CN118949002A - 一种宫颈癌细胞抑制组合物及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及医药技术领域，尤其涉及一种宫颈癌细胞抑制组合物及其制备方法和应用。该组合物由负载乌药醚内酯的脐带间充质干细胞、膦酰二肽和紫杉醇组成。实验结果表明，该组合物的IC₅₀低于10μg/mL，组合物中负载乌药醚内酯的脐带间充质干细胞、膦酰二肽和紫杉醇协同作用，能够有效抑制人宫颈癌细胞的增殖和人宫颈癌细胞裸鼠移植瘤的生长，在治疗宫颈癌方面具有较好的效果，具有广阔的应用前景。

Description

一种宫颈癌细胞抑制组合物及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及医药技术领域，尤其涉及一种宫颈癌细胞抑制组合物及其制备方法和应用。

背景技术

宫颈癌也称为子宫颈癌，是女性生殖道恶性肿瘤，持续的人乳头状瘤病毒感染是其发生发展的主要原因。目前宫颈癌治疗方法以手术联合放射治疗、化学治疗的综合疗法为主，尽管传统综合疗法在一定程度上延长了患者的生存期，但这些方法往往伴随着显著的不良反应，如免疫系统受损、组织损伤、生活质量下降以及高昂的医疗费用。因此，开发新的宫颈癌治疗药物是医药领域的重要研发课题之一。

化学治疗药物紫杉醇（PTX）又称红豆杉醇，是一种高效、低毒、广谱的天然抗癌药物，在临床上已经广泛应用于多种实体肿瘤的治疗。虽然紫杉醇展现了对宫颈癌细胞的强大抑制作用，但其临床应用受限于显著的毒副作用，如骨髓抑制、神经毒性及心脏毒性等，迫使临床医生在治疗剂量上做出妥协，进而影响了治疗效果。此外，纳米技术在药物输送领域的引入，虽为解决药物溶解性差、提高靶向性提供了新途径，但传统纳米载体面临的一个关键挑战是其在体内的快速清除，导致到达肿瘤部位的有效药物浓度不足，限制了治疗效果的进一步提升。

伴随免疫学研究的深入，间充质干细胞在肿瘤免疫调节中的作用备受关注。且研究表明与胚胎干细胞相比，成体干细胞移植后致瘤风险很低，而间充质干细胞特有的肿瘤“归巢”能力使其成为肿瘤靶向治疗中优良的细胞载体。目前，尚未有采用脐带间充质干细胞作为载体负载药物用于抑制宫颈癌细胞的报道。基于此，本发明提供一种以脐带间充质干细胞作为药物载体，结合传统抗癌药物紫杉醇，并引入膦酰二肽形成复合治疗组合物。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明的目的之一在于提供一种宫颈癌细胞抑制组合物，该组合物能够显著抑制宫颈癌细胞的生长增殖。

本发明的目的之二在于提供一种宫颈癌细胞抑制组合物的制备方法，该制备方法步骤简洁，易于生产。

本发明的目的之三在于提供一种宫颈癌细胞抑制组合物的应用，具有广阔的应用前景。

本发明的目的之一采用如下技术方案实现：

一种宫颈癌细胞抑制组合物，所述组合物由负载乌药醚内酯的脐带间充质干细胞、膦酰二肽和紫杉醇组成。

优选地，所述膦酰二肽和紫杉醇的质量比为1：1.5-2，所述紫杉醇和负载乌药醚内酯的脐带间充质干细胞的比例为1mg：1-4×10⁵个。

优选地，所述负载乌药醚内酯的脐带间充质干细胞的制备方法如下：

将人脐带间充质干细胞与乌药醚内酯在培养基中孵育，孵育结束后，经离心，即得。

优选地，所述脐带间充质干细胞在培养基中的浓度为1-3×10⁵个/mL，所述脐带间充质干细胞为P2-P4代脐带间充质干细胞；所述乌药醚内酯在培养基中的浓度为2-4mg/mL。

优选地，所述培养基包括α-MEM培养基，和添加在培养基中的以下成分：α-MEM培养基，和添加在培养基中的以下成分：8-10% FBS、1-2%青-链霉素，所述孵育的时间为24-30h。

优选地，所述P2-P4代脐带间充质干细胞的获取方式为：

（1）将脐带组织进行冲洗、剪碎，消化后进行离心，获得细胞沉淀；

（2）将细胞沉淀接种于培养基中，培养至细胞生长融合度为80-85%，消化后，进行传代培养，即得P2-P4代脐带间充质干细胞。

优选地，步骤（1）中所述消化使用的是0.1%的胶原酶Ⅱ；步骤（2）中所述消化使用的是0.25% EDTA的胰蛋白酶。

优选地，步骤（2）中所述细胞沉淀在培养基中的接种密度为2-6×10⁴个，所述培养基包括α-MEM培养基，和添加在培养基中的以下成分：8-10% FBS、1-2%青-链霉素；所述培养的条件为37℃，5%CO₂。

本发明的目的之二采用如下技术方案实现：

上述宫颈癌细胞抑制组合物的制备方法，包括以下步骤：

按照所述配比，将各原料混合均匀，即得。

本发明的目的之三采用如下技术方案实现：

上述宫颈癌细胞抑制组合物的应用，在制备治疗宫颈癌药物中的应用。

相比现有技术，本发明的有益效果在于：

1、本发明提供一种新的宫颈癌细胞抑制组合物，该组合物由负载乌药醚内酯的脐带间充质干细胞、膦酰二肽和紫杉醇组成。实验结果表明，该组合物的IC₅₀低于10μg/mL，组合物中负载乌药醚内酯的脐带间充质干细胞、膦酰二肽和紫杉醇协同作用，能够有效抑制人宫颈癌细胞的增殖和人宫颈癌细胞裸鼠移植瘤的生长。

2、本发明的组合物还能够避免单药的毒副作用。

3、本发明的组合物具有广阔的应用前景。

附图说明

图1是P2代脐带间充质干细胞的形态图；

图2是P3代脐带间充质干细胞的形态图；

图3是P4代脐带间充质干细胞的形态图。

具体实施方式

下面结合附图以及具体实施方式，对本发明做进一步描述，需要说明的是，在不相冲突的前提下，以下描述的各实施例之间或各技术特征之间可以任意组合形成新的实施例。实施例中未注明的具体条件，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器，如无特殊说明，均为通过市购渠道获得的常规产品。

（一）制备例

制备例1

制备例1提供一种负载乌药醚内酯的脐带间充质干细胞，具体制备方法如下：

使用PBS缓冲液清洗脐带组织，用手术剪将其剪碎为1mm³大小的组织，用0.1%的胶原酶Ⅱ在恒温震荡仪中消化，加入生理盐水，混合均匀后，以2000rpm离心15min，弃上清液，获得细胞沉淀。按照3×10⁴个的接种密度，将细胞沉淀接种于培养基中。于37℃，5%CO₂的细胞培养箱中培养至细胞生长融合度为80%，当细胞融合度达到80%后，使用0.25% EDTA的胰蛋白酶溶液消化细胞，于37℃、5%CO₂细胞培养箱中进行传代，传代比例为1：3，获得P2代脐带间充质干细胞（细胞形态图如图1所示）。

将P2代脐带间充质干细胞与乌药醚内酯在培养基中室温孵育26h，P2代脐带间充质干细胞在培养基中的浓度为2×10⁵个/mL，乌药醚内酯在培养基中的浓度为3mg/mL，孵育结束后，于低温环境下，以300g的速度，离心15min，即得负载乌药醚内酯的脐带间充质干细胞。

用无乌药醚内酯的α-MEM培养基清洗负载乌药醚内酯的脐带间充质干细胞，直至表面无结合的乌药醚内酯。将清洗后的负载乌药醚内酯的脐带间充质干细胞进行细胞裂解，通过质谱，检测出每个脐带间充质干细胞的乌药醚内酯的平均负载量为0.2ng。

上述制备负载乌药醚内酯的脐带间充质干细胞的过程中涉及的培养基由α-MEM培养基，和添加在培养基中的以下成分组成：9% FBS、1%青-链霉素组成。

制备例2

制备例2提供一种负载乌药醚内酯的脐带间充质干细胞，具体制备方法如下：

使用PBS缓冲液清洗脐带组织，用手术剪将其剪碎为1mm³大小的组织，用0.1%的胶原酶Ⅱ在恒温震荡仪中消化，加入生理盐水，混合均匀后，以2000rpm离心15min，弃上清液，获得细胞沉淀。按照2×10⁴个的接种密度，将细胞沉淀接种于培养基中。于37℃，5%CO₂的细胞培养箱中培养至细胞生长融合度为85%，当细胞融合度达到85%后，使用0.25% EDTA的胰蛋白酶溶液消化细胞，于37℃、5%CO₂细胞培养箱中进行传代，传代比例为1：3，获得P3代脐带间充质干细胞（细胞形态图如图2所示）。

将P3代脐带间充质干细胞与乌药醚内酯在培养基中室温孵育24h，P3代脐带间充质干细胞在培养基中的浓度为1×10⁵个/mL，乌药醚内酯在培养基中的浓度为2mg/mL，孵育结束后，于低温环境下，以300g的速度，离心15min，即得。

用无乌药醚内酯的α-MEM培养基清洗负载乌药醚内酯的脐带间充质干细胞，直至表面无结合的乌药醚内酯。将清洗后的负载乌药醚内酯的脐带间充质干细胞进行细胞裂解，通过质谱，检测出每个脐带间充质干细胞的乌药醚内酯的平均负载量为0.18ng。

上述制备负载乌药醚内酯的脐带间充质干细胞的过程中涉及的培养基由α-MEM培养基，和添加在培养基中的以下成分组成：8% FBS、2%青-链霉素组成。

制备例3

制备例3提供一种负载乌药醚内酯的脐带间充质干细胞，具体制备方法如下：

使用PBS缓冲液清洗脐带组织，用手术剪将其剪碎为1mm³大小的组织，用0.1%的胶原酶Ⅱ在恒温震荡仪中消化，加入生理盐水，混合均匀后，以2000rpm离心15min，弃上清液，获得细胞沉淀。按照6×10⁴个的接种密度，将细胞沉淀接种于培养基中。于37℃，5%CO₂的细胞培养箱中培养至细胞生长融合度为80%，当细胞融合度达到80%后，使用0.25% EDTA的胰蛋白酶溶液消化细胞，于37℃、5%CO₂细胞培养箱中进行传代，传代比例为1：3，获得P4代脐带间充质干细胞（细胞形态图如图3所示）。

将P4代脐带间充质干细胞与乌药醚内酯在培养基中室温孵育30h，P4代脐带间充质干细胞在培养基中的浓度为3×10⁵个/mL，乌药醚内酯在培养基中的浓度为4mg/mL，孵育结束后，于低温环境下，以300g的速度，离心15min，即得。

用无乌药醚内酯的α-MEM培养基清洗负载乌药醚内酯的脐带间充质干细胞，直至表面无结合的乌药醚内酯。将清洗后的负载乌药醚内酯的脐带间充质干细胞进行细胞裂解，通过质谱，检测出每个脐带间充质干细胞的乌药醚内酯的平均负载量为0.22ng。

上述制备负载乌药醚内酯的脐带间充质干细胞的过程中涉及的培养基由α-MEM培养基，和添加在培养基中的以下成分组成：10% FBS、1%青-链霉素组成。

（二）实施例

实施例1

实施例1提供一种宫颈癌细胞抑制组合物，该组合物由制备例1制得的负载乌药醚内酯的脐带间充质干细胞、膦酰二肽和紫杉醇组成。组合物中膦酰二肽和紫杉醇的质量比为1：1.6，紫杉醇和负载乌药醚内酯的脐带间充质干细胞的比例为1mg：2×10⁵个。

实施例1还提供上述宫颈癌细胞抑制组合物的制备方法，具体过程如下：

按照上述配比，将负载乌药醚内酯的脐带间充质干细胞、膦酰二肽和紫杉醇混合均匀，即得。

实施例2

实施例2提供一种宫颈癌细胞抑制组合物，该组合物由制备例2制得的负载乌药醚内酯的脐带间充质干细胞、膦酰二肽和紫杉醇组成。组合物中膦酰二肽和紫杉醇的质量比为1：1.5，紫杉醇和负载乌药醚内酯的脐带间充质干细胞的比例为1mg：1×10⁵个。

实施例2还提供上述宫颈癌细胞抑制组合物的制备方法，具体过程如下：

按照上述配比，将负载乌药醚内酯的脐带间充质干细胞、膦酰二肽和紫杉醇混合均匀，即得。

实施例3

实施例3提供一种宫颈癌细胞抑制组合物，该组合物由制备例3制得的负载乌药醚内酯的脐带间充质干细胞、膦酰二肽和紫杉醇组成。组合物中膦酰二肽和紫杉醇的质量比为1：2，紫杉醇和负载乌药醚内酯的脐带间充质干细胞的比例为1mg：4×10⁵个。

实施例3还提供上述宫颈癌细胞抑制组合物的制备方法，具体过程如下：

按照上述配比，将负载乌药醚内酯的脐带间充质干细胞、膦酰二肽和紫杉醇混合均匀，即得。

（三）对比例

对比例1

对比例1与实施例1的区别在于：组合物中缺少膦酰二肽，组合物用量和实施例1的总量相同，其余与实施例1保持一致。

对比例2

对比例2与实施例1的区别在于：组合物由乌药醚内酯、脐带间充质干细胞、膦酰二肽和紫杉醇组成。组合物中膦酰二肽和紫杉醇的质量比为1：1.6，紫杉醇、脐带间充质干细胞和乌药醚内酯的用量比例为1mg：2×10⁵个：40μg，其余与实施例1保持一致。

对比例3

对比例3与实施例1的区别在于：仅由单一紫杉醇组成，紫杉醇用量为实施例1中乌药醚内酯、膦酰二肽和紫杉醇的用量总和，其余与实施例1保持一致。

（四）试验例

试验例1

（1）将乌药醚内酯1mg用40μL的DMSO溶解配置成25mg/mL的母液，再用α-MEM培养基（含1%胎牛血清）连续稀释成乌药醚内酯浓度为0、2.5、5、10、20、40、60、80、100、160μg/mL的待测样品液。

取处于对数生长期的人宫颈癌细胞Hela S3，使用α-MEM培养基将Hela S3稀释为1×10⁶个/mL。取100μL上述Hela S3细胞接种至96孔板中，每孔加入2mL含1%胎牛血清的α-MEM培养基，于37℃、5%CO₂的细胞培养箱中培养1d后，加入100μL上述各组待测样品液，每组设置3个复孔，继续培养3d。每孔加入10μL MTT溶液（浓度为5mg/mL），继续培养4h。弃培养基，每孔加入150μL DMSO，充分震荡溶解后，于570nm下测定各组吸光度OD值。本试验还设置阴性对照组：加入等量的细胞和α-MEM培养基（含1%胎牛血清）。空白对照组只加入等量的α-MEM培养基（含1%胎牛血清）。肿瘤细胞生长抑制率=[1-（待测样品组OD值-空白对照组OD值）/（阴性对照组OD值-空白对照组OD值）]×100%，根据logit法计算样品对于肿瘤细胞生长的半数抑制浓度（IC₅₀），结果参见表1所示。

（2）将膦酰二肽1mg用40μL的DMSO溶解配置成25mg/mL的母液，再用α-MEM培养基（含1%胎牛血清）分别配制膦酰二肽浓度为0、2.5、5、10、20、40、80、100、1000μg/mL的待测样品液。

参考上述乌药醚内酯的肿瘤细胞生长抑制率方法检测膦酰二肽的肿瘤细胞生长抑制率，根据logit法计算样品对于肿瘤细胞生长的半数抑制浓度（IC₅₀），结果参见表1所示。

表1

抗肿瘤活性的评价标准：化合物IC₅₀＜10μg/mL则判断样品在体外对肿瘤细胞有杀伤作用；IC₅₀＜30μg/mL则判断样品在体外对肿瘤细胞有具有较强的增殖抑制作用。通过表1可以看出，乌药醚内酯、膦酰二肽在体外对宫颈癌细胞具有较强的增殖抑制作用，因此能够应用于治疗宫颈癌。

试验例2

将实施例1-3、对比例1-3的组合物1mg用40μL的DMSO溶解配置成25mg/mL的母液，再用α-MEM培养基（含1%胎牛血清）分别配制组合物浓度为0、2.5、5、10、20、40、60、100、160、320、640μg/mL的待测样品液。

参考试验例1的方法检测各组组合物的肿瘤细胞生长抑制率，根据logit法计算样品对于肿瘤细胞生长的半数抑制浓度（IC₅₀），结果参见表2所示。

表2

抗肿瘤活性的评价标准：化合物IC₅₀＜10μg/mL则判断样品在体外对肿瘤细胞有杀伤作用；IC₅₀＜30μg/mL则判断样品在体外对肿瘤细胞有具有较强的增殖抑制作用。

由表2可知，与单独使用紫杉醇、联合使用负载乌药醚内酯的脐带间充质干细胞和紫杉醇相比，实施例1-3组药物的半数抑制浓度明显降低，对人宫颈癌细胞具有较强的增殖抑制作用。而将负载乌药醚内酯的脐带间充质干细胞替换为乌药醚内酯和脐带间充质干细胞时，效果变差。这表明，负载乌药醚内酯的脐带间充质干细胞、膦酰二肽和紫杉醇联用时协同作用最强。综上，负载乌药醚内酯的脐带间充质干细胞、膦酰二肽和紫杉醇的组合物能够用于制备治疗宫颈癌的药物。

试验例3

试验对象：选取5周龄雌性SD大鼠共80只，体重为30-32g。

模型构建：取处于对数生长期的人宫颈癌Hela S3细胞，使用α-MEM培养基将HelaS3稀释为2×10⁸个/mL。于无菌环境下，将0.2mL HeLa S3细胞液注入大鼠大腿根部皮下。

分组：于注射细胞液后第15d，将建模成功的大鼠随机分为7组，模型组、试验组（分为实施例1-3组、对比例1-3组），每组10只。

给药：模型组灌胃等量生理盐水，1次/d，连续给药14d；实施例1-3组：分别灌胃实施例1-3组的组合物，给药剂量30mg/kg，1次/d，连续给药14d；对比例1-3组：分别灌胃对比例1-3组的药物，给药剂量30mg/kg，1次/d，连续给药14d。

效果检测：连续给药14d后，停药1d，脱颈处死各组大鼠，完整剥离出肿瘤组织，观察各组肿瘤组织情况以及有无周围组织浸润，观察有无腹水及其他脏器转移，测量肿瘤质量并计算抑瘤率，抑瘤率=（模型组肿瘤质量-试验组肿瘤质量）/模型组肿瘤质量×100%，结果参见表3。

表3

由表3可知，实施例1-3的组合物能够抑制人宫颈癌Hela S3细胞裸鼠移植瘤的生长。

较省去膦酰二肽（对比例1）、未经负载直接使用乌药醚内酯（对比例2）、仅使用紫杉醇（对比例3）相比，由负载乌药醚内酯的脐带间充质干细胞、膦酰二肽和紫杉醇组成的组合物的抑瘤率最高。表明上述组合物在治疗宫颈癌方面具有较好的效果，且成分之间具有协同作用。

上述实施方式仅为本发明的优选实施方式，不能以此来限定本发明保护的范围，本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。

Claims (9)

1.一种宫颈癌细胞抑制组合物，其特征在于，所述组合物由负载乌药醚内酯的脐带间充质干细胞、膦酰二肽和紫杉醇组成；其配比为：所述膦酰二肽和紫杉醇的质量比为1：1.5-2，所述紫杉醇和负载乌药醚内酯的脐带间充质干细胞的比例为1mg：1-4×10⁵个。

2.根据权利要求1所述宫颈癌细胞抑制组合物，其特征在于，所述负载乌药醚内酯的脐带间充质干细胞的制备方法如下：

将人脐带间充质干细胞与乌药醚内酯在培养基中孵育，孵育结束后，经离心，即得。

3.根据权利要求2所述宫颈癌细胞抑制组合物，其特征在于，所述脐带间充质干细胞在培养基中的浓度为1-3×10⁵个/mL，所述脐带间充质干细胞为P2-P4代脐带间充质干细胞；所述乌药醚内酯在培养基中的浓度为2-4mg/mL。

4. 根据权利要求2所述宫颈癌细胞抑制组合物，其特征在于，所述培养基包括α-MEM培养基，和添加在培养基中的以下成分：8-10% FBS、1-2%青-链霉素，所述孵育的时间为24-30h。

5.根据权利要求3所述宫颈癌细胞抑制组合物，其特征在于，所述P2-P4代脐带间充质干细胞的获取方式为：

（1）将脐带组织进行冲洗、剪碎，消化后进行离心，获得细胞沉淀；

（2）将细胞沉淀接种于培养基中，培养至细胞生长融合度为80-85%，消化后，进行传代培养，即得P2-P4代脐带间充质干细胞。

6. 根据权利要求5所述宫颈癌细胞抑制组合物，其特征在于，步骤（1）中所述消化使用的是0.1%的胶原酶Ⅱ；步骤（2）中所述消化使用的是0.25% EDTA的胰蛋白酶。

7. 根据权利要求5所述宫颈癌细胞抑制组合物，其特征在于，步骤（2）中所述细胞沉淀在培养基中的接种密度为2-6×10⁴个，所述培养基包括α-MEM培养基，和添加在培养基中的以下成分：8-10% FBS、1-2%青-链霉素；所述培养的条件为37℃，5%CO₂。

8.根据权利要求1所述宫颈癌细胞抑制组合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

按照所述配比，将各原料混合均匀，即得。

9.根据权利要求1所述宫颈癌细胞抑制组合物的应用，其特征在于，在制备治疗宫颈癌药物中的应用。