CN118995309A - 一种白僵菌孢子油的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本申请提供一种白僵菌孢子油的制备方法，该方法包括如下步骤：A、取白僵菌孢子粉，粉碎成粉末；B、取白僵菌孢子粉粉末，进行超临界流体萃取，得到白僵菌孢子油粗品；C、将白僵菌孢子油粗品进行过滤和脱水处理，即得白僵菌孢子油。
Description
技术领域
本申请涉及一种白僵菌孢子油的制备方法，属于真菌活性成分提取领域。
背景技术
酪氨酸酶(Tyrosinase,EC.1.14.18.1)广泛存在于人类、动物、植物和微生物中，是一种需氧氧化酶，也是目前已知的生物体中参与黑色素(Melanin)合成的关键酶。在皮肤黑色素沉积或色素代谢过程中，酪氨酸酶发挥着重要作用，其表达和活性直接决定了黑色素生成的速度和产量。因此，控制酪氨酸酶的活性可以有效调节黑色素的生成量。酪氨酸酶的异常表达可引发多种皮肤疾病，如老年斑及光照损伤等，此外，它还与人脑神经黑色素的形成及神经退行性病变相关的帕金森病密切相关。酪氨酸酶抑制剂因此在治疗与黑色素失调相关的疾病中具有重要临床应用，同时在美白化妆品及防止日晒引起的皮肤变黑方面也发挥着关键作用。鉴于酪氨酸酶在上述生理功能中的重要性，研究天然植物和真菌中的酪氨酸酶调节剂，不仅对色素性皮肤病的治疗具有重要意义，也为美白美容化妆品配方的开发提供了新的方向。
白僵菌[Beauveria bassiana(Bals.)]是最早发现的虫草类真菌之一，是一种具有较强专化性的昆虫病原微生物。它不仅是极佳的生物防治材料，也是一种极具潜力的生物活性物质来源。我国古代文献中早有关于白僵蚕入药及其美白功效的记载。白僵菌孢子粉中富含油脂类成分，但目前针对白僵菌孢子油的提取工艺尚无相关报道。近年来，超临界流体萃取技术因其温和的操作条件和环保无毒的特点，逐渐成为提取热敏性和挥发性成分的优选方法。尽管这一技术在其他领域已取得显著成功，但其在白僵菌孢子油提取中的具体应用尚未见报道。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本申请提供一种白僵菌孢子油的制备方法以及采用该方法提取获得的白僵菌孢子油。
作为本发明的一个方面，本发明提供一种白僵菌孢子油的制备方法，该方法包括如下步骤：
A、取白僵菌孢子粉，粉碎成粉末；
B、取白僵菌孢子粉粉末，进行超临界流体萃取，得到白僵菌孢子油粗品；
C、将白僵菌孢子油粗品进行过滤和脱水处理，即得白僵菌孢子油。
优选的，步骤A所述白僵菌孢子粉来源于保藏编号为CGMCC NO：41006的球孢白僵菌菌种。
优选的，步骤A具体为：取白僵菌孢子粉，粉碎后过200-300目筛。
优选的，步骤B具体为：
B1、取白僵菌孢子粉粉末，装入萃取装置中；
B2、将CO2加压，先静态萃取，然后动态萃取；
B3、萃取结束后，通过减压分离得到白僵菌孢子油粗品。
进一步优选的，步骤B2为将CO2加压至4.5-5.0MPa；最优选的，将CO2加压至5.0MPa。
进一步优选的，步骤B2所述动态萃取过程中CO2流量为1.5-3L/h；最优选的，动态萃取过程中CO2流量为2L/h。
进一步优选的，步骤B2静态萃取时间为20-40分钟，动态萃取时间为2-4小时；最优选的，静态萃取时间为30分钟，动态萃取时间为3小时。
进一步优选的，步骤B2萃取温度为25-35℃；最优选的，萃取温度为30℃。
进一步优选的，步骤B2萃取过程中加入萃取溶剂，所述萃取溶剂为丙酮或乙醇溶液；流量为150-300ml/h。最优选的，萃取溶剂为乙醇溶液。
进一步优选的，步骤B3减压分离为萃取结束后，以0.5-1MPa/min的速率降低萃取装置内压力至接近大气压(约0.1MPa)，控制温度为20-25℃，分离得到孢子油粗品。
作为本发明的另一个方面，本发明提供一种采用上述方法提取的白僵菌孢子油。
本发明的有益效果在于：本发明先将白僵菌孢子粉粉碎成粉末；然后将白僵菌孢子粉粉末进行超临界流体萃取，得到白僵菌孢子油粗品；再将白僵菌孢子油粗品进行过滤和脱水处理，即得白僵菌孢子油。本发明采用超临界流体萃取法进行白僵菌孢子油的提取，并通过优化操作参数获得所需的白僵菌孢子油，其操作条件简单、温和，有利于维持白僵菌孢子油中油脂类成分的稳定，对白僵菌孢子油的油脂类成分损耗小，有效保留了白僵菌孢子油的活性成分，大大提高了提取得率，可将提取得率增至12.76％，是常规提取方法提取得率的2.4倍，所制得的白僵菌孢子油纯度高、品质好；此外，本发明采用超临界流体萃取法获得的白僵菌孢子油对酪氨酸酶的抑制率为18.7％，是常规提取方法抑制率的3倍，通过抑制酪氨酸酶活性，减少黑色素的生产，具有很好的美白、淡斑功效。
附图说明
图1为超临界流体萃取工艺提取的白僵菌孢子油。
具体实施方式
以下通过具体实施例进一步描述本发明，本发明不仅仅限于以下实施例。在本发明的范围内或者在不脱离本发明的内容、精神和范围内，对本发明进行的变更、组合或替换，对于本领域的技术人员来说是显而易见的，且包含在本发明的范围之内。
以下实施例所用白僵菌孢子粉来源于编号为BCS01的球孢白僵菌(Beauveriabassiana)菌种，该菌种保藏于位于我国北京朝阳区北辰西路1号院3号的“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC”，保藏编号：CGMCC NO：41006，保藏日期为2023年12月18日。来源于其他球孢白僵菌菌种的白僵菌孢子粉和市售白僵菌孢子粉制备的孢子油均能实现本申请的技术效果。
实施例1
一种白僵菌孢子油的制备方法，该方法包括如下步骤：
A、取白僵菌孢子粉，粉碎成粉末，过200目筛，备用；
B、取白僵菌孢子粉粉末，装入萃取釜中，装填量为80％；启动设备，将CO2加压至4.5MPa，温度稳定在30℃，先静态萃取30min，然后以2L/h流量泵入CO2，动态萃取3h；萃取结束后，以0.5-1MPa/min的速率缓慢降低萃取釜内压力至接近大气压(约0.1MPa)，使孢子油粗品在分离器沉淀下来，该过程中控制温度为20-25℃；
C、将白僵菌孢子油粗品进行过滤和脱水处理，即得白僵菌孢子油。
实施例2
一种白僵菌孢子油的制备方法，该方法包括如下步骤：
A、取白僵菌孢子粉，粉碎成粉末，过300目筛，备用；
B、取白僵菌孢子粉粉末，装入萃取釜中，装填量为80％；启动设备，将CO2加压至4.5MPa，温度稳定在30℃；先静态萃取30min，然后以2L/h流量泵入CO2，动态萃取3h；萃取结束后，以0.5-1MPa/min的速率缓慢降低萃取釜内压力至接近大气压(约0.1MPa)，使孢子油粗品在分离器沉淀下来，该过程中控制温度为20-25℃；
C、将白僵菌孢子油粗品进行过滤和脱水处理，即得白僵菌孢子油。
实施例3
一种白僵菌孢子油的制备方法，该方法包括如下步骤：
A、取白僵菌孢子粉，粉碎成粉末，过300目筛，备用；
B、取白僵菌孢子粉粉末，装入萃取釜中，装填量为80％；启动设备，将CO2加压至4.5MPa，温度稳定在30℃；以200mL/h恒定速率泵入浓度为10％的丙酮水溶液，先静态萃取30min，然后以2L/h流量泵入CO2，动态萃取3h；萃取结束，以0.5-1MPa/min的速率缓慢降低萃取釜内压力至接近大气压(约0.1MPa)，使孢子油粗品在分离器沉淀下来，该过程中控制温度为20-25℃；
C、将白僵菌孢子油粗品进行过滤和脱水处理，即得白僵菌孢子油。
实施例4
一种白僵菌孢子油的制备方法，该方法包括如下步骤：
A、取白僵菌孢子粉，粉碎成粉末，过300目筛，备用；
B、取白僵菌孢子粉粉末，装入萃取釜中，装填量为80％；启动设备，将CO2加压至4.5MPa，温度稳定在30℃；以200mL/h恒定速率泵入浓度为5％的乙醇溶液，先静态萃取30min，然后以2L/h流量泵入CO2，动态萃取3h；萃取结束，以0.5-1MPa/min的速率缓慢降低萃取釜内压力至接近大气压(约0.1MPa)，使孢子油粗品在分离器沉淀下来，该过程中控制温度为20-25℃；
C、将白僵菌孢子油粗品进行过滤和脱水处理，即得白僵菌孢子油。
实施例5
一种白僵菌孢子油的制备方法，该方法包括如下步骤：
A、取白僵菌孢子粉，粉碎成粉末，过300目筛，备用；
B、取白僵菌孢子粉粉末，装入萃取釜中，装填量为80％；启动设备，将CO2加压至5.0MPa，温度稳定在30℃；以200mL/h恒定速率泵入浓度为5％的乙醇溶液，先静态萃取30min，然后以2L/h流量泵入CO2，动态萃取3h；萃取结束后，以0.5-1MPa/min的速率缓慢降低萃取釜内压力至接近大气压(约0.1MPa)，使孢子油粗品在分离器沉淀下来，该过程中控制温度为20-25℃；
C、将白僵菌孢子油粗品进行过滤和脱水处理，即得白僵菌孢子油。
对比例1
一种白僵菌孢子油的制备方法，该方法包括如下步骤：
取白僵菌孢子粉，粉碎成粉末，过300目筛，备用；取白僵菌孢子粉粉末，按孢子粉粉末：乙醇溶液为1:10(g/ml)的比例加入95％乙醇溶液，装入萃取器中，在室温下搅拌萃取4小时；萃取结束后，通过过滤分离固液；将滤液在旋转蒸发仪中蒸发除去乙醇，得到孢子油粗品；对提取出的孢子油进行脱水处理，即得白僵菌孢子油。
对比例2
一种白僵菌孢子油的制备方法，该方法包括如下步骤：
取白僵菌孢子粉，粉碎成粉末，过300目筛，备用；取白僵菌孢子粉粉末，按孢子粉粉末：乙醇溶液为1:10(g/ml)的比例加入95％乙醇溶液，装入超声波萃取器中；启动超声波萃取器，设定频率20kHz，功率150W，在室温下超声波辅助萃取2小时；萃取结束后，通过过滤分离固液；将滤液在旋转蒸发仪中蒸发除去乙醇，得到孢子油粗品；对提取出的孢子油进行脱水处理，即得白僵菌孢子油。
实验测试
1、白僵菌孢子油提取得率
取实施例1-5和对比例1、2制备的白僵菌孢子油，计算提取得率，结果见表1。
表1不同制备方法白僵菌孢子油提取得率
| 实施例 | 提取得率(％) |
| 实施例1 | 8.335±0.177c |
| 实施例2 | 8.685±0.148c |
| 实施例3 | 8.830±0.156bc |
| 实施例4 | 9.145±0.148b |
| 实施例5 | 12.76±0.127a |
| 对比例1 | 5.370±0.418d |
| 对比例2 | 6.055±0.120d |
由表1结果可见，本发明采用超临界流体萃取法进行白僵菌孢子油的提取，并通过优化操作参数获得所需的白僵菌孢子油，其操作条件简单、温和，有利于维持白僵菌孢子油中油脂类成分的稳定，对白僵菌孢子油的油脂类成分损耗小，有效保留了白僵菌孢子油的活性成分，大大提高了提取得率，尤其是实施例5方法提取得率为12.76％，是常规提取方法提取得率的2.4倍。
2、白僵菌孢子油对酪氨酸酶抑制作用
2.1试剂配制
酪氨酸酶的最终浓度分别为25.0μg/ml。酪氨酸溶液、多巴溶液、酶溶液及样品溶液均以50mmol/L磷酸缓冲液(pH 6.8)配制。
PBS溶液：50mmol/L PH6.8 PBS溶液：A液：50mmol/L磷酸二氢钾(KH2PO4，136.09)；B液：50mmol/L磷酸氢二钠(含12个结晶水，Na2HPO4.12H2O，358.14)。然后将A液和B液按照1：1混合即得50mmol/L pH6.8 PBS溶液，4℃保存。
L-多巴溶液：0.5mmol/L L-多巴溶液：称取98.595mg的L-多巴(摩尔质量197.19)溶于1L50mmol/L pH6.8 PBS溶液，4℃保存。
L-酪氨酸溶液：0.5mmol/LL-酪氨酸溶液：称取90.595mg的L-酪氨酸(摩尔质量181.19)溶于1L 50mmol/L pH6.8 PBS溶液，4℃保存。
酪氨酸酶溶液：酶活500U/ml，现用现配，4℃保存。
2.2测定方法
按表2准确吸取1、2、3、4组反应液，充分混匀后在37℃水浴温育30min迅速转移至反应体系为4ml的比色皿中，于475nm处测吸光度A，按公式Ⅰ求抑制率。
表2反应液组成
| 实验组号 | 第1组 | 第2组 | 第3组 | 第4组 |
| 底物/ml | 2 | 0 | 2 | 0 |
| 样品/ml | 0 | 0 | 1 | 1 |
| PBS(pH＝6.8)/ml | 1 | 3 | 0 | 2 |
| 酪氨酸酶溶液/ml | 1 | 1 | 1 | 1 |
| 合计/ml | 4 | 4 | 4 | 4 |
公式：抑制率＝[1-(A3-A4)/(A1-A2)]×100％
2.3测定结果
结果见表3。
表3不同提取方法白僵菌孢子油酪氨酸酶抑制率
| 实施例 | 酪氨酸酶抑制率(％) |
| 实施例1 | 10.54±047c |
| 实施例2 | 11.36±0.40c |
| 实施例3 | 12.73±0.29b |
| 实施例4 | 12.31±0.50b |
| 实施例5 | 18.70±0.17a |
| 对比例1 | 5.82±0.36d |
| 对比例2 | 6.90±0.32d |
由表3可见，本发明采用超临界流体萃取法获得的白僵菌孢子油相对于常规提取方法对酪氨酸酶的抑制率显著提高，尤其是实施例5方法抑制率为18.7％，是常规提取方法抑制率的3倍。通过抑制酪氨酸酶活性，能够减少黑色素的生产，具有很好的美白、淡斑功效，具有良好的开发前景。
Claims (10)
1.一种白僵菌孢子油的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
A、取白僵菌孢子粉，粉碎成粉末；
B、取白僵菌孢子粉粉末，进行超临界流体萃取，得到白僵菌孢子油粗品；
C、将白僵菌孢子油粗品进行过滤和脱水处理，即得白僵菌孢子油。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤A所述白僵菌孢子粉来源于保藏编号为CGMCC NO：41006的球孢白僵菌菌种。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤A为：取白僵菌孢子粉，粉碎成粉末，过200-300目筛。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤B为：
B1、取白僵菌孢子粉粉末，装入萃取装置中；
B2、将CO2加压，先静态萃取，然后动态萃取；
B3、萃取结束后，通过减压分离得到白僵菌孢子油粗品。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤B2为将CO2加压至4.5-5.0MPa；优选的，将CO2加压至5.0MPa。
6.如权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤B2所述动态萃取过程中CO2流量为1.5-3L/h；优选的，动态萃取过程中CO2流量为2L/h。
7.如权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤B2静态萃取时间为20-40分钟，动态萃取时间为2-4小时。
8.如权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤B2萃取的温度为25-35℃。
9.如权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤B2萃取过程中加入萃取溶剂，所述萃取溶剂为丙酮或乙醇溶液；优选萃取溶剂为乙醇溶液。
10.如权利要求1-9任一一种制备方法制备的白僵菌孢子油。
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