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CN119119241A - 一种重组i型胶原蛋白及其制备方法和应用 - Google Patents

一种重组i型胶原蛋白及其制备方法和应用 Download PDF

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CN119119241A
CN119119241A CN202411277903.4A CN202411277903A CN119119241A CN 119119241 A CN119119241 A CN 119119241A CN 202411277903 A CN202411277903 A CN 202411277903A CN 119119241 A CN119119241 A CN 119119241A
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acid sequence
recombinant
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CN202411277903.4A
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叶升
朱培
刘斯
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Tianjin University
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Abstract

本发明公开了一种重组I型胶原蛋白及其制备方法和应用，涉及生物领域。所述重组I型胶原蛋白的氨基酸序列包括A‑Bn‑A；其中，A的氨基酸序列与如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列具有至少80％序列同一性，B的氨基酸序列与如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列具有至少80％序列同一性，n为整数且≥1。该重组I型胶原蛋白中的序列来源于天然胶原蛋白，用于人体时不会出现免疫排斥反应，且该重组I型胶原蛋白在体外能够正确折叠成三股螺旋，具备良好的稳定性和生物活性，应用于药物、医疗器械、生物材料、组织工程产品、化妆品和护肤品等产品的制备具有效果更好的优势。

Description

一种重组I型胶原蛋白及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及生物领域，具体而言，涉及一种重组I型胶原蛋白及其制备方法和应用。
背景技术
胶原蛋白是一种细胞外蛋白质，它是由3条肽链拧成螺旋形的纤维状蛋白质，胶原蛋白是人体内含量最丰富的蛋白质，占全身总蛋白质的25％～30％。胶原蛋白富含人体需要的甘氨酸、脯氨酸、羟脯氨酸等氨基酸，主要存在于人体皮肤、骨骼、眼睛、牙齿、肌腱、内脏(包括心、胃、肠、血管)等部位，其功能是维持皮肤和组织器官的形态和结构，也是修复各损伤组织的重要原料物质。
胶原蛋白主要来源依旧为动物源胶原，如鱼等海产品以及牛、猪等牲畜加工副产物，通过酸、碱、酶等提取工艺来获取。使用这种传统方法制备的动物源胶原有一定的病毒隐患，而且应用于人体时易引起异体异种的排异反应，限制了胶原蛋白的应用。
随着生物科技的发展，利用微生物作为底盘细胞来实现胶原蛋白的表达生产。胶原蛋白的结构相对复杂，在生物体中，胶原蛋白的合成和修饰从原胶原开始，经历了羟基化、糖基化、相互交联等诸多化学变化，受到了多种生物酶的复杂调控，形成三股螺旋结构。现有技术在重组胶原蛋白结构设计上存在几个问题：首先是对脯氨酸与赖氨酸的羟基化功能的缺失；其次，很多设计的重组胶原蛋白表达后表征发现并不具有三股螺旋结构，并且很不稳定，容易形成沉淀，这些制约了重组胶原蛋白的进一步应用。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种重组I型胶原蛋白及其制备方法和应用。
本发明是这样实现的：
第一方面，本发明实施例提供了一种重组I型胶原蛋白，所述重组I型胶原蛋白的氨基酸序列包括：A-Bn-A；其中，所述A的氨基酸序列与如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列具有至少80％序列同一性，所述B的氨基酸序列与如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列具有至少80％序列同一性，所述n为整数且≥1。
第二方面，本发明实施例提供了一种重组I型胶原蛋白，其含有前述实施例所述的重组I型胶原蛋白，且其中至少1个脯氨酸被羟脯氨酸替代。
第三方面，本发明实施例提供了一种分离的核酸分子，其编码前述实施例所述的重组I型胶原蛋白。
第四方面，本发明实施例提供了一种重组载体或含所述重组载体的宿主细胞，所述重组载体包括前述实施例所述的核酸分子。
第五方面，本发明实施例提供了如前述实施例所述的重组I型胶原蛋白的制备方法，其包括：培养前述实施例所述的宿主细胞。
第六方面，本发明实施例提供了一种组合物，其活性成分包括前述实施例所述的重组I型胶原蛋白。
第七方面，本发明实施例提供了一种制品，其活性成分包括前述实施例所述的重组I型胶原蛋白。
第八方面，本发明实施例提供了如前述实施例所述的重组I型胶原蛋白在促进细胞黏附或制备具有促进细胞黏附作用的产品中的应用。
第九方面，本发明实施例提供了如前述实施例所述的重组I型胶原蛋白在制备促进皮肤创伤修复和/或组织再生的产品中的应用。
本发明具有以下有益效果：
本发明实施例提供了一种重组I型胶原蛋白，其氨基酸序列包括：A-Bn-A；其中，所述A的氨基酸序列与如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列具有至少80％序列同一性，所述B的氨基酸序列与如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列具有至少80％序列同一性，所述n为整数且≥1。该重组I型胶原蛋白中的序列来源于天然胶原蛋白，用于人体时不会出现免疫排斥反应，且该重组I型胶原蛋白在体外能够正确折叠成三股螺旋，具备良好的稳定性和生物活性，应用于药物、医疗器械、生物材料、组织工程产品、化妆品和护肤品等产品的制备具有效果更好的优势。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为重组Ⅰ型人源化胶原蛋白C1-2G的纯度检测结果；其中，1：C1-2，2：C1-2(L593)；
图2为C1-2(L593)相对于人Ⅰ型胶原蛋白(sigma-C7774)的羟化率；
图3为重组Ⅰ型人源化胶原蛋白C1-2G中一个片段的二级图谱结果；
图4为重组Ⅰ型人源化胶原蛋白C1-2G的圆二色谱鉴定结果；
图5为C1-2(L593)的圆二色谱鉴定结果；
图6为重组Ⅰ型人源化胶原蛋白C1-2G的热稳定性；
图7为C1-2(L593)的热稳定性；
图8为样本对3T3细胞贴壁的影响；
图9为3T3细胞贴壁效果的统计结果。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
一方面，本发明实施例提供了一种重组I型胶原蛋白，所述重组I型胶原蛋白的氨基酸序列包括：A-Bn-A；其中，所述A的氨基酸序列与如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列具有至少80％序列同一性，所述B的氨基酸序列与如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列具有至少80％序列同一性，所述n为整数且≥1。
在A-Bn-A所示的结构式中，B为重复单元，n个重复单元的序列直接相连；2个A分别连接于n个重复单元序列的N端和C端，该序列为帮助胶原蛋白折叠成三股螺旋的端序列肽段。
一方面，本发明实施例提供的重组I型胶原蛋白中的A和B来源于人I型胶原蛋白(氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示)，避免了动物源胶原固有的难题，显著提高了重组I型胶原蛋白的生物相容性，解决了免疫原性的问题；另一方面，该重组I型胶原蛋白100％严格遵守Gly X Y重复序列，不存在突变导致的疾病风险；进一步地，该重组胶原蛋白的结构设计目的性更强，在体外能够正确折叠成三股螺旋，具有更好的稳定性和生物活性，可广泛应用于护肤品、皮肤修复敷料、医学美容和保健食品等领域。
在一些实施例中，n可以为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10中的任意一种或任意两种之间的范围。当n≥2时，各重复单元(B)之间是直接连接的。
在一些实施例中，所述n为6～10。
本文中的“序列同一性百分数”，定义为：将候选序列与参考多肽序列进行比对并在必要时引入空位以获取最大百分比序列同一性，且不将任何保守置换视为序列同一性的一部分之后，候选序列中与参考多肽序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分数。用于确定氨基酸序列同一性百分数的比对可以用本领域技术人员熟知的各种方式实现，例如，使用公众可获得的计算机软件，如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可以确定用于比对序列的合适参数，包括在所比较的序列的全长上实现最大比对所需的任何算法。
在一些实施例中，所述的具有至少80％序列同一性具体可以为具有80％、82％、84％、86％、88％、90％、92％、94％、96％、98％、100％中的任意一种或任意两种之间的范围。
在一些实施例中，所述A可以在SEQ ID NO:2所示的序列基础上具有1个或多个氨基酸的取代、缺失、插入和/或添加。可选地，取代可以为保守氨基酸取代，指与SEQ ID No.2的氨基酸序列相比，有1、2或3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成肽。这些保守氨基酸的取代可以参照表1所示的进行。
表1氨基酸保守取代
在一些实施例中，所述B可以在SEQ ID NO:3所示的序列基础上具有1个或多个氨基酸的取代、缺失、插入和/或添加。可选地，取代可以为保守氨基酸取代，指与SEQ ID No.3的氨基酸序列相比，有1、2或3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成肽。这些保守氨基酸的取代可以参照表1所示的进行。
在一些实施例中，所述重组I型胶原蛋白的氨基酸序列包括：与如SEQ ID NO:4所示的序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列且具有与如SEQ ID NO:4所示的序列相同或相似的细胞黏附效果。例如，在SEQ ID NO:4所示的序列基础上进行1个或多个氨基酸的取代、缺失、插入和/或添加，多个具体可以为2、3、4、5、6、7、8、9、10或11个。可选地，取代可以为保守氨基酸取代，指与SEQ ID No.4的氨基酸序列相比，有1、2或3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换。这些保守氨基酸的取代可以参照表1所示的进行。
在一些实施例中，所述的具有至少80％序列同一性具体可以为具有80％、82％、84％、86％、88％、90％、92％、94％、96％、98％、100％中的任意一种或任意两种之间的范围。
在一些实施例中，所述重组I型胶原蛋白的氨基酸序列包括：如SEQ ID NO:4所示的序列。
在一些实施例中，所述重组I型胶原蛋白的氨基酸序列还包括：用于纯化或标记的标签。
在一些实施例中，所述重组I型胶原蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示。
本文的多肽序列中的所有氨基酸可为L型氨基酸，其中的一个或多个(如2-5个、2-4个或2-3个)氨基酸也可以用构象为D型的氨基酸、人工修饰的氨基酸、自然界存在的稀有氨基酸等进行替换，以提高多肽的生物利用度、稳定性和/或抗病毒活性。其中D型氨基酸是指与组成蛋白质的L型氨基酸相对应的氨基酸；人工修饰的氨基酸指经过甲基化、磷酸化等修饰的组成蛋白质的常见L型氨基酸；自然界存在的稀有氨基酸包括组成蛋白质的不常见氨基酸和不组成蛋白质的氨基酸，例如羟脯氨酸、5-羟基赖氨酸、甲基组氨酸、γ氨基丁酸、高丝氨酸等。
另一方面，一种重组I型胶原蛋白，其含有前述任意实施例所述的重组I型胶原蛋白，且其中至少1个脯氨酸被羟脯氨酸替代。
在一些实施例中，重组I型胶原蛋白含有前述任意实施例所述的重组I型胶原蛋白，且其中10％～20％的脯氨酸被羟脯氨酸替代。具体地，脯氨酸被羟脯氨酸替代的量为10％、12％、14％、16％、18％、20％中的任意一种或任意两种之间的范围。
另一方面，本发明实施例提供了一种分离的核酸分子，其编码前述任意实施例所述的重组I型胶原蛋白。
在一些实施例中，所述核酸分子的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示。
另一方面，本发明实施例提供了一种重组载体，其包括前述任意实施例所述的核酸分子。
在本发明的实施例中，重组载体是载体构建领域已知的，包括启动子的选择和其他调控元件，例如增强子元件。所述的重组载体包括适合引入细胞的序列。例如，载体可以是表达载体，在该载体中，所述蛋白的编码序列受到它自身顺式作用调控元件的控制，载体的设计便于宿主细胞的基因整合或基因替换等。本领域普通技术人员应理解，在本发明中，“载体”包括DNA分子，例如，质粒、噬菌体、病毒或其他载体，它含有一个或多个异源的或重组的核苷酸序列。合适的噬菌体和病毒载体包括，但不限于：λ-噬菌体、EMBL噬菌体、猿猴病毒、牛疣病毒、Epstein-Barr病毒、腺病毒、疱疹病毒、小鼠肉瘤病毒、鼠类乳癌病毒和慢病毒等。
在一些实施例中，所述重组表达载体包括：pET系列载体、穿梭载体、噬菌体和病毒载体中的任意一种。
在一些实施例中，所述pET系列载体包括pET-28a。
另一方面，本发明实施例提供了一种宿主细胞，其包括前述任意实施例所述的重组载体。
在一些实施例中，宿主细胞可以是原核细胞，例如大肠杆菌，宿主细胞也可以是真核细胞，例如真菌，酵母。
在本发明公开了重组I型胶原蛋白的氨基酸序列的基础上，本领域技术人员容易想到采用基因工程技术或其他技术(化学合成、重组表达)制备得到该重组I型胶原蛋白，例如从能够重组表达如上任一项所述的重组I型胶原蛋白的重组细胞的培养产物中分离纯化得到该重组I型胶原蛋白，这对本领域技术人员来说是容易实现的，基于此，无论采用何种技术制备本发明的抗体或其功能性片段，其均属于本发明的保护范围。
另一方面，本发明实施例提供了如前述任意实施例所述的重组I型胶原蛋白的制备方法，其包括：培养前述任意实施例所述的宿主细胞，诱导蛋白表达。
在一些实施例中，所述培养在转速为220rpm、温度为37℃的摇床中进行。
在一些实施例中，所述诱导蛋白表达的具体程序可以为：降温至16℃并添加IPTG；可选地，所述IPTG的浓度为1mM。
在一些实施例中，在诱导蛋白表达后，所述制备方法还包括：收集表达重组I型胶原蛋白；纯化重组I型胶原蛋白。
可选地，所述收集表达重组I型胶原蛋白的具体程序可以为：将诱导蛋白表达所得到的产物于4℃环境下4000rpm离心10-20min，利用含有1×PBS溶液重悬沉淀，加入抑制剂后进行超声破碎，破碎后于4℃环境下15000～18000rpm离心20～40min。纯化的方法可以为使用Ni亲和层析柱纯化。
可选地，重组I型胶原蛋白的制备方法可以包括：(1)大肠杆菌基因工程菌的构建；(2)大肠杆菌基因工程菌的发酵培养；(3)蛋白的诱导和表达；(4)蛋白的纯化。
可选地，在上述步骤(1)中，大肠杆菌基因工程菌的构建可以通过如下步骤进行：将包含前述任意实施例所述重组I型胶原蛋白的核苷酸序列的表达载体转入大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3)中，筛选得到阳性大肠杆菌基因工程菌。
可选地，在上述步骤(2)与(3)中，大肠杆菌基因工程菌的发酵培养和蛋白的诱导和表达可以通过如下步骤进行：a.挑取优选后的大肠杆菌基因工程菌单菌落，置于含有卡那抗生素的LB液体培养基中(10ml)，37℃，220rpm过夜培养后再转移至含有卡那抗生素的LB液体培养基中(1L)培养，至OD值在0.6～0.8时，降温至16℃；b.加入终浓度为1M IPTG进行诱导，培养12-16小时后收集菌体，即在4℃条件下，4000rpm离心20min收集菌体。
在上述步骤(4)中，蛋白的纯化可以通过如下步骤进行：a.用缓冲液(1×PBS，pH7.4)重悬细菌，然后进行菌体破碎，破碎后在4℃条件下16000rpm离心30分钟，收集上清液；b.利用Ni亲和柱结合蛋白，而后先用缓冲液清洗Ni柱，再用含有20mM咪唑的洗涤缓冲溶液漂洗杂蛋白，再用含有300mM咪唑的洗脱缓冲液洗脱目的蛋白；c.将目的蛋白脱盐处理。
本发明实施例提供了构建了一种前述任意实施例所述的重组人Ⅰ型胶原蛋白的大肠杆菌表达体系，表达量高，纯度高，易于纯化。
应当理解，本领域技术人员可以通过用其它表达菌株替换上述大肠杆菌菌株作为宿主细胞。
另一方面，本发明实施例提供了一种组合物，其活性成分包括前述任意实施例所述的重组I型胶原蛋白。
另一方面，本发明实施例提供了一种制品，其活性成分包括前述任意实施例所述的重组I型胶原蛋白。
在一些实施例中，所述制品为为细胞提供黏附、支撑和/或生长迁移空间的材料或作为输送营养物质和/或新陈代谢产物通道的材料；
在一些实施例中，所述制品包括药物、医疗器械、生物材料、组织工程产品、化妆品、护肤品中的任意一种；
在一些实施例中，所述药物包括皮肤修复敷料。
另一方面，本发明实施例提供了如前述任意实施例所述的重组I型胶原蛋白在促进细胞黏附或制备具有促进细胞黏附作用的产品中的应用。
此外，本发明实施例提供了如前述任意实施例所述的重组I型胶原蛋白在制备促进皮肤创伤修复和/或组织再生的产品中的应用。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1重组Ⅰ型人源化胶原蛋白C1-2G和C1-2(L593)的制备
1.C1-2G和C1-2(L593)基因表达载体的构建
1.1本实施例中使用的重组Ⅰ型人源化胶原蛋白C1-2G的全长蛋白序列为SEQ IDNo.4所示的氨基酸序列，全长198aa。为了在C1-2G蛋白表达后对其进行纯化，本实施例在SEQ ID No:4所示的氨基酸序列的N端连接MHHHHHHHHGSGSGSENLYFQ后获得以下氨基酸序列:MHHHHHHHHGSGSGSENLYFQGPPGPPGPPGPPGPPGDAGAPGAPGSQGAPGLQGMPGDAGAPGAPGSQGAPGLQGMPGDAGAPGAPGSQGAPGLQGMPGDAGAPGAPGSQGAPGLQGMPGDAGAPGAPGSQGAPGLQGMPGDAGAPGAPGSQGAPGLQGMPGDAGAPGAPGSQGAPGLQGMPGDAGAPGAPGSQGAPGLQGMPGPPGPPGPPGPPGPP(SEQ IDNo:5)，其全长为219aa。针对大肠杆菌的密码子对该氨基酸序列对应的编码序列进行了密码子优化，其对应的基因全长660bp(SEQ ID No.6)。
委托南京金斯瑞生物科技有限公司进行基因片段的合成，并将合成后的基因片段通过HindⅢ和BamHI的酶切位点插入pET 28a表达载体，得到相应的重组表达质粒。
1.2采用羟化酶L593(氨基酸序列同专利CN202310276337.4中的SEQ ID NO.6，核酸序列同专利CN202310276337.4中的SEQ ID NO.7)，构建表达胶原蛋白C1-2G和脯氨酸羟化酶L593的质粒pETduet-1-C1-2G-L593。
2.大肠杆菌基因工程菌的构建：
构建表达重组Ⅰ型人源化胶原蛋白C1-2G的工程菌：将构建成功的表达质粒转入大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3)。具体过程为：(1)在-80℃冰箱中取出大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3)置于冰上，待半融时于超净台取1μL表达C1-2G的表达质粒加入大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3)中；(2)将混合物置于冰上冰浴5min，然后于42℃水浴热激60s，取出后置于冰上冰浴5min；(3)于超净台中加入500μL液体LB培养基(10g/L蛋白胨，5g/L酵母提取物，10g/L氯化钠，50μg/ml卡那抗生素)，放于37℃、220rpm条件下复苏60min；(4)取200μL的复苏菌液均匀涂布在含有卡那抗生素的LB平板上；(5)将平板放在37℃的培养箱过夜培养，待其长出大小均匀的菌落。
构建表达脯氨酸羟基化的重组Ⅰ型人源化胶原蛋白C1-2(L593)的工程菌：将构建获得的表达C1-2G和脯氨酸羟化酶L593的质粒转入大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3)，具体过程可参照表达重组Ⅰ型人源化胶原蛋白C1-2G的工程菌的具体过程。
3.重组Ⅰ型人源化胶原蛋白C1-2G和C1-2(L593)的诱导表达：
具体过程为：挑取板上的菌落至10ml LB液体培养基(表达C1-2G时加50μg/ml卡那抗生素，表达C1-2(L593)时加100μg/ml氨苄霉素)，放于37℃摇床中，220rpm培养12h左右接至1L培养基中，37℃，220rpm培养至OD600为0.6-0.8时，加入500μL IPTG(终浓度0.5mM)，16℃，160rpm诱导16-20h。
4.蛋白的纯化：
具体过程为：将菌液分装于离心瓶中，于4000rpm、4℃离心20min，收集菌体。将收集的菌体用结合缓冲液(Binding buffer)(1×PBS pH7.4)重悬，然后进行超声破碎，将细胞破碎后的菌液分装至离心瓶中，于16000rpm、4℃离心30min，收集上清液。
将上清加入到1ml Ni亲和树脂重力柱中，流穿结束后加入8倍柱体积的结合缓冲液清洗Ni柱；而后加入8倍柱体积的洗涤缓冲液(washing buffer)(1×PBS pH7.4，20mM咪唑)洗涤Ni柱；最后用8倍柱体积的洗脱缓冲液(elution buffer)(1×PBS pH7.4，300mM咪唑)洗脱目的蛋白。4℃过夜透析，即得到脱盐的目的蛋白。
实施例2重组Ⅰ型人源化胶原蛋白C1-2G和C1-2(L593)的生物学评价
1.重组Ⅰ型人源化胶原蛋白C1-2G和C1-2(L593)的纯度检测
所得C1-2G和C1-2(L593)蛋白利用SDS PAGE检测纯度。具体过程为：取纯化后的蛋白液20μL，加入5μl 5×的蛋白上样缓冲液(250mM的Tris HCl pH 6.8，10％SDS，0.5％溴酚蓝，50％甘油，5％β 巯基乙醇)，置于100℃沸水中煮5min，然后每孔10μl加入SDS PAGE蛋白胶中，电压250V电泳0.5h后，用考马斯亮蓝染色液(0.1％考马斯亮蓝R 250，25％乙醇，10％冰醋酸)进行蛋白染色3min，再利用蛋白脱色液(10％醋酸，5％乙醇)进行脱色。
结果如图1所示。
2.C1-2(L593)的脯氨酸羟化检测
用HYP检测试剂盒(Solarbio，BC0250)检测OD560nm的吸光度，包括阳性对照(标准品HYP)、人Ⅰ型胶原蛋白(sigma，C7774)以及样本C1-2(L593)。按照HYP检测试剂盒说明处理样本，根据空白对照和阳性对照结果确认实验的可行性。以人Ⅰ型胶原蛋白羟脯氨酸含量为100％，计算出蛋白C1-2(L593)脯氨酸的相对羟化率。结果如图2所示。蛋白C1-2(L593)中羟脯氨酸含量为人Ⅰ型胶原蛋白中羟脯氨酸含量的30％-40％左右，即蛋白C1-2(L593)中脯氨酸的相对羟化率达到约30％-40％。需要说明的是，蛋白C1-2(L593)中脯氨酸的羟化率为10％～20％左右。
2.重组Ⅰ型人源化胶原蛋白C1-2G的质谱鉴定结果
本发明实施例提供的重组Ⅰ型人源化胶原蛋白C1-2G的理论大小是19.2kD，SDSPAGE胶结果显示目的蛋白大小在55kD左右，通过切胶后胶内酶解对样本进行质谱鉴定，具体操作如下：
胶块切下目的条带，约1×1mm，装入EP管，水洗三次；脱色液(ACN/50mM碳酸氢铵1:1混合)没过胶块恒温37℃脱色，至颜色脱尽；加入100％ACN至没过胶粒，脱水至胶块变白变硬，吸净ACN，真空干燥5min，至管内完全干燥；加入α-chymotrypsin工作液(790μl ACN:200mM碳酸氢铵:H2O＝1:2:7+10μl 2000μg/ml)，4℃放置20min，待胶粒充分吸胀后调整液面至刚没过吸胀胶粒，倒置EP管，37℃12-16小时；加入适量(5-10μL)10％FA终止反应；吸出反应液，保存到EP管中，加50％ ACN/0.1％ FA没过胶粒，37℃45min，涡旋、离心、吸出萃取液，加入到反应液EP管中，重复一次；带有反应液和两次次萃取液的EP管，离心浓缩至干燥，25μl0.1％FA样品溶解后，12000rpm，离心20min，取上清20μl装入样品上机。对结果进行分析。分析结果显示样本是C1-2G。图3所示为其中一个片段的二级图谱结果。
3.重组Ⅰ型人源化胶原蛋白C1-2G和C1-2(L593)的圆二色谱鉴定结果
将重组Ⅰ型人源化胶原蛋白C1-2G和C1-2(L593)用PBS稀释到0.2mg/ml，利用Chirascan plus(AppliedPhotophysics)扫描200-260nm处的吸收，结果如图4、图5所示，C1-2G和C1-2(L593)均具有标准胶原蛋白三股螺旋的圆二色图谱，即在200nm之前有一个负峰，在220nm附近有一个正峰。圆二色谱结果显示其在221nm处的MilliDegree值为3.96511，C1-2(L593)在224nm处的MilliDegree值为0.247316。
4.重组Ⅰ型人源化胶原蛋白C1-2G和C1-2(L593)的热稳定性
将重组Ⅰ型人源化胶原蛋白C1-2G和C1-2(L593)分别用PBS稀释到0.5mg/ml，在用不同温度分别处理1小时后，12000rpm离心20min，取上清中的样本20μL，加入5μl 5×的蛋白上样缓冲液，置于100℃沸水中煮5min，然后每孔10μl加入SDS PAGE蛋白胶中，电压250V电泳0.5h后，用考马斯亮蓝染色液，再利用蛋白脱色液进行脱色，C1-2G结果如图6所示，其中1，2，3，4，5，6，7，8分别代表未经过加热处理的C1-2G，以及在40℃，50℃，60℃，70℃，80℃，90℃，100℃加热1小时后的1-2G样本，这表明C1-2G具有很好的溶解性，并且具有极好的耐高温性。
C1-2(L593)结果如图7所示，其中1，2，3，4，5，6，7，8分别代表未经过加热处理的C1-2(L593)，以及在40℃，50℃，60℃，70℃，80℃，90℃，100℃加热1小时后的C1-2(L593)样本，这表明C1-2(L593)具有很好的溶解性，并且具有极好的耐高温性。
5.重组Ⅰ型人源化胶原蛋白C1-2G和C1-2(L593)的生物活性测定
测定蛋白溶液的浓度。将样品稀释50倍，利用NanoDrop分别测定样品在215nm和225nm下的紫外光吸收，利用经验公式C(μg/m L)＝144×(A215 A225)×50计算蛋白质浓度，注意需在A215<1.5的情况下检测。检测完蛋白浓度后，用缓冲液(1×PBS pH7.4)将所有待测蛋白浓度调整到0.05mg/mL。
设置空白孔、PBS孔、对照孔即人Ⅰ型胶原蛋白、胶原蛋白样本孔。向96孔板中加入100μL PBS、人源的Ⅰ型胶原蛋白、C1-2G胶原蛋白溶液，室温静置60min。向每孔中加入100μL浓度为1×106/ml的培养状态良好的3T3细胞，于95％空气、5％ CO2、放有无菌水加湿的37℃细胞培养箱中静置培养60min。将上清轻轻倒扣出，PBS洗三遍，最后一遍用枪头将孔板里残留的液体尽可能地都吸出。用LDH检测试剂盒(Roche，4744926001)检测OD492nm和OD690nm的吸光度。
根据空白对照的数值，可以计算出每孔相对应的吸光度，计算出的吸光度值与贴壁的细胞数成正比。计算公式如下：样本吸光度值＝测试孔A492nm-A690nm-空白孔A492nm-A690nm。计算出的吸光度值即可反应贴壁的细胞数，细胞的贴壁数即可以反应胶原蛋白的活性。蛋白的活性越高，越能在短时间给细胞提供优质的外环境，帮助细胞贴壁。
样本贴壁结果如图8所示，统计结果如图9所示，从结果中可知，本发明的重组Ⅰ型人源化胶原蛋白C1-2G和C1-2(L593)的粘附活性比商品化的人源的Ⅰ型胶原蛋白(sigma-C7774)的效果还要好。
涉及的序列信息如下。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种重组I型胶原蛋白，其特征在于，所述重组I型胶原蛋白的氨基酸序列包括：A-Bn-A；其中，所述A的氨基酸序列与如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列具有至少80％序列同一性，所述B的氨基酸序列与如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列具有至少80％序列同一性，所述n为整数且≥1。
2.根据权利要求1所述的重组I型胶原蛋白，其特征在于，所述A的氨基酸序列如SEQ IDNO:2所示；所述B的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示；
可选地，所述n为6～10；
可选地，所述重组I型胶原蛋白的氨基酸序列包括：与如SEQ ID NO:4所示的序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列；
可选地，所述重组I型胶原蛋白的氨基酸序列包括：如SEQ ID NO:4所示的序列；
可选地，所述重组I型胶原蛋白的氨基酸序列还包括：用于纯化或标记的标签；
可选地，所述重组I型胶原蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示。
3.一种重组I型胶原蛋白，其特征在于，其含有权利要求1或2所述的重组I型胶原蛋白，且其中至少1个脯氨酸被羟脯氨酸替代。
4.一种分离的核酸分子，其特征在于，其编码权利要求1～3任一项所述的重组I型胶原蛋白；
可选地，所述核酸分子的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示。
5.一种重组载体或含所述重组载体的宿主细胞，其特征在于，所述重组载体包括权利要求4所述的核酸分子；
可选地，所述重组载体为重组表达载体；
可选地，所述重组表达载体包括：pET系列载体、穿梭载体、噬菌体和病毒载体中的任意一种；
可选地，所述pET系列载体包括pET-28a。
6.如权利要求1～3任一项所述的重组I型胶原蛋白的制备方法，其特征在于，其包括：培养权利要求5所述的宿主细胞。
7.一种组合物，其特征在于，其活性成分包括权利要求1～3任一项所述的重组I型胶原蛋白。
8.一种制品，其特征在于，其活性成分包括权利要求1～3任一项所述的重组I型胶原蛋白；
可选地，所述制品为为细胞提供黏附、支撑和/或生长迁移空间的材料或作为输送营养物质和/或新陈代谢产物通道的材料；
可选地，所述制品包括药物、医疗器械、生物材料、组织工程产品、化妆品、护肤品中的任意一种；
可选地，所述药物包括皮肤修复敷料。
9.如权利要求1～3任一项所述的重组I型胶原蛋白在促进细胞黏附或制备具有促进细胞黏附作用的产品中的应用。
10.如权利要求1～3任一项所述的重组I型胶原蛋白在制备促进皮肤创伤修复和/或组织再生的产品中的应用。
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