CN119020314A - 一种透明质酸合成酶及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种透明质酸合成酶及其应用，涉及合成生物学技术领域。所述透明质酸合成酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，在体外利用UDP‑GlcA和UDP‑GlcNAc这两种底物进行酶催化的生物合成法得到透明质酸，为合成透明质酸提供新的方法。该方法中HAS基因来自于深海狮子鱼的肠道共生物微生物“Candidatus Mycoplasma liparidae”，同时，该方法所获得的透明质酸合成酶不存在跨膜结构，仅有1个透明质酸结合蛋白，分子量为37.2kDa，本发明提供一种来源于深海的透明质酸合成酶用于合成低分子量的透明质酸。
Description
技术领域
本发明涉及合成生物学技术领域，特别涉及一种透明质酸合成酶及其应用。
背景技术
透明质酸合成酶(HAS)是能够在生物体内合成透明质酸(HA)的一种酶。HASs是一种糖基转移酶，已在脊椎动物和某些微生物中被报道过。1993年，第一个HAS发现于链球菌。从那时起，人们就陆续从人类和其他微生物中发现HAS。HAS根据跨膜结构域的数量分为蛋白质序列和结构域组织两类。I类是完整的膜蛋白，具有一个单一的糖基转移酶2(GT2)结构域，4到6个预测的跨膜区域和1到2个膜相关区域，如链球菌HAS，它包含6个膜区，包括4个完整的膜区和2个两亲膜结构域。此外，链球菌的HAS在胞质结构域上有一个胞质结构域和一个由D、D、QXXRW组成的基序，这对β1→4连锁的糖基转移酶活性至关重要。II类是具有两个GT2结构域的外周膜蛋白。据了解，目前只有一种II型HAS，即来自多杀性巴氏杆菌的pmHAS。II类蛋白质中的每个结构域都负责一种糖苷键的催化作用。
透明质酸(HA)是一种线性糖胺聚糖，其低分子量在10～104kDa之间，通常存在于几乎所有的多细胞生物和一些微生物中。HA不仅是一个重要的结构元素在软骨，滑膜液，眼睛和皮肤的玻璃体，也可能发挥重要作用在调节细胞行为和其他生物过程，如血管壁的渗透性，蛋白质的扩散和操作，水和电解质，并促进伤口愈合。到目前为止，HA在医疗、制药、化妆品和膳食方面有广泛的应用。不同分子量(MW)的HA具有不同的特性值。高分子量的HA一般作为空间填料、渗透缓冲液和粘弹性结构，中等大小的HA，一般大小为200～500kDa，可刺激各种病理学中的促炎反应，而低分子量HA可促进伤口愈合和抗粘附。
目前已有的HAS分为两种类型，分别是Ⅰ类和Ⅱ类，它们来源于人类、小鼠和特定微生物等，这两类HAS有2～7个跨膜结构、2～6个HA结合位点。，且这两类HAS合成的HA分子量大多属于高分子量或中分子量，要想获得小分子量的HA需要依靠物理、化学和生物手段进行分解。其中物理分解只能获得有限的小分子量HA，且消耗时间较长；化学分解虽然时间较短，但对环境不友好。所以目前获得小分子量的HA的方法大多为生物降解。深海蕴含着丰富的基因资源，来源于深海的HAS未见报道，且由深海来源的HAS是否可以合成HA也未见报道。因此，本发明提供一种来源于深海的透明质酸合成酶用于合成低分子量的透明质酸。
发明内容
针对现有技术的上述缺陷，本发明提出一种透明质酸合成酶及其应用，以解决上述背景技术提出的问题。
为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种透明质酸合成酶，所述透明质酸合成酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
优选地，所述透明质酸合成酶不存在跨膜结构，仅有1个透明质酸结合蛋白，分子量为37.2kDa。
优选地，用于扩增透明质酸合成酶的引物的核苷酸序列为：
F1：5’-ATGAAATATACTATTCTTATTCC-3’(SEQ ID NO.2)；
R1：5’-TATATAGAATATATGGATATTAA-3’(SEQ ID NO.3)。
优选地，所述的透明质酸合成酶在合成透明质酸中的应用。
优选地，一种合成透明质酸的方法，所述方法包括如下步骤：
(1)获得上述的透明质酸合成酶；
(2)利用步骤(1)中的透明质酸合成酶在酶活反应体系中催化合成透明质酸。
优选地，步骤(1)中通过分子克隆表达获得透明质酸合成酶。
优选地，步骤(2)中酶活反应体系中含权利要求1所述的透明质酸合成酶30μM、PBS缓冲液50mM、氯化镁溶液15mM、二硫苏糖醇溶液2.5mM、UDP-GlcA 1mM和UDP-GlcNAc1mM。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
(1)本发明获得的HAS有助于了解来源于深海的HAS的序列特征和功能特点，有助于深海基因资源的开发利用。通过实验及数据分析，我们得知本发明的HAS有别于已报道的两类HAS，它分子量较小(分子量为37.2kDa)、仅有一个HA结合位点、不存在跨膜结构，而其他两类HAS分子量相对较大(分子量为47.33～112kDa)、有2～6个HA结合位点、2～7个跨膜结构。
(2)通过对本发明获得的HAS进行酶动力学分析，发现该HAS能够在体外利用两种底物(UDP-GlcA和UDP-GlcNAc)合成两种小分子量的HA，为后续利用小分子量HA利用提供了原材料和理论基础。
(3)本发明获得的透明质酸合成酶序列是宝贵的深海生物基因资源，其本身的序列特点以及具有合成小分子量透明质酸的能力，为深海基因资源进一步开发利用提供依据和理论基础。
(4)本发明相较于现有技术，是利用酶催化的生物合成法得到透明质酸，较化学合成法具有步骤更简单、污染更小、产物更单一等优点。
附图说明
图1为HAS基因的电泳条带图；
图2为本发明HAS与其他生物来源的HAS氨基酸序列比对图；
图3为本发明HAS与其他物种来源的HAS的系统进化树及分类图；
图4为本发明HAS对两种底物UDP-GlcNAc和UDP-GlcA的米氏常数测定结果示意图。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明的技术方案作进一步详细地说明。
实施例1HAS基因获取
前期已对来源于深海狮子鱼的肠道共生物微生物“Candidatus Mycoplasmaliparidae”进行了基因组测序、组装和注释，发现了HAS基因。用总RNA提取试剂盒从深海狮子鱼的肠道中提取总RNA，并用带有gDNA wiper的反转录试剂盒生成单链cDNA，以此为模板进行聚合酶链式反应(PCR)扩增HAS基因全长片段，具体引物信息见表1，电泳条带图详见图1：
表1引物序列
PCR反应体系为：：cDNA 1μL，10μmol/L上下游引物各1μL，2×Phanta Max MasterMix 12.5μL，ddH2O补足至25μL。
PCR扩增反应程序：98℃预变性10s；98℃变性10s，50℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环后；72℃延伸10min；4℃保存。
实施例2HAS基因克隆
利用同源重组酶，将HAS基因PCR扩增产物经MinElute Gel Extraction Kit(Qiagen，德国)胶回收与pMD18-T载体(Takara，日本)进行连接，得到重组质粒，转化到感受态细胞Escherichia coli DH 5α(Takara，日本)后，将菌液铺于含有氨苄青霉素(50mg/L)的LB平板上37℃培养12h，使转化成功的阳性克隆于LB液体培养基中进行扩增培养，利用E.Z.N.A.R Plasmid DNA Mini Kit I试剂盒(Omega,美国)对感受态细胞进行质粒提取，并对质粒中的插入片段进行测序，最终得到HAS基因的全长序列。
HAS测序所得氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，该基因序列含有310个氨基酸。
SEQ ID NO.1：
MKYTILIPCYNAEKYISRCLNSIVNQDYQDFEIIVLNDGSTDNSLAILNSYQEKDQRIKIISRENKGLSVTRNDLIKKVHTDYFYFIDADDWIELNTFSTFDMKLKEVNFVVDMIINSTFINKKNKSKTFYITNKIDENTTNESYLINNTPYAWNILIRKEYLLENKFSFCQEYNYFEDAGSVSFWIYKTKNIIFLNHPNYHYFINKQSLSRANISFEKISAGISQLENFYSLLKSDNVLIKDNKPINDQLAFYHSVIFSHIQFETKVNKSEKNILKTRLRSLEKDNVNLKFPRRYWKFWYFVLYRIYGY。
将本发明HAS的氨基酸序列SEQ ID NO.1与其他生物来源的HAS氨基酸序列比对，发现本发明HAS的氨基酸序列区别于现有氨基酸序列，详见图2所示；将本发明HAS与其他物种来源的HAS的系统进化树及分类，根据系统进化关系分析，本发明HAS与同来源于Mycoplasmatota们的3个HAS聚在一起，且不属于已报道的两类Class I/II的HAS，详见图3所示。
将本发明HAS(Organisms：“Candidatus Mycoplasma liparidae”)与不同来源的HAS跨膜结构、HA结合功能域、分子量及pI预测对比，结果如表2所示：
表2不同来源的HAS跨膜结构、HA结合功能域、分子量及pI预测
经测试可得，本发明的HAS拥有独特的结构，透明质酸不存在跨膜结构，仅有1个透明质酸结合蛋白，分子量为37.2kDa，预测的保守位点：88D、208Q、DGSTD(38～42aa)、DXDD(88～91aa)；HA结合为点为273～281aa(KNILKTRLR)，区别于现有已发现的HAS。
实施例3HAS基因表达及纯化
用设计出的引物对目的基因进行PCR扩增，并将扩增产物进行切胶纯化，使用合适的限制性内切酶对纯化后的PCR产物及表达载体进行双酶切，并用T4连接酶(Takara，日本)对纯化后的酶切产物进行连接，将经测序验证连接成功的重组质粒转化到感受态细胞E.coli BL21Codon Plus(Novagen，美国)，挑取转化后的阳性克隆，在含有氨苄青霉素(50mg/L)的LB液体培养基中进行扩增培养。当菌液培养至OD600值为0.6时加入终浓度为0.2～0.5mM的IPTG(异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷)诱导目的基因的表达，25℃培养16h后离心收集菌体，用裂解缓冲液(Na2HPO4 80mM、NaCl 1.36M、KH2PO4 20mM、KCl 26mM、1％TRITONX-100、pH 8.0)对菌体进行重悬，并利用超声波破碎仪(Fisher，美国)对菌体进行破碎，破碎后释放出的重组蛋白通过Histag标签蛋白纯化试剂盒纯化，纯化产物通过10％的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝胶电泳进行检验，并利用DC Protein Assay Kit试剂盒(Bio-Rad，美国)对纯化后的蛋白进行浓度测定。
实施例4体外酶活检测
HAS的酶活实验体系为：50mM PBS、15mM MgCl、2.5mM DTT、1mM UDP-GlcA、1mMUDP-GlcNAc和30μM纯化的HAS,总容量为50μl。反应体系在37℃条件下反应1h，煮沸后，用HA检测试剂盒对反应体系中HA产物进行检测。试剂盒利用HA结合蛋白和辣根过氧化物作为一抗和二抗，反应过后用TMB进行显色终止，利用酶标仪在OD450条件下检测产物吸光度值。所有的反应体系均设置三个平行样品。
体外酶活检测结果如表3所示：
表3体外酶活检测-米氏常数
HAS对两种底物UDP-GlcNAc和UDP-GlcA的米氏常数测定结果如图4所示，本发明snHAS对底物UDP-GlcNAc的Km值为0.26±0.05mM，明显低于其他来源的HAS(其中来源于Streptococcus pygenes的spHAS的Km值为1.09±0.12mM，来源于Streptococcusequisimilis的seHAS的Km值为0.95±0.17mM，来源于Mouse的HAS1的Km值为0.87±0.06mM)，表明本发明的HAS对该底物具有更强的亲和力。本发明snHAS对底物UDP-GlcA的Km值为0.04±0.01mM，与其他来源的HAS相似。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (8)
1.一种透明质酸合成酶，其特征在于，所述透明质酸合成酶的氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示。
2.根据权利要求1所述的一种透明质酸合成酶，其特征在于，所述透明质酸合成酶不存在跨膜结构，仅有1个透明质酸结合蛋白，分子量为37.2kDa。
3.用于扩增权利要求1所述的透明质酸合成酶的引物。
4.根据权利要求3所述的引物，其特征在于，所述引物的核苷酸序列为：
F1：5’-ATGAAATATACTATTCTTATTCC-3’；
R1：5’-TATATAGAATATATGGATATTAA-3’。
5.根据权利要求1所述的透明质酸合成酶在合成透明质酸中的应用。
6.一种合成透明质酸的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
(1)获得如权利要求1所述的透明质酸合成酶；
(2)利用步骤(1)中的透明质酸合成酶在酶活反应体系中催化合成透明质酸。
7.根据权利要求6所述的合成透明质酸的方法，其特征在于，步骤(1)中通过分子克隆表达获得透明质酸合成酶。
8.根据权利要求6所述的合成透明质酸的方法，其特征在于，步骤(2)中酶活反应体系中含权利要求1所述的透明质酸合成酶30μM、PBS缓冲液50mM、氯化镁溶液15mM、二硫苏糖醇溶液2.5mM、UDP-GlcA 1mM和UDP-GlcNAc 1mM。
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