CN118879517B

CN118879517B - 解脂耶罗维亚酵母Yl590及其应用

Info

Publication number: CN118879517B
Application number: CN202411372939.0A
Authority: CN
Inventors: 张娜; 李明记; 李�瑞; 孔书田; 柴顺星; 米佳黎; 张仁宽; 易梦凡; 赵静宇; 凡林林; 李宇虹
Original assignee: Tianjin Kailaiying Biotechnology Co ltd; Asymchem Laboratories Tianjin Co Ltd
Current assignee: Tianjin Kailaiying Biotechnology Co ltd; Asymchem Laboratories Tianjin Co Ltd
Priority date: 2024-09-29
Filing date: 2024-09-29
Publication date: 2025-01-28
Anticipated expiration: 2044-09-29
Also published as: CN118879517A

Abstract

本发明提供了一种解脂耶罗维亚酵母Yl590及其应用。其中，上述解脂耶罗维亚酵母Yl590，分类命名为解脂耶罗维亚酵母Yarrowia lipolytica，于2024年6月4日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为中国北京，保藏编号为CGMCC No.30855。能够解决现有技术中的解脂耶罗维亚酵母生长速度慢的问题，适用于微生物技术领域。

Description

解脂耶罗维亚酵母Yl590及其应用

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，具体而言，涉及一种解脂耶罗维亚酵母Yl590及其应用。

背景技术

解脂耶罗维亚酵母是一种具有重要工业应用潜力的微生物，已被美国食品药品监督管理局 (FDA)认证为"通常认为是安全的" (GRAS)。这种酵母以其合成多种有价值代谢产物的能力而闻名，但其在实际发酵过程中的生长速度和耐受性限制了产量的提升。

当前技术已经证明，通过酿酒酵母和解脂耶罗维亚酵母可以从头合成香紫苏醇，一些工程菌株已经显示出较高的生产效率。例如，专利申请CN114989997A中的工程菌株在5天内能够达到919 mg/L的产量；而专利申请CN117264792A中的菌株在5 L发酵罐中8天内产量最高可达8510 mg/L。提高菌株的耐受性，使其能在高浓度葡萄糖等严苛条件下持续增殖，将进一步增加产量。同时，加快菌株的生长速度，可以缩短发酵周期，从而提高发酵产率。

因此，在工业应用和菌株改造方面，筛选出具有快速生长、强耐受性和可遗传改造能力的底盘菌株至关重要。这不仅有助于缩短发酵周期，降低生产成本，而且对于实现微生物细胞工厂的高效合成具有重要意义。目前，尚未有报道显示何种解脂耶罗维亚酵母在生长速度等方面有显著提升，这表明该领域仍有待进一步的研究和开发。

发明内容

本发明的主要目的在于提供一种解脂耶罗维亚酵母Yl590及其应用，以解决现有技术中的解脂耶罗维亚酵母生长速度慢的问题。

为了实现上述目的，根据本发明的第一个方面，提供了一种解脂耶罗维亚酵母Yl590，分类命名为解脂耶罗维亚酵母Yarrowia lipolytica，于2024年6月4日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为中国北京，保藏编号为CGMCC No.30855。

进一步地，解脂耶氏酵母Yl590含有SEQ ID NO：1所示的核酸序列。

进一步地，解脂耶罗维亚酵母Yl590具备快速生长、多碳源利用和快速消耗碳源的能力；优选地，快速生长包括：相同初始菌体浓度的解脂耶罗维亚酵母Yl590与解脂耶罗维亚酵母Po1f，在相同条件下的增殖至特定菌体浓度，解脂耶罗维亚酵母Yl590的所需时间为解脂耶罗维亚酵母Po1f的30%-90%；优选地，碳源各自独立选自如下任意一种或多种：乙醇、甲醇、木糖、甘油、乙酸钠、丙二酸、半乳糖、蔗糖或葡萄糖；更优选地，碳源为葡萄糖。

进一步地，解脂耶罗维亚酵母Yl590具备耐受如下任意一种或多种条件的能力：高浓度葡萄糖、低pH和高浓度氯化钠；高浓度葡萄糖的浓度为100-600 g/L；优选地，高浓度葡萄糖的浓度为100 g/L或200 g/L；高浓度氯化钠的浓度为50-100 g/L；优选地，高浓度氯化钠的浓度为50 g/L、60 g/L或70 g/L；低pH的pH值为2-6；优选地，pH值为3、3.5、4、5或6。

为了实现上述目的，根据本发明的第二个方面，提供了一种产香紫苏醇的工程菌株，该工程菌株的出发菌株为上述解脂耶罗维亚酵母Yl590，工程菌株的基因组中通过基因编辑方法插入了焦磷酸赖百当烯二醇酯合酶基因CLS、香紫苏醇合酶基因TP1132以及香叶基香叶基焦磷酸合酶基因CrtE。

进一步地，焦磷酸赖百当烯二醇酯合酶基因CLS表达的蛋白具有SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列；香紫苏醇合酶基因TP1132表达的蛋白具有SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列；香叶基香叶基焦磷酸合酶基因CrtE表达的蛋白具有SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列。

进一步地，工程菌株的基因组中通过基因编辑方法敲除了Ku70、URA3和LEU2基因；优选地，基因编辑方法包括：利用CRISPR、同源重组、非同源末端连接或Cre/lox系统对解脂耶罗维亚酵母Yl590的染色体进行序列的插入、删除或替换。

为了实现上述目的，根据本发明的第三个方面，提供了一种香紫苏醇的生产方法，该生产方法包括：以上述产香紫苏醇的工程菌株为发酵菌株进行种子液的制备和发酵培养，从发酵液和/或菌体中获得香紫苏醇。

进一步地，种子液的制备方法包括：将产香紫苏醇的工程菌株接种至种子培养基，28-32℃，150-250 rpm培养16-36 h；优选地，种子培养基为YPD液体培养基。

进一步地，发酵培养方法包括：将含有产香紫苏醇的工程菌株的种子液接种至发酵培养基中，获得初始OD₆₀₀为0.01-0.04的起始发酵菌液；在28-32℃、150-280 rpm下发酵36-72 h，获得发酵液和/或菌体；优选地，发酵培养基为YPD液体培养基。

进一步地，从发酵液和/或菌体中获得香紫苏醇的方法包括：将发酵液和/或菌体与有机试剂混合，有机试剂选自如下任意一种或多种：正十二烷、无水乙醇、甲醇、异丙醇、丙酮、正庚烷、正己烷或乙腈；优选地，有机试剂为正十二烷。

应用本发明的技术方案，筛选获得了一种解脂耶罗维亚酵母Yl590，该菌株具有以下优点：快速生长、高效利用底物、较强的耐受性，并且可以进行基因操作。这不仅可以节约培养和发酵所需的时间，还可以作为底盘菌株，进一步应用合成不同产品。

附图说明

构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：

图1示出了根据本发明实施例1的菌株Yl590及解脂耶罗维亚酵母标准菌株16SrDNA基因系统发育树。

图2示出了根据本发明实施例1的Yl590和Po1f菌株平板培养结果图，其中图2中A示出了Yl590和Po1f菌株平板培养24h的结果，图2中B示出了Yl590和Po1f菌株平板培养48h的结果。

图3示出了根据本发明实施例1的Yl590菌株的显微镜形态图。

图4示出了根据本发明实施例2的Yl590和Po1f菌株碳源利用结果图。

图5示出了根据本发明实施例3的Yl590和Po1f菌株耐受性结果图。

图6示出了根据本发明实施例3的Yl590和Po1f菌株的生长曲线结果图。

图7示出了根据本发明实施例5的产香紫苏醇的Yl590菌株的发酵结果图。

生物材料信息：一种解脂耶罗维亚酵母Yl590，分类命名为解脂耶罗维亚酵母Yarrowia lipolytica，于2024年6月4日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为中国北京，保藏编号为CGMCC No. 30855。

具体实施方式

需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将结合实施例来详细说明本发明。

如背景技术所提到的，解脂耶罗维亚酵母是现有技术中常用的发酵底盘菌株，但现有技术中的解脂耶罗维亚酵母生长速度限制了其在工业上的发酵能力。在本申请中发明人发现一种生长速度更快的解脂耶罗维亚酵母Yl590，以此为基础提出了本申请的一系列保护方案。

在本申请第一种典型的实施方式中，提供了一种解脂耶罗维亚酵母Yl590，分类命名为解脂耶罗维亚酵母Yarrowia lipolytica，于2024年6月4日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为中国北京，保藏编号为CGMCC No. 30855。

上述解脂耶罗维亚酵母Yl590的生长速度相较于现有技术中的其他解脂耶罗维亚酵母更快，具有快速生长能力，可以快速消耗碳源，能够缩短生长周期，从而缩短培养和发酵所需的时间。

且解脂耶罗维亚酵母Yl590的耐受性强，相较于现有技术中的其他解脂耶罗维亚酵母，能够耐受更低的pH、更高的盐 (如NaCl)浓度、更高的底物 (如葡萄糖)浓度，此种耐受性便于提高解脂耶罗维亚酵母Yl590在发酵中的浓度，也能够减少杂菌污染的风险。且现有技术中对于解脂耶罗维亚酵母的分子生物学方法 (包括但不限于遗传改造方法)同样适用与本申请中的解脂耶罗维亚酵母Yl590，即解脂耶罗维亚酵母Yl590能够便捷地被进行遗传改造等操作，具有很高的应用前景。

在一种优选的实施例中，解脂耶罗维亚酵母Yl590含有SEQ ID NO：1所示的核酸序列。

SEQ ID NO：1：

CAACGGCATTGCCTCAGTACGGCGAGTGAGCGGCAAAAGCTCAAATTTGAAACCCTCGGGATTGTAATTTGAAGATTTGGCATTGGAGAAAGCTAACCCAAGTTGCTTGGAATAGTACGTCATAGAGGGTGACAACCCCGTCTGGCTAACCGTTCTCCATGTATTGCCTTATCAAAGAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTCAAAGTGGGTGGTAAACTCCATCTAAAGCTAAATACTGGTGAGAGACCGATAGCGAACAAGTACTGTGAAGGAAAGGTGAAAAGAACTTTGAAAAGAGAGTGAAATAGTATGTGAAATTGTTGATAGGGAAGGAAATGAGTGGAGAGTGGCCGAGGTTTCAGCCGCCCCTCGTGGGCGGTGTACTGCCGACGCCGAGTCATCGATAGCGAGACGAGGGTTACAAATGGGAGCGCCTTCGGGCGTTCTCCCCTAACCCTCCACACTGCCACCGACGACATAATCCACCCATTTCACCCGTCATAAACACGGACCTAAAAACTGCGACATAAGTCAAGGGTGCTGGCATAATGGTTATATGCCGCCCGTCTTGAAACACGGACCTAAACAAC。

在一种优选的实施例中，所述解脂耶罗维亚酵母Yl590具备快速生长、多碳源利用和快速消耗所述碳源的能力。

在一种优选的实施例中，所述快速生长包括：相同初始菌体浓度的所述解脂耶罗维亚酵母Yl590与解脂耶罗维亚酵母Po1f，在相同条件下的增殖至特定菌体浓度，所述解脂耶罗维亚酵母Yl590的所需时间为所述解脂耶罗维亚酵母Po1f的30%-90%，包括但不限于30%、40%、50%、60%、70%、80%或90%。

在一种优选的实施例中，所述碳源各自独立选自如下任意一种或多种：乙醇、甲醇、木糖、甘油、乙酸钠、丙二酸、半乳糖、蔗糖或葡萄糖；更优选地，碳源为葡萄糖。

在一种优选的实施例中，解脂耶罗维亚酵母Yl590具备耐受如下任意一种或多种条件的能力：高浓度葡萄糖、低pH和高浓度氯化钠的能力；高浓度葡萄糖的浓度为100-600g/L (包括但不限于100、125、150、175、200、250、300、400、500或600 g/L)；优选地，高浓度葡萄糖的浓度为100 g/L或200 g/L；高浓度氯化钠的浓度为50-100 g/L (包括但不限于50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100 g/L)；优选地，高浓度氯化钠的浓度为50 g/L、60g/L或70 g/L；低pH的pH值为2-6 (包括但不限于2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5或6)；优选地，pH值为3、3.5、4、5或6。

上述解脂耶罗维亚酵母Yl590具有生长速度快、底物利用快的特点，在不同阶段的培养增殖中，此种培养方法所需的时间均少于现有技术中的其他解脂耶罗维亚酵母，便于节约整个培养周期所需的时间，如在发酵阶段能够更快达到目标OD₆₀₀，减少发酵所需时间。

且上述解脂耶罗维亚酵母Yl590能够实现对于多种碳源的利用，本领域技术人员可以根据实际的条件和需求选择碳源，包括但不限于以碳源为能量来源、和/或以碳源为工程菌中目标代谢产物的前体。且在不同的碳源中，解脂耶罗维亚酵母Yl590的生长速度均快于现有技术中的解脂耶罗维亚酵母。

上述解脂耶罗维亚酵母Yl590还能够耐受更高的渗透压条件和更低的pH条件，包括但不限于在更高浓度的葡萄糖和/或氯化钠、较低的pH中增殖。此种能力能够使解脂耶罗维亚酵母Yl590在高浓度的底物中进行更快、更高密度的扩增和发酵，且在此种培养环境下其他杂菌难以存活或难以与解脂耶罗维亚酵母Yl590竞争，减少杂菌污染的风险，降低发酵对无菌条件的需求。

在本申请第二种典型的实施方式中，提供了一种产香紫苏醇的工程菌株，该工程菌株的出发菌株为上述解脂耶罗维亚酵母Yl590，工程菌株的基因组中通过基因编辑方法插入了焦磷酸赖百当烯二醇酯合酶基因CLS、香紫苏醇合酶基因TP1132以及香叶基香叶基焦磷酸合酶基因CrtE；

在一种优选的实施例中，工程菌株的基因组中通过基因编辑方法敲除了Ku70、URA3和LEU2基因；优选地，基因编辑方法包括：利用CRISPR、同源重组、非同源末端连接或Cre/lox系统对解脂耶罗维亚酵母Yl590的染色体进行序列的插入、删除或替换。

优选地，上述工程菌株为Yl590△Ku70(URA3^-), siteC6::CrtE, siteE16:: CLS,siteB4::TP1132, △LEU2。

上述工程菌株中，焦磷酸赖百当烯二醇酯合酶基因CLS表达的氨基酸序列为SEQID NO：4、香紫苏醇合酶基因TP1132表达的氨基酸序列为SEQ ID NO：5，香叶基香叶基焦磷酸合酶基因CrtE表达的氨基酸序列为SEQ ID NO：6。本领域技术人员也可以根据现有技术对基因和表达的蛋白进行灵活修改或替换。

香紫苏醇是具有半日花烷骨架的二萜化合物，主要用作香料工业中的原料。香紫苏醇可以用作合成龙涎香化学制剂的原料，如龙涎醚、降龙涎香醚、甲基龙涎醚等。此外，香紫苏醇还是潜在抗肿瘤药物，对人类多种癌细胞如白血病细胞、肿瘤细胞和结肠癌细胞均有细胞毒性。

生产香紫苏醇的方式包括从植物提取、生物发酵等，其中构建微生物细胞工厂是高效合成香紫苏醇等高值萜类化合物极具潜力的一种方式。传统上，香紫苏醇通过从香紫苏花序的植物浸膏中提取获得。然而，由于种植地区的环境和气候因素的影响，导致了植物提取法的限制。相比之下，利用微生物发酵的方式具有生长周期短、全天候生产以及稳定产量的优势，可以满足市场需求的增长。选择合适的微生物对成功实现生物过程至关重要，需要考虑其生产能力、底物利用率以及耐受性，并掌握相关技术以实现菌株改造。利用上述解脂耶罗维亚酵母Yl590作为出发菌株，通过引入外源的基因，能够获得产香紫苏醇的工程菌株。

在本申请第三种典型的实施方式中，提供了一种香紫苏醇的生产方法，该生产方法包括：以上述产香紫苏醇的工程菌株为发酵菌株进行种子液的制备和发酵培养，从发酵液和/或菌体中获得香紫苏醇。

在一种优选的实施例中，种子液的制备方法包括：将产香紫苏醇的工程菌株接种至种子培养基，28-32℃ (包括但不限于28、29、30、31或32℃)，150-250 rpm (包括但不限于150、160、170、180、190、200、210、220、230、240或250 rpm) 培养16-36 h (包括但不限于16、16.5、17、17.5、18、18.5、19、19.5、20、22、25、28、30、32、34或36 h)；优选地，种子培养基为YPD液体培养基。

在现有技术中，常规的解脂耶罗维亚酵母在接种、增殖获得种子培养基的过程中，至少需要进行20h的培养，而本申请的解脂耶罗维亚酵母Yl590增殖速度快，培养16h就能够获得浓度、活力适宜的种子培养基。

在一种优选的实施例中，发酵培养方法包括：将含有产香紫苏醇的工程菌株的种子液接种至发酵培养基中，获得初始OD₆₀₀为0.01-0.04 (包括但不限于0.01、0.015、0.02、0.025、0.03、0.035或0.04) 的起始发酵菌液；在28-32℃ (包括但不限于28、29、30、31或32℃)、150-280 rpm (包括但不限于150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270或280 rpm)下发酵36-72 h (包括但不限于36、42、48、54、60、66或72 h)，获得发酵液和/或菌体；优选地，发酵培养基为YPD液体培养基。

在一种优选的实施例中，从发酵液和/或菌体中获得香紫苏醇的方法包括：将发酵液和/或菌体与有机试剂混合，有机试剂包括但不限于如下任意一种或多种：正十二烷、无水乙醇、甲醇、异丙醇、丙酮、正庚烷、正己烷或乙腈；优选地，有机试剂为正十二烷。

下面将结合具体的实施例来进一步详细解释本申请的有益效果。

实施例1 解脂耶罗维亚酵母Yl590的筛选与鉴定

1.采样与分离：

采用稀释法来分离解脂耶罗维亚酵母。称取从内蒙古自治区不同地区购买的奶制品各9 g，置于含90 mL无菌水的250 mL锥形瓶中，在摇床中以28℃、200 rpm的条件进行混匀共30 min，再用无菌水分别稀释10、100倍，涂布于含三丁酸甘油酯的LB固体培养基平板，30℃培养箱培养直到生长出菌落为止。

含三丁酸甘油酯的LB固体培养基成分如下：酵母粉5 g/L、蛋白胨10 g/L、氯化钠10 g/L、三丁酸甘油酯2 mL和琼脂粉20 g/L。

2.菌种纯化：

在最终生长出来的菌落中，挑选菌落形态为圆形、光滑、扁平且淡黄色的样本在YPD固体培养基中进行三区划线分离，30℃培养24 h获得纯化的单克隆，活化于YPD液体培养基，30℃培养20 h后进行保种，于-80℃冰箱保存。

YPD固体培养基成分如下：酵母粉10 g/L、蛋白胨20 g/L，葡萄糖20 g/L，琼脂粉20g/L，其中葡萄糖需要单独灭菌后加入。

YPD液体培养基成分如下：酵母粉10 g/L、蛋白胨20 g/L，葡萄糖20 g/L，其中葡萄糖需要单独灭菌后加入。

3.解脂耶罗维亚酵母鉴定：

利用PCR扩增得到解脂耶罗维亚酵母的26S ribosomal RNA基因。引物序列如下表1所示。

表1

。

通过基因扩增获取菌株的26S ribosomal RNA基因序列后，由安升达公司测序获得核苷酸序列，再通过NCBI官网 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/) BLAST，获取菌株信息，结果显示菌株Yl590与Yarrowia lipolytica WSYC 781 (FR856618.1) 同源性最高，一致性达99%。选出与该序列相似性较高的26S ribosomal RNA序列，构建系统发育树，如图1所示。根据以上结果，Yl590属于解脂耶罗维亚酵母 (Yarrowia lipolytica)。

Yl590的26S ribosomal RNA基因序列为SEQ ID NO：1所示的序列。

SEQ ID NO：1：

菌株Yl590及解脂耶罗维亚酵母标准菌株Po1f平板培养24 h和48 h对比图如图2中A和图2中B所示，图中左侧均为Po1f平板，右侧均为Yl590平板。

菌株Yl590显微镜形态图 (×100倍) 如图3所示。

实施例2 解脂耶罗维亚酵母Yl590的生长情况和底物利用情况

将解脂耶罗维亚酵母Yl590和对照Po1f菌株活化到含5 mL YPD液体的试管中，30℃、220 rpm条件下培养16 h。

将培养菌液按初始OD₆₀₀=0.2接种到50 mL YPD液体的摇瓶中，30℃、220 rpm条件下培养。取不同时间0 h，5 h，23 h，29 h，47 h，53 h，71 h的样品检测OD₆₀₀值和底物消耗情况以比较菌株生长状态。

生长情况和碳源消耗情况如图4所示，在整个生长周期，Yl590菌株的OD₆₀₀均较对照Po1f菌株高，最高达3倍，表明Yl590菌株的生长速度更快。此外，Yl590菌株在47 h时，葡萄糖消耗接近完全，而Po1f菌株在72 h时，葡萄糖仍有剩余，表明Yl590菌株的底物利用速度更快。

实施例3 解脂耶罗维亚酵母Yl590的性能分析

1.底物碳源利用分析

在96孔板的各孔中，分别加入不同底物碳源，5 g/L乙醇、5 g/L甲醇、5 g/L木糖、5g/L甘油、5 g/L乙酸钠、5 g/L丙二酸、5 g/L半乳糖、5 g/L蔗糖、5 g/L葡萄糖的SD培养基，并以菌株Po1f (泰斯拓生物，TS153400)为对照，总体积为500μL，30℃，700 rpm过夜培养。

SD培养基的配方：酵母基础氮源 (YNB) 1.7 g/L，硫酸铵5 g/L，L-精氨酸0.1 g/L，L-半胱氨酸0.1 g/L，L-赖氨酸0.1 g/L，L-苏氨酸0.1 g/L，L-天冬酰胺0.05 g/L，L-异亮氨酸0.05 g/L，L-苯丙氨酸0.05 g/L，L-脯氨酸0.05 g/L，L-丝氨酸0.05 g/L，L-酪氨酸0.05 g/L，L-缬氨酸0.05 g/L，L-甲硫氨酸0.05 g/L，L-色氨酸0.1 g/L，L-组氨酸0.1 g/L，L-亮氨酸0.1 g/L，尿嘧啶0.1 g/L，腺嘌呤0.1 g/L，pH7.0 ± 0.2。

酵母基础氮源 (YNB) 成分：肌醇2.0 mg/L，烟酸 (维生素B3) 0.4 mg/L，盐酸硫胺素 (维生素B1) 0.4 mg/L，硫酸铜0.04 mg/L，磷酸二氢钾1000 mg/L，硼酸0.5 mg/L，盐酸吡哆醇 (维生素B6) 0.4 mg/L，泛酸钙 (维生素B5) 0.4 mg/L，对氨基苯甲酸0.2 mg/L，硫酸镁500 mg/L，硫酸锰0.4 mg/L，硫酸锌0.4 mg/L，氯化铁0.2 mg/L，核黄素 (维生素B2)0.2 mg/L，氯化钙100 mg/L，碘化钾0.1 mg/L，钼酸钠0.2 mg/L，生物素 (维生素B7、H)0.002 mg/L，氯化钠100 mg/L。

结果如图5所示，Yl590菌株能够利用多种碳源，且利用乙醇、甘油、乙酸钠、丙二酸、半乳糖或葡萄糖的明显能力优于Po1f，其中以甘油或葡萄糖作为碳源时，Yl590菌株生长最佳。

2.耐受性分析

在96孔板的各孔中，分别加入不同葡萄糖质量浓度为 (100、200、300、400、500、600 g/L)，pH值为 (2、3、3.5、4、5、6)、氯化钠质量浓度为 (50、60、70、80、100 g/L) 的SD培养基，并以菌株Po1f (泰斯拓生物，TS153400)为对照，总体积为500 μL，30℃，700 rpm过夜培养。结果如图6所示，在葡萄糖浓度100、200 g/L或pH为3、4、5、6或氯化钠浓度为50、60、70g/L 条件下，Yl590菌株的生长明显好于Po1f。

实施例4 解脂耶罗维亚酵母Yl590的基因编辑能力

对解脂耶罗维亚酵母Yl590进行基因编辑，根据现有技术，通过CRISPR技术敲除Yl590菌株的URA3，LEU2基因便于进行基因编辑，敲除Ku70基因增强了其同源重组能力。通过同源重组技术将可合成香紫苏醇的三个异源基因焦磷酸赖百当烯二醇酯合酶基因CLS(氨基酸序列SEQ ID NO：4)、香紫苏醇合酶基因TP1132 (氨基酸序列SEQ ID NO：5)和香叶基香叶基焦磷酸合酶基因CrtE (氨基酸序列SEQ ID NO：6)整合到解脂耶罗维亚酵母基因组上。结果，解脂耶罗维亚酵母Yl590敲除基因和过表达基因均正确，说明该菌株可以进行基因编辑操作，可作为底盘菌株进行改造。

SEQ ID NO：4

MAFTFTSAHLFLPVTENHSVHVNYSIPPGNWRLWSTAKGGSNKLDIRRLRCSARRTPEPLAQGSNGGRDGVEAIQRLQTIADDKIDGGANELGIVVWDLIRDGVDAVKSMFDSMGDGDISISAYDTAWVALVKDVNGSGGPQFPSSLQWIVDNQLPDGSWGDSEVFSAYDRLLKTLACVVALKSWNIRPDKCQKGLKFFRDNISKLEKENVEASAQMLSGFEVVFLSLIEVARRLDIQIPLHSPVFEDLIARRNLKFAKIPLDLMHNVPTSLLNSLEGMTGVELDWEKLLKLQSQDGSFITSPSSTAFALMQTNDTKCLGYLKFVVQKFNGGAPGQYPVEIFERIWVVDRLQRLGISRYFQLEIKECCLDYAFKHWTQYGSSWARNTPVYDLDDTCMAFRILRLHGYDVSAEAFRHFEKNGVFFCFGWETTQSVTVNFNLYRATQVAFPGENILKEAKQFSFNFLMKKQAAREFQDKWVILKDFPGELKYALEFPWYASLPRVETRFYVEQYGGDNDVWIGKTLYRMPYINNNVYLELAKLDFNNCQALHRKEWETMQKWFMESKLDEFGVSSKTLLESYFLAAASIFEPERSTERLAWAKTAFLMETIGSYFDDEMNSKDLRKAFVQEFKNIYERRMEAKGTKWNLIIILLTTLNHLTEVCGRDINSYLCHSWEKWMMMWEPEGDRYKGAAELLSNSINLSSGRLFSNDTLSHPNYEKLVTLSNKLCHQLGNSRRGNHNEDSDIKDTKIEIAMQELVQLVHQNSSDDISMDLKQTFFAVVRSFYYAAHCDRGTINSHIVKVLFESVV。

SEQ ID NO：5

MSLAFNVGVTPFSGQRVGSRKEKFPVQGFPVTTPNRSRLIVNCSLTTIDFMAKMKENFKREDDKFPTTTTLRSEDIPSNLCIIDTLQRLGVDQFFQYEINTILDNTFRLWQEKHKVIYGNVTTHAMAFRLLRVKGYEVSSEELAPYGNQEAVSQQTNDLPMIIELYRAANERIYEEERSLEKILAWTTIFLNKQVQDNSIPDKKLHKLVEFYLRNYKGITIRLGARRNLELYDMTYYQALKSTNRFSNLCNEDFLVFAKQDFDIHEAQNQKGLQQLQRWYADCRLDTLNFGRDVVIIANYLASLIIGDHAFDYVRLAFAKTSVLVTIMDDFFDCHGSSQECDKIIELVKEWKENPDAEYGSEELEILFMALYNTVNELAERARVEQGRSVKEFLVKLWVEILSAFKIELDTWSNGTQQSFDEYISSSWLSNGSRLTGLLTMQFVGVKLSDEMLMSEECTDLARHVCMVGRLLNDVCSSEREREENIAGKSYSILLATEKDGRKVSEDEAIAEINEMVEYHWRKVLQIVYKKESILPRRCKDVFLEMAKGTFYAYGINDELTSPQQSKEDMKSFVF。

SEQ ID NO：6

MVSGSKAGVSPHREIEVMRQSIDDHLAGLLPETDSQDIVSLAMREGVMAPGKRIRPLLMLLAARDLRYQGSMPTLLDLACAVELTHTASLMLDDMPCMDNAELRRGQPTTHKKFGESVAILASVGLLSKAFGLIAATGDLPGERRAQAVNELSTAVGVQGLVLGQFRDLNDAALDRTPDAILSTNHLKTGILFSAMLQIVAIASASSPSTRETLHAFALDFGQAFQLLDDLRDDHPETGKDRNKDAGKSTLVNRLGADAARQKLREHIDSADKHLTFACPQGGAIRQFMHLWFGHHLADWSPVMKIA。

具体步骤如下：

制备感受态：从YPD固体培养基平板上挑取活化的单克隆于试管中，置于30 ℃培养24 h；5000 rpm离心收集菌体，重悬于1 mL 1ｘTE Buffer，再次离心收集菌体，重悬于1mL 0.1 mol/L的LiAC (OD₆₀₀为3~6)，置于30 ℃孵育1 h；5000 rpm离心1 min收集菌体，重悬于适量的0.1 mol/L的LiAC，即为感受态细胞。

构建工程菌：向1.5 mL离心管中加入15 µL鲑鱼精DNA (需提前加热再冷却)，1-5µg待转化的DNA或2 µg质粒，混合均匀，再加入40 µL制备好的感受态细胞 (OD₆₀₀ ~4)，置于30 ℃孵育15 min；向上一步的混合物中加入280 µL 50% PEG4000，70 µL 0.5 mol/L LiAC和16 µL 1 mol/L DTT，混合均勾，置于30 ℃孵育1 h；向上一步的混合物中加入40 µLDMSO，置于39 ℃孵育10 min，加入600 µL 0.1 mol/L LiAC，混合均匀，置于30 ℃复苏1 h；5000 rpm离心2 min收集菌体，用水重悬后涂布于含有相应抗生素的培养基或营养缺陷型培养基，置于30 ℃培养2-3 天至单菌落长出，将Yl590工程菌命名Yl590△Ku70(URA3^-),siteC6::CrtE, siteE16::CLS, siteB4::TP1132, △LEU2。为在同一水平比较，对Po1f进行基因操作，方法同上，获得工程菌命名Po1f△Ku70, siteB1::CLS, siteC6::CrtE,siteB4::TP1132。

实施例5 解脂耶罗维亚酵母Yl590摇瓶水平的香紫苏醇产量

种子培养基：刮取Yl590△Ku70(URA3^-), siteC6::CrtE, siteE16::CLS,siteB4::TP1132, △LEU2和Po1f△Ku70, siteB1::CLS, siteC6::CrtE, siteB4::TP1132平板菌各一环，分别转接至含有5 mL YPD液体培养基的试管中，30 ℃，200 rpm摇床培养16h。

发酵培养基：按照初始OD₆₀₀为0.02的接种量将种子液转接到含50 mL发酵培养基(YPD培养基，pH 6)的250 mL三角瓶中，30℃，220 rpm进行发酵培养72-96h。

香紫苏醇 (Scl)的检测：在发酵培养48 h时，取1 mL发酵液加入1 mL正十二烷振荡1 h，离心取上清送气相色谱检测。结果Yl590香紫苏醇产量为1.37 mg/L，对照Po1f的香紫苏醇产量仅为0.96 mg/L。此外，Yl590的OD₆₀₀是PO1f的1.7倍，表明生长和耗糖 (葡萄糖)速度更快。摇瓶中Yl590菌株的香紫苏醇产量、生长情况和耗糖情况如图7所示。

从以上的描述中，可以看出，本发明上述的实施例实现了如下技术效果：上述解脂耶罗维亚酵母Yl590的生长速度相较于现有技术中的其他解脂耶罗维亚酵母更快，具有快速生长能力和底物消耗能力，能够缩短生长周期，从而缩短培养和发酵所需的时间。且解脂耶罗维亚酵母Yl590的耐受性强，相较于现有技术中的其他解脂耶罗维亚酵母，能够耐受更低的pH、更高的盐 (如氯化钠)浓度、更高的底物 (如葡萄糖)浓度，此种耐受性便于提高解脂耶罗维亚酵母Yl590在发酵中的浓度，也能够减少杂菌污染的风险。且现有技术中对于解脂耶罗维亚酵母的分子生物学方法 (包括但不限于遗传改造方法)同样适用与本申请中的解脂耶罗维亚酵母Yl590，即解脂耶罗维亚酵母Yl590能够便捷地被进行遗传改造等操作，具有很高的应用前景。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种解脂耶罗维亚酵母Yl590，分类命名为解脂耶罗维亚酵母Yarrowia lipolytica，于2024年6月4日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为中国北京，保藏编号为CGMCC No. 30855。

2.一种产香紫苏醇的工程菌株，其特征在于，所述工程菌株的出发菌株为权利要求1所述的解脂耶罗维亚酵母Yl590，所述工程菌株的基因组中通过基因编辑方法插入了焦磷酸赖百当烯二醇酯合酶基因CLS、香紫苏醇合酶基因TP1132以及香叶基香叶基焦磷酸合酶基因CrtE；

所述焦磷酸赖百当烯二醇酯合酶基因CLS表达的蛋白为SEQ ID NO：4所示的多肽；

所述香紫苏醇合酶基因TP1132表达的蛋白为SEQ ID NO：5所示的多肽；

所述香叶基香叶基焦磷酸合酶基因CrtE表达的蛋白为SEQ ID NO：6所示的多肽。

3.根据权利要求2所述的工程菌株，其特征在于，所述工程菌株的基因组中通过所述基因编辑方法敲除了Ku70、URA3和LEU2基因。

4.根据权利要求2-3中任一项所述的工程菌株，其特征在于，所述基因编辑方法包括：利用CRISPR、同源重组、非同源末端连接或Cre/lox系统对所述解脂耶罗维亚酵母Yl590的染色体进行序列的插入、删除或替换。

5.一种香紫苏醇的生产方法，其特征在于，所述生产方法包括：

以权利要求2-4中任一项所述的产香紫苏醇的工程菌株为发酵菌株，进行种子液的制备和发酵培养，从发酵液和/或菌体中获得所述香紫苏醇。

6.根据权利要求5所述的生产方法，其特征在于，所述种子液的制备方法包括：

将所述产香紫苏醇的工程菌株接种至种子培养基，28-32℃，150-250rpm培养16-36 h。

7.根据权利要求5所述的生产方法，其特征在于，所述发酵培养方法包括：

将含有所述产香紫苏醇的工程菌株的种子液接种至发酵培养基中，获得初始OD₆₀₀为0.01-0.04的起始发酵菌液；

在28-32℃、150-280rpm下发酵36-72 h，获得所述发酵液和/或所述菌体。

8.根据权利要求5所述的生产方法，其特征在于，所述从发酵液和/或菌体中获得所述香紫苏醇的方法包括：

将发酵液和/或所述菌体与有机试剂混合，所述有机试剂选自如下任意一种或多种：正十二烷、无水乙醇、甲醇、异丙醇、丙酮、正庚烷、正己烷或乙腈。