CN119023863A - 阿加曲班对映异构体的检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及阿加曲班对映异构体的检测方法。目前暂无阿加曲班对映异构体的有效检测方法，无法确定阿加曲班产品的质量。本发明包括以下步骤：称取阿加曲班对映异构体，溶解并稀释；量取阿加曲班注射液样品，稀释，然后加入快速柱中过滤，得供试品溶液；量取供试品溶液，稀释，再量取稀释后的供试品溶液，再次稀释，得对照溶液；量取供试品溶液和对映异构体溶液，置同一量瓶中，稀释，然后加入快速柱中过滤，得系统适用性溶液；取系统适用性溶液进行系统适用性试验；取供试品溶液及对照溶液，分别注入高效液相色谱仪，以自身对照法计算对映异构体的含量。本发明能够对阿加曲班对映异构体含量进行有效检测，并且本发明准确性高、专属性高及灵敏度高。

Description

阿加曲班对映异构体的检测方法

技术领域

本发明涉及药物分析技术领域，具体涉及阿加曲班对映异构体的检测方法。

背景技术

阿加曲班注射液适应症为用于对慢性动脉闭塞症(血栓闭塞性脉管炎、闭塞性动脉硬化症)患者的四肢溃疡、静息痛及冷感等的改善。阿加曲班注射液作为凝血酶抑制剂，可通过与凝血酶催化位点发生可逆性结合作用，进而阻止凝血酶催化反应，抑制其诱导作用。同时，阿加曲班有助于灭活凝血酶，因其与血小板有较高亲和性，可与血液细胞内凝血酶相结合，或直接作用于已结合纤维蛋白凝血酶，帮助患者改善脑部动脉血管，促进血管内皮细胞修复功能，且阿加曲班具有收缩血管的功效，能够改善神经功能，还可发挥抗凝治疗作用，利于有效改善短暂性脑缺血发作病症。阿加曲班是C21位R和S型非对映异构体的混合物，其含有四个手性碳原子，理论上存在16个立体异构体，阿加曲班对映异构体为除C21位外，其他三个手性位点异构的混合物。手性药物中的立体异构体杂质的存在直接影响着药品的质量，为保证患者用药安全，就必须对药品中存在的杂质进行定性定量的研究。

对药品中的杂质进行定性定量研究，则需要建立对应的方法对其进行检测，方法验证需满足专属性、灵敏度、准确性等方法验证方面的要求；而对于阿加曲班，在其杂质实际检测方法建立过程中，反相体系不能很好的分离对映异构体，正相体系不能用于含水溶液的检测，方法存在一定的局限，所以，目前暂无阿加曲班对映异构体的有效检测方法，无法确定阿加曲班产品的质量。

因此，亟需一种阿加曲班对映异构体的检测方法。

发明内容

本发明的目的是提供阿加曲班对映异构体的检测方法，以至少解决目前无法检测阿加曲班对映异构体的问题。

为了达到上述目的，本发明所采用的技术方案为：

阿加曲班对映异构体的检测方法，包括以下步骤：

称取阿加曲班对映异构体，加无水乙醇溶解并稀释，得对映异构体溶液；

量取阿加曲班注射液样品，用无水乙醇稀释，然后加入含有填充剂的快速柱中过滤，得供试品溶液；

量取所述供试品溶液，用无水乙醇稀释，再量取稀释后的供试品溶液，用无水乙醇再次稀释，得对照溶液；

量取所述供试品溶液和所述对映异构体溶液，置同一量瓶中，用无水乙醇稀释，然后加入含有填充剂的快速柱中过滤，得系统适用性溶液；

取所述系统适用性溶液进行系统适用性试验；

取所述供试品溶液及所述对照溶液，分别注入高效液相色谱仪，记录所述供试品溶液中对映异构体峰面积及所述对照溶液中主峰面积，以自身对照法计算对映异构体的含量。

进一步的，所述系统适用性试验中的色谱柱规格为CHIRALPAK OZ-H，4.6mm×250mm，5μm。

进一步的，所述流动相为正己烷-乙醇-二乙胺，其体积比为(55-65):(35-45):(0.1-0.3)。

进一步的，所述快速柱填充剂为氯化钠或氯化钾与硫酸钠或硫酸镁的混合物，填充剂总量为4～6g。

进一步的，所述快速柱的洗脱溶剂为无水乙醇。

进一步的，所述快速柱的洗脱压力为0.05～0.1MPa。

进一步的，所述供试品溶液浓度为1mg/ml。

进一步的，所述高效液相色谱仪的填充剂采用纤维素-三(3-氯-4-甲基苯基氨基甲酸酯)键合硅胶。

进一步的，所述高效液相色谱仪的检测波长为259nm，进样体积为10～20μl。

进一步的，所述高效液相色谱仪的柱温为30～50℃，流速为0.8～1.2ml/min。

与现有技术相比，本发明的有益效果如下：

本发明提供了一种高效液相色谱法测定阿加曲班对映异构体含量的测定方法，首先通过快速柱对阿加曲班注射液样品进行干燥前处理，然后采用正相色谱的方式对阿加曲班注射液中的对映异构体进行检测，样品经快速柱处理后，进样后阿加曲班及对映异构体的峰型及分离度均能满足要求，并且经验证，本发明的方法专属性高、灵敏度高及准确性高，并且本发明方法中阿加曲班对映异构体的检测限低至0.1μg/mL，从而能够有效的检测出阿加曲班中对映异构体的含量，从而对阿加曲班质量进行严格把控。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他实施例的附图。

图1是实施例1中系统适用性溶液色谱检测液相图。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下面将参照相关附图对本发明进行更全面的描述。附图中给出了本发明的较佳实施方式。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施方式。相反地，提供这些实施方式的目的是使对本发明的公开内容理解的更加透彻全面。

本专利的描述中，需要理解的是，使用的所有技术以及科学术语具有与本专利所属领域普通技术人员通常理解的相同的含义。当存在矛盾时，以本说明书中的定义为准。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，实施例中所用的试剂为市售商品，实施例中采用的装置为现有装置，对手段、试剂或装置的限定不能理解为对本专利的限制，同类型解决相同技术问题的手段、试剂或装置均在本专利的保护范围之内。

在本专利的描述中，需要理解的是，当量、浓度、或者其它值或参数以范围、优选范围、或一系列上限优选值和下限优选值限定的范围表示时，这应当被理解为具体公开了由任何范围上限或优选值与任何范围下限或优选值的任一配对所形成的所有范围，而不论该范围是否单独公开了。当数值范围在本文中被描述时，除非另外说明，否则该范围意图包括其端值和在该范围内的所有整数和分数。

还应注意到，虽然在方法描述中涉及了步骤顺序，但是在某些情况下，可以以不同于此处的顺序执行，不应被理解为对步骤顺序的限制。

本发明提供一种阿加曲班对映异构体的检测方法，包括以下步骤：

S1：称取阿加曲班对映异构体，加无水乙醇溶解并稀释，得对映异构体溶液；

S2：量取阿加曲班注射液样品，用无水乙醇稀释，然后加入含有填充剂的快速柱中过滤，得供试品溶液；

S3：量取所述供试品溶液，用无水乙醇稀释，再量取稀释后的供试品溶液，用无水乙醇再次稀释，得对照溶液；

S4：量取所述供试品溶液和所述对映异构体溶液，置同一量瓶中，用无水乙醇稀释，然后加入含有填充剂的快速柱中过滤，得系统适用性溶液；

S5：取所述系统适用性溶液进行系统适用性试验；

S6：取所述供试品溶液及所述对照溶液，分别注入高效液相色谱仪，记录所述供试品溶液中对映异构体峰面积及所述对照溶液中主峰面积，以自身对照法计算对映异构体的含量。

其中，系统适用性试验中的色谱柱规格为CHIRALPAK OZ-H，4.6mm×250mm，5μm，流动相为正己烷-乙醇-二乙胺，其体积比为(55-65):(35-45):(0.1-0.3)。

快速柱填充剂为氯化钠或氯化钾与硫酸钠或硫酸镁的混合物，填充剂总量为4～6g，快速柱的洗脱溶剂为无水乙醇，洗脱压力为0.05～0.1MPa。

优选的，供试品溶液浓度为1mg/ml。

高效液相色谱仪的填充剂采用纤维素-三(3-氯-4-甲基苯基氨基甲酸酯)键合硅胶，检测波长为259nm，进样体积为10～20μl，柱温为30～50℃，流速为0.8～1.2ml/min。

本发明所使用的试剂均为市场上可购得的色谱纯级别试剂。

实施例1：

S1：对映异构体溶液的制备

取阿加曲班对映异构体适量，加无水乙醇溶解并稀释成浓度为5μg/ml的溶液，作为对映异构体溶液。

S2：供试品溶液的制备

精密量取阿加曲班注射液样品2ml，置10ml量瓶中，用无水乙醇稀释至刻度，摇匀，然后加入含有4g填充剂的快速柱中过滤，快速柱填充剂为氯化钠，快速柱洗脱溶剂为无水乙醇，快速柱洗脱压力为0.05MPa，收集续滤液，作为供试品溶液。

S3：对照溶液的制备

精密量取供试品溶液1ml，置100ml量瓶中，用无水乙醇稀释至刻度，摇匀，再精密量取1ml，置10ml量瓶中，用无水乙醇稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液。

S4：系统适用性溶液的制备

精密量取供试品溶液2ml，对映异构体溶液2ml，置同一10ml量瓶中，用无水乙醇稀释至刻度，摇匀，然后加入含有4g填充剂的快速柱中过滤，快速柱填充剂为氯化钠，快速柱洗脱溶剂为无水乙醇，快速柱洗脱压力为0.05MPa，收集续滤液，作为系统适用性溶液。

S5：检测条件及系统适用性试验

采用CHIRALPAK OZ-H，4.6mm×250mm，5μm色谱柱，填充剂采用纤维素-三(3-氯-4-甲基苯基氨基甲酸酯)键合硅胶，柱温为40℃，进样体积为20μl，以正己烷-乙醇-二乙胺(体积占比：60:40:0.2)为流动相，流速为1.0ml/min，检测波长为259nm，运行时间为30min，取制备的系统适用性溶液进行系统适用性试验。

S6：阿加曲班对映异构体测定

取供试品溶液及对照溶液，分别注入高效液相色谱仪，记录供试品溶液中对映异构体峰面积及对照溶液中主峰面积，以自身对照法计算对映异构体的含量。

实施例2：

S1：对映异构体溶液的制备

取阿加曲班对映异构体适量，加无水乙醇溶解并稀释成浓度为5μg/ml的溶液，作为对映异构体溶液。

S2：供试品溶液的制备

精密量取阿加曲班注射液样品2ml，置10ml量瓶中，用无水乙醇稀释至刻度，摇匀，然后加入含有5g填充剂的快速柱中过滤，快速柱填充剂为氯化钾与硫酸钠的混合物，快速柱洗脱溶剂为无水乙醇，快速柱洗脱压力为0.07MPa，收集续滤液，作为供试品溶液。

S3：对照溶液的制备

精密量取供试品溶液1ml，置100ml量瓶中，用无水乙醇稀释至刻度，摇匀，再精密量取1ml，置10ml量瓶中，用无水乙醇稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液。

S4：系统适用性溶液的制备

精密量取供试品溶液2ml，对映异构体溶液2ml，置同一10ml量瓶中，用无水乙醇稀释至刻度，摇匀，然后加入含有5g填充剂的快速柱中过滤，快速柱填充剂为氯化钾与硫酸钠的混合物，快速柱洗脱溶剂为无水乙醇，快速柱洗脱压力为0.07MPa，收集续滤液，作为系统适用性溶液。

S5：检测条件及系统适用性试验

采用CHIRALPAK OZ-H，4.6mm×250mm，5μm色谱柱，填充剂采用纤维素-三(3-氯-4-甲基苯基氨基甲酸酯)键合硅胶，柱温为30℃，进样体积为10μl，以正己烷-乙醇-二乙胺(体积占比：60:40:0.2)为流动相，流速为0.8ml/min，检测波长为259nm，运行时间为30min，取制备的系统适用性溶液进行系统适用性试验。

S6：阿加曲班对映异构体测定

取供试品溶液及对照溶液，分别注入高效液相色谱仪，记录供试品溶液中对映异构体峰面积及对照溶液中主峰面积，以自身对照法计算对映异构体的含量。

实施例3：

S1：对映异构体溶液的制备

取阿加曲班对映异构体适量，加无水乙醇溶解并稀释成浓度为5μg/ml的溶液，作为对映异构体溶液。

S2：供试品溶液的制备

精密量取阿加曲班注射液样品2ml，置10ml量瓶中，用无水乙醇稀释至刻度，摇匀，然后加入含有6g填充剂的快速柱中过滤，快速柱填充剂为氯化钾和硫酸镁的混合物，快速柱洗脱溶剂为无水乙醇，快速柱洗脱压力为0.1MPa，收集续滤液，作为供试品溶液。

S3：对照溶液的制备

精密量取供试品溶液1ml，置100ml量瓶中，用无水乙醇稀释至刻度，摇匀，再精密量取1ml，置10ml量瓶中，用无水乙醇稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液。

S4：系统适用性溶液的制备

精密量取供试品溶液2ml，对映异构体溶液2ml，置同一10ml量瓶中，用无水乙醇稀释至刻度，摇匀，然后加入含有6g填充剂的快速柱中过滤，快速柱填充剂为氯化钾和硫酸镁的混合物，快速柱洗脱溶剂为无水乙醇，快速柱洗脱压力为0.1MPa，收集续滤液，作为系统适用性溶液。

S5：检测条件及系统适用性试验

采用CHIRALPAK OZ-H，4.6mm×250mm，5μm色谱柱，填充剂采用纤维素-三(3-氯-4-甲基苯基氨基甲酸酯)键合硅胶，柱温为50℃，进样体积为15μl，以正己烷-乙醇-二乙胺(体积占比：60:40:0.2)为流动相，流速为1.2ml/min，检测波长为259nm，运行时间为30min，取制备的系统适用性溶液进行系统适用性试验。

S6：阿加曲班对映异构体测定

取供试品溶液及对照溶液，分别注入高效液相色谱仪，记录供试品溶液中对映异构体峰面积及对照溶液中主峰面积，以自身对照法计算对映异构体的含量。

本发明对实施例1进行了验证试验，如下：

(1)系统适用性及专属性验证：

对含1mg/ml阿加曲班和1μg/ml对映异构体的系统适用性溶液，照测定方法验证，考察系统适用性，结果见表1及图1：

表1系统适用性溶液色谱法分离结果

结论：出峰顺序依次为阿加曲班和阿加曲班对映异构体，两峰之间的分离度符合规定，本方法系统适用性及专属性良好。

(2)灵敏度验证：

对阿加曲班和对映异构体的S/N进行确认，结果见表2：

表2阿加曲班和对映异构体S/N确认结果

结论：阿加曲班及阿加曲班对映异构体定量限信噪比在10～30之间，浓度不大于报告限度(0.05％)，检测限信噪比在3～8之间，灵敏度符合要求。

(3)线性与范围验证：

结果见表3：

表3阿加曲班和对映异构体的线性范围

结论：阿加曲班及阿加曲班对映异构体在定量限～0.2％范围内，浓度与相对应的峰面积线性关系良好，判定系数R²大于0.99，线性符合要求。

(4)准确度验证：

精密量取3份2ml供试品溶液，对映异构体溶液(10μg/ml)分别取0.5ml、1.0ml和1.5ml各3份，将供试品溶液分别与三种不同体积的对映异构体溶液置于同一10ml量瓶中，共9份样品，用无水乙醇稀释至刻度，摇匀，然后转移至离心管中，加入无水硫酸钙4g，在5000rpm下离心10分钟，取上清液进样，结果见表4：

表4对映异构体检测结果

结论：本方法检测阿加曲班异构体，在三个浓度下回收率均值均为97.7％，9份样品的RSD(relative standard deviation，相对标准偏差)值为5.60％，小于15.0％，符合规定，说明本方法的准确性良好。

综上所述，本方法专属性好、灵敏度高及准确性高，因此，本发明的方法适用于阿加曲班注射液中对映异构体的检测。

以上应用了具体个例对本发明进行阐述，只是用于帮助理解本发明，并不用以限制本发明。对于本发明所属技术领域的技术人员，依据本发明的思想，还可以做出若干简单推演、变形或替换。

Claims (10)

1.阿加曲班对映异构体的检测方法，其特征在于：包括以下步骤：

称取阿加曲班对映异构体，加无水乙醇溶解并稀释，得对映异构体溶液；

量取阿加曲班注射液样品，用无水乙醇稀释，然后加入含有填充剂的快速柱中过滤，得供试品溶液；

量取所述供试品溶液，用无水乙醇稀释，再量取稀释后的供试品溶液，用无水乙醇再次稀释，得对照溶液；

量取所述供试品溶液和所述对映异构体溶液，置同一量瓶中，用无水乙醇稀释，然后加入含有填充剂的快速柱中过滤，得系统适用性溶液；

取所述系统适用性溶液进行系统适用性试验；

取所述供试品溶液及所述对照溶液，分别注入高效液相色谱仪，记录所述供试品溶液中对映异构体峰面积及所述对照溶液中主峰面积，以自身对照法计算对映异构体的含量。

2.根据权利要求1所述的阿加曲班对映异构体的检测方法，其特征在于：

所述系统适用性试验中的色谱柱规格为CHIRALPAK OZ-H，4.6mm×250mm，5μm。

3.根据权利要求2所述的阿加曲班对映异构体的检测方法，其特征在于：

所述流动相为正己烷-乙醇-二乙胺，其体积比为(55-65):(35-45):(0.1-0.3)。

4.根据权利要求1所述的阿加曲班对映异构体的检测方法，其特征在于：

所述快速柱填充剂为氯化钠或氯化钾与硫酸钠或硫酸镁的混合物，填充剂总量为4～6g。

5.根据权利要求1所述的阿加曲班对映异构体的检测方法，其特征在于：

所述快速柱的洗脱溶剂为无水乙醇。

6.根据权利要求1所述的阿加曲班对映异构体的检测方法，其特征在于：

所述快速柱的洗脱压力为0.05～0.1MPa。

7.根据权利要求1所述的阿加曲班对映异构体的检测方法，其特征在于：

所述供试品溶液浓度为1mg/ml。

8.根据权利要求1所述的阿加曲班对映异构体的检测方法，其特征在于：

所述高效液相色谱仪的填充剂采用纤维素-三(3-氯-4-甲基苯基氨基甲酸酯)键合硅胶。

9.根据权利要求1所述的阿加曲班对映异构体的检测方法，其特征在于：

所述高效液相色谱仪的检测波长为259nm，进样体积为10～20μl。

10.根据权利要求1所述的阿加曲班对映异构体的检测方法，其特征在于：

所述高效液相色谱仪的柱温为30～50℃，流速为0.8～1.2ml/min。