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CN119101755A - 一种检测毛皮动物常见肺炎致病菌的引物组合和多重pcr方法 - Google Patents

一种检测毛皮动物常见肺炎致病菌的引物组合和多重pcr方法 Download PDF

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CN119101755A
CN119101755A CN202411519215.4A CN202411519215A CN119101755A CN 119101755 A CN119101755 A CN 119101755A CN 202411519215 A CN202411519215 A CN 202411519215A CN 119101755 A CN119101755 A CN 119101755A
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Abstract

本发明公开了一种检测毛皮动物常见肺炎致病菌的引物组合和多重PCR方法，属于医学检测技术领域。本发明通过利用致病菌的特异性基因(uidA、khe、LasI和atpD)来区分病料中的不同肺炎病原菌，通过多重PCR技术，在同一反应体系中加入核苷酸序列如SEQ ID NO.1‑SEQ ID NO.8所示的4对引物，并优化了多重PCR反应体系中引物的终浓度和反应程序中的退火温度，达到了同一反应体系中扩增出多条目的DNA片段的技术效果，解决了单重PCR费时费力同时无法排除不同样品孔间的加样差异的技术问题。本发明构建的多重PCR检测方法具有较高的灵敏性和特异性，具有广阔的应用前景。

Description

一种检测毛皮动物常见肺炎致病菌的引物组合和多重PCR 方法
技术领域
本发明涉及医学检测技术领域，特别是涉及一种检测毛皮动物常见肺炎致病菌的引物组合和多重PCR方法。
背景技术
毛皮动物细菌性呼吸道病的病原菌复杂且种类繁多，给养殖业带来巨大的经济损失。常见的分子生物学方法在动物疫病检测中的应用越来越广泛，其中最突出的是聚合酶链反应(PCR)。PCR技术通过扩增病原体的DNA或RNA片段，使其在样本中变得更容易检测。这种技术具有高度的灵敏性和特异性，使其成为许多动物疫病检测的首选方法之一。但传统PCR只能对一个靶标进行扩增，想要确诊毛皮动物肺炎致病菌需要花更多的时间去检测，既费时又费力。因此，亟需开发一种针对多种毛皮动物常见肺炎致病菌，能够快速、准确、灵敏、高效地检测的多重PCR方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种检测毛皮动物常见肺炎致病菌的引物组合和多重PCR方法，以解决上述现有技术存在的问题，本发明在同一反应体系中引入多对引物，解决了单重PCR费时费力和无法排除不同样品孔间加样差异的问题。
为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
本发明提供了一种检测毛皮动物常见肺炎致病菌的引物组合，包括以下引物：
核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的uidA-F和如SEQ ID NO.2所示的uidA-R；
核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的khe-F和如SEQ ID NO.4所示的khe-R；
核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示的LasI-F和如SEQ ID NO.6所示的LasI-R；
核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示的atpD-F和如SEQ ID NO.8所示的atpD-R。
优选的是，所述引物uidA-F和所述引物uidA-R的扩增片段长度为421bp；
所述引物khe-F和所述引物khe-R的扩增片段长度为143bp；
所述引物LasI-F和所述引物LasI-R的扩增片段长度为315bp；
所述引物atpD-F和所述引物atpD-R的扩增片段长度为756bp。
优选的是，所述常见肺炎致病菌为大肠杆菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌和奇异变形杆菌。
本发明提供了所述的引物组合在制备检测毛皮动物常见肺炎致病菌的产品中的应用。
优选的是，所述产品为试剂或试剂盒。
本发明还提供了一种检测毛皮动物常见肺炎致病菌的试剂盒，包括所述的引物组合。
本发明还提供了所述的引物组合或所述的试剂盒在非诊断或治疗目的的检测毛皮动物常见肺炎致病菌中的应用。
本发明还提供了一种非诊断或治疗目的的检测毛皮动物常见肺炎致病菌的方法，包括使用所述的引物组合或所述的试剂盒对样品DNA进行多重PCR扩增的步骤。
优选的是，所述多重PCR扩增的反应体系中，uidA-F和uidA-R的浓度均为0.4μmol/L；khe-F和khe-R的浓度均为0.4μmol/L；LasI-F和LasI-R的浓度均为0.4μmol/L；atpD-F和atpD-R的浓度均为32nmol/L。
优选的是，所述多重PCR扩增的退火温度为52℃。
本发明公开了以下技术效果：
本发明通过利用致病菌的特异性基因来区分病料中的不同肺炎病原菌，通过多重PCR技术，在同一个反应体系中加入一对以上的引物，如存在与各对引物互补的模板，则它们分别结合在模板相对应的部位，达到了同一反应体系中扩增出一条以上的目的DNA片段的技术效果，解决了单重PCR费时费力同时无法排除不同样品孔间的加样差异的技术问题。本发明构建的多重PCR检测方法具有较高的灵敏性和特异性。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为uidA单一PCR退火温度梯度电泳结果图；其中，M为DNA标准DL2000，1-12退火温度梯度为50℃、50.4℃、51.2℃、52.4℃、53.8℃、55.3℃、56.7℃、58.2℃、59.6℃、60.8℃、61.6℃和62℃，13为阴性对照ddH2O；
图2为khe单一PCR退火温度梯度电泳结果图；其中，M为DNA标准DL2000，1-12退火温度梯度为50℃、50.4℃、51.2℃、52.4℃、53.8℃、55.3℃、56.7℃、58.2℃、59.6℃、60.8℃、61.6℃和62℃，13为阴性对照ddH2O；
图3为LasI单一PCR退火温度梯度电泳结果图；其中，M为DNA标准DL2000，1-12退火温度梯度为50℃、50.4℃、51.2℃、52.4℃、53.8℃、55.3℃、56.7℃、58.2℃、59.6℃、60.8℃、61.6℃和62℃，13为阴性对照ddH2O；
图4为atpD单一PCR退火温度梯度电泳结果图；其中，M为DNA标准DL2000，1-12退火温度梯度为50℃、50.4℃、51.2℃、52.4℃、53.8℃、55.3℃、56.7℃、58.2℃、59.6℃、60.8℃、61.6℃和62℃，13为阴性对照ddH2O；
图5为uidA单一PCR引物浓度梯度电泳结果图；其中，M为DNA标准DL2000，1-8引物浓度梯度为0.4μmol/L、0.32μmol/L、0.24μmol/L、0.16μmol/L、0.08μmol/L、0.04μmol/L、32nmol/L和24nmol/L；
图6为khe单一PCR引物浓度梯度电泳结果图；其中，M为DNA标准DL2000，1-8引物浓度梯度为0.4μmol/L、0.32μmol/L、0.24μmol/L、0.16μmol/L、0.08μmol/L、0.04μmol/L、32nmol/L和24nmol/L；
图7为LasI单一PCR引物浓度梯度电泳结果图；其中，M为DNA标准DL2000，1-8引物浓度梯度为0.4μmol/L、0.32μmol/L、0.24μmol/L、0.16μmol/L、0.08μmol/L、0.04μmol/L、32nmol/L和24nmol/L；
图8为atpD单一PCR引物浓度梯度电泳结果图；其中，M为DNA标准DL2000，1-8引物浓度梯度为0.4μmol/L、0.32μmol/L、0.24μmol/L、0.16μmol/L、0.08μmol/L、0.04μmol/L、32nmol/L和24nmol/L；
图9为四重PCR退火温度梯度电泳结果图；其中，M为DNA标准DL2000，1-12退火温度梯度为50℃、50.4℃、51.2℃、52.4℃、53.8℃、55.3℃、56.7℃、58.2℃、59.6℃、60.8℃、61.6℃和62℃；
图10为四重PCR引物浓度组合电泳结果图；其中，M为DNA标准DL2000，1-6中uidA、khe、LasI和atpD引物终浓度分别为0.4μmol/L、0.4μmol/L、0.4μmol/L和32nmol/L，0.5μmol/L、0.4μmol/L、0.5μmol/L和32nmol/L，0.3μmol/L、0.4μmol/L、0.3μmol/L和32nmol/L，0.4μmol/L、0.4μmol/L、0.4μmol/L和22.4nmol/L，0.5μmol/L、0.4μmol/L、0.5μmol/L和22.4nmol/L，0.3μmol/L、0.4μmol/L、0.3μmol/L和22.4nmol/L；
图11为四重PCR方法灵敏性检验电泳结果图；其中，M为DNA标准DL2000；1-6混合DNA稀释倍数为100、101、102、103、104和105；
图12为四重PCR方法特异性检测电泳结果图，其中，1-8分别为大肠杆菌、奇异变形杆菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、腐生葡萄球菌、蜡样芽孢杆菌、屎肠球菌和科氏葡萄球菌，9为阴性对照ddH2O，M为DNA标准DL2000；
图13为应用四重PCR方法对17份毛皮动物肺炎病料致病菌DNA进行检测的电泳结果图；其中，M为DNA标准DL2000。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值，以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
本发明中，某一引物终浓度为针对该DNA片段所用上游引物或下游引物在配置完成的PCR反应体系中的浓度。
实施例1大肠杆菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌和奇异变形杆菌多重PCR方法的建立
1.实验材料
1.1菌株和引物
大肠杆菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌和奇异变形杆菌由中国农业科学院特产研究所动物传染与防控技术实验室分离鉴定并保存。
根据GenBank中收录的基因序列信息并参考相关文献引用大肠杆菌uidA、肺炎克雷伯氏菌的溶血酵素基因khe、铜绿假单胞菌LasI、奇异变形杆菌atpD引物序列，并由生工生物工程有限公司合成。引物的序列、扩增片段长度如表1所示。
表1四重PCR引物序列
1.2主要试剂
胰蛋白胨大豆肉汤(TSB)，青岛科源生物科技公司产品；DNA标准DL2000，近岸蛋白质科技有限公司产品；细菌基因组DNA提取试剂盒，omega公司产品；粪便基因组DNA提取试剂盒，biomiga公司产品。
1.3主要仪器设备
电泳仪，购自北京六一生物科技有限公司；PCR仪，购自德国耶拿分析仪器股份公司。
2.实验方法
2.1单项PCR方法的建立
2.1.1单一PCR退火温度梯度测试
反应体系为：2×ES Taq Mastermix 12.5μL，10μmol/L的单一引物溶液1μL，对应模板菌液1μL，灭菌ddH2O将反应体积补至25μL。
反应程序：94℃预变性10min；94℃变性30s，不同温度退火30s，72℃延伸1min，30个循环；最后72℃延伸10min。
梯度设定单一PCR反应程序的退火温度为50℃、50.4℃、51.2℃、52.4℃、53.8℃、55.3℃、56.7℃、58.2℃、59.6℃、60.8℃、61.6℃和62.0℃，其他反应条件不变，探索适宜的退火温度范围。
2.1.2单一PCR引物浓度梯度测试
通过稀释加入单一PCR反应中引物的浓度，控制引物终浓度为0.4μmol/L、0.32μmol/L、0.24μmol/L、0.16μmol/L、0.08μmol/L、0.04μmol/L、32nmol/L和24nmol/L以2.1.1中适宜退火温度范围的中间温度作为退火温度进行测试，其他条件不变，探索各引物反应的浓度范围。
2.2四重PCR方法的建立
2.2.1扩增条件的优化
以4种菌的混合菌液为模板，对PCR反应的引物浓度、退火温度等进行优化，以确定最佳反应体系和反应程序。
反应体系为：2×ES Taq Mastermix 12.5μL，不同终浓度组合的4对引物，模板菌液混合物1μL，灭菌ddH2O将反应体积补至25μL。
反应程序：94℃预变性10min；94℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环；最后72℃延伸10min。
对退火温度(50、50.4、51.2、52.4、53.8、55.3、56.7、58.2、59.6、60.8、61.6、62.0℃)和各引物终浓度组合(组合设定如表2所示)两项反应条件进行优化，筛选出四重PCR扩增的最佳反应条件。
表2四重PCR引物终浓度组合设计表
2.2.2敏感性试验
将过夜培养的大肠杆菌、奇异变形杆菌、肺炎克雷伯菌和铜绿假单胞菌菌液用平板法进行计数。然后直接取大肠杆菌、奇异变形杆菌、肺炎克雷伯菌和铜绿假单胞菌DNA，混合并进行10倍倍比稀释，以各浓度梯度菌液为模板，采用优化后的四重PCR扩增条件进行反应。
2.2.3四重PCR特异性检测
采用优化后的扩增条件及程序分别以大肠杆菌、奇异变形杆菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、腐生葡萄球菌、蜡样芽孢杆菌、屎肠球菌和科氏葡萄球菌菌液为模板，进行四重PCR扩增反应。
2.2.4样品的检测
提取毛皮动物肺炎病料DNA，应用四重PCR方法进行肺炎致病菌检测。
3.实验结果
3.1单项PCR方法的建立
如图1-图4所示，结果显示四种基因退火温度在退火温度50℃-58.2℃之间之间均有相应的目的片段条带。
如图5-图8所示，4种基因在引物浓度在0.4μmol/L-0.16μmol/L时均有明显条带，其中atpD在引物终浓度为32nmol/L时仍有可见条带，LasI在引物浓度为0.08μmol/L时仍有可见条带。
3.2四重PCR方法的建立
3.2.1退火温度的优化
将4种菌液等比例混合作为模板，选择不同的退火温度(50℃-62℃)进行四重PCR扩增，如图9所示，结果表明，退火温度在50℃-53.8℃扩增效果较好，确定52℃为最佳退火温度。
3.2.2引物浓度的优化
取不同浓度的引物组合进行四重PCR反应，结果如图10所示，表明uidA、khe、LasI和atpD引物终浓度为0.4μmol/L、0.4μmol/L、0.4μmol/L和32nmol/L时扩增效果最好。
3.2.3敏感性检测
以大肠杆菌、奇异变形杆菌、肺炎克雷伯菌和铜绿假单胞菌菌液混合后10倍梯度稀释作为模板，采用优化好的扩增条件进行四重PCR反应。结果如图11所示，结果显示，该大肠杆菌、奇异变形杆菌、肺炎克雷伯菌和铜绿假单胞菌菌液最低检测限为9.57×103CFU/mL、1.07×106CFU/mL、1.53×106CFU/mL、6.5×105CFU/mL。
3.3四重PCR特异性检测
采用优化好的扩增条件进行四重PCR的特异性检测，结果如图12所示，以大肠杆菌、奇异变形杆菌、肺炎克雷伯菌和铜绿假单胞菌的菌液为模板均可扩增出特异的目的片段，而以其他常见细菌菌液和ddH2O阴性对照均未扩增出相应的条带，表明建立的四重PCR方法的特异性较好。
3.4样品检测
应用建立的四重PCR方法对16份毛皮动物肺炎病料致病菌DNA进行检测，结果如图13所示，四重PCR方法大肠杆菌、奇异变形杆菌、肺炎克雷伯菌和铜绿假单胞菌的阳性率分别为100％、43.75％、100％和43.75％。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims (10)

1.一种检测毛皮动物常见肺炎致病菌的引物组合，其特征在于，包括以下引物：
核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的uidA-F和如SEQ ID NO.2所示的uidA-R；
核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的khe-F和如SEQ ID NO.4所示的khe-R；
核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示的LasI-F和如SEQ ID NO.6所示的LasI-R；
核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示的atpD-F和如SEQ ID NO.8所示的atpD-R。
2.如权利要求1所述的引物组合，其特征在于，所述引物uidA-F和所述引物uidA-R的扩增片段长度为421bp；
所述引物khe-F和所述引物khe-R的扩增片段长度为143bp；
所述引物LasI-F和所述引物LasI-R的扩增片段长度为315bp；
所述引物atpD-F和所述引物atpD-R的扩增片段长度为756bp。
3.如权利要求1所述的引物组合，其特征在于，所述常见肺炎致病菌为大肠杆菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌和奇异变形杆菌。
4.如权利要求1-3任一项所述的引物组合在制备检测毛皮动物常见肺炎致病菌的产品中的应用。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述产品为试剂或试剂盒。
6.一种检测毛皮动物常见肺炎致病菌的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1-3任一项所述的引物组合。
7.如权利要求1-3任一项所述的引物组合或如权利要求6所述的试剂盒在非诊断或治疗目的的检测毛皮动物常见肺炎致病菌中的应用。
8.一种非诊断或治疗目的的检测毛皮动物常见肺炎致病菌的方法，其特征在于，包括使用权利要求1-3任一项所述的引物组合或权利要求6所述的试剂盒对样品DNA进行多重PCR扩增的步骤。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述多重PCR扩增的反应体系中，uidA-F和uidA-R的浓度均为0.4μmol/L；khe-F和khe-R的浓度均为0.4μmol/L；LasI-F和LasI-R的浓度均为0.4μmol/L；atpD-F和atpD-R的浓度均为32nmol/L。
10.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述多重PCR扩增的退火温度为52℃。
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