要求，但是DSPG-Na后有3个杂质峰，能洗脱出DSPG-Na的未知杂质。

二硬脂酰磷脂酰甘油钠有关物质分析检测的高效液相色谱法较少，目前仅有非常少量的公开方案，如对比例2的“HPLC-电雾式检测器(CAD)检测法测定脂质体中磷脂含量”文献方法，但其中峰形拖尾，测定效果不佳，由此说明了二硬脂酰磷脂酰甘油钠有关物质分析检测的高效液相色谱法条件较难获得，本申请通过多种试验条件、参数的摸索研究，也证实了这一点。

本发明通过大量研究工作，开发了针对于二硬脂酰磷脂酰甘油钠及其各有关物质的检测方法，解决了对该物质进行有关物质检测中的各种问题。本发明的分析检测方法能够同时分离检测二硬脂酰磷脂酰甘油钠与杂质Ⅰ：溶血磷脂酰甘油、杂质Ⅱ：硬脂酸、杂质Ⅲ：磷脂酸以及杂质Ⅳ：磷脂酰胆碱。

从实施例和对比例的试验结果可以看出，本发明提出的检测分析方法更为直观，使用一个色谱条件可检测样品中的4种已知杂质及其他未知杂质。

且经过方法验证，本发明方法的专属性、检测限和定量限、线性、准确度以及耐用性等方面均通过方法验证的要求，可以更好、更方便地实现对DSPG-Na有关物质的检测与控制。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何形式上的限制，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内，依据本发明的技术实质，对以上实施例所作的任何简单的修改、等同替换与改进等，均仍属于本发明技术方案的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种二硬脂酰磷脂酰甘油钠有关物质的分析检测方法，其特征在于：采用高效液相色谱法联合电喷雾检测器进行检测，色谱条件为：

采用以辛烷基键合硅胶为填料的色谱柱；以乙酸铵缓冲液调节pH值2.9~3.1或甲酸铵缓冲液调节pH值1.9~2.1为流动相A；以乙酸铵甲醇溶液、甲酸铵甲醇溶液、甲酸的甲醇溶液或甲醇为流动相B：梯度洗脱程序为：

0min→10min，23％~27%流动相A、77%~73%流动相B；

10min→30min，23％~27%流动相A、77%~73%流动相B线性变化为12%流动相A、88％流动相B；

30min→80min，12％流动相A、88％流动相B线性变化为8%流动相A、92％流动相B；

80min→85min，8%流动相A、92％流动相B；

85min→86min，8％流动相A、92％流动相B线性变化为23％~27%流动相A、77%~73%流动相B；

86min→100min，23％~27%流动相A、77%~73%流动相B。

2.根据权利要求1所述的二硬脂酰磷脂酰甘油钠有关物质的分析检测方法，其特征在于：电喷雾检测器的雾化温度为 35~50 ℃。

3.根据权利要求1所述的二硬脂酰磷脂酰甘油钠有关物质的分析检测方法，其特征在于：所述的分析检测方法能够同时分离检测二硬脂酰磷脂酰甘油钠与杂质Ⅰ：溶血磷脂酰甘油、杂质Ⅱ：硬脂酸、杂质Ⅲ：磷脂酸以及杂质Ⅳ：磷脂酰胆碱。

4.根据权利要求1所述的二硬脂酰磷脂酰甘油钠有关物质的分析检测方法，其特征在于：所述色谱柱采用Luna^®5μm C₈(2)100Å，250×4.6mm。

5.根据权利要求1所述的二硬脂酰磷脂酰甘油钠有关物质的分析检测方法，其特征在于：所述流动相A为0.14~0.16 mol/L的乙酸铵缓冲液，用乙酸调节pH值至2.9~3.1，或0.09~0.11 mol/L甲酸铵缓冲液，用甲酸调节pH值1.9~2.1。

6.根据权利要求1所述的二硬脂酰磷脂酰甘油钠有关物质的分析检测方法，其特征在于：所述流动相B采用0.009~0.011 mol/L的乙酸铵甲醇溶液，或采用0.009~0.011 mol/L的甲酸铵甲醇溶液，或采用0. 09%~0.11%甲酸的甲醇溶液。

7.根据权利要求1所述的二硬脂酰磷脂酰甘油钠有关物质的分析检测方法，其特征在于：梯度洗脱程序为：

0min→10min，25%流动相A、75%流动相B；

10min→30min，25%流动相A、75%流动相B线性变化为12%流动相A、88％流动相B；

30min→80min，12％流动相A、88％流动相B线性变化为8%流动相A、92％流动相B；

80min→85min，8%流动相A、92％流动相B；

85min→86min，8％流动相A、92％流动相B线性变化为25%流动相A、75%流动相B；

86min→100min，25%流动相A、75%流动相B。

8.根据权利要求1所述的二硬脂酰磷脂酰甘油钠有关物质的分析检测方法，其特征在于：供试品溶液的配制为称取二硬脂酰磷脂酰甘油钠，加溶剂溶解并定量稀释制成3.2~4.0mg mg/ml的溶液。

9.根据权利要求1所述的二硬脂酰磷脂酰甘油钠有关物质的分析检测方法，其特征在于：柱温为28~32°C；检测流速为0.9~1.1ml/min。

10.根据权利要求1所述的二硬脂酰磷脂酰甘油钠有关物质的分析检测方法，其特征在于：溶剂为：叔丁醇-水，45~55：45~55 v/v；进样量为20~50μl。