CN111358959B

CN111358959B - Roquin1蛋白及其编码基因在制备抑制肿瘤的药物中的应用

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Publication number: CN111358959B
Application number: CN201910959801.3A
Authority: CN
Inventors: 鹿文葆
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Priority date: 2019-10-10
Filing date: 2019-10-10
Publication date: 2021-03-26
Anticipated expiration: 2039-10-10
Also published as: CN111358959A

Abstract

本发明涉及Roquin1蛋白以及Roquin1基因在肿瘤治疗中的一种新用途。具体地，本发明涉及Roquin1蛋白以及Roquin1基因在制备肿瘤治疗药物中的新作用及其作为分子靶标在抗肿瘤药物研发中的新用途。本发明对于肿瘤细胞周期、肿瘤细胞增殖、肿瘤生长和转移的机制研究具有重要的理论价值。本发明对于肿瘤治疗具有十分重要的应用价值。

Description

Roquin1蛋白及其编码基因在制备抑制肿瘤的药物中的应用

技术领域

本发明涉及肿瘤学、遗传学、分子生物学领域，具体地，本发明涉及Roquin1 蛋白以及Roquin1基因的一种新用途，更具体地，本发明涉及Roquin1蛋白以及 Roquin1基因在制备肿瘤治疗药物中的新用途以及作为靶标物在抗肿瘤药物研发中的新用途。

背景技术

癌症的一个共有特征是细胞周期失调(Kastan MB,et al.,2004)。癌细胞通常展示出失控的细胞增殖(Massague J.2004)以及无控制的细胞周期(Lapenna S,GiordanoA.2009)，这也成为肿瘤细胞无限增殖并抵抗传统治疗手段的原因之一。虽然广泛的研究进展已经拓展了我们对于癌细胞周期进展失控的了解，然而，癌细胞中通过转录后机制所形成的细胞周期失控调节，尤其是通过RNA结合蛋白Roquin1形成的机制仍然不清楚。

Roquin1，一个由Rc3h1基因编码的CCCH型RNA-binding protein，最初发现该分子在自身免疫调节中发挥重要作用，可通过其泛素连接酶特性抑制自身免疫 (Vinuesa CGet al.,2005；Yu D et al.,2007)。使用炎性抑制性因子IL10 刺激T细胞可诱导Roquin1表达(Schaefer JS et al.,2014)。作为一种 RNA-binding protein，Roquin1可通过其ROQ功能区结合并降解ICOS mRNA从而抑制自身免疫(Schlundt A et al.,2014)。Roquin1被认为是一种免疫多功能调节子，可调节多种免疫细胞分化，包括TfH、NkT、Treg(Linterman MAet al., 2009；Heissmeyer V et al.,2013；Drees C et al.,2017；Lee SY et al.,2019)。缺失Roquin1的小鼠可引起胚胎致死并引起严重的自身炎症反应及肠炎(SchaeferJS et al.,2013)。Roquin1可识别并结合其靶基因3’UTR中的stem-loop(茎环)结构靶向降解mRNA(Janowski R et al.,2016；Bram J et al.,2018；Leppek K et al.,2013)。此外，Roquin1还调节多种信号通路，包括AMPK(Ramiscal RR et al.,2015)、NF-κB(Murakawa Yet al.,2015)以及PI3K-mTOR(Essig K et al.,2017)信号通路，进而调节免疫反应。研究显示Roquin1还具有结合并调节miRNA合成的作用(Srivastava M et al.,2015)。然而，据我们所知，关于Roquin1在癌症进展中的作用报道很少。Auguste T等发现与正常T细胞样本相比，T-lymphoma中Roquin的表达水平没有改变(Auguste T et al.,2013)。然而，仍然不清楚Roquin1在癌症进展及肿瘤细胞周期进展中的作用。

细胞周期相关基因表达异常是癌细胞周期进展失控的一个根本原因(Sherr CJet al.,1999；Nigg EA et al.,1995)。根据功能可将细胞周期相关基因分为细胞周期促进基因(包括CDKs、E2F1、CCNDs、CCNEs等)以及细胞周期抑制基因 (包括p21、p27、TP53、RB1等)。它们之间的比率决定了癌细胞的周期进展 (Malumbres M et al.,2001)。大多数肿瘤细胞周期失控是由于细胞周期促进基因的表达水平增加以及细胞周期抑制基因表达被限制(Malumbres M et al., 2009)。细胞周期促进基因表达水平高与肿瘤患者差的预后相关(Orega SM et al., 2002；Yu D et al.,2006；Leonard JP et al.,2012；Sheppard KE etal.,2013； Sawai CM et al.,2012)。因此，目前的临床肿瘤治疗主要是抑制细胞周期促进基因表达以恢复癌细胞对细胞周期调控的敏感性。

发明内容

本发明的目的在于，提供了Roquin1蛋白以及Roquin1基因的一种新用途，更具体地，本发明涉及Roquin1蛋白以及Roquin1基因在制备肿瘤治疗药物中的新用途以及作为靶标物在抗肿瘤药物研发中的新用途。

本发明首先保护Roquin1蛋白在制备肿瘤治疗药物中的应用。

本发明还保护Roquin1基因或具有Roquin1基因的生物材料在制备肿瘤治疗药物中的应用。

本发明还保护可以上调生物体中Roquin1蛋白丰度的物质在制备肿瘤治疗药物中的应用。所述可以上调生物体中Roquin1蛋白丰度的物质可以为Roquin1蛋白本身，也可以是生物体中位于Roquin1蛋白上游的可以促进Roquin1蛋白生成的其他蛋白质，也可以是生物体中位于Roquin1蛋白下游的可以减少Roquin1蛋白降解的其他蛋白质，也是可以促进生物体中Roquin1蛋白水平增加的化合物或其他小分子。

本发明还保护可以上调生物体中Roquin1基因丰度的物质在制备肿瘤治疗药物中的应用。所述可以上调生物体中Roquin1基因丰度的物质可以为Roquin1基因本身，也可以是生物体中位于Roquin1基因上游的可以促进Roquin1基因表达的其他蛋白或核酸分子，也可以是生物体中位于Roquin1基因下游的可以减少 Roquin1基因降解的其他蛋白或核酸分子，也是可以促进生物体中Roquin1基因表达的化合物或其他小分子。

本发明还保护Roquin1蛋白或Roquin1基因作为靶标物在抗肿瘤药物研发中的应用。Roquin1蛋白作为靶标物具体可为Roquin1蛋白作为靶标物被上调。可以上调生物体中Roquin1蛋白的物质可以为Roquin1蛋白本身，也可以是生物体中位于Roquin1蛋白上游的可以促进Roquin1蛋白生成的其他蛋白质，也可以是生物体中位于Roquin1蛋白下游的可以减少Roquin1蛋白降解的其他蛋白质，也是可以促进生物体中Roquin1蛋白水平增加的化合物或其他小分子。Roquin1基因作为靶标物具体可为Roquin1基因作为靶标物被上调。可以上调生物体中Roquin1 基因的物质可以为Roquin1基因本身，也可以是生物体中位于Roquin1基因上游的可以促进Roquin1基因表达的其他蛋白或核酸分子，也可以是生物体中位于 Roquin1基因下游的可以减少Roquin1基因降解的其他蛋白或核酸分子，也是可以促进生物体中Roquin1基因表达的化合物或其他小分子。

本发明还保护一种Roquin1蛋白截短体，即Roquin1蛋白的ROQ功能区。

Roquin1蛋白的ROQ功能区为Roquin1蛋白第174-326位氨基酸残基。

编码所述Roquin1蛋白截短体的基因也属于本发明的保护范围。

本发明还保护Roquin1蛋白截短体在制备肿瘤治疗药物中的应用。

本发明还保护编码所述Roquin1蛋白截短体的基因或具有编码所述Roquin1 蛋白截短体的基因的生物材料在制备肿瘤治疗药物中的应用。

本发明还保护Roquin1蛋白截短体或编码所述Roquin1蛋白截短体的基因作为靶标物在抗肿瘤药物研发中的应用。Roquin1蛋白截短体作为靶标物具体可为 Roquin1蛋白截短体作为靶标物被上调。可以上调生物体中Roquin1蛋白截短体的物质可以为Roquin1蛋白截短体本身，也是可以促进生物体中Roquin1蛋白截短体水平增加的其他蛋白质、肽段、化合物或其他小分子。编码Roquin1蛋白截短体的基因作为靶标物具体可为编码Roquin1蛋白截短体的基因作为靶标物被上调。可以上调生物体中编码Roquin1蛋白截短体的基因的物质可以为编码Roquin1蛋白截短体的基因本身，也可以是促进编码Roquin1蛋白截短体的基因表达的其他蛋白、多肽、核酸分子、化合物或其他小分子。

以上任一所述药物的功能为如下(a1)和/或(a2)和/或(a3)和/或(a4)： (a1)治疗肿瘤；(a2)抑制肿瘤生长和/或转移；(a3)抑制肿瘤细胞增殖；(a4) 阻止肿瘤细胞的周期进展(G1/S期进展)。

示例性的，以上任一所述Roquin1蛋白可为人Roquin1蛋白。

以上任一所述Roquin1蛋白具体可为如下(b1)、(b2)、(b3)或(b4)：

(b1)序列表中序列1所示的蛋白质；

(b2)在(b1)的氨基末端或羧基末端连接标签得到的融合蛋白；

(b3)将(b1)经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有(a1)至(a4)中任一功能的蛋白质；

(b4)来源于人且与(b1)具有98％以上同一性且具有(a1)至(a4)中任一功能的蛋白质。

标签具体如表1所示。

表1标签的序列

所述Roquin1蛋白还可为其它物种中的具有(a1)至(a4)中任一功能的同源蛋白。所述其它物种包括但不限于小鼠、大鼠、兔子、狗、猴子、猩猩、猿类、牛、羊、猪、马、绵羊、山羊、猫等。

Roquin1基因即编码Roquin1蛋白的基因。

以上任一所述Roquin1基因具体可为如下(c1)或(c2)或(c3)：

(c1)编码区如序列表中序列2所示的DNA分子；

(c2)来源于人且与(c1)具有95％以上同一性且编码所述蛋白质的DNA分子；

(c3)在严格条件下与(c1)限定的核苷酸序列杂交且编码所述蛋白质的DNA 分子。

所述Roquin1基因还可为其它物种中的同源基因。所述其它物种包括但不限于小鼠、大鼠、兔子、狗、猴子、猩猩、猿类、牛、羊、猪、马、绵羊、山羊、猫等。

Roquin1蛋白截短体具体可为如下(d1)、(d2)、(d3)或(d4)：

(d1)序列表的序列1中第174-326位氨基酸残基所示的蛋白质；

(d2)在(d1)的氨基末端或羧基末端连接标签得到的融合蛋白；

(d3)将(d1)经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有(a1)至(a4)中任一功能的蛋白质；

(d4)来源于人且与(d1)具有98％以上同一性且具有(a1)至(a4)中任一功能的蛋白质。

标签具体如表1所示。

所述Roquin1蛋白截短体还可为其它物种中的具有(a1)至(a4)中任一功能的同源蛋白。所述其它物种包括但不限于小鼠、大鼠、兔子、狗、猴子、猩猩、猿类、牛、羊、猪、马、绵羊、山羊、猫等。

以上任一所述编码Roquin1蛋白截短体的基因具体可为如下(e1)或(e2) 或(e3)：

(e1)序列表中序列2所示的DNA分子中编码Roquin1蛋白截短体的DNA分子；

(e2)来源于人且与(e1)具有95％以上同一性且编码所述Roquin1蛋白截短体的DNA分子；

(e3)在严格条件下与(e1)限定的核苷酸序列杂交且编码所述Roquin1蛋白截短体的DNA分子。

所述编码Roquin1蛋白截短体的基因还可为其它物种中的同源基因。所述其它物种包括但不限于小鼠、大鼠、兔子、狗、猴子、猩猩、猿类、牛、羊、猪、马、绵羊、山羊、猫等。

以上任一所述具有Roquin1基因的生物材料可为具有Roquin1基因的表达载体。以上任一所述具有编码Roquin1蛋白截短体的基因的生物材料可为具有编码 Roquin1蛋白截短体的基因的表达载体。所述表达载体能够携带核苷酸序列，并将这个序列整合到细胞基因组中，并能够在细胞中复制。“表达载体”包括质粒、黏端质粒、病毒(噬菌体、动物病毒、植物病毒等)以及人工染色体(比如YACs)。当前可能适用于临床基因治疗的作为表达载体的病毒(又称病毒载体)如下：腺病毒载体、逆转录病毒载体、腺相关病毒载体、慢病毒载体、疱疹病毒载体、嵌合病毒载体以及其它病毒载体。

以上任一所述肿瘤包括但不限于乳腺癌。

以上任一所述肿瘤细胞包括但不限于乳腺癌细胞。

本发明的发明者发现Roquin1蛋白具有显著的肿瘤抑制功能，可诱导肿瘤细胞周期停滞，其机制在于选择性抑制细胞周期促进基因转录本的表达(包括 CCNE1/2、CDK6、MCM2等)。本发明的发明者发现在乳腺癌组织及细胞中Roquin1 基因表达是被抑制的，这可能方便它们逃避细胞周期调控。过表达Roquin1基因可阻滞乳腺癌细胞周期G1/S进展，然而，通过使用shRNA进一步抑制Roquin1基因表达可增强肿瘤细胞增殖及周期进展。与这些体外观察相一致，在生物体内过表达Roquin1基因可显著抑制肿瘤生长及转移。通过分析人肿瘤组织样本数据库，发明者发现低表达水平的Roquin1强烈的与差的乳腺癌患者存活相关联。并且，在癌症患者组织中Roquin1基因的表达水平与其靶基因CCNE1、MCM2的表达水平呈显著负相关。这些结果表明Roquin1是一个潜在的肿瘤抑制子，参与调节细胞周期信号通路，通过抑制细胞周期促进基因表达。基于此，利用该肿瘤抑制性蛋白Roquin1提高临床肿瘤治疗效果具有非常重要的应用前景。

本发明首次鉴定人Roquin1基因是一种肿瘤抑制基因，肿瘤细胞中过表达Roquin1基因可显著抑制肿瘤细胞增殖并抑制肿瘤转移。本发明对于肿瘤细胞周期、肿瘤细胞增殖、肿瘤生长和转移的机制研究主要重要的理论价值。本发明对于肿瘤治疗具有十分重要的理论及实际意义。

附图说明

图1为Roquin1抑制肿瘤细胞增殖并阻止肿瘤细胞周期进展。MDA-MB-468/R1-GFP细胞和MDA-MB-231/R1-GFP细胞均有效表达R1-GFP融合蛋白 (图1A)；过表达Roquin1基因显著抑制肿瘤细胞增殖(图1B、图1C、图1D和图1E)；过表达Roquin1基因阻止肿瘤细胞的周期G1/S期进展(图1F和图1G)。

图2为Roquin1靶向3’UTRs选择性抑制细胞周期促进基因的mRNAs表达。过表达Roquin1基因后，细胞周期促进基因mRNAs被下调，部分细胞周期抑制基因被上调(图2A、图2B、图2C、图2D和图2E)；Roquin1蛋白可靶向结合细胞周期促进基因的mRNAs，但是不结合细胞周期抑制基因的mRNAs(图2F和图2G)； Roquin1蛋白可靶向结合细胞周期促进基因的3’UTR降解它们的mRNAs，但不能靶向细胞周期抑制基因的3’UTRs(图2H)。

图3为Roquin1的ROQ功能区负责降解细胞周期促进基因的mRNAs。对细胞周期促进基因mRNAs半衰期的检测发现(图3A、图3B、图3C 和图3D )，过表达Roquin1 基因显著降低它们的半衰期；Roquin1功能区示意图及不同突变体的制备策略(图 3E)；免疫印迹法鉴定Roquin1不同突变体的表达(图3F)；过表达S1截短体基因或S3截短体基因后，细胞周期促进基因mRNAs被下调(图3G)；S1截短体或 S3截短体可靶向结合细胞周期促进基因的3’UTR降解它们的mRNAs图3H)；过表达S1截短体基因或S3截短体基因阻止肿瘤细胞的周期G1/S期进展(图3I)。

图4为体内过表达Roquin1基因抑制肿瘤生长及转移。过表达Roquin1基因显著抑制裸鼠体内肿瘤生长(图4A、图4B、图4C和图4E)。表达Roquin1基因的重组腺病毒可以抑制荷瘤裸鼠的肿瘤生长和转移(图4D和图4F)。

具体实施方式

以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述。以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。如无特殊说明，以下实施例中的定量试验，均设置3次以上重复实验，结果取平均值。

pEGFP-N1载体：Clontech公司；pEGFP-N1载体表达EGFP蛋白，EGFP蛋白又称为GFP蛋白。MDA-MB-468细胞(人乳腺癌细胞)：

HTB-132TM。MDA-MB-231 细胞(人乳腺癌细胞)：

HTB-26^TM。

实施例1、Roquin1阻止肿瘤细胞周期进展新功能的鉴定

1、将Roquin1基因(Roquin1基因如序列表的序列2所示，插入序列去除了终止密码子)插入pEGFP-N1载体的EcoR I和AgeI酶切位点之间，得到重组质粒 pEGFP-N1-Roquin1-GFP。重组质粒pEGFP-N1-Roquin1-GFP已进行测序验证。重组质粒pEGFP-N1-Roquin1-GFP中，插入的DNA分子与载体中的EGFP基因形成融合基因，表达Roquin1-EGFP融合蛋白(简称R1-GFP融合蛋白)。

2、将重组质粒pEGFP-N1-Roquin1-GFP导入MDA-MB-468细胞，得到重组细胞，命名为MDA-MB-468/R1-GFP细胞。

3、将pEGFP-N1载体导入MDA-MB-468细胞，得到重组细胞，命名为 MDA-MB-468/GFP细胞。

4、将重组质粒pEGFP-N1-Roquin1-GFP导入MDA-MB-231细胞，得到重组细胞，命名为MDA-MB-231/R1-GFP细胞。

5、将pEGFP-N1载体导入MDA-MB-231细胞，得到重组细胞，命名为 MDA-MB-231/GFP细胞。

6、取MDA-MB-468/R1-GFP细胞和MDA-MB-468/GFP细胞，分别进行如下步骤：在平行条件下进行培养，36小时后进行细胞裂解，然后收集裂解液进行免疫印迹。免疫印迹采用GFP抗体的结果见图1A的左图。免疫印迹采用GFP抗体和Roquin1 抗体(先采用Roquin1抗体杂交，洗膜后再采用GFP抗体杂交)的结果见图1A的右图，Endo-R1代表细胞内源的Roquin1蛋白。图1A的泳道上方，GFP代表 MDA-MB-468/GFP细胞，R1-GFP代表MDA-MB-468/R1-GFP细胞。

7、取MDA-MB-468细胞(在图中标注为MDA468/Parental)、MDA-MB-468/GFP 细胞(在图中标注为Empty Vector)和MDA-MB-468/R1-GFP细胞(在图中标注为Roquin1/GFP)，分别进行如下步骤：在平行条件下进行培养，不同培养时间(0h、 24h、48h、72h)进行细胞计数，以检测过表达Roquin1基因对细胞增殖的影响。结果见图1B。

8、取MDA-MB-231细胞(在图中标注为MDA231/Parental)、MDA-MB-231/GFP 细胞(在图中标注为Empty Vector)和MDA-MB-231/R1-GFP细胞(在图中标注为 Roquin1/GFP)，分别进行如下步骤：在平行条件下进行培养，不同培养时间(0h、 24h、48h、72h)进行细胞计数，以检测过表达Roquin1基因对细胞增殖的影响。结果见图1C。

9、取MDA-MB-468细胞(在图中标注为MDA468/Parental)、MDA-MB-468/GFP 细胞(在图中标注为Empty Vector)和MDA-MB-468/R1-GFP细胞(在图中标注为 Roquin1/GFP)，分别进行如下步骤：在平行条件下进行培养，不同培养时间(0h、 24h、48h、72h)进行MTT染色，以检测过表达Roquin1基因对细胞增殖的影响。结果见图1D。

10、取MDA-MB-231细胞(在图中标注为MDA231/Parental)、MDA-MB-231/GFP 细胞(在图中标注为Empty Vector)和MDA-MB-231/R1-GFP细胞(在图中标注为 Roquin1/GFP)，分别进行如下步骤：在平行条件下进行培养，不同培养时间(0h、 24h、48h、72h)进行MTT染色，以检测过表达Roquin1基因对细胞增殖的影响。结果见图1E。

11、取MDA-MB-231/R1-GFP细胞(在图中标注为R1-GFP)和MDA-MB-231/GFP 细胞(在图中标注为Empty Vector)，分别进行如下步骤：在平行条件下进行培养，36小时后，收集细胞进行流式细胞术分析，获得处于各个细胞周期的细胞比率。结果见图1F。

12、取MDA-MB-468/R1-GFP细胞(在图中标注为R1-GFP)和MDA-MB-468/GFP 细胞(在图中标注为Empty Vector)，分别进行如下步骤：在平行条件下进行培养，36小时后，收集细胞进行流式细胞术分析，获得处于各个细胞周期的细胞比率。结果见图1G。

图1的结果表明：MDA-MB-468/R1-GFP细胞和MDA-MB-231/R1-GFP细胞均有效表达R1-GFP融合蛋白(图1A)；过表达Roquin1基因显著抑制肿瘤细胞增殖(图 1B、图1C、图1D和图1E)；过表达Roquin1基因阻止肿瘤细胞的周期G1/S期进展(图1F和图1G)。

以上结果表明：过表达Roquin1基因从而提高Roquin1蛋白水平，可以抑制肿瘤细胞增殖并阻止肿瘤细胞周期进展，即过表达Roquin1基因从而提高Roquin1 蛋白水平具有治疗肿瘤的效果。Roquin1蛋白/Roquin1基因的上述功能是本发明的发明人首次发现的。

实施例2、Roquin1特异性降解细胞周期促进基因mRNAs

一、Roquin1特异性降解细胞周期促进基因mRNAs

为了进一步检测Roquin1蛋白抑制肿瘤细胞增殖并阻止细胞周期进展的机制，对调节肿瘤细胞周期相关基因进行检测。

1、取实施例1中的MDA-MB-468/R1-GFP细胞，培养36小时后提取总RNA并反转录为cDNA，然后进行PCRarray(QIAGEN公司)，结果见图2A。

2、取实施例1中的MDA-MB-468/R1-GFP细胞，进行如下步骤：不同培养时间 (0h、24h、36h、48h)收集细胞，提取总RNA并反转录为cDNA，然后进行qPCR 以检测目标基因的表达量。结果见图2B。

3、取实施例1中的MDA-MB-231/R1-GFP细胞，进行如下步骤：不同培养时间 (0h、24h、36h、48h)收集细胞，提取总RNA并反转录为cDNA，然后进行qPCR 以检测目标基因的表达量。结果见图2C。

4、取MDA-MB-468/R1-GFP细胞，进行如下步骤：在平行条件下进行培养，不同培养时间(24h、48h、72h)进行western blot,检测各个目标蛋白的丰度，结果见图2D中的各个时间点对应的泳道。取MDA-MB-468/GFP细胞，进行如下步骤：在平行条件下培养72h，进行western blot,检测各个目标蛋白的丰度，结果见图 2D中的Con对应的泳道。

5、取MDA-MB-231/R1-GFP细胞，进行如下步骤：在平行条件下进行培养，不同培养时间(24h、48h、72h)进行western blot,检测各个目标蛋白的丰度，结果见图2E中的各个时间点对应的泳道。取MDA-MB-231/GFP细胞，进行如下步骤：在平行条件下培养72h，进行western blot,检测各个目标蛋白的丰度，结果见图 2E中的Con对应的泳道。

6、取MDA-MB-468/R1-GFP细胞，进行如下步骤：培养36小时后进行细胞裂解，然后收集裂解液；将GFP抗体(或同型IgG)与Protein A/G Beads(Santa Cruz 公司)孵育2h,然后加入所述裂解液并继续孵育2h，然后4℃、2000rpm离心，充分洗涤Beads，然后用Trizol收集总RNA；取总RNA，进行RT-PCR以检测目的基因。结果见图2F和图2G。图2F和图2G中，GAPDH作为阴性对照，TNF-α作为阳性对照。

7、荧光素酶报告子试验

在HEK293细胞中共转染供试质粒和报告子载体，转染36小时后进行细胞裂解，然后收集裂解液，利用Dual-LuciferaseReporter Assay System(Promega) 检测荧光素酶活性，结果见图2H。供试质粒分别为：重组质粒 pEGFP-N1-Roquin1-GFP(在图中标注为Roquin1)或pEGFP-N1载体(在图中标注为Control)。报告子载体分别为：具有β-Actin基因3’UTR的报告子载体、具有CCNE2基因3’UTR的报告子载体、具有MCM2基因3’UTR的报告子载体、具有 CDK6基因3’UTR的报告子载体或具有CCNE1基因3’UTR的报告子载体。

8、取MDA-MB-468/R1-GFP细胞(在图中标注为Roquin-GFP)和MDA-MB-468/GFP 细胞(在图中标注为Empty Vector)，分别进行如下步骤以检测细胞周期促进基因mRNAs的半衰期：用ActD和DRB处理细胞(ActD的工作浓度为5μg/mL，DRB 的工作浓度为5μg/mL)，分别于0min、60min、120min和240min后取细胞，提取总RNA，然后进行RT-PCR以检测目的基因。结果见图3A、图3B、图3C和图3D。

步骤一的结果表明：过表达Roquin1基因后，细胞周期促进基因mRNAs被下调，部分细胞周期抑制基因被上调(图2A、图2B、图2C、图2D和图2E)；Roquin1 蛋白可靶向结合细胞周期促进基因的mRNAs，但是不结合细胞周期抑制基因的 mRNAs(图2F和图2G)；Roquin1蛋白可靶向结合细胞周期促进基因的3’UTR降解它们的mRNAs，但不能靶向细胞周期抑制基因的3’UTRs(图2H)；对细胞周期促进基因mRNAs半衰期的检测发现(图3A、图3B、图3C和图3D)，过表达Roquin1 基因显著降低它们的半衰期，这进一步证实Roquin1蛋白特异性降解细胞周期促进基因的mRNAs。

以上结果表明：本发明的发明人首次发现了Roquin1蛋白的一个新功能，即可以选择性的降解细胞周期促进基因mRNAs，该新功能解释了过表达Roquin1基因可以阻止肿瘤细胞周期进展的本质原因。

二、Roquin1蛋白的ROQ功能区负责阻止肿瘤细胞周期进展

Roquin1蛋白的结构域示意图见图3E。第14-54位氨基酸残基为RING结构域，第174-326位氨基酸残基为ROQ结构域，第413-441位氨基酸残基为ZF结构域，第534-788位氨基酸残基为PRD结构域。

1、制备若干重组质粒如下(各个重组质粒均已进行测序验证)：

将序列表的序列2中编码截短体1的DNA分子插入pEGFP-N1载体，得到重组质粒pEGFP-N1-S1-GFP；重组质粒pEGFP-N1-S1-GFP表达S1-EGFP融合蛋白。截短体1用S1表示，如序列表的序列1中第1-441位氨基酸残基所示。

将序列表的序列2中编码截短体2的DNA分子插入pEGFP-N1载体，得到重组质粒pEGFP-N1-S2-GFP；重组质粒pEGFP-N1-S2-GFP表达S2-EGFP融合蛋白。截短体2用S2表示，如序列表的序列1中第441-1133位氨基酸残基所示。

将序列表的序列2中编码截短体3的DNA分子插入pEGFP-N1载体，得到重组质粒pEGFP-N1-S3-GFP；重组质粒pEGFP-N1-S3-GFP表达S3-EGFP融合蛋白。截短体3用S3表示，如序列表的序列1中第174-326位氨基酸残基所示。

2、将重组质粒pEGFP-N1-S1-GFP导入MDA-MB-468细胞，得到重组细胞，命名为MDA-MB-468/S1-GFP细胞。将重组质粒pEGFP-N1-S2-GFP导入MDA-MB-468细胞，得到重组细胞，命名为MDA-MB-468/S2-GFP细胞。将重组质粒pEGFP-N1-S3-GFP 导入MDA-MB-468细胞，得到重组细胞，命名为MDA-MB-468/S3-GFP细胞。

3、取实施例1中的MDA-MB-468/R1-GFP细胞(在图中标注为R1-GFP)，取步骤2制备的MDA-MB-468/S1-GFP细胞(在图中标注为1-441)、MDA-MB-468/S2-GFP 细胞(在图中标注为441-1133)和MDA-MB-468/S3-GFP细胞(在图中标注为 174-326)，分别进行如下步骤：在平行条件下进行培养，36小时后进行细胞裂解，然后收集裂解液采用GFP抗体进行免疫印迹。结果见图3F(NS代表非特异性条带)。

4、取实施例1中的MDA-MB-468/R1-GFP细胞(在图中标注为Roquin1-GFP) 和MDA-MB-468/GFP细胞(在图中标注为Control Vector)，取步骤2制备的各个重组细胞(根据截短体，在图中分别标注为1-441、174-326、441-1133)，分别进行如下步骤：在平行条件下进行培养，36小时后取细胞，提取总RNA并反转录为cDNA，然后进行qPCR以检测细胞周期促进基因的表达量。结果见图3G。

5、荧光素酶报告子试验

在HEK293细胞中共转染供试质粒和报告子载体，转染36小时后进行细胞裂解，然后收集裂解液，利用Dual-LuciferaseReporter Assay System(Promega) 检测荧光素酶活性，结果见图3H。供试质粒分别为：重组质粒 pEGFP-N1-Roquin1-GFP(在图中标注为Roquin1-GFP)或pEGFP-N1载体(在图中标注为Control)或重组质粒pEGFP-N1-S1-GFP(在图中标注为1-441)或重组质粒pEGFP-N1-S2-GFP(在图中标注为441-1133)或重组质粒pEGFP-N1-S3-GFP(在图中标注为174-326)。报告子载体分别为：具有β-Actin基因3’UTR的报告子载体、具有CCNE1基因3’UTR的报告子载体、具有MCM2基因3’UTR的报告子载体、具有CDK6基因3’UTR的报告子载体或具有CCNE2基因3’UTR的报告子载体。

6、取实施例1中的MDA-MB-468/R1-GFP细胞(在图中标注为Roquin1-GFP) 和MDA-MB-468/GFP细胞(在图中标注为Control Vector)，取步骤2制备的 MDA-MB-468/S2-GFP细胞(在图中标注为441-1133)和MDA-MB-468/S3-GFP细胞(在图中标注为174-326)，分别进行如下步骤：在平行条件下进行培养，36小时后进行流式细胞术分析，获得处于各个细胞周期的细胞比率。结果见图3I。

步骤二的结果表明：过表达S1截短体基因或S3截短体基因后，细胞周期促进基因mRNAs被下调(图3G)；S1截短体或S3截短体可靶向结合细胞周期促进基因的3’UTR降解它们的mRNAs图3H)；过表达S1截短体基因或S3截短体基因阻止肿瘤细胞的周期G1/S期进展(图3I)。

以上结果表明：Roquin1蛋白的ROQ功能区在特异性降解细胞周期促进基因中发挥重要作用。

实施例3、过表达Roquin1基因(提高Roquin1蛋白水平)抑制肿瘤生长及转移

1、取实施例1中的MDA-MB-468/R1-GFP细胞(在图中标注为Roquin1-GFP) 和MDA-MB-468/GFP细胞(在图中标注为Control Vector)，分别进行如下步骤：背部皮下注射BALB/c裸鼠(每只小鼠注射：1×10⁸个细胞/100μL PBS缓冲液)，从注射开始计天数。第14天至第36天每天测量原位的肿瘤体积，原位肿瘤体积随时间的变化见图4A(5只小鼠的平均值)，注射36天后小鼠原位肿瘤的照片见图4B。第36天处死小鼠并进行解剖，除了原位肿瘤外，所有小鼠都发生了肺转移。取肺脏并拍照，见图4C的左图。统计肺脏中的白色结节数量，见图4C的右图(5 只小鼠的平均值)。

2、取MDA-MB-231细胞，背部皮下注射BALB/c裸鼠(每只小鼠注射：1×10⁸个细胞/100μL PBS缓冲液)。从注射MDA-MB-231细胞开始计天数。第40天时，各小鼠的原位肿瘤均直径＞3mm。第40天开始每隔一天注射一次重组腺病毒(每次每只小鼠注射1×10¹⁰pfu)，共注射5次。设置两个处理组，分别给予表达Roquin1 基因的重组腺病毒(Roquin1基因如序列表的序列2所示，表达Roquin1基因的重组腺病毒用Ad-Roquin1或Ad-R1表示)或对照腺病毒(用Ad-Con表示，与表达 Roquin1基因的重组腺病毒相比对照腺病毒的差异仅在于不具有所述Roquin1基因)。第30天至第56天每天测量原位的肿瘤体积，原位肿瘤体积随时间的变化见图4E(5只小鼠的平均值)。第56天，处死小鼠，取肺脏制作病理切片并进行 HE染色，见图4F。根据HE染色的结果统计转移灶数量，结果见图4D(5只小鼠的平均值)。

结果发现Roquin1可在体内显著抑制肿瘤生长并抑制肿瘤细胞肺转移。综上实验结果表明，过表达Roquin1基因(提高Roquin1蛋白水平)可显著抑制肿瘤生长及肿瘤转移。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

SEQ ID NO.1

SEQ ID NO.2

Claims

1.Roquin1蛋白在制备肿瘤治疗药物中的应用；所述药物的功能为如下（a1）和/或（a2）和/或（a3）和/或（a4）：（a1）治疗肿瘤；（a2）抑制肿瘤生长和/或转移；（a3）抑制肿瘤细胞增殖；（a4）阻止肿瘤细胞的周期进展；

所述肿瘤为乳腺癌；所述肿瘤细胞为乳腺癌细胞。

2.Roquin1基因或具有Roquin1基因的生物材料在制备肿瘤治疗药物中的应用；所述药物的功能为如下（a1）和/或（a2）和/或（a3）和/或（a4）：（a1）治疗肿瘤；（a2）抑制肿瘤生长和/或转移；（a3）抑制肿瘤细胞增殖；（a4）阻止肿瘤细胞的周期进展；

Roquin1基因即编码Roquin1蛋白的基因；

所述肿瘤为乳腺癌；所述肿瘤细胞为乳腺癌细胞。

3.Roquin1蛋白截短体在制备肿瘤治疗药物中的应用；所述药物的功能为如下（a1）和/或（a2）和/或（a3）和/或（a4）：（a1）治疗肿瘤；（a2）抑制肿瘤生长和/或转移；（a3）抑制肿瘤细胞增殖；（a4）阻止肿瘤细胞的周期进展；

Roquin1蛋白截短体，即Roquin1蛋白的ROQ功能区；

所述肿瘤为乳腺癌；所述肿瘤细胞为乳腺癌细胞。

4.编码Roquin1蛋白截短体的基因或具有编码Roquin1蛋白截短体的基因的生物材料在制备肿瘤治疗药物中的应用；所述药物的功能为如下（a1）和/或（a2）和/或（a3）和/或（a4）：（a1）治疗肿瘤；（a2）抑制肿瘤生长和/或转移；（a3）抑制肿瘤细胞增殖；（a4）阻止肿瘤细胞的周期进展；

Roquin1蛋白截短体，即Roquin1蛋白的ROQ功能区；

所述肿瘤为乳腺癌；所述肿瘤细胞为乳腺癌细胞。