CN110946877A

CN110946877A - 一种治疗肝硬化的干细胞生物制品及其制备方法与应用

Info

Publication number: CN110946877A
Application number: CN201911399028.6A
Authority: CN
Inventors: 曾宪卓; 余振东; 汪月; 王琳
Original assignee: Shenzhen Istem Regenerative Medicine Sci Tech Co ltd; Peking University Shenzhen Hospital
Current assignee: Shenzhen Istem Regenerative Medicine Sci Tech Co ltd; Peking University Shenzhen Hospital
Priority date: 2019-12-30
Filing date: 2019-12-30
Publication date: 2020-04-03

Abstract

为克服现有肝硬化常规治疗方法效果不足的问题，本发明提供了一种干细胞生物制品，包括间充质干细胞，所述间充质干细胞经转染引入有载体，所述载体上包括CCR9基因序列。同时，本发明还公开了上述干细胞生物制品的制备方法及应用。本发明提供的干细胞生物制品，利用CCL25与受体CCR9结合具有细胞趋化的作用，提高了间充质干细胞在肝硬化病灶部位的特异性归巢能力，提高局部干细胞数量，有效提高间充质干细胞对肝硬化的治疗效果。

Description

一种治疗肝硬化的干细胞生物制品及其制备方法与应用

技术领域

本发明属于干细胞技术领域，具体涉及一种治疗肝硬化的干细胞生物制品及其制备方法、应用。

背景技术

肝硬化是临床常见的慢性进行性肝病，由一种或多种病因长期或反复作用形成的弥漫性肝损害，以肝组织弥漫性纤维化、假小叶和再生结节形成为特征的慢性肝病。在我国大多数为肝炎后肝硬化，少部分为酒精性肝硬化和血吸虫性肝硬化。本病发病高峰年龄在35～48岁，男女比例约为(3.6～8)：1。

研究表明，趋化因子CCL25在正常肝组织、肝纤维化以及肝硬化病人肝组织中均有表达，肝脏发生纤维增生性损伤时，肝内的CCL25的含量显著增加，同时随着肝纤维化向肝硬化病程加深，肝硬化病人的肝组织中CCL25含量最高。骨髓源性肝干细胞可以在CCL25的趋化作用下迁移并定植到肝脏损伤部位，补充因为疾病损伤而减少的肝细胞数量、修复因为疾病损伤而破坏了的肝组织结构。

发明内容

针对现有肝硬化常规治疗方法效果不足的问题，本发明提供了一种治疗肝硬化的干细胞生物制品及其制备方法、应用。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案如下：

一方面，本发明提供了一种干细胞生物制品，包括间充质干细胞，所述间充质干细胞经转染引入有载体，所述载体上包括CCR9基因序列。

可选的，所述间充质干细胞为分离于哺乳动物体外的间充质干细胞，所述间充质干细胞包括脐带间充质干细胞、胎盘间充质干细胞、脂肪间充质干细胞、骨髓间充质干细胞和牙髓间充质干细胞中的一种或多种。

可选的，所述载体选自质粒载体，所述质粒载体包括pcDNA3.1+、pcDNA3.1-HisA,B,C、pcDNA3.1-3xflag和pcDNA6/MYC-HIS A,B,C中的一种或多种。

可选的，所述CCR9基因序列包括如SEQ ID NO.9所示的序列，转入CCR9基因序列的载体包括如SEQ ID NO.10所示的序列。

另一方面，本发明提供了如上所述的干细胞生物制品的制备方法，包括以下操作：

获取CCR9目的基因；

构建包括CCR9基因序列的载体；

获取间充质干细胞；

载体转染间充质干细胞。

可选的，所述“获取CCR9目的基因”包括以下操作：

收取肝组织样本，提取总RNA，设计扩增引物，以逆转录-聚合酶链式反应法PCR扩增CCR9基因全长，电泳，纯化CCR9目的基因片段。

可选的，所述“构建包括CCR9基因序列的载体”之后，将包括CCR9基因序列的载体转染至原核细胞中进行扩充培养，提取包括CCR9基因序列的载体。

可选的，所述“获取间充质干细胞”的途径包括获取脐带、胎盘、脂肪、骨髓或牙髓，进行培养和分离，得到间充质干细胞。

可选的，所述“载体转染间充质干细胞”的方式包括电击法、磷酸钙法、脂质体介导法和病毒介导法。

另一方面，本发明提供了如上所述的干细胞生物制品在制备治疗肝硬化的药物中的应用。

根据本发明提供的干细胞生物制品，通过基因转染的方式在间充质干细胞中转入带有CCR9基因序列的载体，从而促进间充质干细胞中趋化因子受体CCR9的高表达，由于炎性部位高表达CCL25，由于CCL25为趋化因子，CCL25与受体CCR9结合具有细胞趋化的作用，提高了间充质干细胞在肝硬化病灶部位的特异性归巢能力，提高局部干细胞数量，有效提高间充质干细胞对肝硬化的治疗效果。

附图说明

图1为CCR9蛋白表达的western blot检测结果。

具体实施方式

为了使本发明所解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

本发明一实施例提供了一种干细胞生物制品，包括间充质干细胞，所述间充质干细胞经转染引入有载体，所述载体上包括CCR9基因序列。

趋化因子受体9(CCR9)是趋化因子受体家族中的一员，CCR9是一类小分子G蛋白偶联受体，只有一个已知的配体趋化因子25(CCL25)。CCR9主要表达在淋巴细胞，树突状细胞及单核巨噬细胞等细胞膜上，研究证明CCR9参与多种炎症性疾病的发生发展，包括炎症性肠病、急性肝炎、类风湿性关节炎等炎症疾病。本实施例提供的间充质干细胞通过转染导入包括CCR9基因序列的载体，能促进受体CCR9的高表达，从而促进上述治疗效果，促进间充质干细胞在病灶位置归巢。

所述间充质干细胞中载体并非天然存在的物质，而是作为通过基因工程的方法进行人工操作的结果。

在一些实施例中，所述间充质干细胞包括脐带间充质干细胞、胎盘间充质干细胞、脂肪间充质干细胞、骨髓间充质干细胞和牙髓间充质干细胞中的一种或多种。

在优选的实施例中，所述充间质干细胞选自脐带间充质干细胞。

在一些实施例中，所述间充质干细胞为分离于哺乳动物体外的间充质干细胞。

所述哺乳动物包括人及其他哺乳动物。

在一些实施例中，所述载体选自质粒载体，所述质粒载体包括pcDNA3.1+、pcDNA3.1-HisA,B,C、pcDNA3.1-3xflag和pcDNA6/MYC-HIS A,B,C中的一种或多种。

在其他实施例中，所述载体还可采用病毒载体。

在一些实施例中，所述CCR9基因序列包括如SEQ ID NO.9所示的序列。

在一些实施例中，转入CCR9基因序列的载体包括如SEQ ID NO.10所示的序列。

需要说明的是，本发明中的CCR9基因序列不局限于实施例中所用的SEQ ID NO.9所示的序列，载体也不限于如SEQ ID NO.10所示的序列，其他CCR9序列以及可能新发现的CCR9序列及其变体或是其他载体经过常规验证均可使用，CCR9基因序列可以将本说明书或后附的序列表所公开的序列信息、公共数据库(例如DDBJ/EMBL/GenBank)中登录的序列信息作为参考，使用标准的基因工程方法、分子生物学方法、生化学方法等来制备。采用其他CCR9序列以及可能新发现的CCR9序列及其变体或是其他载体，其相应引物和分子生物学实验操作也可以以分子生物学领域常规技术手段(如萨姆布鲁克《分子克隆实验指南》)完成，均应包括在本发明的保护范围之内。

考虑到密码子的简并，只要是编码相同蛋白质(即CCR9受体)的DNA序列，则与SEQID NO.9所示的DNA序列在功能上等价，可以作为本发明中的CCR9基因使用。另外，一般而言，对某一蛋白质的氨基酸序列的一部分进行改变时，有时改变后的蛋白质与改变前的蛋白质具有同等的功能。即，有时氨基酸序列的改变对蛋白质的功能没有实质性的影响，蛋白质的功能在改变前后维持不变。因此，与SEQ ID NO.9所示的DNA序列编码的蛋白质具有同源的氨基酸序列、并且作为CCR9受体作用的蛋白质(以下也称为“同源蛋白质”)的DNA序列也可以作为本发明的CCR9基因使用。此处的“同源的氨基酸序列”是指，与SEQ ID NO.9所示的氨基酸序列部分不同、但该不同对蛋白质的功能(该情况下为CCR9受体活性)没有实质性影响的氨基酸序列。

“氨基酸序列的部分不同”，典型地是指通过构成氨基酸序列的一个至数个氨基酸的缺失、取代、或一个至数个氨基酸的添加、插入、或者它们的组合使氨基酸序列产生突变(变化)。此处的氨基酸序列的不同只要不使CCR9受体活性大幅下降就是容许的。只要满足该条件则氨基酸序列不同的位置没有特别限制，另外也可以在多个位置产生不同。此处的多个例如为相当于小于全部氨基酸的约30％的个数，优选为相当于小于约20％的个数，进一步优选为相当于小于约10％的个数，更进一步优选为相当于小于约5％的个数，最优选为相当于小于约1％的个数。即，同源蛋白质与序列编号15的氨基酸序列具有例如约70％以上、优选约80％以上、进一步优选约90％以上、更进一步优选约95％以上、最优选约99％以上的同源性。

本发明的另一实施例提供了如上所述的干细胞生物制品的制备方法，包括以下操作：

获取CCR9目的基因；

构建包括CCR9基因序列的载体；

获取间充质干细胞；

载体转染间充质干细胞。

在一些实施例中，所述“获取CCR9目的基因”包括以下操作：

收取患者肝组织样本，提取总RNA，设计扩增引物，以逆转录-聚合酶链式反应法PCR扩增CCR9基因全长，电泳，纯化CCR9目的基因片段。

在一些实施例中，所述CCR9基因序列的酶切位点为Kpn1和EcoR1，应用Primer6.0软件设计CCR9基因的扩增引物，引物序列如下：

(1)当载体选自pcDNA3.1+时，设计引物序列如下：

CCR9-Kpn1-F1:ggggtaccat gacacccaca gacttcaca(SEQ ID NO.1)

CCR9-EcoR1-R1:cggaattctc agagggagag tgctcctg(SEQ ID NO.2)

(2)当载体选自pcDNA3.1-HisA,B,C时，设计引物序列如下：

CCR9-Kpn1-F2:ggggtaccaa tgacacccac agacttcaca(SEQ ID NO.3)

CCR9-EcoR1-R1:cggaattctc agagggagag tgctcctg(SEQ ID NO.4)

(3)当载体选自pcDNA3.1-3xflag时，设计引物序列如下：

CCR9-EcoR1-F3:cggaattcat gacacccaca gacttcaca(SEQ ID NO.5)

CCR9-Kpn1-R3:ggggtacccg gagggagagt gctcctgagg(SEQ ID NO.6)

(4)当载体选自pcDNA6/MYC-HIS A,B,C时，设计引物序列如下：

CCR9-Kpn1-F1:ggggtaccat gacacccaca gacttcaca(SEQ ID NO.7)

CCR9-EcoR1-R4:cggaattccg gagggagagt gctcctgagg(SEQ ID NO.8)。

在一些实施例中，所述“构建包括CCR9基因序列的载体”包括以下操作：

通过限制性内切酶对载体进行双酶切，加入CCR9目的基因和连接酶，使CCR9目的基因转入载体的酶切位点。

在转入CCR9目的基因时，可在载体中追加功能序列(例如选择标记或增强子)等进一步的改变。

另外，关于构建本发明的表达载体时所需的操作方法、试剂、条件等，可以参考例如分子克隆(Molecular Cloning)(第三版，冷泉港实验室出版社，纽约)或分子生物学实验方法汇编(Frederick M.Ausubel等编著，1987)等。

在一些实施例中，所述“构建包括CCR9基因序列的载体”之后，将包括CCR9基因序列的载体转染至原核细胞中进行扩充培养，提取包括CCR9基因序列的载体。

通过原核细胞对包括CCR9基因序列的载体进行扩充培养，能够有利于后续包括CCR9基因序列的载体的提纯和检测载体是否表达成功。

所述原核细胞选自于大肠杆菌或其他适合培养载体的原核细菌。

在一些实施例中，所述“获取间充质干细胞”的途径包括获取脐带、胎盘、脂肪、骨髓或牙髓，进行培养和分离，得到间充质干细胞。

在一些实施例中，所述“载体转染间充质干细胞”的方式包括电击法、磷酸钙法、脂质体介导法和病毒介导法。

在优选的实施例中，采用脂质体介导法处理所述间充质干细胞，以使载体成功转染至间充质干细胞中。

本发明的另一实施例提供了如上所述的干细胞生物制品在制备治疗肝硬化的药物中的应用。

所述干细胞生物制品可通过静脉注射或病灶位置局部注射。

以下通过实施例对本发明进行进一步的说明。

实施例1

本实施例用于说明本发明公开的干细胞生物制品及其制备方法，包括以下操作步骤：

步骤一、载有目的基因CCR9重组质粒载体的构建

步骤1、获取目的基因。收取患者肝组织样本，采用Trizol试剂，提取总RNA，琼脂糖电泳鉴定总RNA有无降解。设计扩增引物为：

CCR9-Kpn1-F1:ggggtaccat gacacccaca gacttcaca(SEQ ID NO.1)

CCR9-EcoR1-R1:cggaattctc agagggagag tgctcctg(SEQ ID NO.2)

取1μg总RNA以OligodT(20)逆转录cDNA，RT-PCR法扩增CCR9基因全长。

PCR条件：98℃变性15s，68℃退火及延伸3min，循环35次，末次循环后72℃延长15min。琼脂糖凝胶电泳观察，切胶回收并纯化目的基因片段。

步骤2、载体双酶切。灭菌的EP管，取5ug的质粒载体pcDNA3.1+，用Kpn1和EcoR1双酶切，1.5ul Kpn1，1.5ul EcoR1；用dd H₂O补充总体系为50ul，37℃酶切20min，取酶切产物6ul进行1.5％琼脂糖凝胶电泳，30min；将凝胶置于紫外灯下，判定目的片段位置进行割胶回收，将回收的胶放入无菌EP管中，利用微量琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收DNA目的片段。

步骤3、目的片段与载体连接。目的片段CCR9与商用质粒载体pcDNA3.1+链接，反应体系：pcDNA3.1+100ng，CCR9 100ng，5*CE II Buffer 4ul，ClonExpress II One StepCloning Kit连接酶2ul；dd H₂O添加至总体积20ul；37℃连接，30min，冰浴5min。

步骤4、连接产物转化感受态细胞。在冰中解冻感受态细胞150ul，解冻后加入2ul连接产物，摇匀冰浴30min后于42℃水浴中热休克45s，然后迅速冰浴2min。然后放入500ulLB培养基，37℃、225r/min震荡培养箱中培养1h，取50ul，100ul，150ul 3个递增梯度的量的菌液均匀涂布于3个含Amp抗生素(100μg/ml)的琼脂平板上。倒置放于37℃孵育箱中过夜培养。挑取单个菌落于Amp+LB(100μg/ml)培养基3管(每管约5ml)中培养12～16h，测定其OD值约为2～3时提取质粒。

步骤5、质粒提取。取细菌培养液5ml于干净无菌的离心管中，8000r/min离心2min，吸干培养基；加入250μl Buffer P1/RNaseA混合液，使用涡旋振荡器彻底悬浮细菌沉淀；加入250μl Buffer P2，立即平和颠倒混匀离心管5～10次，室温静置2～4min；加入350μlBuffer P3，出现白色沉淀，立即平和颠倒离心管5～10次混匀，12000r/min离心12min，将上清全部移入吸附柱，8000r/min离心30s，倒掉收集管中的液体；在吸附柱中加入500μlBuffer DW1，8000r/min离心30s，倒掉收集管中的液体；在吸附柱中加入500μl WashSolution，10000r/min离心30s，倒掉收集管中的液体；再用500μl Wash Solution洗一次，10000r/min离心30s，倒掉收集管中的液体。离心空吸附柱，8000r/min离心1min；将吸附柱放入新的1.5ml离心管中，在吸附膜中央加入65μl已经预热到65℃的Elution buffer，为提高洗脱率，室温静置2min，8000r/min离心1min，将所得质粒DNA溶液置于-20℃保存，用于后续的体外转录实验。

步骤6、质粒酶切鉴定。用限制性内切酶Knp1和EcoR1进行双酶切，酶切反应体系为:10×Buffer 5ul；pcDNA3.1-CCR9 2μg；限制性内切酶Knp1和EcoR1各1ul；加无酶水补充到总体积20ul；37℃酶切20min。酶切完成后，取6ul 15000Marker和6ul酶切产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳检测。琼脂糖凝胶电泳鉴定完毕后，送上海生工进行质粒DNA序列测定，测序结果与序列SEQ ID NO.9对比，证明pcDNA3.1-CCR9真核表达载体构建成功。

步骤二、脐带间充质干细胞的分离培养

步骤1：脐带自手术台取下后，浸入含抗生素的0.9％生理盐水中，4℃保存；

步骤2：在超净台内取出脐带，用生理盐水冲洗净脐动脉和脐静脉内的残余血液，用止血:钳和剪刀剔除上述血管，将脐带剪成1mm^3大小的组织块；

步骤3：加入质量/体积比为0.1％的II型胶原酶至完全覆盖组织块，置于培养箱内持续消化6h，100目筛网过滤收集细胞；

步骤4：生理盐水冲洗细胞3次，每次2000rpm，8min；

步骤5：用含10％FBS的DMEM/F12培养液重悬细胞，调整细胞密度为1x106cells/ml，接种于T.25培养瓶中，置于37℃、饱和湿度、5％C0₂培养箱内培养；

步骤6：3天后全量换为MesenPRORSrMMedium培养液，弃去未贴壁的细胞与杂质，以后根据细胞生长情况，每3天换液一次。

步骤三、脂质体瞬时转染脐带间充质干细胞

脐带间充质干细胞在MesenPRORSrMMedium培养液中37℃5％CO₂培养至细胞密度达到80％后，用Lipofectamine TM 2000试剂盒将pcDNA3.1-CCR9DNA转染至脐带间充质干细胞，具体步骤参考试剂盒说明书。24h后，细胞可转染5μg pcDNA3.1-CCR9 DNA。

实施例2

本实施例用于说明本发明公开的干细胞生物制品及其制备方法，包括实施例1中大部分操作步骤，其不同之处在于：

步骤一中，步骤1设计扩增引物为：

CCR9-Kpn1-F2:ggggtaccaa tgacacccac agacttcaca(SEQ ID NO.3)

CCR9-EcoR1-R1:cggaattctc agagggagag tgctcctg(SEQ ID NO.4)；

步骤3目的片段CCR9与商用质粒载体pcDNA3.1-HisA,B,C链接。

构建pcDNA3.1-HisA,B,C-CCR9表达载体。

步骤三中，采用pcDNA3.1-HisA,B,C-CCR9对脐带间充质干细胞进行转染。

实施例3

步骤一中，步骤1设计扩增引物为：

CCR9-EcoR1-F3:cggaattcat gacacccaca gacttcaca(SEQ ID NO.5)

CCR9-Kpn1-R3:ggggtacccg gagggagagt gctcctgagg(SEQ ID NO.6)；

步骤3目的片段CCR9与商用质粒载体pcDNA3.1-3xflag链接。

构建pcDNA3.1-3xflag-CCR9表达载体。

步骤三中，采用pcDNA3.1-3xflag-CCR9对脐带间充质干细胞进行转染。

实施例4

步骤一中，步骤1设计扩增引物为：

CCR9-Kpn1-F1:ggggtaccat gacacccaca gacttcaca(SEQ ID NO.7)

CCR9-EcoR1-R4:cggaattccg gagggagagt gctcctgagg(SEQ ID NO.8)；

步骤3目的片段CCR9与商用质粒载体pcDNA6/MYC-HIS A,B,C链接。

构建pcDNA6/MYC-HIS A,B,C-CCR9表达载体。

步骤三中，采用pcDNA6/MYC-HIS A,B,C-CCR9对脐带间充质干细胞进行转染。

对比例1

本对比例用于对比说明本发明公开的干细胞生物制品及其制备方法，包括实施例1中大部分操作步骤，其不同之处在于：

不进行步骤一载有目的基因CCR9重组质粒载体的构建；

步骤三中，采用无血清培养基替换Lipofectamine TM 2000试剂盒对脐带间充质干细胞进行处理。

对比例2

不进行步骤一载有目的基因CCR9重组质粒载体的构建；

步骤三中，脐带间充质干细胞在MesenPRORSrMMedium培养液中37℃5％CO₂培养至细胞密度达到80％后，用Lipofectamine TM 2000试剂盒将pcDNA3.1转染至脐带间充质干细胞，具体步骤参考试剂盒说明书。24h后，细胞可转染5μg pcDNA3.1DNA。

性能测试

转染脐带间充质干细胞的CCR9表达情况检测

转染细胞48h后收集目的细胞并提取蛋白，用BCA试剂盒检测其浓度。按比例将上样缓冲液加入50～80μg的蛋白样品，沸水浴10min，冷却离心后在12％的分离胶进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS－PAGE)，湿转法在110V 90min电转至PVDF膜。用磷酸盐缓冲液和TBST溶解的5％的脱脂奶粉室温封闭1h，孵育一抗[兔来源的抗CCR9单克隆抗体(1：500)，兔来源的抗β-actin单克隆抗体(1：1 000)]4℃过夜，次日用TBST洗涤4遍(每次8min)，然后室温孵育辣根过氧化物酶标记的二抗(鼠抗兔的单抗IgG 1：5000)2h，最后用ECL来检测在PVDF膜上的蛋白表达情况。

测试结果如图1所示，其中标号1为对比例1的电泳结果，标号2为对比例2的电泳结果，标号3为实施例1的电泳结果，标号4为实施例2的电泳结果，标号5为实施例3的电泳结果，标号6为实施例4的电泳结果。

从图1的测试结果可知，相比于对比例1和对比例2的对照组，实施例1～4通过将CCR9基因通过质粒载体的方式转染至脐带间充质干细胞，能够促进脐带间充质干细胞中CCR9蛋白的高表达。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 深圳爱生再生医学科技有限公司北京大学深圳医院

<120> 一种治疗肝硬化的干细胞生物制品及其制备方法与应用

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

ggggtaccat gacacccaca gacttcaca 29

<210> 2

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

cggaattctc agagggagag tgctcctg 28

<210> 3

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ggggtaccaa tgacacccac agacttcaca 30

<210> 4

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

cggaattctc agagggagag tgctcctg 28

<210> 5

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

cggaattcat gacacccaca gacttcaca 29

<210> 6

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

ggggtacccg gagggagagt gctcctgagg 30

<210> 7

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

ggggtaccat gacacccaca gacttcaca 29

<210> 8

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

cggaattccg gagggagagt gctcctgagg 30

<210> 9

<211> 1110

<212> DNA

<213> CCR9基因

<400> 9

atgacaccca cagacttcac aagccctatt cctaacatgg ctgatgacta tggctctgaa 60

tccacatctt ccatggaaga ctacgttaac ttcaacttca ctgacttcta ctgtgagaaa 120

aacaatgtca ggcagtttgc gagccatttc ctcccaccct tgtactggct cgtgttcatc 180

gtgggtgcct tgggcaacag tcttgttatc cttgtctact ggtactgcac aagagtgaag 240

accatgaccg acatgttcct tttgaatttg gcaattgctg acctcctctt tcttgtcact 300

cttcccttct gggccattgc tgctgctgac cagtggaagt tccagacctt catgtgcaag 360

gtggtcaaca gcatgtacaa gatgaacttc tacagctgtg tgttgctgat catgtgcatc 420

agcgtggaca ggtacattgc cattgcccag gccatgagag cacatacttg gagggagaaa 480

aggcttttgt acagcaaaat ggtttgcttt accatctggg tattggcagc tgctctctgc 540

atcccagaaa tcttatacag ccaaatcaag gaggaatccg gcattgctat ctgcaccatg 600

gtttacccta gcgatgagag caccaaactg aagtcagctg tcttgaccct gaaggtcatt 660

ctggggttct tccttccctt cgtggtcatg gcttgctgct ataccatcat cattcacacc 720

ctgatacaag ccaagaagtc ttccaagcac aaagccctaa aagtgaccat cactgtcctg 780

accgtctttg tcttgtctca gtttccctac aactgcattt tgttggtgca gaccattgac 840

gcctatgcca tgttcatctc caactgtgcc gtttccacca acattgacat ctgcttccag 900

gtcacccaga ccatcgcctt cttccacagt tgcctgaacc ctgttctcta tgtttttgtg 960

ggtgagagat tccgccggga tctcgtgaaa accctgaaga acttgggttg catcagccag 1020

gcccagtggg tttcatttac aaggagagag ggaagcttga agctgtcgtc tatgttgctg 1080

gagacaacct caggagcact ctccctctga 1110

<210> 10

<211> 1531

<212> DNA

<213> 人工质粒

<400> 10

cattgacgtc aatgggagtt tgttttggca ccaaaatcaa cgggactttc caaaatgtcg 60

taacaactcc gccccattga cgcaaatggg cggtaggcgt gtacggtggg aggtctatat 120

aagcagagct ctctggctaa ctagagaacc cactgcttac tggcttatcg aaattaatac 180

gactcactat agggagaccc aagctggcta gcgtttaaac ttaagcttgg taccatgaca 240

cccacagact tcacaagccc tattcctaac atggctgatg actatggctc tgaatccaca 300

tcttccatgg aagactacgt taacttcaac ttcactgact tctactgtga gaaaaacaat 360

gtcaggcagt ttgcgagcca tttcctccca cccttgtact ggctcgtgtt catcgtgggt 420

gccttgggca acagtcttgt tatccttgtc tactggtact gcacaagagt gaagaccatg 480

accgacatgt tccttttgaa tttggcaatt gctgacctcc tctttcttgt cactcttccc 540

ttctgggcca ttgctgctgc tgaccagtgg aagttccaga ccttcatgtg caaggtggtc 600

aacagcatgt acaagatgaa cttctacagc tgtgtgttgc tgatcatgtg catcagcgtg 660

gacaggtaca ttgccattgc ccaggccatg agagcacata cttggaggga gaaaaggctt 720

ttgtacagca aaatggtttg ctttaccatc tgggtattgg cagctgctct ctgcatccca 780

gaaatcttat acagccaaat caaggaggaa tccggcattg ctatctgcac catggtttac 840

cctagcgatg agagcaccaa actgaagtca gctgtcttga ccctgaaggt cattctgggg 900

ttcttccttc ccttcgtggt catggcttgc tgctatacca tcatcattca caccctgata 960

caagccaaga agtcttccaa gcacaaagcc ctaaaagtga ccatcactgt cctgaccgtc 1020

tttgtcttgt ctcagtttcc ctacaactgc attttgttgg tgcagaccat tgacgcctat 1080

gccatgttca tctccaactg tgccgtttcc accaacattg acatctgctt ccaggtcacc 1140

cagaccatcg ccttcttcca cagttgcctg aaccctgttc tctatgtttt tgtgggtgag 1200

agattccgcc gggatctcgt gaaaaccctg aagaacttgg gttgcatcag ccaggcccag 1260

tgggtttcat ttacaaggag agagggaagc ttgaagctgt cgtctatgtt gctggagaca 1320

acctcaggag cactctccct ctgagaattc tgcagatatc cagcacagtg gcggccgctc 1380

gagtctagag ggcccgttta aacccgctga tcagcctcga ctgtgccttc tagttgccag 1440

ccatctgttg tttgcccctc ccccgtgcct tccttgaccc tggaaggtgc cactcccact 1500

gtcctttcct aataaaatga ggaaattgca t 1531

Claims

1.一种干细胞生物制品，其特征在于，包括间充质干细胞，所述间充质干细胞经转染引入有载体，所述载体上包括CCR9基因序列。

2.根据权利要求1所述的干细胞生物制品，其特征在于，所述间充质干细胞为分离于哺乳动物体外的间充质干细胞，所述间充质干细胞包括脐带间充质干细胞、胎盘间充质干细胞、脂肪间充质干细胞、骨髓间充质干细胞和牙髓间充质干细胞中的一种或多种。

3.根据权利要求1所述的干细胞生物制品，其特征在于，所述载体选自质粒载体，所述质粒载体包括pcDNA3.1+、pcDNA3.1-HisA,B,C、pcDNA3.1-3xflag和pcDNA6/MYC-HIS A,B,C中的一种或多种。

4.根据权利要求1所述的干细胞生物制品，其特征在于，所述CCR9基因序列包括如SEQID NO.9所示的序列，转入CCR9基因序列的载体包括如SEQ ID NO.10所示的序列。

5.根据权利要求1～4任意一项所述的干细胞生物制品的制备方法，其特征在于，包括以下操作：

获取CCR9目的基因；

构建包括CCR9基因序列的载体；

获取间充质干细胞；

载体转染间充质干细胞。

6.根据权利要求5所述的干细胞生物制品，其特征在于，所述“获取CCR9目的基因”包括以下操作：

7.根据权利要求5所述的干细胞生物制品，其特征在于，所述“构建包括CCR9基因序列的载体”之后，将包括CCR9基因序列的载体转染至原核细胞中进行扩充培养，提取包括CCR9基因序列的载体。

8.根据权利要求5所述的干细胞生物制品，其特征在于，所述“获取间充质干细胞”的途径包括获取脐带、胎盘、脂肪、骨髓或牙髓，进行培养和分离，得到间充质干细胞。

9.根据权利要求5所述的干细胞生物制品，其特征在于，所述“载体转染间充质干细胞”的方式包括电击法、磷酸钙法、脂质体介导法和病毒介导法。

10.根据权利要求1～4任意一项所述的干细胞生物制品在制备治疗肝硬化的药物中的应用。