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CN118883941A - 一种基于acsm1的前列腺癌辅助诊断检测试纸及其制备方法 - Google Patents

一种基于acsm1的前列腺癌辅助诊断检测试纸及其制备方法 Download PDF

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CN118883941A
CN118883941A CN202410993561.XA CN202410993561A CN118883941A CN 118883941 A CN118883941 A CN 118883941A CN 202410993561 A CN202410993561 A CN 202410993561A CN 118883941 A CN118883941 A CN 118883941A
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acsm1
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pad
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CN202410993561.XA
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王红群
华浩铭
马志厚
沈靖
陶司政
余娜
朱娅男
巩幼洁
黄岩
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Bengbu Third People's Hospital Bengbu Central Hospital
Original Assignee
Bengbu Third People's Hospital Bengbu Central Hospital
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Abstract

本发明公开了一种基于ACSM1的前列腺癌辅助诊断检测试纸及其制备方法，涉及生物技术领域，所述基于ACSM1的前列腺癌检测试纸的结构包括底板，及依次搭接在底板上的样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，所述结合垫为包被有鼠抗人IgG‑胶体金复合物的胶体金垫，所述硝酸纤维素膜上设有由兔抗鼠IgG包被的质控线和ACSM1重组抗体包被的检测线。该检测试纸可迅速检测出患者尿液样品中的ACSM1，可用于区分前列腺增生患者和前列腺癌患者，协助前列腺癌的诊断，主要用于前列腺癌术后或保守治疗后患者的自测、以及前列腺癌治疗后的疗效判断及用药指导，相较于侵入性筛查诊断前列腺癌以及现有技术中公开的利用生物标志物进行实时荧光定量PCR技术诊断的手段而言，本发明操作方便，费用成本低，具有良好的应用前景。

Description

一种基于ACSM1的前列腺癌辅助诊断检测试纸及其制备方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种基于ACSM1的前列腺癌辅助诊断检测试纸及其制备方法。
背景技术
前列腺癌是男性常见的恶性肿瘤之一，且近年来发病率逐渐上升，全球各国近几十年来对包括前列腺癌在内的各种癌症研究和临床治疗投入了大量的人力物力，但其发病机制至今尚未完全清楚。前列腺癌的早期诊断目前依赖于穿刺活检结合前列腺核磁共振，属于有创诊断方式，易造成患者机体损伤，且诊断周期长，为达到早发现、早干预、延长前列腺癌患者的生存时间的目的，寻求无创、高效诊断的方式是十分有必要的。
ACSM1基因位于染色体16p12.2位置上。ACSM1最早从人肝脏线粒体分离出来，后续研究发现ACSM1在睾丸中的表达水平较高，胰腺也有一定的表达，而肝脏中的表达水平非常低。ACSM1主要分布在线粒体基质中，少数分布在胞质内，具有中链脂肪酸：CoA连接酶活性，对4～16个碳原子的脂肪酸具有广泛的底物特异性。ACSM1催化产生的酰基辅酶A主要用于β-氧化以在线粒体基质中产生ATP和CO2。多项研究表明，ACSM1在前列腺癌中表达上调，同时在转移性前列腺癌中增加更为显著。泛癌分析显示，ACSM1在前列腺癌中表达水平最高，作为生物标志物有特别高的灵敏度和特异度。此外，ACSM1基因可增强前列腺癌细胞对铁死亡的抵抗能力并促进细胞远处转移。最新研究发现，ACSM1在前列腺癌中的致癌作用主要通过代谢途径和细胞外基质-受体相互作用信号通路，但与微环境中的免疫信号通路无关。并且认为ACSM1可能是一种新的癌基因，可作为前列腺癌筛查、预后预测的生物标志物或治疗靶点。
目前已有专利报道了从基因层面出发进行前列腺癌诊断，如中国授权专利CN110628908B公开了ACSM1、AMACR等基因可作为生物标记物用于前列腺癌诊断分级和良恶性预测，具体公开了含有ACSM1、AMACR等基因的上下游引物和探针的试剂盒，通过实时荧光定量PCR的方法，利用试剂盒中的引物和探针对待测尿液样品中的外泌体RN A进行检测，并利用内参基因对标志物的表达水平进行归一化，即根据检测生物标志物目标基因Ct值，并根据任一内参SLC25A或NKX3-1，计算ΔCt，使用逻辑回归模型得到判定分数；或在计算ΔCt之后，再结合tPSA数值，使用逻辑回归模型得到判定分数，根据判定分数和阈值判断受试者是否患有前列腺癌及确定前列腺癌的高低级别。该专利是基因层面出发，利用实时荧光定量PCR对尿液外泌体进行生物标记物检测，虽相较于侵入性筛查诊断前列腺癌的手段，提高了诊断效率，且可有效避免患者因进行穿刺活检所遭受的痛苦和可能的感染，但是实际上从尿液样本中提取外泌体RNA的操作难度大且耗时长，涉及步骤及后续数据处理过程专业且复杂、程序多，费用高，无法便于患者前期以及术后的日常筛查；此外，综上以上可以看出，目前从蛋白层面辅助前列腺癌症的诊断并进行试纸的开发未见有过报道。
发明内容
本发明的目的在于为解决上述技术问题而提供了一种基于ACSM1的前列腺癌辅助诊断检测试纸及其制备方法和应用。
本发明通过以下技术方案来实现上述目的：
作为本发明的第一个方面，提供了一种基于ACSM1的前列腺癌辅助诊断检测试纸，包括底板，及依次搭接在底板上的样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，其特征在于，所述结合垫为包被有鼠抗人IgG-胶体金复合物的胶体金垫，所述硝酸纤维素膜上设有由兔抗鼠IgG包被的质控线和ACSM1重组抗体包被的检测线。
作为本发明进一步的优化方案，所述ACSM1重组抗体的制备方法具体为：先根据ACSM1基因序列制备用于表达ACSM1蛋白的大肠杆菌重组菌，将重组菌进行发酵表达并离心获得菌体，对菌体超声破碎，离心后取上清液，将上清液过亲和层析柱纯化后获得ACSM1重组抗原，然后将ACSM1重组抗原注射至小鼠体内，激发其免疫系统产生抗体，免疫过程完成后，采集小鼠血清，将小鼠血清过蛋白A/G琼脂糖柱纯化后获得ACSM1重组抗体。
作为本发明进一步的优化方案，所述ACSM1基因序列如SEQ ID NO.1所示。
基于ACSM1的前列腺癌辅助诊断检测试纸检测前列腺癌症的步骤包括：
步骤一：将试纸平放，取待测新鲜尿液样品50-100μL，加入样品垫；
步骤二：室温静置15min后，判断：若质控线出现色线且检测线不出现色线，为阴性；若质控线和检测线都出现色线，为阳性。
作为本发明的第二个方面，还提供了一种如上述任一所述的基于ACSM1的前列腺癌辅助诊断检测试纸的制备方法，包括以下步骤：
(1)制备纯化的ACSM1重组抗体；
(2)制备硝酸纤维素膜：将兔抗鼠IgG和纯化的ACSM1重组抗体分别稀释后，包被在硝酸纤维素膜的质控线和检测线上；
(3)制备胶体金溶液；
(4)胶体金标记鼠抗人IgG：取鼠抗人IgG，将胶体金溶液与鼠抗人IgG混合，离心，用PBS溶液重悬沉淀，获得鼠抗人IgG-胶体金复合物；
(5)制备胶体金垫：将鼠抗人IgG-胶体金复合物均匀喷在结合垫上，充分干燥，获得胶体金垫；
(6)样品垫的处理：将样品垫浸泡在20mmol/L的PBS缓冲液中2-5小时，并且边震荡边混匀，其中缓冲液中加入活化剂，浸泡结束后，将样品垫放入烘箱中烘干；
(7)组装：在干燥环境下，将样品垫、胶体金垫、包被好的硝酸纤维素膜和吸水垫粘贴在底板上，裁切后，获得试纸。
作为本发明进一步的优化方案，所述步骤(2)中，兔抗鼠IgG和纯化的ACSM1重组抗体分别以50mmol/L的Tris缓冲液稀释至终浓度为1mg/ml，再以0.75μL/cm的喷量喷施包被在质控线和检测线上，充分干燥。
作为本发明进一步的优化方案，所述步骤(4)中，胶体金标记鼠抗人IgG的步骤包括：
(Ⅰ)取鼠抗人IgG溶于0.2ml 10mM的缓冲液中，将胶体金溶液的pH值调至7.2；
(Ⅱ)每20-50mg鼠抗人IgG中，加入10ml胶体金溶液；
(Ⅲ)混合3-5min后，加入质量分数为0.05％的BSA，室温作用结合15min；
(Ⅳ)先2000r/min低速离心15min，再12000r/min高速离心25min；
(Ⅴ)用100mmol/L的pH7.8的含0.2％质量分数Proclin300的缓冲液重悬沉淀，获得鼠抗人IgG-胶体金复合物。
作为本发明进一步的优化方案，所述鼠抗人IgG-胶体金复合物在结合垫上的喷洒量为10μL/cm。
本发明具有如下有益效果：
(1)本发明从蛋白层面出发并开发了基于ACSM1的前列腺癌辅助诊断检测试纸，该试纸可通过是否检测出患者尿液样品中的ACSM1，将前列腺癌症同前列腺增生或其他前列腺疾病相区分，患者在具有前列腺相关疾病不适症状时可先使用该试纸条进行自测再结合相关前列腺疾病或癌症的诊断方法进行确定，协助前列腺癌的诊断，可在一定程度上避免不必要的诊断流程，提高诊断的针对性，从而有助于诊断效率的提升；
(2)本发明开发的基于ACSM1的前列腺癌辅助诊断检测试纸可方便前列腺癌术后或保守治疗后患者的自测、以及前列腺癌治疗后的疗效判断及用药指导，通过是否检测出患者尿液中的ACSM1指示患者术后恢复及化疗效果以及及时监控并排除癌症复发风险。
(3)本发明相较于侵入性筛查诊断前列腺癌以及现有技术中公开的从基因层面出发利用生物标志物进行实时荧光定量PCR技术诊断的手段而言，操作难度小，费用成本低，具有良好的应用前景。
附图说明
图1A为本发明实施例1提供的以PCR方法检测血液中ACSM1的mRNA浓度；
图1B为本发明实施例1提供的以PCR方法检测血液中ACSM1的电泳图(图中：1为前列腺癌术后3个月组；2为前列腺癌症组；3、前列腺增生组；CK为阴性对照组)；
图2A为本发明实施例2提供的酶联免疫吸附法检测血液样品中ACSM1的蛋白浓度；
图2B为本发明实施例2提供的酶联免疫吸附法检测尿液样品中ACSM1的蛋白浓度；
图3为本发明实施例3提供的免疫组化实验结果(图中，A为患有前列腺癌的前列腺组织切片；B为正常的前列腺组织切片；C为患有前列腺增生的前列腺组织切片)；
图4为本发明实施例4提供的基于ACSM1的前列腺癌检测试纸的整体结构示意图；
图中，1为底板；2、硝酸纤维素膜；3、样品垫；4、结合垫；5、吸水垫。
具体实施方式
下面结合附图对本申请作进一步详细描述，有必要在此指出的是，以下具体实施方式只用于对本申请进行进一步的说明，不能理解为对本申请保护范围的限制，该领域的技术人员可以根据上述申请内容对本申请作出一些非本质的改进和调整。
一、试剂及方法
以下实施例中所用方法如无特别说明均为本领域的技术人员所知晓的常规方法，未注明具体条件者，按照常规条件或者制造商建议的条件进行。
所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
二、研究对象及分组
将20名确诊前列腺增生患者作为前列腺增生组，将20名确诊前列腺癌症患者作为前列腺癌症组，将10名确诊前列腺癌症并经手术后3个月的患者作为前列腺癌术后组，进行后续实验。
三、方法
实施例1基于PCR技术的检测
1、血液样品采集及处理
用EDTA抗凝管采集各组患者的血液5ml，并密封盖好。采集后及时送检，室温下保存时间不应超过2小时。直接取新鲜的血液2ml，加入3倍体积红细胞裂解液，混匀后室温放置10min，10000rpm离心1min。弃上清，收集白细胞沉淀。向沉淀中孔加入2ml RNAsio Plus，轻轻摇晃使RNAsio Plus与细胞全面充分接触，室温放置5分钟后转移至1.5ml离心管中。每管加入0.2ml氯仿，上下翻转15秒使其混匀，室温静置2～3分钟。然后4度，12000g离心15分钟，轻轻将上层水相转移至另一离心管中，上层水相加入0.5ml的异丙醇，上下翻转15秒使其混匀，室温静置10分钟。4度，12000g离心10分钟，弃上清，沉淀用1ml的75％乙醇轻轻吹打重悬。4度，7500g离心5分钟，弃上清，将离心管管口打开置于通风橱内室温敞口干燥约30分钟，然后，加适量无RNase水溶解沉淀。紫外分光光度计测量好浓度放入-80度冰箱，保存。
逆转录：按照逆转录试剂盒说明书配置反应体系，PCR仪设置的反转录反应条件为：①37度，15分钟；②85度，5秒；③4度暂存。
2、引物设计
从GENBANK(https://www.ncbi.nlm.nih.gov)获取ACSM1基因序列(GENBANK基因登录号：116285)如SEQ ID NO.1所示，通过Primer Premier 6.0软件对ACSM1基因序列设计PCR引物。上下游引物序列分别为：
SEQ ID NO.2：MF：5'-tggtggctggtggctgtg-3'；
SEQ ID NO.3：MR：5'-tctgaggcaagggcatctatgg-3'；
引物序列于生工生物基因公司合成。
3、PCR扩增
按照RT-QPCR试剂盒说明书配置反应体混合液，然后加入8联管，2000g离心2分钟，把液体气泡去除后置于罗氏LightCycler 96实时荧光定量PCR仪进行反应。反应参数如下：①95度，30秒；②95度，10分钟；③56度，20秒；72度，34秒；③重复40个循环；溶解参数如下：①95度，15秒；②60度，60秒；③95度，15秒。
反应结束后在LightCycler96软件上，查看各组ACSM1基因的扩增情况，导出ct值，重复组内ct值差1以内计入统计，导出CT值计算相对量采用2-ΔΔCt方法，ΔCt目的基因＝Ct目的基因-Ct同一样本β-actin，ΔΔCt目的基因＝ΔCt处理组目的基因-ΔCt对照组目的基因。
结果如图1A所示，从图中可以看出，血液中前列腺癌症组ACSM1的mRNA的浓度显著高于前列腺增生症及前列腺癌术后3个月组，且血液中前列腺癌术后3个月组的ACSM1基因表达水平显著低于前列腺增生和前列腺癌组。
另外，PCR扩增反应结束后对扩增产物进行了电泳检测，结果如图1B所示，从图中可以看出，检测前列腺癌术后3个月组、前列腺癌症组及前列腺增生组血液中ACSM1的mR NA均有明显的条带显示。
实施例2基于酶联免疫吸附法(ELISA)检测各组血液及尿液样品中ACSM1的浓度
取上海酶联生物ELISA试剂盒，根据所需检测尿液样品的数量及血液样品的数量确定抗体包被微孔板的所需数量，取出包被条使用记号笔在抗体包被微孔板上设置所需数量的标准孔、样品孔和空白孔(若试剂盒在4℃冰箱中保存，使用前需提前取出室温解冻)。
按照试剂盒的说明书配制标准品，在标准孔中加入配制好的梯度标准品50ul。在样品孔中先加入待测新鲜尿液样品10ul或血液样品10ul，然后，再加入样品稀释液40ul，空白孔不操作。
在标准孔和样品孔的每个孔中加入HRP标记的酰基辅酶A合成酶中链家族成员抗体试剂100ul，然后用封板膜封好，于37℃恒温箱内孵育1小时。弃去反应孔内液体，在吸水纸上拍干板条，每孔加满洗涤液后静置30秒，甩掉反应孔内液体，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次。每个反应孔内加入显色剂A、B液各50ul，37℃温箱内避光孵育15分钟。每个反应孔加入终止液50ul，然后酶标仪测量450nm波长处各孔的OD值。导出数据在Excel表内绘制标准曲线，根据公式计算ACSM1的实际浓度。
如图2A所示，前列腺癌症组的患者血液样品中ACSM1的mRNA的浓度高于前列腺增生组，也明显高于前列腺癌术后3个月组，前列腺癌术后3个月组浓度最低，前列腺癌术后3个月组与前列腺增生组的浓度差异较小。
如图2B所示，前列腺癌症组的患者尿液样品中ACSM1蛋白的平均浓度为29.51±1.96×2.59pg/ml，高于前列腺增生组，也明显高于前列腺癌术后3个月组，前列腺增生组浓度最低，且显著低于前列腺术后3个月组。
实施例3免疫组化实验
选取前列腺癌症组的患者的前列腺组织切片作为实验组，选取正常未癌变的前列腺组织切片作为对照组。对两组前列腺组织切片进行免疫组化实验，步骤如下：
将两组的前列腺组织切片按照4微米厚度连续切片，48度蒸馏水摊片，60度烤片2h。经二甲苯I10分钟→二甲苯II 10分钟→二甲苯Ⅲ10分钟→二甲苯Ⅳ10分钟→无水乙醇I 5分钟→无水乙醇II 5分钟→无水乙醇Ⅲ5分钟→无水乙醇Ⅳ5分钟→95％乙醇5分钟→80％乙醇5分钟后蒸馏水冲洗2次，每次5分钟。将切片放入1xEDTA修复液(30ml原液：1500ml蒸馏水)中，于电磁炉加热进行抗原修复，电磁炉加热高压锅喷气后计算时间，3min后停止加热，冷修复结束后，室温使其自然冷却。PBS洗3次，每次各5分钟。组化笔画圈后滴加内源性过氧化物阻断酶封闭10分钟，PBS洗3次，每次各5分钟。滴加ACSM1抗体稀释液(稀释液为蒸馏水或PBS液，1:100)后，将玻片置于湿盒中，37℃孵育1小时，PBS洗3次，每次各5分钟；滴加100uL二抗，37℃孵育20min，PBS冲洗3次，每次各5分钟；滴加200uL DAB显色液，室温显色5-10min，自来水冲洗；在玻片上滴加苏木素染液染色10-20s(根据温度调整)，流水冲洗3分钟。浸入分化液3s，温水反蓝3min，流水冲洗10分钟。经95％无水乙醇5分钟→100％无水乙醇I 5分钟→100％无水乙醇II 5分钟→100％无水乙醇Ⅲ5分钟→二甲苯I10分钟→二甲苯II 10分钟。然后利用中性树胶封片后加盖玻片，通风橱内室温自然晾干。
免疫组化实验结果如图3所示，从图中可以看出，在前列腺癌患者的前列腺组织切片中ASCM1呈弥漫强阳性，而在正常的前列腺组织切片及患有前列腺增生的前列腺组织切片中，ASCM1抗原未见表达或低表达，即表明在前列腺癌患者的前列腺组织切片中，ASCM1的表达高于正常的前列腺组织切片，也高于前列腺增生组。
实施例4基于试纸条的检测
1、制备试纸
1.1、纯化的ACSM1重组抗原、抗体
从GENBANK(https://www.ncbi.nlm.nih.gov)获取ACSM1基因序列，送华大基因公司制备表达ACSM1蛋白的大肠杆菌重组菌，将重组菌发酵表达并离心获得菌体，将菌体破碎充分，离心取上清，将上清过亲合层析柱，即为纯化的ACSM1重组抗原。
将纯化的ACSM1重组抗原注射至小鼠体内，激发其免疫系统产生抗体，免疫过程完成后，采集小鼠血清，将小鼠血清过蛋白A/G琼脂糖柱，使抗体从其他血清成分中分离和纯化，即获得纯化的ACSM1重组抗体。
1.2、制备硝酸纤维素膜2
将兔抗鼠IgG和纯化的ACSM1重组抗体分别以50mmol/L的Tris缓冲液(缓冲液中含有0.9％NaCl，Tween20和pc300)稀释至终浓度为1mg/ml，然后分别均匀喷在硝酸纤维素膜2上的质控线C和检测线T，喷量均为0.75μL/cm，充分干燥。
1.3、胶体金溶液的制备
采用柠檬酸三钠还原法，制备20-40nm胶体金，具体操作方法如下：
(1)取质量分数为0.01％的HAuCl4水溶液100ml，加热煮沸；
(2)迅速加入质量分数为4％的柠檬酸三钠水溶液1ml，继续煮沸约5min；
(3)制成粒径20-40nm金颗粒后，观察淡黄色的氯金酸水溶液在柠檬酸三钠加入后很快变成灰色，继而变成黑色，随后稳定成酒红色；
(4)冷却至室温后4℃避光保存。
1.4、制备胶体金标鼠抗人IgG
(1)取高纯度鼠抗人IgG溶于0.2ml的10nM的Tris缓冲液中，将胶体金溶液的pH值调至7.2；
(2)按以下组合将鼠抗人IgG与胶体金混合：每30mg鼠抗人IgG加入10ml 40nm胶体金溶液；
(3)混合3-5min后，加入质量分数为0.05％的BSA，室温作用结合15min；
(4)先2000r/min低速离心15min，再12000r/min高速离心25min；
(5)用100mmol/L的pH7.8的含0.2％质量分数Proclin300的Tris缓冲液重悬沉淀，获得鼠抗人IgG-胶体金复合物；
1.5、制备结合垫4
将上述制备的鼠抗人IgG-胶体金复合物按照10μL/cm的喷量均匀喷在玻璃纤维素膜上，充分干燥获得胶体金垫，即结合垫4。
1.6、样品垫3的处理
为提高检测的准确度和稳定性，使检测样品时的C线和T线颜色更加均一，将样品垫3进行处理，具体处理方式为，将样品垫3浸泡在20mmol/L的PBS缓冲液中2-5小时，振荡混匀，其中缓冲液中加入1％的PEG8000。浸泡结束后，将样品垫3放入烘箱中烘干，烘干温度为37℃，时间为14小时。
1.7、试纸的组装
在底板1(在本实施例中，底板1的材质为PVC)中央粘贴步骤1.2包被好的硝酸纤维素膜2，硝酸纤维素膜2上缘粘贴吸水垫5，下缘粘贴步骤1.5制得的胶体金垫4，胶体金垫4的下缘粘贴步骤1.6处理后的样品垫2，各组分相互叠加部分为1-2mm，完成后用裁切机均匀切割成等宽的试纸条，试纸条的结构如图4所示。将切好的试纸条装入成品外壳中，再将试纸条和干燥剂密封于铝箔袋中，完成产品的组装。
2、试纸检测
利用试纸检测各组患者新鲜尿液样品中的ACSM1，具体的操作步骤包括：将试纸条平放于桌面上，将各组患者的新鲜尿液样品作为待检样品，同时取正常人的新鲜尿液样品作为空白对照。分别取检测样品和空白对照50-100μL，加入样品垫2，室温静置15min，根据质控线和检测线的颜色读取结果：若质控线出现色线且检测线不出现色线，为阴性；若质控线和检测线都出现色线，为阳性。结果如表1所示。
表1检测结果表
从表1中可以看出，前列腺癌症组检测呈阳性，且色线较深，前列腺增生组检测呈阴性，前列腺癌术后3个月组检测呈阴性。可见，本申请制备的胶体金试纸一方面可通过是否检测出患者尿液样品中的ACSM1，将前列腺癌症同前列腺增生或其他前列腺疾病相区分，可在一定程度上避免不必要的诊断流程，提高诊断的针对性，从而有助于诊断效率的提升；另外一方面，前列腺癌术后患者使用该试纸可指示术后恢复及化疗效果以及及时监控并排除癌症复发风险。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。

Claims (7)

1.一种基于ACSM1的前列腺癌辅助诊断检测试纸，包括底板，及依次搭接在底板上的样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，其特征在于，所述结合垫为包被有鼠抗人IgG-胶体金复合物的胶体金垫，所述硝酸纤维素膜上设有由兔抗鼠IgG包被的质控线和ACSM1重组抗体包被的检测线。
2.根据权利要求1所述的一种基于ACSM1的前列腺癌辅助诊断检测试纸，其特征在于，所述ACSM1重组抗体的制备方法具体为：先根据ACSM1基因序列制备用于表达ACSM1蛋白的大肠杆菌重组菌，将重组菌进行发酵表达并离心获得菌体，对菌体超声破碎，离心后取上清液，将上清液过亲和层析柱纯化后获得ACSM1重组抗原，然后将ACS M1重组抗原注射至小鼠体内，激发其免疫系统产生抗体，免疫过程完成后，采集小鼠血清，将小鼠血清过蛋白A/G琼脂糖柱纯化后获得ACSM1重组抗体。
3.根据权利要求2所述的一种基于ACSM1的前列腺癌辅助诊断检测试纸，其特征在于，所述ACSM1基因序列如SEQ ID NO.1所示。
4.一种如权利要求1-3任一所述的基于ACSM1的前列腺癌辅助诊断检测的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)制备纯化的ACSM1重组抗体；
(2)制备硝酸纤维素膜：将兔抗鼠IgG和纯化的ACSM1重组抗体分别稀释后，包被在硝酸纤维素膜的质控线和检测线上；
(3)制备胶体金溶液；
(4)胶体金标记鼠抗人IgG：取鼠抗人IgG，将胶体金溶液与鼠抗人IgG混合，离心，用PBS溶液重悬沉淀，获得鼠抗人IgG-胶体金复合物；
(5)制备胶体金垫：将鼠抗人IgG-胶体金复合物均匀喷在结合垫上，充分干燥，获得胶体金垫；
(6)样品垫的处理：将样品垫浸泡在20mmol/L的PBS缓冲液中2-5小时，并且边震荡边混匀，其中缓冲液中加入活化剂，浸泡结束后，将样品垫放入烘箱中烘干；
(7)组装：在干燥环境下，将样品垫、胶体金垫、包被好的硝酸纤维素膜和吸水垫粘贴在底板上，裁切后，获得试纸。
5.根据权利要求4所述的一种基于ACSM1的前列腺癌辅助诊断检测试纸的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中，兔抗鼠IgG和纯化的ACSM1重组抗体分别以50mmol/L的Tris缓冲液稀释至终浓度为1mg/ml，再以0.75μL/cm的喷量喷施包被在质控线和检测线上，充分干燥。
6.根据权利要求4所述的一种基于ACSM1的前列腺癌辅助诊断检测试纸的制备方法，其特征在于，所述步骤(4)中，胶体金标记鼠抗人IgG的步骤包括：
(Ⅰ)取鼠抗人IgG溶于0.2ml 10mM的缓冲液中，将胶体金溶液的pH值调至7.2；
(Ⅱ)每20-50mg鼠抗人IgG中，加入10ml胶体金溶液；
(Ⅲ)混合3-5min后，加入质量分数为0.05％的BSA，室温作用结合15min；
(Ⅳ)先2000r/min低速离心15min，再12000r/min高速离心25min；
(Ⅴ)用100mmol/L的pH7.8的含0.2％质量分数Proclin300的缓冲液重悬沉淀，获得鼠抗人IgG-胶体金复合物。
7.根据权利要求4所述的一种基于ACSM1的前列腺癌辅助诊断检测试纸的制备方法，其特征在于，所述鼠抗人IgG-胶体金复合物在结合垫上的喷洒量为10μL/cm。
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Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
RAJ SHRESTHA ET AL.: ""ACSM1 and ACSM3 regulate prostate cancer fatty acid metabolism to promote tumour growth and constrain ferroptosis"", BIORXIV, no. 2022, 14 October 2022 (2022-10-14), pages 1 - 65 *

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