[go: up one dir, main page]

CN118879693A - 一种缺氧应答启动子元件及其应用 - Google Patents

一种缺氧应答启动子元件及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN118879693A
CN118879693A CN202410724475.9A CN202410724475A CN118879693A CN 118879693 A CN118879693 A CN 118879693A CN 202410724475 A CN202410724475 A CN 202410724475A CN 118879693 A CN118879693 A CN 118879693A
Authority
CN
China
Prior art keywords
4hre
hypoxia
huc
promoter element
sequence
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202410724475.9A
Other languages
English (en)
Inventor
林彬
周丽诗
杨宋
高强
岑坚正
王萍
许恒
林先明
林泽斌
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Foshan Zhongke Ludong Biotechnology Co ltd
Original Assignee
Foshan Zhongke Ludong Biotechnology Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Foshan Zhongke Ludong Biotechnology Co ltd filed Critical Foshan Zhongke Ludong Biotechnology Co ltd
Priority to CN202410724475.9A priority Critical patent/CN118879693A/zh
Publication of CN118879693A publication Critical patent/CN118879693A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/88—Lyases (4.)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/28—Bone marrow; Haematopoietic stem cells; Mesenchymal stem cells of any origin, e.g. adipose-derived stem cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/48—Reproductive organs
    • A61K35/51—Umbilical cord; Umbilical cord blood; Umbilical stem cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/04—Inotropic agents, i.e. stimulants of cardiac contraction; Drugs for heart failure
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
    • C12N5/0662—Stem cells
    • C12N5/0668—Mesenchymal stem cells from other natural sources
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y402/00—Carbon-oxygen lyases (4.2)
    • C12Y402/01—Hydro-lyases (4.2.1)
    • C12Y402/01001—Carbonate dehydratase (4.2.1.1), i.e. carbonic anhydrase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/10—Plasmid DNA
    • C12N2800/106—Plasmid DNA for vertebrates
    • C12N2800/107—Plasmid DNA for vertebrates for mammalian

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)

Abstract

本发明公开了一种缺氧应答启动子元件及其应用。该缺氧应答启动子元件是基于CA9基因的启动子进行改造得到CA9‑4HRE或CA9‑4HRE‑TA，其中，CA9‑4HRE的序列如SEQ ID NO.2所示，CA9‑4HRE‑TA的序列如SEQ ID NO.3所示。本发明在碳酸酐酶(carbon anhydrase IX)编码基因CA9的启动子基础上进行改造，创造了一种在hUC‑MSC中对缺氧环境进行迅速应答的启动子元件，并利用该元件构建了一种在缺氧环境高表达NRG1活性多肽，在常氧环境中低表达NRG1活性多肽的工程化hUC‑MSC株。

Description

一种缺氧应答启动子元件及其应用
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种缺氧应答启动子元件及其应用。
背景技术
人脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cell,hUC-MSC)是指从新生儿脐带组织中分离获得的一种多功能干细胞，能向外界分泌多种细胞因子、多肽、外泌体等物质，起到调节免疫功能、促进器官修复的作用。由于hUC-MSC具有低免疫原性、不成瘤、安全性高等特点，目前正被开发成为治疗多种疾病的细胞药物，这些适应症包括脑卒中、冠心病、缺血性心力衰竭等重大缺血性疾病。
但是，这些缺血性疾病的受损组织/器官往往具有特殊的微观环境。以缺血性心衰为例，缺血性心衰指由于冠状动脉疾病引起的心肌坏死和纤维化，并导致严重左室功能障碍而引发的心力衰竭，缺血性心衰患者的心肌组织由于长期缺血，处于缺氧状态，这意味着到达病灶部位的hUC-MSC面临缺氧的微环境。
缺氧应答元件(hypoxia response element,HRE)是一类位于启动子区域的DNA序列，在低氧环境下，缺氧诱导因子能够结合这些序列并启动下游基因的表达。利用HRE和缺氧诱导因子的特性，使hUC-MSC在缺氧环境下特异地高表达功能性蛋白，而在常氧环境中低表达或不表达这些蛋白成为可能，由此技术可以进一步延伸，通过构建包含缺氧应答启动子元件及特定基因的工程化hUC-MSC株，使其在缺氧的组织/器官中持续地分泌治疗性的蛋白/多肽，在常氧的组织/器官中低分泌或不分泌这些蛋白/多肽，达到有效、安全的双重目的。因此，这种启动子元件的识别是构建工程化hUC-MSC株的关键。在hUC-MSC中，对缺氧环境进行特异应答的启动子元件的识别鲜有报道。
发明内容
本发明在碳酸酐酶(carbon anhydrase IX)编码基因CA9的启动子基础上进行改造，创造了一种在hUC-MSC中对缺氧环境进行迅速应答的启动子元件，并利用该元件构建了一种在缺氧环境高表达NRG1活性多肽(NRG-1β2的第177-237位氨基酸的多肽)，在常氧环境中低表达NRG1活性多肽的工程化hUC-MSC株。
1、首次发现hUC-MSC中对缺氧环境快速响应的一系列基因，其中，CA9基因具有以下特点：(1)缺氧6小时其表达水平开始上调，并能持续上调，至缺氧72小时，其表达水平是对照组(常氧环境培养的hUC-MSC)的416倍；(2)CA9基因在常氧环境下基本不表达(或表达水平极低)；(3)CA9基因的启动子区域含有HRE元件。
2、对CA9基因的启动子(CA9-WT)进行了改造，改造信息如表1。
表1
3、双荧光素酶实验的结果显示，在缺氧环境中，CA9-4HRE-TA的下游基因表达随着培养时间延长逐渐增加，且其表达水平显著高于CA9-WT和CA9-4HRE的下游基因的表达水平；在常氧环境中，CA9-4HRE-TA的下游基因表达随着培养时间延长基本不发生变化。
4、常用启动子(CMV、SV40、EF1α、hPGK1)的比较。双荧光素酶实验的结果显示，CA9-4HRE-TA与在缺氧环境中，CA9-4HRE-TA的下游基因表达随着培养时间延长逐渐增加，在缺氧24-72小时时，其下游基因表达与SV40、EF1α、hPGK1的下游基因的表达没有显著差异，但低于CMV的下游基因表达水平；在缺氧96小时时，CA9-4HRE-TA的下游基因表达与CMV、SV40、EF1α、hPGK1的下游基因的表达没有显著差异。然而在常氧环境中，CA9-4HRE-TA的下游基因表达在2、24、72、96小时时，均显著低于CMV和EF1α的下游基因表达水平。CA9-4HRE-TA作为新发现的启动子，与常用启动子，有着同样的功能。
5、将CA9-4HRE-TA与表达NRG1活性多肽(NRG-1β2的第177-237位氨基酸的多肽，后简称P61)的cDNA组合，构建出可以根据氧气浓度调控表达P61的元件。将该元件利用基因组编辑技术敲入B2M基因的第二个外显子中，构建了一种在缺氧环境高表达P61，在常氧环境中低表达P61的工程化hUC-MSC株。
附图说明
图1为实施例2中构建的启动子报告载体PGL6-CA9-WT的质粒图谱；
图2为实施例2中构建的启动子报告载体PGL6-CA9-4HRE的质粒图谱；
图3为实施例2中构建的启动子报告载体PGL6-CA9-4HRE-TA的质粒图谱；
图4为实施例2中构建的启动子报告载体PGL6-CMV的质粒图谱；
图5为实施例2中构建的启动子报告载体PGL6-SV40的质粒图谱；
图6为实施例2中构建的启动子报告载体PGL6-Ef1α的质粒图谱；
图7为实施例2中构建的启动子报告载体PGL6-hPGK1的质粒图谱；
图8为实施例3中CA9启动子及优化后双荧光素酶实验结果图；
图9为实施例3中CA9-4HRE-TA与常用启动子比较双荧光素酶实验结果；
图10为实施例4中构建的B2M-CA9-4HRE-TA-EGFP-P61载体质粒图谱；
图11为实施例4中ELISA的测试结果。
具体实施方式
为让本领域的技术人员更加清晰直观的了解本发明，下面将结合附图，对本发明作进一步的说明。
实施例1：筛选hUC-MSC中对缺氧环境快速响应的基因
1.1常氧条件：使用常规CO2细胞培养箱(Thermo Scientific，150i；设置：37℃，5％CO2，95％空气)培养hUC-MSC；缺氧条件：使用三气培养箱(ESCO，CLL-170T-8；设置：95％N2，1％O2，4％CO2)培养hUC-MSC。实验分组：hUC-MSC接种至六孔板，收集不同缺氧处理时间(2h、6h、24h、72h)，以及对照组(常氧24h)，每个时间点设置3个生物学重复。
1.2总RNA提取：用EZ-10总RNA小量提取试剂盒(Sangon Biotech，B618583-0050)提取细胞总RNA(样品使用RNase-Free DNA清除试剂盒(Sangon Biotech，B618253-0050)清除残留基因组DNA)。
1.3将以上5个分组的样品(共计15个样品)送至北京诺禾致源科技股份有限公司进行转录组测序，获得转录组测序数据。
表2测序结果分析。分析组别命名如下：
筛选false discovery rate(FDR)<0.05的蛋白编码基因，以log2 Fold Change(DEG_H72)值降序排列，前十名的基因见表3。
表3
由上表可知，CA9基因的表达水平从缺氧6小时开始上调，并能持续上调，至缺氧72小时，其上调倍数在所有表达上调基因中仅次于CHRDL2基因。但是，由于CHRDL2基因在缺氧24小时表达水平突然降低，存在不稳定性，因此我们选择CA9基因的启动子进行分析和改造。
实施例2：启动子报告载体构建
2.1CA9野生型启动子及改造后的启动子的报告载体构建
2.1.1根据已有的研究，我们选取CA9基因启动子区-166～+42bp(基因组位置：chr9:35,673,752-35,673,959，GRCh38/hg38)进行分析并改造成CA9-4HRE-TA序列，构建不同的启动子元件。具体改动如下：(1)CA9-4HRE：在CA9-WT序列中插入3个HRE序列(5’-TGCACGTA-3’，下划线标示)，同时将-74nt的C(5’-GGGGCTC-3’中加粗的C)突变为A(5’-GGGGCTC-3’加粗的a)；(2)CA9-4HRE-TA：在CA9-WT序列中插入3个HRE序列(5’-TGCACGTA-3’，下划线标示)，将-74nt的C(5’-GGGGCTC-3’中加粗的C)突变为A(5’-GGGGCTC-3’加粗的a)，将+30-+37nt的“5’-CACAGTCA-3’”变为“5’-TATATATA-3’”([]号中的序列)。在北京擎科生物科技股份有限公司合成相应的DNA序列。
CA9-WT序列
CCTCACTCCACCCCCATCCTAGCTTTGGTATGGGGGAGAGGGCACAGGGCCAGACAAACCTGTGAGACTTTGGCTCCATCTCTGCAAAAGGGGCTCTGTGAGTCAGCCTGCTCCCCTCCAGGCTTGCTCCTCCCCCACCCAGCTCTCGTTTCCAATGCACGTACAGCCCGTACACACCGTGTGCTGGGACACCC[CACAGTCA]GCCGC(SEQ IDNO.1)
CA9-4HRE序列：
CCTCACTCCACCCCCATCCTAGCTTTGGTATGGGGGAGAGGGCACAGGGCCAGACAAACCTGTGAGACTTTGGCTCCATCTCTGCAAAAGGGGCTCTGTGAGTCAGCCTGCTCCCCTCCAGGCTTGCTCCTCCCCCACCCAGCTCTCGTTTCCAATGCACGTACTGCACGTACTGCACGTACTGCACGTACAGCCCGTACACACCGTGTGCTGGGACACCCCACAGTCAGCCGC(SEQ ID NO.2)
CA9-4HRE-TA序列：
CCTCACTCCACCCCCATCCTAGCTTTGGTATGGGGGAGAGGGCACAGGGCCAGACAAACCTGTGAGACTTTGGCTCCATCTCTGCAAAAGGGGCTCTGTGAGTCAGCCTGCTCCCCTCCAGGCTTGCTCCTCCCCCACCCAGCTCTCGTTTCCAATGCACGTACTGCACGTACTGCACGTACTGCACGTACAGCCCGTACACACCGTGTGCTGGGACACCC[TATATATA]GCCGC(SEQ ID NO.3)
2.1.2以合成基因序列为模板，设计扩增引物，并在引物上加入酶切位点，上游酶切位点为XhoI，下游酶切位点HindIII，引物序列如下：
CA9-XhoI-F：TACTCGAGCCTCACTCCACCCCCATC(SEQ ID NO.4)
CA9 Promoter-HindIII-R：TAAAGCTTGCGGCTGACTGTGGGGT(SEQ ID NO.5)
CA9-4HRE-TA-HindIII-R：TAAAGCTTGCGGCTATATATAGGGTGTCCCAGC(SEQ ID NO.6)
PCR扩增反应体系(20μl)如下表：
PCR扩增程序为：95℃5min；95℃30sec，56℃30sec，72℃30sec，循环30次；72℃10min。
反应完成后，用PCR回收试剂盒回收目的片段(UElandy，UE-PCR-250)。
将回收产物与PGL6载体分别进行双酶切反应(限制性内切酶为XhoI和HindIII)
反应条件为37℃水浴2h，之后取2μl与DNA loading buffer混合后进行琼脂糖凝胶电泳验证成功切开。使用DNA凝胶回收与纯化试剂盒回收(翌圣，19101ES50)，获得纯化产物。
2.1.3连接转化：将纯化后的载体分别与纯化片段连接，连接体系如下：
充分混匀后16℃过夜连接，之后进行转化。转化步骤为：从-80℃冰箱中取出1支感受态细胞放于冰上解冻，全部连接产物与50μl感受态细胞轻柔混匀，在冰上放置30min后放置于42℃水浴锅中热激30s，立即置于冰上5min，在超净工作台中向上述混合物中加入400μl灭菌后的无抗生素LB液体培养基，轻轻吹打混匀后置于摇床中37℃，170rpm孵育1h。孵育结束后在超净工作台中吸取150μl加入到氨苄浓度为150μg/mL的LB固体培养基中进行涂板，之后倒置于37℃培养箱中过夜培养。
2.1.4挑菌验证：向1.5ml离心管中加入1ml含有氨苄的LB液体培养基，挑取若干单克隆菌落，恒温摇床37℃、200rpm振荡培养6h，再取200μl菌液加入5ml含有氨苄的LB液体培养基，恒温摇床37℃、200rpm振荡过夜培养。小量提取质粒，送测序验证是否连接成功，测序正确的菌落进行扩大培养，使用质粒大量提取试剂盒提取确定连接成功的Firefly荧光素酶报告载体PGL6-CA9-WT、PGL6-CA9-4HRE、PGL6-CA9-4HRE-TA，质粒图谱如图1-3所示。
2.2哺乳动物常用启动子报告载体构建
2.2.1从pcDNA3.1(+)(Honorgene，HG-VPI0001)克隆CMV启动子584bp的序列，从Firefly荧光素酶报告载体PGL6(beyotime，D2102)克隆SV40启动子358bp的序列，从PX458-EF1α-pSpCas9(BB)-2A-GFP质粒(Addgen，75232)克隆Ef1α核心启动子212bp的序列，从pCW-Cas9-Blast载体(Addgene，83481)克隆hPGK1启动子511bp的序列。根据以上启动子序列，设计扩增引物，并在引物上加入酶切位点，上游酶切位点为XhoI，下游酶切位点HindIII，引物序列如下：
CMV-XhoI-F：CGCGCTCGAGGACATTGATTATTGACTAGTT(SEQ ID NO.7)
CMV-HindIII-R：CGAAGCTTAGCTCTGCTTATATAGACCTCCC(SEQ ID NO.8)
SV40-XhoI-F：TATACTCGAGCTGAGGCGGAAAGAACC(SEQ ID NO.9)
SV40-HindIII-R：TAAAGCTTTTTGCAAAAGCCTAGGCCTCC(SEQ ID NO.10)
Ef1α-XhoI-F：TATACTCGAGGGGCAGAGCGCACAT(SEQ ID NO.11)
Ef1α-HindIII-R：TAAAGCTTCTGTGTTCTAGCGGCAAACCC(SEQ ID NO.12)
hPGK1-XhoI-F：TATACTCGAGGGGGTTGGGGTTGCG(SEQ ID NO.13)
hPGK1-HindIII-R：TAAAGCTTCTGGGGAGAGAGGTCGGT(SEQ ID NO.14)
PCR扩增反应体系同实施例2，PCR扩增程序为：95℃5min；95℃30sec，56℃30sec，72℃30sec，循环30次；72℃10min。反应完成后，用PCR回收试剂盒回收目的片段。
2.2.2将回收产物与PGL6载体分别进行双酶切反应(限制性内切酶为XhoI和HindIII)
反应条件为37℃水浴2h，之后取2μl与DNA loading buffer混合后进行琼脂糖凝胶电泳验证成功切开。使用DNA凝胶回收与纯化试剂盒回收(翌圣，19101ES50)，获得纯化产物。
2.2.3连接转化：将纯化后的载体分别与纯化片段连接，连接体系如下：
充分混匀后16℃过夜连接，之后进行转化。转化步骤为：从-80℃冰箱中取出1支感受态细胞放于冰上解冻，全部连接产物与50μl感受态细胞轻柔混匀，在冰上放置30min后放置于42℃水浴锅中热激30s，立即置于冰上5min，在超净工作台中向上述混合物中加入400μl灭菌后的无抗生素LB液体培养基，轻轻吹打混匀后置于摇床中37℃，170rpm孵育1h。孵育结束后在超净工作台中吸取150μl加入到氨苄浓度为150μg/mL的LB固体培养基中进行涂板，之后倒置于37℃培养箱中过夜培养。
2.2.4挑菌验证：向1.5ml离心管中加入1ml含有氨苄的LB液体培养基，挑取若干单克隆菌落，恒温摇床37℃、200rpm振荡培养6h，再取200μl菌液加入5ml含有氨苄的LB液体培养基，恒温摇床37℃、200rpm振荡过夜培养。小量提取质粒，送测序验证是否连接成功，测序正确的菌落进行扩大培养，使用质粒大量提取试剂盒提取确定连接成功的Firefly荧光素酶报告载体PGL6-CMV、PGL6-SV40、PGL6-Ef1α、PGL6-hPGK1，质粒图谱如图4-7所示。
实施例3：缺氧和常氧条件下CA9系列启动子与常用启动子比较
3.1hUC-MSC的培养：培养基具体组成为10％胎牛血清(HyClone，SH30396.03)；1％PS(Invitrogen，10378016)；1％的非必需氨基酸NEAA(购自Invitrogen，11140050)；余量为DMEM/F12(Gibco，C11330500BT)。hUC-MSC 3-4天传代一次。
3.2缺氧和常氧条件下CA9系列启动子的转录效率比较
3.2.1转染细胞：hUC-MSC按2*104/孔接种至六孔板，24h后应用-LT1(Mirus，MIR 2300)将实施例2构建的PGL6-CA9-WT、PGL6-CA9-4HRE、PGL6-CA9-4HRE-TA报告载体以及PGL6分别和Renilla荧光素酶报告载体PRL-TK(beyotime，D2760)按1:1共转染hUC-MSC，转染18～24h内更换新鲜培养基，共转染48h后将细胞进行常氧或缺氧处理，处理时间分为2h、6h、24h。
3.2.2处理完成后，立即弃去培养液，加入300μl/孔双萤光素酶报告基因细胞裂解液(beyotime，RG132M)，室温条件下裂解15min至细胞完全裂解，将细胞裂解液收集转移到1.5mL的EP中，15000g离心5min后，取上清置于冰上待测。
3.2.3双荧光素酶检测：样品和试剂使用前恢复室温，采用Dual-LumiTMII双萤光素酶报告基因检测试剂盒(beyotime，RG089S)分别检测两种荧光素酶活性，PRL-TK作为内对照报告基因。取20μl样品，加入100μl萤火虫荧光素酶检测试剂适当混匀，室温孵育10分钟，应用Flash多功能酶标仪(Thermo Scientific)检测荧光素酶活性；加入100μl海肾荧光素酶检测工作液，检测海肾荧光素酶(内参)活性。两组数值比即为相对荧光素酶单位(RLU)。
结果分析：双荧光素酶报告实验结果(图8)显示，与转染PGL6-CA9-WT载体的hUC-MSC相比，4HRE和4HRE-TA在常氧和缺氧环境中均显著提高下游基因的表达，其中4HRE-TA的下游基因的表达升幅最高；在常氧环境下，4HRE-TA的下游基因的表达不随着培养时间的增加而增加；在缺氧环境下，4HRE-TA的下游基因的表达随着培养时间的增加而显著增加。
3.3缺氧和常氧条件下CA9-4HRE-TA与常见启动子的转录效率比较
3.3.1转染细胞：hUC-MSC按1.5*104/孔接种至六孔板，24h后应用-LT1(Mirus，MIR 2300)将PGL6-CA9-WT、PGL6-CA9-4HRE-TA、PGL6-CMV、PGL6-SV40、PGL6-Ef1α、PGL6-hPGK1、PGL6分别和Renilla荧光素酶报告载体PRL-TK(beyotime，D2760)按1:1共转染hUC-MSC，转染18～24h内更换新鲜培养基，共转染48h后将细胞进行常氧或缺氧处理，处理时间分为2h、24h、48h、72h、96h。
3.3.2处理完成后，立即弃去培养液，加入300μl/孔双萤光素酶报告基因细胞裂解液，室温条件下裂解15min至细胞完全裂解，将细胞裂解液收集转移到1.5mL的EP中，15000g离心5min后，取上清置于冰上待测。
3.3.3双荧光素酶检测：样品和试剂使用前恢复室温，采用Dual-LumiTMII双萤光素酶报告基因检测试剂盒分别检测两种荧光素酶活性，PRL-TK作为内对照报告基因。取20μl样品，加入100μl萤火虫荧光素酶检测试剂适当混匀，室温孵育10分钟，应用Flash多功能酶标仪检测荧光素酶活性；加入100μl海肾荧光素酶检测工作液，检测海肾荧光素酶(内参)活性。两组数值比即为相对荧光素酶单位(RLU)。
结果分析：双荧光素酶报告实验结果(图9)显示，在缺氧环境中，4HRE-TA组在缺氧2小时时，RLU值显著低于CMV、SV40、Ef1α、hPGK1组；在缺氧24小时、48小时、72小时时，4HRE-TA组的RLU值显著低于CMV组，但是与SV40、Ef1α、hPGK1组没有显著差异；在缺氧96小时时，4HRE-TA组的RLU值与CMV、SV40、Ef1α、hPGK1组没有显著差异。在常氧环境中，在培养2小时、24小时、72小时、96小时时，4HRE-TA组的RLU值显著低于CMV和Ef1α组。该结果说明缺氧时间的延长能显著促进4HRE-TA下游基因的表达，最终在缺氧96小时时，其促进下游基因的表达的能力与其他常用启动子无显著差异；在常氧环境下，4HRE-TA促进下游基因的表达的能力显著低于CMV和Ef1α这两种常用启动子的能力。
实施例4：构建能在常氧和缺氧环境中自适应调控目的基因表达工程化脐带间充质干细胞株
4.1构建切割B2M的gRNA、Cas9二合一表达载体
PX458-EF1a-pSpCas9(BB)-2A-GFP质粒(Addgen，75232)及pCW-Cas9-Blast质粒(Addgene，83481)均购自Addgene。
4.1.1sgRNA序列设计：从NCBI网站查询人类基因B2M的编码区，根据B2M基因结构，选择B2M基因转录本211第2号外显子设计CRISPR/Cas9基因编辑系统的guide RNA(gRNA)序列。使用在线软件CRISPOR(http://crispor.tefor.net/)挑选评分较高的sgRNA，得到针对第2号外显子的sgRNA序列(5’-CAGTAAGTCAACTTCAATGT-3’(SEQ ID NO.15)，PAM：CGG)。
4.1.2sgRNA oligo退火：设计好的sgRNA和对应的互补序列分别加上BbsⅠ限制性内切酶酶切位点，合成对应的oligo，序列见下表。
序列名称 序列(5’-3’)
B2M-sgRNA-F CACCGCAGTAAGTCAACTTCAATGT(SEQ ID NO.16)
B2M-sgRNA-R AAACACATTGAAGTTGACTTACTGC(SEQ ID NO.17)
使用ddH2O将oligo干粉稀释后，如下表配制oligo退火体系，混匀后使用PCR仪通过逐步降温的方式，合成两端带有BbsΙ内切酶黏性末端的DNA链。降温的程序为：95℃5min，之后每秒降低1℃，直至降至25℃，取出放置于-20℃冰箱保存备用。
4.1.3载体酶切：使用BbsΙ内切酶将载体切开，酶切体系如下：
充分混匀后放置于37℃水浴2h，之后取2μl与DNA loading buffer混合后进行琼脂糖凝胶电泳验证成功切开。使用DNA凝胶回收与纯化试剂盒对酶切后的产物进行纯化回收，获得PX458线性载体。
4.1.4连接转化：将线性载体与oligo退火产物连接，连接体系如下表，充分混匀后16℃过夜连接。转化操作步骤同实施例2。
4.1.5挑菌验证：向1.5ml离心管中加入1ml含有氨苄的LB液体培养基，挑取若干单克隆菌落，恒温摇床37℃、200rpm振荡培养6h，再取200ul菌液加入5ml含有氨苄的LB液体培养基，恒温摇床37℃、200rpm振荡过夜培养。小量提取质粒，送测序验证是否连接成功，选择hU6-F(5’-TAATTTCTTGGGTAGTTTGC-3’(SEQ ID NO.18))为测序引物，测序正确的菌落进行扩大培养，使用质粒大量提取试剂盒提取确定连接成功的质粒PX458-B2M。
4.2构建含有B2M同源臂并且可调控表达P61的B2M-CA9-4HRE-TA-EGFP-P61载体
4.2.1在pCW-Cas9-Blast载体中引入多个酶切位点，酶切位点为XhoI-MluI-NsiI-AgeI-NgoMIV。
XhoI-F：TCGAGACGCGTATGCATACCGGTG(SEQ ID NO.19)
NgoMIV-R：CCGGCACCGGTATGCATACGCGTC(SEQ ID NO.20)
4.2.2引物退火：使用ddH2O将合成引物干粉稀释后，如下表配制退火体系，混匀后使用PCR仪通过逐步降温的方式，合成带有XhoI和NgoMIV内切酶黏性末端的DNA链。降温的程序为：95℃5min，之后每秒降低1℃，直至降至25℃，取出放置于-20℃冰箱保存备用。
4.2.3载体酶切：使用XhoI和NgoMIV内切酶将载体切开，酶切体系如下：
充分混匀后放置于37℃水浴2h，之后取2μl与DNA loading buffer混合后进行琼脂糖凝胶电泳验证成功切开。使用DNA凝胶回收与纯化试剂盒对酶切后的产物进行纯化回收，获得pCW-Cas9-Blast线性载体。
4.2.4连接转化：将线性载体与退火产物连接，连接体系如下表，充分混匀后16℃过夜连接。转化操作步骤同实施例2。
4.2.5挑菌验证：向1.5ml离心管中加入1ml含有氨苄的LB液体培养基，挑取若干单克隆菌落，恒温摇床37℃、200rpm振荡培养6h，再取200ul菌液加入5ml含有氨苄的LB液体培养基，恒温摇床37℃、200rpm振荡过夜培养。小量提取质粒，送测序验证是否连接成功，测序正确的菌落进行扩大培养，使用质粒小量提取试剂盒提取确定连接成功的质粒pCW-酶切位点。
4.2.6依据gRNA位置设计同源臂并引入酶切位点，引物具体如下表。使用人心肌细胞基因组DNA进行PCR扩增，利用引物B2M-LA-F和B2M-LA-R得到同源臂左臂(B2M-LA)；利用引物B2M-RA-F和B2M-RA-R得到同源臂右臂(B2M-RA)。
PCR扩增程序为：95℃5min；95℃30sec，56℃1min，72℃30sec，循环30次；72℃10min。
反应完成后，用PCR回收试剂盒回收目的片段。同源臂左臂使用NotI和XhoI内切酶双酶切，同源臂右臂使用NgoMⅣ和Acc65Ⅰ内切酶双酶切，使用DNA凝胶回收与纯化试剂盒回收，获得纯化产物。
序列名称 序列(5’-3’)
B2M-LA-F1 TATAGCGGCCGCGGCAATGGAATGAGATTC(SEQ ID NO.21)
B2M-LA-R1 TACTCGAGTGTCGGATGGATGAAACCCAG(SEQ ID NO.22)
B2M-RA-F1 TAGCCGGCTGAAGTTGACTTACTGAAGAATG(SEQ ID NO.23)
B2M-RA-R1 TAGGTACCCTCCATGATGCTGCTTACATG(SEQ ID NO.24)
使用NotI和XhoI内切酶将pCW-酶切位点载体切开，酶切体系如下：
充分混匀后放置于37℃水浴2h，之后取2μl与DNA loading buffer混合后进行琼脂糖凝胶电泳验证成功切开。使用DNA凝胶回收与纯化试剂盒对酶切后的产物进行纯化回收，获得pCW-酶切位点线性载体。
连接转化：将线性载体与同源臂左臂连接，连接体系如下表，充分混匀后16℃过夜连接。转化操作步骤同实施例2。
挑菌验证：向1.5ml离心管中加入1ml含有氨苄的LB液体培养基，挑取若干单克隆菌落，恒温摇床37℃、200rpm振荡培养6h，再取200ul菌液加入5ml含有氨苄的LB液体培养基，恒温摇床37℃、200rpm振荡过夜培养。小量提取质粒，送测序验证是否连接成功，使用质粒小量提取试剂盒提取确定连接成功的质粒pCW-酶切位点-B2M-LA。
4.2.7载体酶切：使用NgoMⅣ和Acc65Ⅰ内切酶将pCW-酶切位点-B2M-LA载体切开，酶切体系如下：
充分混匀后放置于37℃水浴2h，之后取2μl与DNA loading buffer混合后进行琼脂糖凝胶电泳验证成功切开。使用DNA凝胶回收与纯化试剂盒对酶切后的产物进行纯化回收，获得pCW-酶切位点-B2M-LA线性载体。
连接转化：将线性载体与同源臂右臂连接，连接体系如下表，充分混匀后16℃过夜连接。转化操作步骤同实施例2。
挑菌验证：向1.5ml离心管中加入1ml含有氨苄的LB液体培养基，挑取若干单克隆菌落，恒温摇床37℃、200rpm振荡培养6h，再取200ul菌液加入5ml含有氨苄的LB液体培养基，恒温摇床37℃、200rpm振荡过夜培养。小量提取质粒，送测序验证是否连接成功，使用质粒小量提取试剂盒提取确定连接成功的质粒pCW-酶切位点-B2M。
4.2.8在北京擎科生物科技股份有限公司合成一段DNA片段(命名为：插入片段)，该片段含有限制性内切酶AgeI、XbaI、SbfI、SalI、NgoMIV的酶切位点，AgeI和XbaI之间的片段为CA9-4HRE-TA启动子，XbaI和SbfI之间的片段为EGFP绿色荧光蛋白，SbfI和SalI之间的片段为T2A连接肽，SalI和NgoMIV之间的片段为NRG-1β2的第177至237位氨基酸的多肽(P61)和6×his标签蛋白。将合成的基因片段用AgeI和NgoMIV双酶切，使用DNA凝胶回收与纯化试剂盒对酶切后的产物进行纯化回收。该DNA片段序列如下(5’-3’)：
ACCGGTCCTCACTCCACCCCCATCCTAGCTTTGGTATGGGGGAGAGGGCACAGGGCCAGACAAACCTGTGAGACTTTGGCTCCATCTCTGCAAAAGGGAGCTCTGTGAGTCAGCCTGCTCCCCTCCAGGCTTGCTCCTCCCCCACCCAGCTCTCGTTTCCAATGCACGTACTGCACGTACTGCACGTACTGCACGTACAGCCCGTACACACCGTGTGCTGGGACACCCTATATATAGCCGCTCTAGAGCCACCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGT GCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGACCTGCAGGGGCAGTGGAGAGGGCAGAGGAAGTCTGCTAACATGCGGTGACGTCGAGGAGAATCCTGGCCCAGTCGACATGGGTTGGAGTTGCATCATCCTATTTCTAGTCGCTACCGCCACAGGCGTGCATTCCAGCCATCTTGTAAAATGTGCGGAGAAGGAGAAAACTTTCTGTGTGAATGGAGGGGAGTGCTTCATGGTGAAAGACCTTTCAAACCCCTCGAGATACTTGTGCAAGTGCCCAAATGAGTTTACTGGTGATCGCTGCCAAAACTACGTAATGGCCAGCTTCTACAAGGCGGAGGAGCTGTACCAGCACCACCACCATCACCACTAAGCCGGC(SEQ ID NO.25)
4.2.9载体酶切：使用AgeI和NgoMIV内切酶将pCW-酶切位点-B2M载体切开，酶切体系如下：
充分混匀后放置于37℃水浴2h，之后取2μl与DNA loading buffer混合后进行琼脂糖凝胶电泳验证成功切开。使用DNA凝胶回收与纯化试剂盒对酶切后的产物进行纯化回收，获得pCW-酶切位点-B2M线性载体。
连接转化：将线性载体与酶切后的插入片段连接，连接体系如下表，充分混匀后16℃过夜连接。转化操作步骤同实施例2。
挑菌验证：向1.5ml离心管中加入1ml含有氨苄的LB液体培养基，挑取若干单克隆菌落，恒温摇床37℃、200rpm振荡培养6h，再取200ul菌液加入5ml含有氨苄的LB液体培养基，恒温摇床37℃、200rpm振荡过夜培养。小量提取质粒，送测序验证是否连接成功，使用质粒大量提取试剂盒提取确定连接成功的质粒B2M-CA9-4HRE-TA-EGFP-P61，质粒图谱如图10所示。
4.3构建敲除B2M并能在常氧和缺氧环境中自适应调控目的基因表达工程化脐带间充质干细胞株
4.3.1转染细胞：接种hUC-MSC到六孔板中，用含10％胎牛血清的DMEM/F12培养液进行培养，待细胞汇合度达到40％-50％时用终浓度为1μM的L755507(MCE，HY-19334)处理6h后，按照-LT1(Mirus，MIR 2300)说明书操作将PX458-B2M和B2M-CA9-4HRE-TA-EGFP-P61按质量比1：1共转染hUC-MSC。
4.3.2转染24h后，将培养液更换成新鲜培养液。转染48h后，使用倒置荧光显微镜观察绿色荧光表达情况，并使用流式细胞仪(FACSAria IIU,BD Biosciences)分选带有绿色荧光的细胞，获得hUC-MSC-B2M-CA9-4HRE-TA-EGFP-P61多克隆细胞。
4.3.3鉴定hUC-MSC-B2M-CA9-4HRE-TA-EGFP-P61单克隆细胞
待分选细胞扩增至单克隆细胞，使用枪头吸取单克隆细胞接种于96孔细胞培养板。待克隆培养至细胞密度80％左右，将克隆消化后分成两份，一份用于PCR鉴定，一份进行扩大培养。
PCR鉴定：提取单克隆细胞基因组DNA，利用PCR初步鉴定是否发生同源重组、序列插入基因组位置是否正确等内容；选择PCR鉴定正确的单克隆细胞，提取其基因组DNA进行桑格测序。引物序列如下表，其中B2M-LA-F2，B2M-RA-R2位于人类B2M基因上，B2M-LA-R2，B2M-RA-F2位于B2M-CA9-4HRE-TA-EGFP-P61载体上。各引物序列如下表所示。
序列名称 序列(5’-3’)
B2M-LA-F2 AAGGCAGGCTGATCACTTGAAGT(SEQ ID NO.26)
B2M-LA-R2 TGGAAACGAGAGCTGGGTGG(SEQ ID NO.27)
B2M-RA-F2 TGAATGGAGGGGAGTGCTTC(SEQ ID NO.28)
B2M-RA-R2 TGGGGCCATACACCTTCTTCATG(SEQ ID NO.29)
4.3.4利用ELISA进行鉴定：由于hUC-MSC-B2M-CA9-4HRE-TA-EGFP-P61中表达的P61携带6×his标签，因此可以利用His Tag ELISA Detection Kit(Genscript,L00436)检测各组细胞向培养上清中分泌的6×his标签含量，以此来计算各组分泌P61的相对含量。
将相同数量的hUC-MSC(作为对照组)和hUC-MSC-B2M-CA9-4HRE-TA-EGFP-P61分别常氧和缺氧培养48h，搜集培养上清，利用His Tag ELISA Detection Kit检测6×his标签的含量，结果如图11所示，缺氧培养48h的hUC-MSC-B2M-CA9-4HRE-TA-EGFP-P61向培养上清分泌P61的含量是对照组的71.6倍。
B2M切割位点上游同源臂804bp：
ggcaatggaatgagattccatcccaaaaaataaaaaaataaaaaaataaagaacataccttgggttgatccacttaggaacctcagataataacatctgccacgtatagagcaattgctatgtcccaggcactctactagacacttcatacagtttagaaaatcagatgggtgtagatcaaggcaggagcaggaaccaaaaagaaaggcataaacataagaaaaaaaatggaaggggtggaaacagagtacaataacatgagtaatttgatgggggctattatgaactgagaaatgaactttgaaaagtatcttggggccaaatcatgtagactcttgagtgatgtgttaaggaatgctatgagtgctgagagggcatcagaagtccttgagagcctccagagaaaggctcttaaaaatgcagcgcaatctccagtgacagaagatactgctagaaatctgctagaaaaaaaacaaaaaaggcatgtatagaggaattatgagggaaagataccaagtcacggtttattcttcaaaatggaggtggcttgttgggaaggtggaagctcatttggccagagtggaaatggaattgggagaaatcgatgaccaaatgtaaacacttggtgcctgatatagcttgacaccaagttagccccaagtgaaataccctggcaatattaatgtgtcttttcccgatattcctcaggtactccaaagattcaggtttactcacgtcatccagcagagaatggaaagtcaaatttcctgaattgctatgtgtctgggtttcatccatccgaca(SEQ ID NO.30)
B2M切割位点下游同源臂837bp：
Tgaagttgacttactgaagaatggagagagaattgaaaaagtggagcattcagacttgtctttcagcaaggactggtctttctatctcttgtactacactgaattcacccccactgaaaaagatgagtatgcctgccgtgtgaaccatgtgactttgtcacagcccaagatagttaagtggggtaagtcttacattcttttgtaagctgctgaaagttgtgtatgagtagtcatatcataaagctgctttgatataaaaaaggtctatggccatactaccctgaatgagtcccatcccatctgatataaacaatctgcatattgggattgtcagggaatgttcttaaagatcagattagtggcacctgctgagatactgatgcacagcatggtttctgaaccagtagtttccctgcagttgagcagggagcagcagcagcacttgcacaaatacatatacactcttaacacttcttacctactggcttcctctagcttttgtggcagcttcaggtatatttagcactgaacgaacatctcaagaaggtataggcctttgtttgtaagtcctgctgtcctagcatcctataatcctggacttctccagtactttctggctggattggtatctgaggctagtaggaagggcttgttcctgctgggtagctctaaacaatgtattcatgggtaggaacagcagcctattctgccagccttatttctaaccattttagacatttgttagtacatggtattttaaaagtaaaacttaatgtcttccttttttttctccactgtctttttcatagatcgagacatgtaagcagcatcatggag(SEQ ID NO.31)。

Claims (9)

1.一种缺氧应答启动子元件，其特征在于，为基于CA9基因的启动子进行改造得到CA9-4HRE或CA9-4HRE-TA，其中，CA9-4HRE的序列如SEQ ID NO.2所示，CA9-4HRE-TA的序列如SEQID NO.3所示。
2.如权利要求1所述的缺氧应答启动子元件，其特征在于，所述的CA9-4HRE是在CA9-WT序列中插入3个HRE序列5’-TGCACGTA-3’，并将-74nt的C突变为A得到。
3.如权利要求1所述的缺氧应答启动子元件，其特征在于，所述的CA9-4HRE-TA是在CA9-WT序列中插入3个HRE序列5’-TGCACGTA-3’，并将-74nt的C突变为A，再将+30-+37nt的“5’-CACAGTCA-3’”变为“5’-TATATATA-3’”得到。
4.权利要求1中的所述的缺氧应答启动子元件在显著提高缺氧环境下细胞中下游基因表达的应用。
5.一种缺氧环境下可高表达下游基因的细胞，其特征在于，含有如权利要求1所述的缺氧应答启动子元件。
6.如权利要求4所述的细胞，其特征在于，通过缺氧应答启动子元件和质粒载体构建重组质粒，然后转染细胞获得。
7.一种缺氧环境下可高表达P61基因的hUC-MSC细胞株，其特征在于，通过如权利要求1中所述的缺氧应答启动子元件构建表达P61的重组质粒，将重组质粒转染脐带间充质干细胞，获得缺氧环境下高表达P61基因和和常氧环境下低表达P61基因的hUC-MSC细胞株。
8.如权利要求7所述的hUC-MSC细胞株，其特征在于，所述表达P61的重组质粒为B2M-CA9-4HRE-TA-EGFP-P61。
9.如权利要求7或8所述的hUC-MSC细胞株在制备治疗缺血性脑卒中、冠心病、缺血性心力衰竭的细胞药物中的应用。
CN202410724475.9A 2024-06-05 2024-06-05 一种缺氧应答启动子元件及其应用 Pending CN118879693A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202410724475.9A CN118879693A (zh) 2024-06-05 2024-06-05 一种缺氧应答启动子元件及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202410724475.9A CN118879693A (zh) 2024-06-05 2024-06-05 一种缺氧应答启动子元件及其应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN118879693A true CN118879693A (zh) 2024-11-01

Family

ID=93219993

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202410724475.9A Pending CN118879693A (zh) 2024-06-05 2024-06-05 一种缺氧应答启动子元件及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN118879693A (zh)

Similar Documents

Publication Publication Date Title
AU2022235633A1 (en) Modified stem cell memory T cells, methods of making and methods of using same
JP2020508046A (ja) ゲノム編集システムおよび方法
WO2018188571A1 (zh) 基因组编辑系统和方法
WO2019120193A1 (zh) 拆分型单碱基基因编辑系统及其应用
CN116813749B (zh) 一种重组人源化iii型胶原蛋白及其制备方法和应用
CN110257420A (zh) 基于CasRx的植物基因沉默载体及其构建方法和应用
CN102453716B (zh) 猪骨骼肌特异性表达基因α-actin启动子的克隆及应用
CN102127546B (zh) 一种骨骼肌特异性actin启动子及其应用
CN103305516B (zh) 一种肺组织特异性sp-c启动子及其应用
CN118879693A (zh) 一种缺氧应答启动子元件及其应用
WO2024230181A1 (zh) 一种生产人源乳铁蛋白的枯草芽孢杆菌及其应用
CN115725551B (zh) MmBBK2在制备胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶抑制剂中的应用
CN117660533A (zh) 一种降低重组腺相关病毒中rcAAV残留的包装质粒及应用
CN114990093A (zh) 氨基酸序列小的蛋白序列mini rfx-cas13d
CN110946877A (zh) 一种治疗肝硬化的干细胞生物制品及其制备方法与应用
CN111944811A (zh) 靶向敲除FRZB基因的双sgRNA和敲除FRZB基因的猪成纤维细胞系及其应用
CN103834660A (zh) 一种肺组织特异性bpifa3启动子及其应用
CN117568311B (zh) 一种用于精准基因编辑的工程化crispr融合蛋白和系统及其应用
CN103667346B (zh) 一种pRBE-HCR-hAAT-hFIXml质粒及其构建和应用
CN102649960B (zh) 一种骨骼肌特异性MYHC-II b启动子及其应用
CN102226182A (zh) 人自吞噬基因Beclin 1启动子序列及其应用
CN118620897A (zh) 一种敲除猪Cofilin基因的sgRNA及其应用
CN101514340B (zh) 人自吞噬基因Beclin 1启动子序列及其应用
CN119082083A (zh) 人源化CRISPRa系统及其应用
CN118834876A (zh) 一种乳酸菌组成型启动子、重组载体及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination