CN118067996B

CN118067996B - 一种PDK1 Nedd8修饰的结直肠癌标志物及应用

Info

Publication number: CN118067996B
Application number: CN202410458412.3A
Authority: CN
Inventors: 张令强; 彭志强; 方威; 李少华
Original assignee: Academy of Military Medical Sciences AMMS of PLA
Current assignee: Academy of Military Medical Sciences AMMS of PLA
Priority date: 2024-04-17
Filing date: 2024-04-17
Publication date: 2024-10-01
Anticipated expiration: 2044-04-17
Also published as: CN118067996A

Abstract

本发明公开了一种PDK1 Nedd8修饰的结直肠癌标志物及应用。本发明提供了PDK1蛋白K163位点的Nedd8修饰作为标志物在制备用于评判结直肠癌诊断产品中的应用，以及在制备用于预测结直肠癌预后的产品中的应用。本发明还制备了PDK1 Nedd8修饰抗体，其可以特异性识别PDK1 K163位点的Nedd8修饰，PDK1 Nedd8修饰程度越高，患者预后越差。本发明对结直肠癌诊断、预测预后情况及为个体患者提供辅助治疗方案具有重要的临床意义。

Description

一种PDK1 Nedd8修饰的结直肠癌标志物及应用

技术领域

本发明涉及肿瘤分子生物学领域，具体涉及一种PDK1 Nedd8修饰的结直肠癌标志物及应用。

背景技术

结直肠癌是世界范围内第三大常见的恶性肿瘤，也是最常见恶性肿瘤之一。早期结直肠癌可无症状，主要通过肠镜筛查发现。近年来，在结直肠癌的预防、诊断及治疗方面取得了很大的进展，仍约三分之一的患者明确诊断时已处于进展期，超过半数的病患不可避免地会复发和转移，预后不容乐观。因此及时发现可治愈的癌前病变或早期癌具有相当重要的临床意义。

近些年来，分子生物学的发展为临床早期诊断结直肠癌提供了分子手段。相对敏感、特异、有效的非侵入性检查，例如基因检测、酶标志物检测等将在结直肠癌的早期诊断及筛查中发挥越来越重要的作用, 并将为结直肠癌的诊断甚至治疗提供新的策略和思路。在结直肠癌中，PI3K/AKT通路异常激活，该通路的激活往往导致肿瘤的进展、不良预后及治疗抵抗等，但是相关基因在基因组的突变与该通路的激活并没有明显的相关性。AKT的磷酸化修饰水平的高低则代表了该通路的激活情况，其中第308位的苏氨酸的磷酸化修饰启动了AKT的激酶活性，而介导该位点磷酸化修饰的激酶是PDK1，这也是目前被报道AKT的T308位点唯一的激酶。PDK1先前被认为是组成型激活的激酶，但是随着研究发现，其活性在细胞中受到严格的调控，但是背后的调控机制尚不清楚。

发展新型结直肠癌标志物作为预后指标与新型治疗靶点一直是当前的研究热点。由于早期结直肠癌没有明显的临床表现，发病早期与其他肠道疾病症状极为相似，再加上有其他疾病的干扰，例如糖尿病等，这些都增加了临床对于结直肠癌诊断与治疗的难度。而且发现时，患者往往已经处于中晚期且难以实现切除手术，即使进行了手术，术后状态也严重影响患者身心和生活质量。结直肠癌的周边问题已经成为严重的社会医疗问题，因而针对结直肠癌前病变和早期癌的诊断至关重要且迫在眉睫。因此，早期诊断和预测结直肠癌预后是该领域急需解决的临床实际问题。肿瘤标志物的发现和合理应用是肿瘤预测预后和辅助治疗的前提。因此对于找出更好的结直肠癌诊断和预测预后分子标志物，将为结直肠癌的分子靶向治疗提供了重要的理论依据。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供一种结直肠癌标志物，该标志物位于PDK1蛋白的K163位点，PDK1蛋白如SEQ ID NO:1所示。另外提供上述结直肠癌标志物在预测结直肠癌预后的产品中的应用。

为实现上述发明目的，本发明提供的技术方案为：

本发明的技术方案包括提供一种结直肠癌标志物，其包含人源PDK1蛋白K163位点。优选的，标志物为SYAKNGELLK序列，其中人源PDK1蛋白K163位点上进行修饰；优选的，在位点上进行肽端修饰，进一步的，修饰为第163位赖氨酸上连接LRGG肽段，优选的，修饰肽端C端为甘氨酸，其与第163位赖氨酸共价连接。进一步优选的，修饰肽为LRGG。

本发明的技术方案包括提供一种抗原标志物，抗原标志物为多肽，其序列为SYAK（LRGG）NGELLK，其中LRGG肽端中的甘氨酸与赖氨酸共价连接。

还提供一种抗原标志物，其序列如下式（I）所示：

式（I）。

本发明的技术方案是提供如上所示抗原标志物或结直肠癌标志物筛选的抗体，抗体可以是多克隆抗体、单克隆抗体、多聚体抗体和CDR移植抗体，能够与特异性抗原结合的免疫球蛋白分子。还可以是Fab抗体、Fv抗体、单域抗体、纳米抗体和VHH抗体或单链抗体。

本发明的另一个技术方案是提供如上所示抗原标志物或结直肠癌标志物在制备用于评判结直肠癌分级分期的产品中的应用。

本发明的另一个技术方案是提供用于检测PDK1蛋白K163位点的Nedd8修饰的物质在制备用于评判结直肠癌分级分期的产品中的应用；

所述用于检测P DK1蛋白K163位点的Nedd8修饰的物质为能够与SEQ ID No.2所示肽段特异性结合的物质或与式（I）所示肽段特异性结合的物质。优选的，所述物质为抗体，更优选的，抗体可以是多克隆抗体、单克隆抗体、多聚体抗体和CDR移植抗体以及能够与特异性抗原结合的免疫球蛋白分子。还可以是Fab抗体、Fv抗体、单域抗体、纳米抗体和VHH抗体或单链抗体，上述抗体可以是上述表述中的抗体之一或多种组合。

本发明的另一个技术方案是提供用于检测PDK1蛋白K163位点的Nedd8修饰的物质在制备用于预测结直肠癌预后的产品中的应用；用于检测PDK1蛋白K163位点的Nedd8修饰的物质是如上所示抗原标志物或结直肠癌标志物。

所述用于检测PDK1蛋白K163位点的Nedd8修饰的物质为能够与SEQ ID No.2所示肽段特异性结合的物质或与式（I）所示肽段特异性结合的物质。

优选的，所述能够与SEQ ID No.2或式（I）所示肽段特异性结合的物质为抗SEQ IDNo.2或抗式（I）所示肽段的抗体。

优选的，抗体为以SEQ ID No.2所示肽段或式（I）所示肽段作为免疫原免疫动物所得的多克隆抗体或抗血清。

本发明的另一个技术方案是如上筛选的抗体在结直肠癌诊断或预后评估中的非治疗诊断目的的应用。

本发明的另一个技术方案是上述任一抗原标志物或结直肠癌标志物在结直肠癌诊断或预后评估中的非治疗诊断目的的应用；或，上述任一抗原标志物或结直肠癌标志物在制备结直肠癌诊断或预后评估产品、药物、试剂或试剂盒中的应用。

本发明的另一个技术方案是提供PDK1蛋白K163位点的Nedd8修饰作为标志物在制备用于评判结直肠癌分期的产品中的应用。优选的，结直肠癌分期是早期分期。优选的，PDK1蛋白K163位点的Nedd8修饰是如SEQ ID NO:2所示的肽段，或如式（I）所示的肽段。

本发明的另一个技术方案是提供PDK1蛋白K163位点的Nedd8修饰作为标志物在制备用于预测结直肠癌预后的产品中的应用。PDK1蛋白K163位点的Nedd8修饰是如SEQ IDNO:2所示的肽段，或如式（I）所示的肽段。

本发明的另一个技术方案是提供用于检测PDK1蛋白K163位点的Nedd8修饰的物质在制备用于评判结直肠癌分期的产品中的应用。优选的，结直肠癌分期是早期分期，优选的，所述分期为TNM分期。PDK1蛋白K163位点的Nedd8修饰是如SEQ ID NO:2所示的肽段，或如式（I）所示的肽段。上述所述物质是抗体。

本发明的另一个技术方案是提供用于检测PDK1蛋白K163位点的Nedd8修饰的物质在制备用于预测结直肠癌预后的产品中的应用。PDK1蛋白K163位点的Nedd8修饰是如SEQID NO:2所示的肽段，或如式（I）所示的肽段。上述所述物质是抗体。

本发明的另一个技术方案是要求保护SEQ ID No.2所示肽段或如式（I）所示的肽段。

本发明的另一个技术方案是要求保护能够与SEQ ID No.2所示肽段特异性结合的物质。

进一步地，所述能够与SEQ ID No.2所示肽段特异性结合的物质可为抗SEQ IDNo.2所示肽段的抗体；

更进一步地，所述抗体具体可为以SEQ ID No.2所示肽段作为免疫原免疫动物所得的多克隆抗体或抗血清。

本发明的另一个技术方案是要求保护如下任一中的应用：

（A1）SEQ ID No.2所示肽段在制备上述方案任一所述能够与SEQ ID No.2所示肽段或如式（I）所示的肽段特异性结合的物质中的应用；

（A2）上述方案任一所述能够与SEQ ID No.2所示肽段或如式（I）所示的肽段特异性结合的物质在制备用于检测PDK1蛋白K163位点的Nedd8修饰的产品中的应用。

在上述各技术方案中，所述分期为TNM分期。

在上述各技术方案中，PDK1蛋白K163位点的Nedd8修饰水平在结直肠癌患者肿瘤TNM分期的I期就明显升高；PDK1蛋白K163位点的Nedd8修饰程度越高，患者预后越差。

本发明的另一个技术方案是要求保护PDK1蛋白K163位点的Nedd8修饰作为靶点在筛选或制备结直肠癌靶向药物中的应用。

其中，所述结直肠癌靶向药物如结直肠癌分子靶向药物。

在上述各方案中，所述PDK1蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

在上述各方案中，所述PDK1蛋白K163位点的Nedd8修饰是指所述PDK1蛋白的第163位赖氨酸上共价结合Nedd8蛋白羧基末端后的一种翻译后修饰。

在上述各方案中，如SEQ ID NO:2所示的肽段还可以是与SEQ ID NO:2具有至少85%同一性的氨基酸序列，”还可以为85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%、99.9%的同一性。

在上述各方案中，修饰肽段还可以是LRGG肽段的变体，将其进行一个氨基酸的替换，所述替换不包括羧基端的甘氨酸。修饰肽段的变体同样具有Nedd8的类似结合PDK1蛋白的功能，结合位点包含K163位点。

定义

在本文中，术语“包含”或“包括”为开放式表达，即包括本发明所指明的内容，但并不排除其他方面的内容。

在本文中，术语“任选地”、“任选的”或“任选”通常是指随后所述的事件或状况可以但未必发生，并且该描述包括其中发生该事件或状况的情况，以及其中未发生该事件或状况的情况。

在本文中，术语“抗体”通常是指可识别一种或多种抗原表位的抗体，包括但不限于单抗、多抗、多聚体抗体和CDR移植抗体，是能够与特异性抗原结合的免疫球蛋白分子。

在本文中，术语“单域抗体”、“纳米抗体”和“VHH抗体”可互换使用，其最初被描述为“重链抗体”（即“缺乏轻链的抗体”）的抗原结合免疫球蛋白（可变）域(Hamers-CastermanC ,AtarhouchT ,Muyldermans S ,Robinson G ,Hamers C ,Songa EB,Bendahman N ,Hamers R .:“Naturallyoccurring antibodies devoid of light chains”；Nature 363,446-448(1993))，只包含重链可变区（VH）和常规的CH2与CH3区，其通过重链可变区与抗原特异性结合。

在本文中，术语“单链抗体”通常是指由重链可变区（VH）和轻链可变区（VL）通过连接肽连接而成的抗体。

在本文中，术语“同一性”、“同源性”或“相似相”均用于描述相对于参考序列的氨基酸序列或核酸序列时，采用通过常规的方法进行确定两个氨基酸序列或核酸序列之间的相同氨基酸或核苷酸的百分比，例如参见，Ausubel等，编著(1995)，Current Protocols inMolecular Biology，第19章(Greene Publishing and Wiley-Interscience，New York)；和 ALIGN程序 (Dayhoff(1978)，Atlas of Protein Sequence and Structure 5：Suppl.3(National Biomedical Research Foundation，Washington，D.C.)。关于比对序列和测定序列同一性有很多算法，包括，Needleman等(1970)J.Mol.Biol.48：443的同源性比对算法；Smith等(1981)Adv.Appl.Math.2：482的局部同源性算法；Pearson等(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.85：2444的相似性搜索方法；Smith-Waterman 算法(Meth.Mol.Biol.70：173-187(1997)；和 BLASTP，BLASTN，和BLASTX算法(参见Altschul等(1990)J.Mol.Biol.215：403-410)。利用这些算法的计算机程序也是可获得的，并且包括但不限于：ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件，或者 WU-BLAST-2(Altschul 等，Meth.Enzym.，266：460-480(1996))；或者 GAP，BESTFIT，BLAST Altschul等，上文，FASTA，和TFASTA，在Genetics Computing Group(GCG)包，8版，Madison，Wisconsin，USA中可获得；和Intelligenetics，Mountain View，California提供的PC/Gene程序中的CLUSTAL。

在本文中，术语“至少85%同一性”指与各参考序列至少为85%，可为85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%、99.9%的同一性。

如本文中使用的，“结合”，“特异性结合”的抗体或“抗抗原抗体”指以KD值为1.0×10^-8mol/L或更低。结合亲和力是用标准结合测定法测定的。

本发明至少包括以下有益效果：本发明以PDK1 Nedd8共价修饰作为标志物用于结直肠癌早期诊断的靶标，PDK1 Nedd8修饰抗体可以特异性识别PDK1 K163位点的Nedd8修饰，PDK1 Nedd8修饰程度越高，患者预后越差，这将为深入研究和大规模验证PDK1 Nedd8修饰与结直肠癌的相关性，对结直肠癌预测预后情况及为个体患者提供辅助治疗方案具有重要的临床意义。

附图说明

此处所说明的附图用来提供对本发明实施例的进一步理解，构成本申请的一部分，并不构成对本发明实施例的限定。在附图中：

图1为实施例中制备靶向PDK1蛋白K163位点的Nedd8修饰抗体的部分结果示意图。其中，A为制备抗体所使用的抗原多肽；B为合成用于制备抗体所用修饰肽段和非修饰肽段的质谱鉴定结果；C为Dot blot实验检测PDK1蛋白K163位点的Nedd8修饰抗体与抗原肽的结合结果； D为western blot检测 Nedd8修饰激活酶抑制剂MLN4924阻断HCT-116细胞中PDK1K163位点Nedd8修饰的抗体特异性评价结果；E为western blot检测敲除Nedd8修饰激活酶和结合酶后HCT-116细胞中PDK1 K163位点Nedd8修饰的抗体特异性评价结果；F为westernblot检测PDK1 K163R突变HCT-116细胞中PDK1 K163位点Nedd8修饰的抗体特异性评价结果。

图2为实施例中PDK1蛋白K163位点的Nedd8修饰抗体检测PDK1蛋白K163位点的Nedd8修饰作为结直肠癌患者诊断和预后的新型标志物的部分结果示意图。其中A为免疫组化检测结直肠癌患者癌和癌旁组织中PDK1 K163位点Nedd8修饰水平的结果；B为PDK1 K163位点Nedd8修饰程度和结直肠癌患者预后的K-M曲线分析结果；C为正常组织和TNM分期1期癌组织中PDK1 K163位点Nedd8修饰程度的着色统计图；D为TNM分期1期患者配对的癌旁组织和癌组织中PDK1 K163位点Nedd8修饰程度的着色统计图。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

以下实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下面结合附图通过实施例来对本发明进行详细说明，但并不是对本发明的限制，仅作为示例说明。

本发明研究发现结直肠癌组织样本中PDK1蛋白的K163位点存在Nedd8修饰。其中，PDK1蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

本发明使用PDK1蛋白K163位点的Nedd8修饰抗体，分析比较结直肠癌组织样本与正常对照样本中PDK1蛋白K163位点的Nedd8修饰程度。

本发明的部分实验结果首先特异性靶向PDK1蛋白K163位点的Nedd8修饰抗原决定簇设计合成肽段，然后免疫兔子4次（分别在第1天，第21天，第28天和第35天），取血4次（第45天取30ml，第50天、第65天和第70天取20ml）进行血清筛选检测（ELISA/Dot blot），采血进行抗血清纯化，western blot鉴定。

本发明使用PDK1蛋白K163位点的Nedd8修饰抗体在含有100多对结直肠癌患者癌组织和癌旁组织标本切片的肿瘤芯片上进行免疫组化，肿瘤芯片来自协和肿瘤医院，分析PDK1 蛋白K163位点的Nedd8修饰程度在结直肠癌患者癌组织和癌旁组织中的表达情况，分析PDK1蛋白K163位点的Nedd8修饰程度与结直肠癌患者预后的相关性，提示PDK1蛋白K163位点的Nedd8修饰程度可以作为结直肠癌新的预后标志物。

在TNM分期I期患者中的差异表达分析结果显示：PDK1蛋白K163位点的Nedd8修饰在早期患者的癌组织中100%升高，提示PDK1蛋白K163位点的Nedd8修饰可以作为新的结直肠癌早期诊断分子标志物。

实施例1、设计和制备靶向PDK1蛋白K163位点的Nedd8修饰抗体

一、材料和方法

1、材料

生理盐水，弗氏完全佐剂，弗氏不完全佐剂，健康的6周大小的新西兰大白兔两只（约2Kg），蛋白多肽。

2、方法

（1）根据Nedd8共价结合PDK1蛋白K163位点设计肽段进行合成，肽段序列为SYA-(LRGG)K-NGELLK（SEQ ID No.2，括号内肽段序列为第4位赖氨酸上的修饰基团序列），此肽段靶向PDK1蛋白K163位点共价结合Nedd8的序列。此肽段作为制备抗体的免疫原，检测抗体效价的抗原。

（2）挑选健康的6周大小的新西兰大白兔两只，使其适应新的生活环境，稳定几天再进行首次取血作为阴性对照；

（3）用生理盐水稀释免疫原，然后与相应的佐剂进行1:1体积混合，抗原和佐剂完全混合形成稳定的乳剂，将该乳剂在兔子双肩周围的皮肤下进行皮下注射和后大腿进行肌肉注射。每个区域大约用1/4的免疫原。初次免疫400μg抗原，使用弗氏完全佐剂，后续免疫加强为每次100µg，使用弗氏不完全佐剂，注射体积1ml/只。

（4）取血：家兔仰卧于兔架上固定头部，用纱布固定四肢，头部略放低以暴露颈部。剃毛并消毒皮肤；沿颈部中线用手术刀切开皮肤约10cm，分离皮下结缔组织，直至暴露出气管两侧的胸锁乳突肌；用直头止血钳分离胸锁乳突肌与气管间的颈三角区疏松组织，暴露出颈总动脉后用弯头眼科镊使之游离，剥离神经和结缔组织；于动脉下套入两根黑丝线，分别置于远心及近心端。结扎远心端的丝线。近心端的动脉用血管夹夹住；用小拇指垫在血管下，用尖头眼科手术剪在两根丝线间的动脉璧上剪一小口，插入塑料放血管。再将近心端的丝线结扎固定于放血管上，以防放血管滑脱；松开止血钳，使血液流入容器中。一般一只家兔可放血100-120ml。

（5）血清的分离：用三角瓶或平皿盛血，将器皿倾斜放置于37℃烘箱2小时，转移到4℃沉淀过夜，第二天早上用吸管吸取血清，在血清中加入NaN3至终浓度1g/ml，分装后-20℃保存。

（6）ELISA测定效价

①包被抗原：先配制0.05M Na₂CO₃-NaHCO₃缓冲液（pH9.6），然后用新鲜配制0.05MNa₂CO3-NaHCO₃缓冲液稀释抗原（SEQ ID No.2所示肽段）为1：100倍浓度溶液，取出96孔酶标板，用移液枪将稀释好的抗原加到96孔板的2×10孔中，每孔100μl（每孔50μg），标记未加抗原包被的孔，置于4℃过夜。

②洗涤：从4℃里取出已包被的酶标板，甩干包被液，每孔中加入100μl含0.05%Tween-20的PBS洗涤在3-5次，每次3-5min，最后一次洗涤后在吸水纸上拍干。

③封闭：用移液枪向每孔中加入100μl含5%正常牛血清的PBS-T（0.05%Tween-20-PBS），置于37℃恒温培养箱中温育1h，封闭非特异性结合位点。

洗涤：取出已封闭的酶标板，甩干封闭液，每孔中加入100μl含0.05%Tween-20的PBS洗涤在3-5次，每次3-5min，最后一次洗涤后在吸水纸上拍干。

④加样：将在事先准备好的兔抗血清用PBS-T从1：2K（2000）进行3倍梯度稀释到1：4374K，然后在加过包被液包被过的两排孔的第1对孔中加入免疫前兔血清为阴性对照，余下的孔分别按兔抗血清浓度梯度依次加入样品，每孔100μl，置于37℃恒温培养箱中温育1小时。

⑤洗涤：取出加过样的酶标板，甩干样品血清，每孔中加入100μl含0.05%Tween-20的PBS洗涤在3-5次，每次3-5min，最后一次洗涤后在吸水纸上拍干。

⑥加酶标二抗：用PBS-T稀释辣根过氧化物酶标记的羊抗兔抗体至1：10000倍，每孔加入100μl，置于37℃恒温培养箱中温育1小时。

⑦洗涤：取出加过酶标二抗的酶标板，甩干里面的辣根过氧化物酶标记的羊抗兔抗体，在每孔中加入100μl含0.05%Tween-20的PBS洗涤在3-5次，每次3-5min，最后一次洗涤后在吸水纸上拍干。

⑧加底物显色液：配制含0.03% H2O2的溶于磷酸-柠檬酸缓冲液（7ml0.1MNa₂HPO₄和3ml 0.1M柠檬酸混合）的0.4mg/ml OPD显色液，每孔加入新鲜配制的OPD显色液100μl，室温静置于阴暗处20-40min。

⑨加终止液：待显色均匀（溶液变淡黄色）后，每孔加入50μl 12% H₂SO₄终止反应。

⑩酶标仪读数：将加了终止液的酶标板放入酶标仪中，将波长调至490nm读取数据。

（7）制备亲和柱进行抗体的亲和纯化

①准备 protein A 亲和柱：通常选取 5mL 或 10 mL protein A 填料，将等体积的填料和 PBS 缓冲溶液混合、搅拌，抽气去除填料中的气泡。

将 protein A 填料缓慢加入玻璃柱中，灌制层析柱。此过程中要避免柱干。灌注完毕后用 10 倍体积预冷的 PBS 缓冲溶液平衡柱子。

②Protein A 亲和层析：

将血清用过滤器进行过滤后，上样到平衡好的 protein A 层析柱上，为检测抗血清与填料的结合效率，需保留上样流出液。

用 PBS 缓冲溶液清洗柱子，再用 150 mM 甘氨酸缓冲液进行洗脱。收集洗脱液，并加入中和缓冲溶液调制 pH 为 7。

③富集目的抗体：将 protein A 纯化后得到的粗纯 IgG 上样到平衡好的抗原多肽亲和层析柱上，专一性的富集目的抗体。

④去除非特异性抗体：将上一步得到的目的抗体上样到平衡好的阴性多肽亲和层析柱上，直接收集流出液，从而去除非特异性的抗体成分。

⑤在得到洗脱的抗体后，经蔗糖或聚乙二醇浓缩后于PBS中透析除盐，使用紫外可见分光光度计在波长280nm处测定抗体OD值，所得OD值除以1.35即为所测抗体的浓度，加入等体积甘油置于-20℃可长期保存。

（8）western blot鉴定抗体效果和特异性

二、结果

用SEQ ID No.2所示肽段（图1A）免疫兔子制备得到效价良好的抗体，验证该抗体能否识别人源细胞内源PDK1蛋白K163位点Nedd8修饰。

为了判断所检测到的western blot条带是否为修饰带，使用Nedd8修饰激活酶抑制剂MLN4924处理人结直肠癌细胞系HCT-116细胞12个小时，收取蛋白进行western blot检测。若该修饰带能够被MLN4924去除，则证明该抗体可特异性识别PDK1蛋白K163位点的Nedd8修饰，结果如图1中D所示，使用制备的PDK1蛋白K163位点Nedd8修饰抗体可以在人结直肠癌细胞系HCT-116细胞中检测到内源PDK1蛋白K163位点Nedd8修饰，且能被MLN4924抑制，其中Cullin4A蛋白为该实验的阳性对照，GAPDH蛋白作为内参。

此外，联合敲除Nedd8修饰激活酶Uba3和结合酶Ubc12进行特异性验证。若敲除Uba3和Ubc12后抑制PDK1蛋白K163位点的Nedd8修饰，则表明该抗体具有良好的特异性，结果入图1中E所示，敲除Uba3和Ubc12后的确显著抑制了PDK1蛋白K163位点的Nedd8修饰。

最后，还在PDK1 K163R突变的HCT-116细胞中进行验证，如图1中F所示，使用制备的PDK1蛋白K163位点Nedd8修饰抗体可以在PDK1野生型HCT-116细胞中检测到内源PDK1蛋白K163位点Nedd8修饰，但无法在PDK1 K163R突变的HCT-116细胞中检测到PDK1蛋白K163位点Nedd8修饰。

上述结果显示制备的抗体具有良好的特异性，可以准确识别细胞内PDK1蛋白K163位点的Nedd8修饰。

实施例2、分析结直肠癌组织和癌旁组织中PDK1 K163位点Neddylation修饰程度的变化

一、材料和方法

1、材料

人结直肠癌肿瘤芯片（来自协和肿瘤医院，含病人病理信息）：含有100多对结直肠癌患者癌组织和癌旁组织标本切片的肿瘤芯片；

实施例1中制备的PDK1蛋白K163位点Nedd8修饰抗体。

2、方法

（1）切片放入60℃烘箱烤20min，使蜡融化；

（2）脱蜡至水：二甲苯1→二甲苯2→无水乙醇1→无水乙醇2→95%乙醇→90%乙醇→80%乙醇→70乙醇→水，各5min；

（3）PBS洗5min；

（4）微波修复抗原：预先将购买的商品化柠檬酸钠修复液（碧云天，P0081）微波加热至沸腾，将切片浸入柠檬酸钠修复液，微波中火修复15min 修复结束后将烧杯放置等待冷却至室温后才可将切片取出。（也可放置在4℃冷却至室温）；

（5）PBS洗5min，3次；

（6）过氧化氢封闭：取30%过氧化氢溶液用PBS稀释至浓度为3%过氧化氢溶液，避光封闭20min；

（7）PBS洗5min，3次；

（8）封闭：用滤纸擦拭玻片正面无组织的部分，甩去组织上多余水分，用免疫组化笔在组织外围画圈，迅速滴加10%BSA-PBS，放入湿盒中，37℃ 封闭30min；

（9）一抗：取实施例1中制备的PDK1蛋白K163位点Nedd8修饰抗体（40μg/μl），用5%BSA-PBS 按1：100稀释，封闭结束后取出玻片，甩去组织上的封闭液，迅速滴加稀释好的抗体，放入湿盒中，4℃过夜；

（10）PBS洗5min，5次；

（11）二抗：用5%BSA-PBS稀释兔二抗，通常稀释比例为1:200，甩去组织上水分后迅速滴加稀释好的二抗，室温2 h 或 37℃ 45min；

（12）PBS洗5min，5次；

（13）DAB显色：A液1滴 B液1ml 配制DAB显色液，甩去组织上水分，迅速滴加DAB显色液，通常显色3-5min 显色时镜下观察，待着色后浸入纯水中终止显色；

（14）纯水洗25min；

（15）染核：甩去组织上多余水分，滴加苏木素染色液染色3-5min ，分色液分色2s至粉红色随后浸入纯水中，镜下观察染色效果。自来水洗15min或使用返蓝液使核颜色返蓝；

（16）封片：纯水→70乙醇→80%乙醇→90%乙醇→95%乙醇→无水乙醇→无水乙醇→二甲苯→二甲苯各5min，取出玻片，用滤纸擦拭多余液体，在玻片组织一端滴加封片用树脂，取载玻片轻轻盖上组织，组织上不要有气泡。

二、结果

染色扫描后使用Image Pro Plus 软件分析PDK1 K163位点Nedd8修饰抗体染色的IOD（积累光密度）水平，然后进行数据整理和统计分析，分析结果显示，与癌旁组织相比，PDK1 K163位点的Nedd8修饰程度在结直肠癌患者组织中显著升高（图2中A）。

实施例3、K-M曲线分析PDK1 K163位点Neddylation修饰对结直肠癌患者预后的影响

一、材料和方法

1、材料

人结直肠癌肿瘤芯片，实施例1中制备的PDK1蛋白K163位点Nedd8修饰抗体。

2、方法

免疫组化，方法同实施例2。

二、结果

使用GraphPad Prism 5软件，Kaplan-Meier检验分析PDK1蛋白K163位点Nedd8的修饰水平与结直肠癌患者积累生存率的相关性。分析结果发现，PDK1蛋白K163位点Nedd8修饰程度高的患者积累生存概率低，反之则高（图2中B），表明PDK1蛋白K163位点Nedd8修饰程度确实可以作为结直肠癌的预后分子标志物。

实施例4、分析早期结直肠癌组织中PDK1 K163位点Neddylation修饰程度的变化

一、材料和方法

1、材料

2.、方法

免疫组化，方法同实施例2。

二、结果

Image Pro Plus软件统计PDK1蛋白K163位点Nedd8修饰抗体染色的IOD（积累光密度）水平，分析结果发现PDK1蛋白K163位点的Nedd8修饰程度在TNM分期I期患者的癌组织中显著升高，且相较于配对的癌组织，癌组织中PDK1蛋白K163位点的Nedd8修饰水平的升高率为100%（图2中C、D）。

结论：本发明采用分子生物学实验的方法分析发现PDK1蛋白K163位点发生Nedd8修饰，制备特异性靶向该修饰位点的抗体，免疫组化实验发现在结直肠癌患者体内PDK1 蛋白K163位点呈现高Nedd8修饰；预后分析表明PDK1蛋白K163位点Nedd8修饰程度越高，患者预后越差；差异表达分析显示，在TNM分期I期的患者癌组织中，PDK1蛋白K163位点Nedd8修饰水平相较于配对的癌旁组织中升高率为100%。

本发明明确PDK1蛋白K163位点Nedd8修饰可作为一种新型结直肠癌标志物，本发明所制备的用于检测PDK1蛋白K163位点Nedd8修饰的抗体可应用于临床结直肠癌预后以及早期诊断，为结直肠癌发病机制的研究和预测结直肠癌病人诊治及预后提供新的靶点。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims

1.用于检测PDK1蛋白K163位点的Nedd8修饰的物质在制备用于结直肠癌诊断的产品中的应用；

所述用于检测PDK1蛋白K163位点的Nedd8修饰的物质为能够与式（I）所示肽段特异性结合的物质；

所述式（I）为

，其中LRGG肽端中的甘氨酸G与赖氨酸K共价连接。

2.用于检测PDK1蛋白K163位点的Nedd8修饰的物质在制备用于预测结直肠癌预后的产品中的应用；

所述用于检测PDK1蛋白K163位点的Nedd8修饰的物质为能够与式（I）所示肽段特异性结合的物质，所述式（I）为

，其中LRGG肽端中的甘氨酸G与赖氨酸K共价连接。

3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，

所述能够与式（I）所示肽段特异性结合的物质为式（I）所示肽段的抗体。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，

所述抗体为以式（I）所示肽段作为免疫原免疫动物所得的多克隆抗体或抗血清。

5.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，

所述PDK1蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNo.1所示。

6.一种用于结直肠癌诊断或预后评估的标志物，其特征在于，结直肠癌标志物为PDK1蛋白K163位点的Nedd8修饰，所述PDK1蛋白K163位点的Nedd8修饰是指K163位点上共价连接了Nedd8的PDK1蛋白，所述PDK1蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNo.1所示，其中PDK1蛋白的第163位氨基酸残基K与LRGG肽端中的甘氨酸G共价连接。

7.如权利要求6所述的标志物在制备用于结直肠癌诊断产品中的应用。

8.如权利要求6所述的标志物在制备结直肠癌诊断或预后评估的产品中的应用，其特征在于，产品包括药物、试剂或试剂盒的任一项。