CN114277119B - 一种环状RNA circ-Arsb在制备防治骨质疏松产品中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种环状RNAcirc‑Arsb在制备防治骨质疏松产品中的应用；本发明通过对circ‑Arsb进行破骨细胞功能学的研究，发现沉默circ‑Arsb的表达抑制了破骨细胞分化和骨吸收；反之，过表达circ‑Arsb促进了破骨细胞分化和骨吸收。基于此，本发明使用检测circ‑Arsb的试剂制备骨质疏松诊断试剂盒；使用包括抑制或阻止circ‑Arsb表达的试剂，或者与circ‑Arsb基因表达产物结合，使circ‑Arsb表达产物失去活性的试剂作为治疗骨质疏松的药物组合物的有效成分。

Description

一种环状RNA circ-Arsb在制备防治骨质疏松产品中的应用

技术领域

本发明属于生物医药技术与骨质疏松领域，具体涉及一种环状RNA circ-Asrb在制备诊治骨质疏松产品中的应用。

背景技术

骨质疏松症是代谢性全身性的骨骼相关疾病，其表现为骨量减少、骨小梁稀疏变薄、骨机械强度下降等等。病理性髋部骨折和脊柱胸腰段的骨折是由该疾病导致的严重临床表现，骨折的发生进展可导致老龄患者致残、致死。当前，骨质疏松的治疗方法主要包括：药物治疗，如双膦酸盐、降钙素、锶雷奈酸盐、激素替代治疗药物、重组人甲状旁腺激素相关药物、狄诺塞麦和洛莫索珠单抗；手术治疗，如以注入骨水泥为主的PKP(经皮椎体后凸成形术)和PVP(椎体成形术)手术治疗。但是，骨质疏松症的发病机制复杂、个人差异丰富多样，当前药物治疗和手术治疗仍不能取得满意结局。因此，积极探索预防和治疗骨质疏松的方法，有助于提高人类的健康水平和生活质量。

环状RNA(circRNA)是一类由mRNA前体在成熟过程中通过反向剪切形成的单链、闭合RNA分子，具有性质稳定、物种保守性强，疾病特异性的特点，在生理、病理过程中扮演分子标签与调控因子的角色。大多数circRNA是外显子来源，通过套索驱动环化形成共价结合的闭合环状结构，具有高度稳定性。环状RNA可通过多种机制发挥生物学功能：如作为miRNA海绵竞争性结合miRNA的结合位点，进而使miRNA失去对下游靶基因的调节功能，如circ-ASAP1通过吸附miR-326和miR-532-5p发挥竞争性内源性RNA 的作用参与肝细胞性肝癌的转移[Circular RNA Sequencing Identifies CircASAP1 as a Key Regulator inHepatocellular Carcinoma Metastasis.Hepatology 2019]；环状RNA也可以作为支架，介导复合体的形成，同时结合特异性的酶和对应的底物，进而特定蛋白在细胞内移位并发挥作用，如circ-Amotl1结合三磷酸肌醇依赖蛋白激酶 1(3-phosphoinositide-dependentprotein kinase 1,PDK1)和RAC-α丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶1(RAC-alphaserine/threonine-protein kinase,AKT1)促进pAKT进入细胞核，进而发挥心肌细胞保护作用[ACircular RNA Binds To and Activates AKT Phosphorylation and NuclearLocalization Reducing Apoptosis and Enhancing Cardiac Repair.Theranostics2017,7(16):3842-3855]；还有一些环状RNA可以翻译成蛋白质发挥作用，如circLINC-PINT通过编码肽PINT87aa抑制胶质瘤致癌基因转录[Apeptide encoded by circular formofLINC-PINT suppresses oncogenic transcriptional elongation inglioblastoma.Nat Commun 2018,9(1): 4475]。

circ-Arsb是来自于ARSB(Arylsulfatase B，ARSB)的外显子环状RNA。ARSB是糖胺聚糖降解酶芳基硫酸酯酶，是人鼠保守基因，已有研究报道ARSB敲除破骨细胞的骨吸收功能降低。但circ-Arsb的功能目前尚不清楚，尤其是在骨质疏松中的作用及其应用尚无报道。

由于骨质疏松的病理机制复杂，传统药物具有副作用、周期长等缺陷，目前缺乏可靠治疗靶位点，因而限制了患者的预后。

发明内容

为解决骨质疏松诊治的相关问题，本发明提出一种环状RNA circ-Arsb在骨质疏松诊治及破骨细胞抑制方面的应用，目的在于根据发明人对环状RNA circ-Arsb在人骨质疏松中的表达及其对破骨细胞生物学功能的调节作用和研究，提供基于circ-Arsb及其表达产物在骨质疏松诊断试剂盒和治疗药物的应用。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

第一方面，本发明提供一种骨质疏松诊断试剂盒，该骨质疏松诊断试剂盒包括检测 circ-Arsb的试剂。

作为优选，所述circ-Asrb的circBase ID为hsa_circ_0073119。

作为优选，所述试剂盒还包括扩增circ-Arsb的引物，所述引物包括如SEQ IDNo.7 和SED ID No.8所示的核酸序列组成的引物对。

第二方面，本发明还提供了一种治疗骨质疏松的药物组合物；该药物组合物包括抑制或阻止circ-Arsb表达的试剂，或者与circ-Arsb基因表达产物结合，使circ-Arsb表达产物失去活性的试剂。所述circ-Arsb的核苷酸序列如SEQ ID No.1所述。

作为优选，与circ-Arsb基因表达产物结合，使circ-Arsb表达产物失去活性的试剂中包括沉默序列，其正义链如SEQ ID No.19；反义链如SEQ ID No.20。

作为优选，所述抑制或阻止circ-Arsb表达的试剂采用用于沉默circ-Arsb表达的Lsh-RNA或siRNA。

作为优选，所述Lsh-RNA所作用的靶序列如SEQ ID No.12所示。

第三方面，本发明还提供了circ-Arsb在制备骨质疏松诊断试剂盒的用途，所述circ-Arsb 的CircBase ID为hsa_circ_0073119。

第四方面，本发明还提供了以circ-Arsb及其表达产物作为靶点的试剂在制备或筛选治疗骨质疏松的药物中的用途，所述circ-Arsb的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。所述的试剂能够抑制或阻止circ-Arsb，或者与circ-Arsb基因表达产物结合，使circ-Arsb表达产物失去活性。

本发明的有益效果是：

1、本发明使用circ-Arsb及其表达产物作为诊断骨质疏松的标志物，使骨质疏松诊断更加准确、快速，作为制备治疗骨质疏松药物的靶基因为治疗骨质疏松提供了新的治疗靶点和治疗途径。

2、本发明提供试剂盒能够检测骨质疏松病人松质骨中circ-Arsb的表达情况，以发现其表达水平明显提高，作为骨质疏松的诊断标志，检测circ-Arsb表达含量与骨质疏松症的关联性已在小鼠样本中验证。

3、本发明通过对circ-Arsb进行破骨细胞功能学的研究，发现沉默circ-Arsb的表达抑制了破骨细胞分化和骨吸收；反之，过表达circ-Arsb促进了破骨细胞分化和骨吸收。基于此，本发明利用抑制或阻止circ-Arsb，或者与circ-Arsb基因表达产物结合，使circ-Arsb 表达产物失去活性的试剂实现了治疗骨质疏松的药物的制备。

附图说明

图1为实施例1中小鼠来源的BMMs中circ-Arsb的成环剪切位点及circ-Arsb的琼脂糖凝胶电泳图；

图2为实施例1中小鼠来源的破骨细胞中circ-Arsb的表达变化及对照组和骨松病人的松质骨标本中circ-Arsb的表达水平图；

图3为在BMMs中沉默circ-Arsb和过表达circ-Arsb的效率图及对其增殖和凋亡的作用图；

图4为在BMMs中沉默circ-Arsb和过表达circ-Arsb后，对其分化和骨吸收影响的作用图；

图5为在BMMs中circ-Arsb与EWSR1、YY1蛋白的相互作用分析图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。实施例中采用的实施条件可以根据具体厂家和实验室的条件做进一步调整，未注明的实施条件通常为常规实验中的条件。本发明通过举例而非给出限制的方式来进行说明。应注意的是，在文件中所述的“一”或“一种”实施方式未必是指同一种具体实施方式，而是指“至少有一种”。

实施例1circ-Arsb在破骨细胞中的表达水平

1.Circ-Arsb的简介

该环状RNA高度保守，在人或小鼠来源的物种中均是由Arsb基因的第5个外显子在转录时候，经反向剪切生成的环状RNA。其中小鼠来源的circ-Arsb又称为mmu_circ_0004889，长度为586bp，其对应的亲本基因位于chr5:78251117-78265015，其反向剪切位点为 TTCTCCACAG/(splice junction)ATCCATTTGG(SEQ ID No.16)。人源的circ-Arsb又称为hsa_circ_0073119，长度为586bp；其对应的亲本基因位于chr5:78251117-78265015，其反向剪切位点为CTACAG/(splicejunction)ATCCGT SEQ ID No.17(如图1中的A部分所示)。其琼脂糖凝胶电泳DNA片段如图1中B部分所示。

人源的circ-Arsb(SEQ ID No.1)：

ATCCGTACAGGTTTACAGCACCAAATAATCTGGCCCTGTCAGCCCAGCTGTGTTCCT CTGGATGAAAAACTCCTGCCCCAGCTCCTAAAAGAAGCAGGTTATACTACCCATATGGTCGGAAAATGGCACCTGGGAATGTACCGGAAAGAATGCCTTCCAACCCGCCGAGGATTTGA TACCTACTTTGGATATCTCCTGGGTAGTGAAGATTATTATTCCCATGAACGCTGTACATTAATTGACGCTCTGAATGTCACACGATGTGCTCTTGATTTTCGAGATGGCGAAGAAGTTGCAA CAGGATATAAAAATATGTATTCAACAAACATATTCACCAAAAGGGCTATAGCCCTCATAACTAACCATCCACCAGAGAAGCCTCTGTTTCTCTACCTTGCTCTCCAGTCTGTGCATGAGCC CCTTCAGGTCCCTGAGGAATACTTGAAGCCATATGACTTTATCCAAGACAAGAACAGGCATCACTATGCAGGAATGGTGTCCCTTATGGATGAAGCAGTAGGAAATGTCACTGCAGCTTT AAAAAGCAGTGGGCTCTGGAACAACACGGTGTTCATCTTTTCTACAG

小鼠来源的circ-Arsb(SEQ ID No.2)：

ATCCATTTGGGCTTACAGCATTACCTCATCATGACCTGTCAGCCCAGCTGTGTTCCCC TAGACGAAAAACTCCTGCCCCAGCTTTTAAAGGAAGCAGGCTATGCTACGCACATGGTCGGGAAATGGCACCTGGGGATGTACCGGAAAGAATGTCTGCCGACACGCCGAGGATTCGA TACCTACTTCGGATACCTCCTAGGCAGTGAAGACTATTACACCCACGAGGCCTGTGCGCC GATTGAGTCTTTGAATGGTACCCGCTGTGCGCTTGACTTAAGAGATGGTGAAGAACCTGCAAAAGAGTATAACAATATTTACTCAACAAACATATTTACCAAAAGGGCTACAACCGTCAT AGCTAACCACCCACCGGAGAAACCACTGTTCCTCTACCTTGCTTTCCAGTCTGTCCACGATCCCCTGCAGGTCCCTGAGGAGTACATGGAGCCATATGGCTTCATCCAAGATAAGCACAG ACGTATTTATGCAGGGATGGTGTCCCTCATGGATGAAGCAGTGGGGAACGTCACCAAAGCCTTGAAAAGCCACGGGCTCTGGAACAACACGGTCTTCATCTTCTCCACAG

2.Circ-Arsb(mmu_circ_0004889)在OVX小鼠破骨细胞前体细胞中的表达水平

(1)OVX小鼠模型实验。

选择年龄为12周的C57BL/6小鼠(雌性，由浙江大学医学院附属邵逸夫医院实验动物中心提供)，分为Sham组与OVX组，每组各6只。

Sham组：小鼠为12周龄的C57BL/6小鼠，进行假手术，用作对照组。

OVX组：小鼠为12周龄的C57BL/6小鼠，进行双侧卵巢切除，当作骨质疏松实验组。

(2)破骨细胞前体细胞培养。

将Sham组小鼠和OVX组小鼠安乐死后于无菌的50ml离心管中，放入浓度为75％医用酒精浸泡，将小鼠于超净工作台中分离双侧后肢，剔除皮肤、筋膜、肌肉及各关节囊，得到各组小鼠的股骨和胫骨，将其放入无菌培养皿中，无菌PBS浸润。使用无菌剪刀剪开股骨上端及胫骨下端，利用10,000rpm瞬时离心法分离出骨髓，加入2ml红细胞裂解液重悬骨髓，静置5分钟裂解红细胞。随后室温下水平离心(800rpm，5分钟)，弃掉液体后加10ml含 25ng/mlM-CSF的完全α-MEM培养液，轻柔吹打混匀，移至10cm无菌细胞培养器皿，于37℃、 5％浓度CO₂的培养箱中培养。第二天更换含25ng/ml M-CSF的完全α-MEM培养液以去除未贴壁的杂细胞，继续培养至骨髓来源的单核巨噬细胞生长为80％密度以上。

丢弃完全培养基，无菌的PBS清洗细胞，加入胰酶消化后于37℃培养箱放置数分钟，显微镜下可见细胞稍微皱缩后加入含血清的培养基2ml，吹打细胞后收集液体，室温下水平离心 (800rpm，5分钟)。留沉淀，加入适量含血清的培养基重悬细胞，轻轻吹打混匀。取出10ul 的细胞悬液滴入计数板4大格中。细胞悬液细胞数/ml＝(4大格细胞总数/4)×10⁴。

将单核巨噬细胞种入12孔板，细胞密度为2×10⁴细胞/孔，培养基为含25ng/ml M-CSF 和50ng/ml RANKL的完全α-MEM培养液，培养48小时。待到相应时间点后，收集细胞准备提取RNA。

(3)获取cDNA。

采用Thermo Fisher公司生产的TRIZOL试剂从每个样品提取5μg的总RNA，然后按照 TAKARA逆转录试剂盒(货号为RR047A)说明书使用方法获得cDNA。

(4)qPCR检测小鼠破骨细胞分化中circ-Arsb的表达变化，以及Sham小鼠和OVX小鼠来源的破骨细胞前体细胞中的circ-Arsb表达。

具体引物序列如下所示：

检测小鼠源circ-Arsb的引物：

上游引物qPCR-circ-Arsb(M)-F(SEQ ID No.3)：

5’-GGAGCTGCTACACAACATCG-3’；

下游引物qPCR-circ-Arsb(M)-R(SEQ ID No.4)：

5’-GGATCGTGGACAGACTGGAA-3’；

内参上游引物qPCR-β-actin(M)-F(SEQ ID No.5)：

5’-CGTTGACATCCGTAAAGACC-3’；

内参下游引物qPCR-β-actin(M)-R(SEQ ID No.6)：

5’-AACAGTCCGCCTAGAAGCAC-3’；

检测人源circ-Arsb的引物：

上游引物qPCR-circ-Arsb(H)-F(SEQ ID No.7)：

5’-GCAAGTGGAAGAAATGGAGCA-3’；

下游引物qPCR-circ-Arsb(H)-R(SEQ ID No.8)：

5’-AGCAGCCATGGTAAGTCCAA-3’；

内参上游引物qPCR-β-actin(H)-F(SEQ ID No.9)：

5’-CATGTACGTTGCTATCCAGGC-3’；

内参下游引物qPCR-β-actin(H)-R(SEQ ID No.10)：

5’-CTCCTTAATGTCACGCACGAT-3’；

qPCR反应体系如下所示：

H₂O 32.5ul，5×Buffer 10ul，dNTP(各2.5mM)4ul，上游引物(10μM)1ul，下游引物(10μM)1ul，cDNA样本1ul，PrimeSTAR 0.5ul。qPCR反应条件为：cycle 1(1×)预变性： 95℃，30s；cycle 2(40×)变性95℃，5s。

退火延伸：60℃，10s。

(5)结果分析。

小鼠破骨细胞分化中，circ-Arsb的表达上调且丰富(如图2中的A和B部分所示)。患有骨质疏松的病人，其松质骨中circ-Arsb比对照组病人中的表达水平较高(如图2中的C部分所示)。结果说明circ-Arsb可作为骨质疏松中破骨细胞活性的生物标记物，为该疾病的诊断与治疗提供靶位点。

实施例2在骨髓来源的单核巨噬细胞(BMMs)中敲低或过表达circ-Arsb并检测其对BMMs增殖和凋亡的影响

(1)敲低circ-Arsb的实验。

以BMMs为研究对象，采用Invitrogen生产的Lipofectamine^TM Stem TransfectionReagent转染干扰序列(SEQ ID NO:11-15)，以获得低表达circ-Arsb的细胞，然后进行cck-8和流式细胞凋亡实验。

敲低circ-Arsb的干扰RNA靶序列，其核苷酸序列如下所示：

Circ-Arsb的备选靶序列：5’-GGCTTGCCATCCACTGTTC-3’(SEQ ID No.11)， 5’-GCCATCCACTGTTCCTCTA-3’(SEQ ID No.12)，5’-CCATCCACTGTTCCTCTAC-3’(SEQ ID No.13)，经过初筛验证，最终选取SEQ ID NO:12作为本试验的使用工具。对照序列的正义链：5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3’(SEQ ID No.14)；对照序列的反义链： 5’-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3’(SEQ ID No.15)。

由于小鼠与人具有同源性，故可以推导得到用于人体敲低circ-Arsb的沉默序列的正义链： 5’-UUCUACAGAUCCGUACAGGTT-3’(SEQ ID No.19)；反义链： 5’-CCUGUACGGAUCUGUAGAATT-3’(SEQ ID No.20)。

具体实验过程如下：

将BMMs以6×10⁴/cm²接种六孔板中，至细胞汇合度达到80％左右后转染；取一支灭菌后的1.5ml EP管，标记为管a，并向其中加入500μl Opti-MEM及2μg的转染干扰序列(SEQID No.11)，轻轻吹打混匀后静止5min，为a液；另取一支1.5ml EP管，标记为管b，并向其中加入500μl Opti-MEM及5μl Lipofectamine^TM Stem Transfection Reagent轻吹混匀后静止5min，为b 液；将a和b液混匀后，于室温下避光静置10min。随后混合液分别转移至BMMs细胞中，于37℃、 5％CO2的培养箱中继续培养；于6h后更换完全培养基，并继续培养24h后收集细胞；提取RNA，逆转录cDNA，qPCR验证circ-Arsb表达水平(结果如图3中的A部分所示)。

(2)过表达circ-Arsb的实验。

通过构建circ-Arsb慢病毒载体，转染BMMs细胞。然后通过qPCR验证。具体实验过程如下：

构建circ-Arsb慢病毒载体：由汉恒公司构建，另以空载作为对照，具体方法为：将circ-Arsb 全长通过多克隆位点插入到pCD513B-1载体中，以获得circ-Arsb慢病毒载体pCD513B-1-circ-Arsb。

具体实验过程如下：

以293T工具细胞(由中国科学院上海生命科学院细胞资源中心提供)为介质，在直径为 6cm的培养皿中培养，待其汇合度为80％左右后，更换为无血清培养基。在灭菌后的离心管中，加入已经构建好的circ-Arsb慢病毒载体(5μg)和1.5ml的Opti-MEM培养液；在另一支离心管中加入50μl Lipofectamine^TM Stem Transfection Reagent及1.5ml的Opti-MEM培养液，然后将两者混匀后，作为293T细胞的培养液。在6h后更换正常培养基，接着再继续培养48 h。

病毒的收获及浓缩：收集培养48h后293T工具细胞的上清液，并于4℃、4000g离心，以去除细胞碎片。然后将上清液过滤离心(0.45μm滤器)，获得病毒粗提液。接着，将病毒粗提液在过滤器中离心(5000g转速下离心15min)，以获得所需病毒浓缩液。

慢病毒感染BMMs：待6孔板中的细胞汇合至60％左右时，更换无血清培养基，然后每孔加入2×10⁶TU的病毒与polybrene(1μl)。感染12h后，弃上清液，更换正常培养基继续培养 48h，然后加入1μg/ml puromycin进行稳定细胞株筛选。随后提取RNA，逆转录cDNA，qPCR 验证circ-Arsb表达水平(如图3中的B部分所示)。

(3)BMMs增殖和凋亡的分析。

将BMMs种入96孔板，细胞密度为6×10³细胞/孔，每板共12孔(1个NC组，1个沉默circ-Arsb组，1个空载组和1个过表达circ-Arsb组，每组3个复孔)，培养基为含25ng/ml 的M-CSF的完全α-MEM培养液，分别培养48和96小时，隔天换液。待到相应时间点后，每孔加入10μl的cck-8试剂，黑暗条件下在细胞培养箱孵育1小时后取出，酶标仪上充分震荡并测定450nm处吸光度值(活性细胞数目越多，吸光度OD值越高)，实验结果显示沉默和过表达circ-Arsb对BMMs的增殖均无明显作用(如图3中的C部分所示)。

将BMMs种入6孔板，细胞密度为20×10⁴细胞/孔，每板共6孔(1个对照组，1个沉默circ-Arsb组，1个空载组和1个过表达circ-Arsb组，每组3个复孔)，培养基为含25ng/ml 的M-CSF的完全α-MEM培养液，分别培养48小时，隔天换液。待到相应时间点后，采用AnnexinV-FITC/PI法，检测BMMs的凋亡情况，实验结果显示沉默circ-Arsb对BMMs的凋亡有一定的促进作用，而过表达circ-Arsb对BMMs的凋亡有一定的抑制作用(如图3中的D 部分所示)。

实施例3

在BMMs中沉默或过表达circ-Arsb后检测其对破骨细胞的分化和骨吸收的影响，具体实验过程如下：

设NC组、沉默circ-Arsb组、空载组和过表达circ-Arsb处理组，每组3个复孔，将BMMs 种于96孔板中(8×10³细胞/孔)，隔天将培养基换为含50ng/ml RANKL和25ng/ml M-CSF 的完全α-MEM培养液，当NC组和空载组出现破骨细胞融合的情况终止培养。将培养基吸掉后，PBS缓冲液清洗1遍，加入4％的多聚甲醛100ul固定细胞20分钟，使用试剂盒进行抗酒石酸酸性磷酸酶染色，倒置显微镜下拍照并后期计算多于3个细胞核且抗酒石酸酸性磷酸酶染色阳性的破骨细胞的数量和每个破骨细胞的细胞面积。结果显示沉默circ-Arsb后，明显地抑制了破骨细胞分化和骨吸收，而过表达circ-Arsb后，促进了破骨细胞分化和骨吸收(如图4中的A-D部分所示)。

实施例4.circ-Arsb与EWSR1、YY1结合通过抑制NFE2L2表达对破骨细胞分化和吸收的影响

(1)circ-Arsb与蛋白EWSR1、YY1的作用分析

在小鼠BMMs中过表达circ-Arsb，诱导分化为破骨细胞。构建生物素标记的circ-Arsb探针，RNApull down后行蛋白质谱分析(RNAantisense Purification massspectrum，RAP-MS)，筛选出与circ-Arsb结合的靶蛋白EWSR1和YY1(图5中的A部分所示)。

利用结合物进行电泳试验，随后利用银染试验分析circ-Arsb所结合的蛋白位置大小(如图5中的B部分所示)。

接着利用EWSR1、YY1和IgG抗体进行RNA结合蛋白免疫共沉淀试验，将得到纯化的RNA进行PCR检测，分析circ-Arsb的表达(如图5中的C部分所示)。

(2)circ-Arsb沉默和过表达对NFE2L2表达的作用分析

将BMMs以6×10⁴/cm²接种六孔板中，至细胞汇合度达到80％左右后转染；取一支灭菌后的1.5ml EP管，标记为管a，并向其中加入500μl Opti-MEM及2μg的转染干扰序列(SEQID No.11)，轻轻吹打混匀后静止5min，为a液；另取一支1.5ml EP管，标记为管b，并向其中加入500μl Opti-MEM及5μl Lipofectamine^TM Stem Transfection Reagent轻吹混匀后静止5min，为b液；将a和b液混匀后，于室温下避光静置10min。随后混合液分别转移至BMMs 细胞中，于37℃、5％CO2的培养箱中继续培养；于6h后更换完全培养基，并继续培养48h 后收集细胞；提取蛋白质，加入loadingbuffer后煮沸，利用Westernblot试验验证NFE2L2的表达变化(如图5中的D部分所示)。

(3)沉默circ-Arsb后，通过过表达NFE2L2分析其对破骨细胞分化和骨吸收的影响

在以往的研究中，已经较为明确地提示NFE2L2对破骨细胞分化和骨吸收的抑制作用，其主要通过拮抗氧自由基(ROS)的水平来实现对破骨细胞的调控作用[NuclearNrf2induction by protein transduction attenuates osteoclastogenesis.Free RadicBiol Med.2014；77:239-48.]。而我们通过，沉默circ-Arsb后，发现NFE2L2的表达明显上调，而同时破骨细胞的分化和骨吸收被抑制(如图4和图5中的D部分所示)。进一步，在通过沉默NFE2L2(SEQ ID No.18： 5’-UGAAAGCACAGCAGAAUUTT-3’)，可以部分挽救破骨细胞的分化情况，证实了circ-Arsb 可以通过NFE2L2发挥对破骨细胞分化的调控作用(如图5中的E部分所示)。

以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。

序列表

<110> 浙江大学医学院附属邵逸夫医院

<120> 一种环状RNA circ-Arsb在制备防治骨质疏松产品中的应用

<160> 20

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 586

<212> DNA

<213> Human Circ-Arsb

<400> 1

atccgtacag gtttacagca ccaaataatc tggccctgtc agcccagctg tgttcctctg 60

gatgaaaaac tcctgcccca gctcctaaaa gaagcaggtt atactaccca tatggtcgga 120

aaatggcacc tgggaatgta ccggaaagaa tgccttccaa cccgccgagg atttgatacc 180

tactttggat atctcctggg tagtgaagat tattattccc atgaacgctg tacattaatt 240

gacgctctga atgtcacacg atgtgctctt gattttcgag atggcgaaga agttgcaaca 300

ggatataaaa atatgtattc aacaaacata ttcaccaaaa gggctatagc cctcataact 360

aaccatccac cagagaagcc tctgtttctc taccttgctc tccagtctgt gcatgagccc 420

cttcaggtcc ctgaggaata cttgaagcca tatgacttta tccaagacaa gaacaggcat 480

cactatgcag gaatggtgtc ccttatggat gaagcagtag gaaatgtcac tgcagcttta 540

aaaagcagtg ggctctggaa caacacggtg ttcatctttt ctacag 586

<210> 2

<211> 586

<212> DNA

<213> Mus musculus Circ-Arsb

<400> 2

atccatttgg gcttacagca ttacctcatc atgacctgtc agcccagctg tgttccccta 60

gacgaaaaac tcctgcccca gcttttaaag gaagcaggct atgctacgca catggtcggg 120

aaatggcacc tggggatgta ccggaaagaa tgtctgccga cacgccgagg attcgatacc 180

tacttcggat acctcctagg cagtgaagac tattacaccc acgaggcctg tgcgccgatt 240

gagtctttga atggtacccg ctgtgcgctt gacttaagag atggtgaaga acctgcaaaa 300

gagtataaca atatttactc aacaaacata tttaccaaaa gggctacaac cgtcatagct 360

aaccacccac cggagaaacc actgttcctc taccttgctt tccagtctgt ccacgatccc 420

ctgcaggtcc ctgaggagta catggagcca tatggcttca tccaagataa gcacagacgt 480

atttatgcag ggatggtgtc cctcatggat gaagcagtgg ggaacgtcac caaagccttg 540

aaaagccacg ggctctggaa caacacggtc ttcatcttct ccacag 586

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Unknown)

<400> 3

ggagctgcta cacaacatcg 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Unknown)

<400> 4

ggatcgtgga cagactggaa 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Unknown)

<400> 5

cgttgacatc cgtaaagacc 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Unknown)

<400> 6

aacagtccgc ctagaagcac 20

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Unknown)

<400> 7

gcaagtggaa gaaatggagc a 21

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Unknown)

<400> 8

agcagccatg gtaagtccaa 20

<210> 9

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Unknown)

<400> 9

catgtacgtt gctatccagg c 21

<210> 10

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Unknown)

<400> 10

ctccttaatg tcacgcacga t 21

<210> 11

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Unknown)

<400> 11

ggcttgccat ccactgttc 19

<210> 12

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Unknown)

<400> 12

gccatccact gttcctcta 19

<210> 13

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Unknown)

<400> 13

ccatccactg ttcctctac 19

<210> 14

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Unknown)

<400> 14

uucuccgaac gugucacgut t 21

<210> 15

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Unknown)

<400> 15

acgugacacg uucggagaat t 21

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Unknown)

<400> 16

ttctccacag atccatttgg 20

<210> 17

<211> 12

<212> DNA

<213> 人工序列(Unknown)

<400> 17

ctacagatcc gt 12

<210> 18

<211> 20

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Unknown)

<400> 18

ugaaagcaca gcagaauutt 20

<210> 19

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Unknown)

<400> 19

uucuacagau ccguacaggt t 21

<210> 20

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Unknown)

<400> 20

ccuguacgga ucuguagaat t 21

Claims (2)

1.检测circ-Arsb表达水平的试剂在制备骨质疏松诊断试剂盒中的应用。

2.沉默circ-Arsb表达的试剂在制备治疗骨质疏松的药物中的应用，其特征在于：所述的沉默circ-Arsb表达的试剂为沉默序列；所述沉默序列的正义链如SEQ ID No.19所述；反义链如SEQ ID No.20所述。

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