CN118871451A

CN118871451A - 分离多肽的方法

Info

Publication number: CN118871451A
Application number: CN202380027581.5A
Authority: CN
Inventors: E·比奇洛; 宋远礼
Original assignee: Bristol Myers Squibb Co
Current assignee: Bristol Myers Squibb Co
Priority date: 2022-03-18
Filing date: 2023-03-17
Publication date: 2024-10-29
Also published as: WO2023178329A1; EP4493575A1; KR20240159621A; JP2025509749A; US20250206775A1

Abstract

本公开文本涉及分离和/或纯化蛋白质种类的方法，所述方法包括以连续操作模式使包含所述种类和一种或多种杂质的混合物与两个或更多个色谱柱接触。在一些方面，所述蛋白质种类是电荷变体。

Description

分离多肽的方法

相关申请的交叉引用

本申请要求2022年3月18日提交的美国临时申请号63/321,531的优先权权益，将该临时申请通过引用以其整体并入本文。

技术领域

本申请涉及使用两个或更多个色谱柱进行的蛋白质分离和纯化的领域。

背景技术

治疗性蛋白质(特别是单克隆抗体(mAb))经受各种翻译后修饰(PTM)，如氧化、脱酰胺、糖基化和赖氨酸截短。这些修饰中的一些产生蛋白质电荷变体。需要对治疗性蛋白质的电荷变体进行表征和分析以确保药物产品的质量不受影响。然而，大规模的蛋白质纯化和分离可能是昂贵的并且耗时的。分离特定蛋白质种类(species)的传统方法依赖于HPLC和/或FPLC，所述方法可花费数周至数月以产生大量产物用于进一步分析和/或使用。传统方法典型地强制决定了具有高生产率或高纯度，但两者通常不能同时实现。

因此，在蛋白质纯化领域中仍然需要用于使产率和纯度最大化同时减少产生纯化样品所需时间的方法。

发明内容

本公开文本的一些方面涉及从包含蛋白质种类和一种或多种杂质的混合物中分离所述蛋白质种类的方法，所述方法包括以连续操作模式使所述混合物与两个或更多个色谱柱接触。

本公开文本的一些方面涉及从包含所述蛋白质种类和一种或多种杂质的混合物中增加所述蛋白质种类的纯度和/或产率的方法，所述方法包括以连续操作模式使所述混合物与两个或更多个色谱柱接触。

本公开文本的一些方面涉及用于富集用于分析表征的蛋白质种类的方法，所述方法包括：(a)从包含所述蛋白质种类和一种或多种杂质的混合物中分离所述蛋白质种类，包括在色谱分离系统中以连续操作模式使所述混合物与两个或更多个色谱柱接触；以及(b)使来自(a)的所述种类经受分析表征。

本公开文本的一些方面涉及用于进行蛋白质种类的分析表征的方法，所述方法包括：(a)从包含所述蛋白质种类和一种或多种杂质的混合物中分离所述蛋白质种类，包括在色谱分离系统中以连续操作模式使所述混合物与两个或更多个色谱柱接触；以及(b)对来自(a)的所述种类进行分析表征。

在一些方面，所述分析表征通过以下进行：HPLC系统、毛细管等电聚焦(cIEF)凝胶电泳、成像毛细管等电聚焦(iCIEF)、阳离子交换色谱法(CEX)、阴离子交换色谱法(AEX)、MFI、SEC-MALS、SEC或质谱法。在一些方面，与HPLC或FPLC相比，所述方法产生所述蛋白质种类的增加的纯度和/或增加的产率。

在一些方面，所述两个或更多个色谱柱富集所述种类。

在一些方面，所述方法进一步包括将所述混合物加载到所述第一色谱柱上。在一些方面，所述加载的混合物通过所述第一色谱柱并且被分离成包含所述种类的富集种类和丢弃种类(“富集阶段I”)。在一些方面，所述富集种类通过所述第二柱，并且将所述丢弃种类在所述第一色谱柱后丢弃(“富集阶段II”)。

在一些方面，所述方法进一步包括重新平衡所述第一色谱柱。

在一些方面，所述方法进一步包括使所述富集种类与所述第一色谱柱接触。在一些方面，所述方法进一步包括将另外的混合物加载到所述第一柱中，其中所述另外的混合物包含所述种类和一种或多种杂质。在一些方面，在将所述富集种类添加至所述第一色谱柱中的同时添加所述另外的混合物。在一些方面，在将所述富集种类添加至所述第一色谱柱中之后并且在所述富集种类通过所述第一色谱柱之前添加所述另外的混合物。

在一些方面，所述富集阶段I和II重复至少两次、至少三次、至少四次、至少五次、至少六次、至少七次、至少八次、至少九次或至少十次。

在一些方面，所述方法进一步包括耗尽阶段。在一些方面，所述耗尽阶段包括在不存在另外的混合物的情况下使所述富集种类与所述第一色谱柱接触。在一些方面，所述耗尽阶段进一步包括使所述富集种类通过所述第一色谱柱并且将所述种类与一种或多种杂质分离。在一些方面，所述耗尽阶段进一步包括使所述富集种类通过所述第二色谱柱，将所述种类与一种或多种杂质分离。

在一些方面，所述方法进一步包括洗脱所述种类。在一些方面，所述方法产生至少88％、89％、90％、91％、92％、93％、95％、96％、97％、98％、99％或100％纯的所述蛋白质种类。

在一些方面，所洗脱的所述种类的浓度是所述混合物中所述种类的浓度的至少约1.5倍、至少约1.6倍、至少约1.7倍、至少约1.8倍、至少约1.9倍、至少约2.0倍、至少约2.5倍、至少约3.0倍、至少约3.5倍、至少约4.0倍、至少约4.5倍、至少约5.0倍、至少约5.5倍、至少约6.0倍、至少约6.5倍、至少约7.0倍、至少约7.5倍、至少约8.0倍、至少约8.5倍、至少约9.0倍、至少约9.5倍或至少约10.0倍。

在一些方面，所述色谱柱中的一个或多个包括盐梯度、pH梯度或两者。在一些方面，所述盐梯度包括氯化钠梯度。在一些方面，所述盐梯度包括有或没有盐。在一些方面，所述盐的浓度在约50mM与约600mM之间、在约100mM与约550mM之间、在约150mM与约500mM之间、在约200mM与约450mM之间、在约250mM与约400mM之间、在约100mM与约400mM之间、在约100mM与约350mM之间、在约100mM与约300mM之间、在约100mM与约250mM之间、在约300mM与约600mM之间、在约350mM与约550mM之间、在约400mM与约500mM之间或在约350mM与约450mM之间。在一些方面，所述盐的浓度为至少50mM、至少约100mM、至少约150mM、至少约200mM、至少约250mM、至少约260mM、至少约270mM、至少约280mM、至少约290mM、至少约300mM、至少约310mM、至少约320mM、至少约330mM、至少约340mM、至少约350mM、至少约360mM、至少约370mM、至少约380mM、至少约390mM、至少约400mM、至少约450mM、至少约500mM、至少约550mM或至少约600mM。

在一些方面，所述pH梯度的pH在约pH 3与约pH 11之间。在一些方面，所述混合物在缓冲液中。在一些方面，所述缓冲液包括MES、磷酸盐缓冲液、Tris或其任何组合。

在一些方面，所述方法进一步包括测量翻译后修饰。在一些方面，所述翻译后修饰包括N-谷氨酰胺焦谷氨酸化、C末端赖氨酸截短、C末端脯氨酸酰胺化、糖化、唾液酸化、脱酰胺化、天冬氨酸异构化、通用截短或其任何组合。

在一些方面，所述蛋白质包括融合蛋白或抗体或其抗原结合部分。在一些方面，所述抗体或其抗原结合部分结合选自以下的抗原：PD-1、PD-L1、CTLA-4、LAG-3、TIGIT、GITR、CXCR4、CD73、HER2、VEGF、CD20、CD40、CD11a、组织因子(TF)、MICA/B PSCA、IL-8、EGFR、HER3、HER4及其任何组合。

在一些方面，所述融合蛋白包含免疫球蛋白组分和生长因子。在一些方面，所述融合蛋白包括Fc融合蛋白。在一些方面，所述融合蛋白包括与CTLA-4融合的Fc。在一些方面，所述融合蛋白包含阿巴西普或贝拉西普。

在一些方面，所述融合蛋白包括与白介素融合的Fc。

在一些方面，所述融合蛋白或抗体的种类是酸性种类、碱性种类或主要种类。在一些方面，通过蛋白A亲和色谱法部分地纯化所述融合蛋白或抗体。

在一些方面，通过逆流纯化系统富集所述种类。在一些方面，所述逆流纯化系统是多柱逆流溶剂梯度纯化(MCSGP)系统。

本公开文本的一些方面涉及通过本文公开的方法制备的蛋白质种类。在一些方面，所述蛋白质种类是电荷变体。

本公开文本的一些方面涉及治疗有需要的受试者的疾病或病症的方法，所述方法包括施用本文公开的所述蛋白质种类。

附图说明

图1A、图1B和图1C提供了使用MCSGP双柱连续色谱法的本文所述的富集方法的示意图。加载材料由三种种类(红色(“R”)、绿色(“G”)和蓝色(“B”))的混合物表示，其中绿色种类是目的种类。绿色种类的富集通过三阶段操作实现，所述三阶段操作包括绿色种类的富集、红色和蓝色种类的耗尽以及绿色种类的洗脱。特别地，图1A示出了富集阶段，其中将混合物加载到第一柱上，并且在丢弃从第一柱洗脱的种类(蓝色)后，将用于富集的种类(绿色)再循环到第二柱。在所有绿色组分再循环之后，经由汽提步骤从第一柱中丢弃后面的洗脱种类(红色)。将另外的加载物(混合物)注射到柱2中，然后在柱2上进行与柱1相同的分离(丢弃蓝色，再循环绿色以及丢弃红色)，并且随着循环次数的增加，发生绿色的富集。图1B示出了耗尽阶段，其中目的种类(绿色)保留在柱中，并且去除不需要的种类(蓝色和红色)。耗尽随后是洗脱阶段，以从系统中回收绿色种类。图1C示出了整个上述操作的UV迹线的模拟。在左小图中，加载材料含有相同丰度的三种种类(蓝色、绿色和红色)。中间小图示出了在10个绿色种类富集循环后所得到的产物。最后，右小图示出了在1个耗尽循环后，系统中几乎没有留下蓝色和红色种类，而绿色种类保持不变。该产物在处理的最后阶段期间被洗脱，并且被收集用于随后的分析。本文中所讨论的分子中的一种的每个阶段的持续时间为每个循环约45分钟。鉴于存在10个富集循环、2个耗尽循环和1个洗脱循环，这总计约10小时的处理时间。

图2A、图2B、图2C和图2D示出了使用以下色谱系统中的一种对mAb1抗体的电荷变体的分离：(i)高效液相色谱法(HPLC)，(ii)快速蛋白液相色谱法(FPLC)，和(iii)本文所述的连续色谱法(CUBE)。图2A示出了使用HPLC系统的电荷变体分离。箭头前的级分定义为酸性级分。图2B示出了使用FPLC系统的电荷变体分离。箭头前的级分定义为酸性级分。图2C示出了使用CUBE的酸性级分富集。提供了来自柱1(左)和柱2(右)的个循环2(黑色；1)与循环10(红色；2)之间的连续色谱曲线的比较。图2D提供了使用HPLC、FPLC和连续色谱方法的分离或富集方法的处理时间(黑色(1)条)和酸性级分纯度(红色(2)条)的比较。计算从具有17％酸性变体的加载材料中产生10mg酸性级分的时间。用iCIEF方法确定纯度。

图3提供了使用连续色谱法分离的mAb1抗体的电荷变体的成像毛细管电泳图谱。小图(1)示出了分离或富集前的加载材料。酸性和碱性区域二者均被鉴定。小图(2)示出了小图(1)中所示的酸性区域1的富集。小图(3)示出了小图(1)中所示的酸性区域2的富集。小图(4)示出了小图(1)中所示的碱性区域1的富集。以及小图(5)示出了小图(1)中所示的碱性区域2的富集。Y轴基于峰最大值进行归一化。

图4提供了使用连续色谱法分离的mAb2抗体的电荷变体的成像毛细管电泳图谱。顶部小图(a)为分级或富集前的加载材料。第二小图(b)是富集后的加载材料。箭头指示样品中存在的酸性种类。Y轴基于峰最大值进行归一化。

图5A提供了来自mAb3的去糖基化样品的完整质量(从顶部至底部小图：标准参考材料、未富集的材料、富集的酸性种类和富集的碱性种类)。144673m/z附近的峰指定为去糖基化种类。144835m/z和144999m/z附近的峰分别指定为具有一个和两个糖化的种类。碱性样品中144558m/z附近的峰(在未富集的材料中几乎不可见)被指定为C末端脯氨酸酰胺化种类。

图5B示出了来自图4A的去糖基化样品中截短种类的存在(从顶部至底部小图为标准参考材料、加载材料、富集的酸性种类和富集的碱性种类)。121385m/z附近的峰被指定为缺失一条轻链的种类。131538m/z附近的峰被指定为重链截短种类，其中一条重链缺失在329后的残基。

图6提供了mAb3抗体的电荷变体的成像毛细管电泳图谱。使用具有盐梯度或pH梯度的Mono S CEX或Mono Q AEX将mAb3的酸性种类分级(用FPLC)或富集(用连续色谱法)。小图(1)示出了分级或富集前的加载材料。小图(2)示出了使用具有盐梯度的Mono S用FPLC分级的酸性种类。小图(3)示出了使用具有盐梯度的Mono S用连续色谱法富集的酸性种类。小图(4)示出了使用具有pH梯度的Mono Q用FPLC分级的酸性种类。小图(5)示出了使用具有pH梯度的Mono Q用连续模式富集的酸性种类。Y轴基于峰最大值进行归一化。

图7A、图7B、图7C、图7D和图7E提供了使用阳离子交换色谱法(CEX)(Mono S)和阴离子交换色谱法(AEX)(Mono Q)分离的mAb3抗体样品的肽作图质谱结果。使用传统FPLC方法制备标记为“分级”的样品，并且使用连续色谱方法制备标记为“富集”的样品。图7A示出了使用具有盐梯度的Mono S(顶部小图)或使用具有pH梯度的Mono Q(底部小图)分离的样品的唾液酸化。条代表了检测到的不同唾液酸化糖型：G1FS(白色)、G2FS(浅灰色)和G2FS2(深灰色)。G1FS是GIF聚糖的单唾液酸化糖型。G2FS和G2FS2分别是G2F聚糖的单唾液酸化糖型和二唾液酸化糖型。图7B示出了使用具有盐梯度的Mono S(顶部小图)或使用具有pH梯度的Mono Q(底部小图)分离的样品的脱酰胺。条代表了不同的氨基酸残基：N84(白色)、N325(浅灰色)、N384(灰色)以及N389(深灰色)。图7C示出了使用具有盐梯度的Mono S(顶部小图)或使用具有pH梯度的Mono Q(底部小图)分离的样品的糖化。条代表了不同的肽：肽1(白色)和肽2(灰色)。图7D示出了使用具有盐梯度的Mono S(顶部小图)或使用具有pH梯度的Mono Q(底部小图)分离的样品中检测到的N末端谷氨酰胺的百分比。图7E示出了使用具有盐梯度的Mono S(顶部小图)或使用具有pH梯度的Mono Q(底部小图)分离的样品中观察到的C末端脯氨酸酰胺化的百分比。

具体实施方式

大规模的蛋白质纯化和分离可以是昂贵的并且耗时的。分离特定蛋白质种类的传统方法依赖于HPLC和/或FPLC。然而，得到大量的产量，如大于10mg的所需蛋白质种类，可能花费几周或更久。本公开文本的一些方面涉及从包含蛋白质种类和一种或多种杂质的混合物中分离所述蛋白质种类的方法，所述方法包括以连续操作模式使所述混合物与两个或更多个色谱柱接触。本公开文本的一些方面涉及从包含所述蛋白质种类和一种或多种杂质的混合物中增加所述蛋白质种类的纯度和/或产率的方法，所述方法包括以连续操作模式使所述混合物与两个或更多个色谱柱接触。

在一些方面，所述蛋白质种类是电荷变体。在一些方面，所述两个或更多个色谱柱包含至少两个离子交换柱。在一些方面，所述两个或更多个色谱柱包括pH梯度。在一些方面，所述两个或更多个色谱柱包括盐梯度。在一些方面，所述两个或更多个色谱柱包括pH梯度和盐梯度。

I.术语

为了可以更容易地理解本公开文本，首先定义某些术语。如本申请所用，除非本文另外明确提供，否则以下术语中的每一个都应当具有下文所阐述的含义。另外的定义贯穿本申请进行阐述。

除非上下文另外清楚地规定，否则单数形式“一个/一种(a)”、“一个/一种(an)”以及“所述(the)”包括复数指示物。术语“一个/一种(a)”(或“一个/一种(an)”)以及术语“一个或多个/一种或多种(one or more)”和“至少一个/至少一种(at least one)”可以在本文中可互换地使用。在某些方面，术语“一个/一种(a)”或“一个/一种(an)”意指“单个/单一(single)”。在其他方面，术语“一个/一种(a)”或“一个/一种(an)”包括“两个或更多个/两种或更多种(two or more)”或“多个/多种(multiple)”。

术语“和/或”在用于本文的情况下被视为对两个指定特征或组分中的每一个与或不与另一个的具体公开。因此，如在本文中以短语如“A和/或B”使用的术语“和/或”旨在包括“A和B”、“A或B”、“A”(单独)和“B”(单独)。同样地，如以短语如“A、B和/或C”使用的术语“和/或”旨在涵盖以下方面中的每一个：A、B和C；A、B或C；A或C；A或B；B或C；A和C；A和B；B和C；A(单独)；B(单独)；以及C(单独)。

术语“约”或“基本上由……构成”是指如通过本领域普通技术人员所确定在特定值或组成的可接受误差范围内的值或组成，其将部分取决于如何测量或确定所述值或组成，即测量系统的限制。例如，根据本领域的实践，“约”或“基本上由……构成”可以意指在1个或多于1个标准差内。可替代地，“约”或“基本上由……构成”可以意指高达10％的范围。此外，特别是关于生物系统或过程，这些术语可以意指值的至多一个数量级或至多5倍。当在本申请和权利要求中提供特定值或组成时，除非另有说明，否则应假定“约”或“基本上由……构成”的含义在该特定值或组成的可接受误差范围内。

应理解，无论在哪里在本文中用语言“包括/包含(comprising)”描述方面，还提供了以“由……组成”和/或“基本上由……组成”措辞描述的在其他方面类似的方面。

如本文所用，如应用于一个或多个目的值的术语“大约”是指类似于所陈述参考值的值。在某些方面，除非另外陈述或上下文另有明确含义，否则术语“大约”是指落在所陈述参考值的任一方向(大于或小于)上的10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或更小内的一系列值(这个数字超过可能值的100％的情况除外)。

如本文所述，除非另外指示，否则任何浓度范围、百分比范围、比率范围或整数范围都应理解为包括所列举范围内的任何整数的值以及在适当时所述值的分数(如整数的十分之一和百分之一)。

除非另外定义，否则本文所使用的所有技术和科学术语均具有与本公开文本所涉及领域的普通技术人员通常所理解的相同的含义。例如，Concise Dictionary ofBiomedicine and Molecular Biology,Juo,Pei-Show,第2版,2002,CRC Press；TheDictionary of Cell and Molecular Biology,第3版,1999,Academic Press；以及OxfordDictionary of Biochemistry And Molecular Biology,修订版,2000,OxfordUniversity Press为技术人员提供了本公开文本所用的许多术语的通用词典。

单位、前缀和符号是以它们的国际单位系统(Système International deUnites)(SI)接受的形式表示。本文提供的标题不是对本公开文本的各个方面的限制，所述各个方面可以通过参考说明书作为整体而获得。因此，通过从整体上参考说明书，更全面地定义所定义的术语。

本文使用的缩写在本公开文本通篇中定义。在以下小节中进一步详细描述了本公开文本的各个方面。

如在本文中可互换使用的术语“纯化”、“分开”或“分离”是指从包含目的蛋白和一种或多种杂质的组合物或样品中提高目的蛋白的纯度。通常，通过从组合物中去除(完全或部分)至少一种杂质来提高目的蛋白的纯度。在一些方面，目的蛋白是蛋白质的第一电荷变体，例如，抗体的电荷变体，并且一种或多种杂质包含相同蛋白质的第二电荷变体。

如本文所用，术语“色谱法”是指将靶分子如靶蛋白(例如，蛋白质(例如，抗体)的电荷变体)与混合物中的其他分子(例如，其他电荷变体)分离并且允许将靶分子分离出的动态分离技术。典型地，在色谱方法中，液体流动相将含有目的靶分子的样品输送跨过或穿过固定相(通常为固体)介质。对固定相的分配或亲和力的差异引起选定分子与固定相的暂时结合，而流动相在不同时间携带出不同分子。

术语“连续操作模式”或“连续色谱法”是指其中样品通过至少两个串联(即，将来自第一柱的洗脱物直接加载到第二柱上)的色谱柱的色谱过程。在一些方面，将样品加载到第一柱上，将来自第一柱的洗脱物直接应用于第二柱上，并且收集来自第二柱的洗脱物。在一些方面，将样品加载到第一柱上，将来自第一柱的洗脱物直接加载到第二柱上，并且将来自第二柱的洗脱物加载回到第一柱上，并且将过程重复至少一次、至少两次、至少三次、至少四次或至少五次，然后收集来自第二柱的洗脱物。

如本文所用，术语“离子交换色谱法”是指色谱模式，其中待分离的靶分子如蛋白质(例如，蛋白质的电荷变体)是基于与固定在色谱树脂上的带电荷的分子(例如，带正电荷或带负电荷的分子)的极性相互作用而被分离出。可以使用盐梯度或改变pH来实现从离子交换色谱柱洗脱。

“阴离子交换色谱法”或“AEX”是指包含对具有净负表面电荷的分子具有亲和力的带正电荷的离子交换树脂的离子交换色谱法。可以将盐梯度应用于柱以将目的蛋白与其他结合的蛋白质分离，并且蛋白质将以取决于其净表面电荷的顺序洗脱。

“阳离子交换色谱法”或“CEX”是指包含对具有净正表面电荷的分子具有亲和力的带负电荷的离子交换树脂的离子交换色谱法。可以将盐梯度应用于柱以将目的蛋白与其他结合的蛋白质分离，并且蛋白质将以取决于其净表面电荷的顺序洗脱。

如本文所用，术语“亲和色谱法”是指这样的色谱模式，其中有待分离的靶分子如蛋白质分子(例如，蛋白质的电荷变体)通过其与固定在色谱树脂上的分子(例如，基于蛋白A的配体)的“锁与钥”相互作用而被分离出。这种特定的相互作用允许靶分子结合固定在树脂上的分子，而不希望的分子流穿。改变流动相的温度、pH或离子强度，然后使靶分子以高纯度释放。在本文所述的各种实施方案中，亲和色谱法涉及将含有靶分子(例如，免疫球蛋白或另一种含Fc蛋白)的样品添加到固体支持物上，所述固体支持物在其上携带基于蛋白A的C结构域的配体(称为蛋白A亲和色谱介质或树脂)。用于亲和色谱法的其他配体可以包括例如来自链球菌属(Steptococci)的蛋白G，其与免疫球蛋白的Fc区结合。

如本文所用，术语“高效液相色谱法”或“HPLC”或“高压液相色谱法”是指这样的色谱系统，所述色谱系统依靠泵使加压液体和样品混合物通过填充有吸附剂的柱，导致样品组分的分离。样品混合物的组分由于它们与吸附剂颗粒的不同程度的相互作用而彼此分离。

如本文所用，术语“毛细管等电聚焦凝胶电泳”或“cIEF凝胶电泳”是指允许基于蛋白质/肽混合物、蛋白质糖型和其他电荷变体的等电点(pI)分离它们的高分离度分析技术。

如本文所用，术语“成像毛细管等电聚焦”或“iCIEF”是指根据生物分子的两性组分的等电点在电场中分离它们的分析技术。

如本文所用，术语“接触”是指将溶液(例如，如本文所述的包含蛋白质产物和污染物的混合物)应用于色谱基质中。在一些实施方案中，术语“接触”与将溶液“加载”到色谱柱上是同义的。如本文所用，“柱填料”或“色谱基质”是指包含在色谱柱内的吸附固体材料。在一些方面，柱填料包括Super Q。在一些方面，柱填料包括GigaCap。在一些方面，柱填料包括SQ₃ ^-。

当在梯度应用于色谱基质的上下文中使用时，术语“应用于”广泛地意指梯度直接或间接地在色谱基质内和/或周围形成。在一些实施方案中，色谱基质存在于柱中，并且梯度在柱内形成。在一些实施方案中，应用于色谱基质的梯度在柱内部形成，与在外部形成然后添加至柱中的梯度相反。在某些实施方案中，由于将多于一种缓冲液添加至色谱基质中，应用于色谱基质的梯度在柱内形成。在其他实施方案中，应用于色谱基质的梯度在外部形成，然后添加至柱中。

如本文所用的术语“培养物”、“细胞培养物”和“真核细胞培养物”是指在适合于细胞群存活和/或生长的条件下维持或生长在培养基(参见下文“培养基”的定义)中的表面附着的或悬浮的细胞群。如本领域普通技术人员将清楚的，如本文所用的这些术语可以指代包含细胞群和所述群体悬浮于其中的培养基的组合。

如本文所用，术语“表达(expression)”或“表达(expresses)”用于指发生在细胞内的转录和翻译。可以基于存在于细胞中的对应mRNA的量或由细胞产生的由产物基因编码的蛋白质的量或两者来确定宿主细胞中产物基因的表达水平。

在一些方面，术语“抗体”是指包含由二硫键相互连接的至少两条重(H)链和两条轻(L)链的蛋白质。每条重链由重链可变区(在本文中缩写为VH)和重链恒定区(在本文中缩写为CH)构成。在一些抗体(例如，天然存在的IgG抗体)中，重链恒定区由铰链和三个结构域CH1、CH2和CH3构成。在一些抗体(例如，天然存在的IgG抗体)中，每条轻链由轻链可变区(在本文中缩写为VL)和轻链恒定区构成。轻链恒定区由一个结构域(在本文中缩写为CL)构成。VH和VL区可以进一步细分为具有高变性的区域，称为互补决定区(CDR)，其间散布有更保守的区域，称为框架区(FR)。每个VH和VL由三个CDR和四个FR构成，按照以下顺序从氨基末端到羧基末端排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。术语“抗体”可以包括双特异性抗体或多特异性抗体。

在一些方面，如本文所用的“IgG抗体”(例如，人IgG1、IgG2、IgG3和IgG4抗体)具有天然存在的IgG抗体的结构，即，它具有与相同亚类的天然存在的IgG抗体相同数量的重链和轻链和二硫键。例如，IgG1、IgG2、IgG3或IgG4抗体可以由两条重链(HC)和两条轻链(LC)组成，其中两条HC和LC分别通过在天然存在的IgG1、IgG2、IgG3和IgG4抗体中存在的相同数量和位置的二硫桥连接(除非抗体已经突变以修饰二硫桥)。

免疫球蛋白可以来自任何通常已知的同种型，包括但不限于IgA、分泌型IgA、IgG和IgM。IgG同种型在某些物种中分为以下亚类：人中的IgG1、IgG2、IgG3和IgG4，以及小鼠中的IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3。免疫球蛋白(例如，IgG1)以若干种同种异型存在，它们彼此最多有几个氨基酸的差异。举例来说，“抗体”包括天然存在的抗体和非天然存在的抗体；单克隆抗体和多克隆抗体；嵌合抗体和人源化抗体；人抗体和非人抗体；以及全合成抗体。

如本文所用，术语抗体的“抗原结合部分”是指抗体中保留与抗原特异性结合的能力的一个或多个片段。已经证明抗体的抗原结合功能可以由全长抗体的片段执行。涵盖在术语抗体的“抗原结合部分”内的结合片段的例子包括(i)Fab片段(来自木瓜蛋白酶切割的片段)或由VL、VH、LC和CH1结构域组成的类似的单价片段；(ii)F(ab')2片段(来自胃蛋白酶切割的片段)或包含由铰链区的二硫桥连接的两个Fab片段的类似的二价片段；(iii)由VH和CH1结构域组成的Fd片段；(iv)由抗体单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段；(v)dAb片段(Ward等人,(1989)Nature 341:544-546)，其由VH结构域组成；(vi)经分离的互补决定区(CDR)；以及(vii)可以任选地通过合成接头连接的两个或更多个经分离的CDR的组合。此外，尽管Fv片段的两个结构域VL和VH由分开的基因编码，但是它们可以使用重组方法通过合成接头来接合，所述合成接头使得能将它们制成单个蛋白质链，在所述单个蛋白质链中VL区和VH区配对形成单价分子(称为单链Fv(scFv))；参见例如，Bird等人(1988)Science242:423-426；以及Huston等人(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883)。此类单链抗体也旨在涵盖在术语抗体的“抗原结合部分”内。这些抗体片段是使用本领域技术人员已知的常规技术获得的，并且以与完整抗体相同的方式筛选所述片段的效用。抗原结合部分可以通过重组DNA技术或通过完整的免疫球蛋白的酶促或化学切割来产生。

如本文所用，术语“重组人抗体”包括通过重组手段制备、表达、产生或分离的所有人抗体，如(a)从对于人免疫球蛋白基因而言是转基因或转染色体的动物(例如，小鼠)或者由其制备的杂交瘤分离的抗体，(b)从转化用于表达抗体的宿主细胞(例如，从转染瘤)分离的抗体，(c)从重组的组合人抗体文库分离的抗体，和(d)通过涉及将人免疫球蛋白基因序列剪接到其他DNA序列的任何其他手段制备、表达、产生或分离的抗体。

如本文所用，“同种型”是指由重链恒定区基因编码的抗体种类(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA1、IgA2、IgD和IgE抗体)。

氨基酸在本文中由其通常已知的三字母符号或由IUPAC-IUB生化命名委员会推荐的单字母符号来提及。同样，核苷酸由其普遍接受的单字母代码来提及。

如本文所用，术语“多肽”是指由通过酰胺键(也称为肽键)线性连接的单体(氨基酸)构成的分子。术语“多肽”或“蛋白质”或“产物”或“产物蛋白”或“氨基酸残基序列”可互换使用。术语“多肽”是指两个或更多个氨基酸的任何一条或多条链，并且不涉及产物的具体长度。如本文所用，术语“蛋白质”旨在涵盖由一种或多种多肽构成的分子，所述多肽在一些情形下可以通过除酰胺键以外的键缔合。在另一方面，蛋白质也可以是单条多肽链。在后一种情况下，单条多肽链在一些情形下可以包含两个或更多个多肽亚基，其融合在一起以形成蛋白质。术语“多肽”和“蛋白质”还指代表达后修饰的产物，所述表达后修饰包括而不限于糖基化、乙酰化、磷酸化、酰胺化、通过已知的保护/阻断基团衍生化、蛋白水解切割或通过非天然存在的氨基酸修饰。多肽或蛋白质可以源自天然生物来源或通过重组技术产生。

如本文所用的术语“多核苷酸”或“核苷酸”旨在涵盖包含单个核酸以及多个核酸，并且是指经分离的核酸分子或构建体，例如信使RNA(mRNA)、互补DNA(cDNA)或质粒DNA(pDNA)。术语“核酸”是指存在于多核苷酸中的任何一个或多个核酸区段，例如DNA、cDNA或RNA片段。当应用于核酸或多核苷酸时，术语“经分离的”是指已经从其天然环境中取出的核酸分子DNA或RNA，例如，出于本公开文本的目的，认为包含在载体中的编码抗原结合蛋白的重组多核苷酸是经分离的。经分离的多核苷酸的进一步的例子包括在异源宿主细胞中维持或从溶液中的其他多核苷酸纯化(部分或基本)的重组多核苷酸。经分离的RNA分子包括本公开文本的多核苷酸的体内或体外RNA转录物。根据本公开文本的经分离的多核苷酸或核酸进一步包括合成产生的此类分子。另外，多核苷酸或核酸可以包括调节元件，如启动子、增强子、核糖体结合位点或转录终止信号。

如本文所用，术语“杂质(impurity)”或“杂质(impurities)”是指存在于具有靶分子(例如，靶多肽种类)(例如，靶多肽电荷变体)的混合物中的一种或多种分子(例如，多肽、核酸分子、小分子或其任何组合)。在一些方面，杂质是不同的多肽，例如，具有与靶多肽不同的结构、序列或功能的多肽。在一些方面，杂质是靶多肽的不同种类，例如，电荷变体或HMW种类。

如本文所用，术语“纯度”是指组合物(例如，包含靶多肽的溶液)包含一种或多种杂质的程度。例如，包含靶多肽的溶液具有98％的纯度，其中溶液中靶多肽的98％是电荷变体A，并且靶多肽的2％包含除电荷变体A外的一种或多种其他电荷变体。

II.本公开文本的方法

本公开文本的一些方面涉及从包含蛋白质种类和一种或多种杂质的混合物中分离所述蛋白质种类的方法，所述方法包括以连续操作模式使所述混合物与两个或更多个色谱柱接触。本公开文本的一些方面涉及从包含所述蛋白质种类和一种或多种杂质的混合物中增加所述蛋白质种类的纯度和/或产率的方法，所述方法包括以连续操作模式使所述混合物与两个或更多个色谱柱接触。在一些方面，色谱法包含逆流纯化系统。在一些方面，所述逆流纯化系统是多柱逆流溶剂梯度纯化(MCSGP)系统。

术语蛋白质的“种类”或“变体”是指由相同核苷酸序列编码但在蛋白质链长度、蛋白质质量和/或翻译后修饰方面不同的差异形式，包括但不限于糖基化程度不同的种类、单体、寡聚物或多聚体(也称为高分子量(HMW)种类)、截短形式、电荷形式等。例如，单克隆抗体(mAb)由于多个翻译后修饰和降解事件而在其生物化学和生物物理特性方面是异质的。mAb的电荷异质性可能会受到这些修饰的影响，导致净电荷或局部电荷分布的改变。mAb的电荷变体被鉴定为酸性种类、碱性种类和主要种类。如本文所用的术语mAb的“主要种类”、“主峰”或“主要变体”是指作为具有中性等电点(pI)的主峰洗脱的mAb。本文所用的术语mAb的“酸性种类”或“酸性变体”是指pI低于主要种类的变体。如本文所用的术语mAb的“碱性种类”或“碱性变体”是指pI高于主要种类的变体。mAb的C末端赖氨酸残基可产生另外的正电荷，增加mAb的碱性种类。在抗体生产期间内源性羧肽酶对C末端赖氨酸残基的非有效切割是产生具有零个、一个或两个C末端赖氨酸的mAb的主要原因之一(Zhang等人,2015)。

在一些方面，与常规方法相比，本文公开的方法导致种类的纯度增加。在一些方面，与HPLC或FPLC方法相比，本文公开的方法导致种类的纯度增加。在一些方面，与HPLC或FPLC方法相比，样品的纯度增加至少约1.5倍、至少约2倍、至少约2.5倍、至少约3倍、至少约3.5倍、至少约4倍、至少约4.5倍、至少约5倍、至少约6倍、至少约7倍、至少约8倍、至少约9倍或至少约10倍。

在一些方面，与常规方法相比，本文公开的方法减少了获得足够量的种类所需的总时间。在一些方面，与HPLC或FPLC方法相比，本文公开的方法减少了获得足够量的种类所需的总时间。在一些方面，足够量的种类为至少约5mg、至少约6mg、至少约7mg、至少约8mg、至少约9mg、至少约10mg、至少约11mg、至少约12mg、至少约13mg、至少约14mg、至少约15mg、至少约20mg、至少约25mg、至少约30mg、至少约35mg、至少约40mg、至少约45mg、至少约50mg、至少约75mg或至少约100mg的种类。在一些方面，种类的足够量为至少约10mg。在一些方面，相对于常规方法(例如，HPLC或FPLC)，获得足够量的种类所需的时间减少至少约1.5倍、至少约2倍、至少约2.5倍、至少约3倍、至少约3.5倍、至少约4倍、至少约4.5倍、至少约5倍、至少约6倍、至少约7倍、至少约8倍、至少约9倍或至少约10倍。在一些方面，获得足够量的种类所需的时间是使用常规方法(例如，HPLC或FPLC)获得相同或可比量的种类所需时间的小于约90％、小于约80％、小于约75％、小于约70％、小于约60％、小于约50％、小于约40％、小于约30％、小于约25％、小于约20％、小于约15％、小于约10％、小于约5％、小于约4％、小于约3％、小于约2％或小于约1％。在一些方面，本文公开的方法在少于约7天、少于约6天、少于约5天、少于约4天、少于约3天、少于约48小时、少于约36小时、少于约30小时或少于约24小时内产生至少约10mg的靶种类。在一些方面，本文公开的方法在少于约48小时内产生至少约10mg的靶种类。在一些方面，本文公开的方法在少于约36小时内产生至少约10mg的靶种类。在一些方面，本文公开的方法在少于约30小时内产生至少约10mg的靶种类。在一些方面，本文公开的方法在少于约24小时内产生至少约10mg的靶种类。

在一些方面，相对于常规方法(例如，HPLC或FPLC)，本文公开的方法具有增加的生产率(通过将产量(例如，种类的克)相对于持续时间归一化来测量)。在一些方面，相对于常规方法(例如，HPLC或FPLC)，生产率增加至少约至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约6倍、至少约7倍、至少约8倍、至少约9倍、至少约10倍、至少约11倍、至少约12倍、至少约13倍、至少约14倍、至少约15倍、至少约20倍、至少约25倍或至少约30倍。

在一些方面，所述方法进一步包括使分离的种类经受一种或多种分析表征。因此，本公开文本的一些方面涉及用于富集用于分析表征的蛋白质种类的方法，所述方法包括：(a)从包含所述蛋白质种类和一种或多种杂质的混合物中分离所述蛋白质种类，包括在色谱分离系统中以连续操作模式使所述混合物与两个或更多个色谱柱接触；以及(b)使来自(a)的所述种类经受分析表征。本公开文本的一些方面涉及用于进行蛋白质种类的分析表征的方法，所述方法包括：(a)从包含所述蛋白质种类和一种或多种杂质的混合物中分离所述蛋白质种类，包括在色谱分离系统中以连续操作模式使所述混合物与两个或更多个色谱柱接触；以及(b)对来自(a)的所述种类进行分析表征。

在一些方面，分析表征包括HPLC系统、毛细管等电聚焦(cIEF)凝胶电泳、成像毛细管等电聚焦(iCIEF)、阳离子交换色谱法(CEX)、阴离子交换色谱法(AEX)、MFI、SEC-MALS、SEC、质谱法或其任何组合。在一些方面，分析表征包括使种类(例如，蛋白质(例如，抗体)的电荷变体)经受HPLC系统。在一些方面，分析表征包括使种类(例如，蛋白质(例如，抗体)的电荷变体)经受毛细管等电聚焦(cIEF)凝胶电泳。在一些方面，分析表征包括使种类(例如，蛋白质(例如，抗体)的电荷变体)经受成像毛细管等电聚焦(iCIEF)。在一些方面，分析表征包括使种类(例如，蛋白质(例如，抗体)的电荷变体)经受阳离子交换色谱法(CEX)。在一些方面，分析表征包括使种类(例如，蛋白质(例如，抗体)的电荷变体)经受阴离子交换色谱法(AEX)。

A.柱色谱法

本公开文本的一些方面包括以连续操作模式使包含蛋白质种类和一种或多种杂质的混合物接触两个或更多个色谱柱。在一些方面，所述两个或更多个色谱柱富集种类(例如，电荷变体)。在一些方面，所述方法包括将包含蛋白质种类和一种或多种杂质的混合物加载到第一色谱柱上。第一色谱柱可以包含任何色谱基质。在一些方面，第一柱的色谱基质是AEX基质。在一些方面，第一柱的色谱基质是CEX基质。在一些方面，第一柱的色谱基质是混合模式色谱基质。在一些方面，第一柱的色谱基质是亲和色谱基质。在一些方面，第一柱的色谱基质是尺寸排阻基质。

在一些方面，加载的混合物通过第一色谱柱并且被分离成(i)包含种类的富集种类和(ii)包含一种或多种杂质的一种或多种丢弃种类。该步骤在本文中称为“富集阶段I”。在富集阶段I期间，丢弃种类从柱中被洗脱并且被丢弃。然后将离开柱的富集种类加载到第二柱上。在一些方面，第二柱被定位成使得富集种类从第一柱被直接洗脱到第二柱上。在一些方面，将富集种类从第一柱收集并且应用于第二柱。在一些方面，第二丢弃种类从第一柱中被洗脱并且在富集种类已经通过柱后被丢弃，即，第二丢弃种类比富集种类从第一柱洗脱和丢弃更慢地行进穿过柱。

在一些方面，将富集种类应用于第二柱。富集种类行进通过第二柱并且进一步被分离成(i)包含种类的富集种类和(ii)包含一种或多种另外的杂质的一种或多种另外的丢弃种类。该步骤在本文中称为“富集阶段II”。在富集阶段II期间，另外的丢弃种类从柱中被洗脱并且被丢弃。在一些方面，另外的丢弃种类在富集种类前从第二柱中洗脱。在一些方面，另外的丢弃种类在富集种类后从第二柱中洗脱。在一些方面，另外的丢弃种类在富集种类前从第二柱中洗脱，并且另外的丢弃种类在富集种类后从第二柱中洗脱。

一旦富集种类通过第二柱，将富集种类加载到第一柱上。在一些方面，将另外的混合物(包含种类和一种或多种杂质)与富集种类同时添加至第一柱中。在一些方面，在加载到第一柱上前，将富集种类与另外的混合物合并。在一些方面，将富集种类加载到第一柱上，然后将另外的混合物加载到相同的第一柱上。在一些方面，将另外的混合物加载到第一柱上，然后将富集种类加载到相同的第一柱上。在一些方面，在将所述富集种类添加至所述第一色谱柱中之后并且在所述富集种类通过所述第一色谱柱之前添加所述另外的混合物。在一些方面，在加载前将第一柱重新平衡。在一些方面，在加载前将第二柱重新平衡。

在一些方面，富集阶段I和II重复至少两次、至少三次、至少四次、至少五次、至少六次、至少七次、至少八次、至少九次或至少十次。在一些方面，重复富集阶段I和II，直到所有起始混合物已被应用于第一柱。

在一些方面，所述方法进一步包括“耗尽阶段”。耗尽阶段在富集阶段之后，即，在富集阶段I和II重复n次后，富集种类进行到耗尽阶段。在一些方面，n为至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9或至少10。在一些方面，所述耗尽阶段包括在不存在另外的混合物的情况下使所述富集种类与所述第一色谱柱接触。然后富集种类通过第一色谱柱，将电荷种类与一种或多种剩余杂质分离。在一些方面，第一剩余杂质在富集种类前离开第一柱，并且丢弃第一剩余杂质。在一些方面，富集种类离开第一柱并且应用于第二柱。然后富集种类通过第二色谱柱，将富集种类与一种或多种剩余杂质分离。在耗尽阶段之后，从第二柱中洗脱种类。

在一些方面，洗脱的种类具有至少约80％、至少约81％、至少约82％、至少约83％、至少约84％、至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％的纯度。在一些方面，洗脱的种类具有至少约90％的纯度。在一些方面，洗脱的种类具有至少约95％的纯度。在一些方面，洗脱的种类具有至少约96％的纯度。在一些方面，洗脱的种类具有至少约97％的纯度。在一些方面，洗脱的种类具有至少约98％的纯度。在一些方面，洗脱的种类具有至少约99％的纯度。

在一些方面，所述种类以以下浓度洗脱，所述浓度是所述混合物中所述种类的浓度的至少约1.5倍、至少约1.6倍、至少约1.7倍、至少约1.8倍、至少约1.9倍、至少约2.0倍、至少约2.5倍、至少约3.0倍、至少约3.5倍、至少约4.0倍、至少约4.5倍、至少约5.0倍、至少约5.5倍、至少约6.0倍、至少约6.5倍、至少约7.0倍、至少约7.5倍、至少约8.0倍、至少约8.5倍、至少约9.0倍、至少约9.5倍或至少约10.0倍。

在一些方面，所述方法进一步包括测量对蛋白质种类的翻译后修饰。在一些方面，修饰包括N-谷氨酰胺焦谷氨酸化、C末端赖氨酸截短、C末端脯氨酸酰胺化、糖化、唾液酸化、脱酰胺化、天冬氨酸异构化、通用截短或其任何组合。

在一些方面，色谱柱中的一个或多个包括盐梯度。在一些方面，色谱柱中的一个或多个包括pH梯度。在一些方面，色谱柱中的一个或多个包括盐梯度和pH梯度。在一些方面，盐梯度包括氯化钠(NaCl梯度)。在一些方面，盐梯度包括从无盐(例如，无NaCl)到高盐浓度的梯度。

在一些方面，盐(例如，NaCl)浓度为从0mM至至少约500mM、0mM至至少约450mM、0mM至至少约400mM、0mM至至少约350mM、0mM至至少约300mM、0mM至至少约290mM、0mM至至少约280mM、0mM至至少约270mM、0mM至至少约260mM、0mM至至少约250mM、约50mM至至少约500mM、约50mM至至少约450mM、约50mM至至少约400mM、约50mM至至少约350mM、约50mM至至少约300mM、约50mM至至少约290mM、约50mM至至少约280mM、约50mM至至少约270mM、约50mM至至少约260mM、约50mM至至少约250mM、约100mM至至少约500mM、约100mM至至少约450mM、约100mM至至少约400mM、约100mM至至少约350mM、约100mM至至少约300mM、约100mM至至少约290mM、约100mM至至少约280mM、约100mM至至少约270mM、约100mM至至少约260mM、约100mM至至少约250mM、约150mM至至少约350mM、约1200mM至至少约300mM或约225mM至至少约375mM的盐(例如，NaCl)。

在一些方面，盐(例如，NaCl)的浓度为至少50mM、至少约100mM、至少约150mM、至少约200mM、至少约250mM、至少约260mM、至少约270mM、至少约280mM、至少约290mM、至少约300mM、至少约310mM、至少约320mM、至少约330mM、至少约340mM、至少约350mM、至少约360mM、至少约370mM、至少约380mM、至少约390mM、至少约400mM、至少约450mM、至少约500mM、至少约550mM或至少约600mM的盐(例如，NaCl)。

在一些方面，盐梯度是线性梯度。在一些方面，盐梯度是分步梯度(stepgradient)。

在一些方面，盐梯度流动相进一步包含缓冲液。在一些方面，盐梯度流动相包含MES。在一些方面，盐梯度流动相包含至少约10mM MES、至少约15mM MES、至少约20mM MES、至少约25mM MES或至少约30mM MES。在一些方面，盐梯度流动相包含至少约20mM MES。在一些方面，盐梯度流动相的pH为至少约5.5、至少约5.6、至少约5.7、至少约5.8、至少约5.9、至少约6.0、至少约6.1、至少约6.2、至少约6.3、至少约6.4或至少约6.5。在一些方面，盐梯度流动相包含具有和不具有250mM氯化钠的20mM MES(pH为6.0)。在一些方面，盐梯度流动相包含具有和不具有400mM氯化钠的20mM MES(pH为5.8)。

在一些方面，色谱柱中的一个或多个包括pH梯度。在一些方面，pH梯度流动相的pH在约pH 3与约pH 11之间、在约pH 3与约pH 10之间、在约pH3与约pH 9之间、在约pH 3与约pH 8之间、在约pH 3与约pH 7之间、在约pH 4与约pH 11之间、在约pH 5与约pH 11之间、在约pH 6与约pH 11之间或在约pH 7与约pH 11之间。在一些方面，pH梯度流动相的pH在约pH3与约pH 11之间。

在一些方面，pH梯度流动相进一步包含缓冲液。在一些方面，缓冲液包含MES、磷酸盐缓冲液、Tris、双-Tris、1,3二氨基丙烷、二乙醇胺、哌嗪、咪唑、乙酸、丙二酸、甲酸、MOPSO、HEPES、BICINE、CHES、CAPS或其任何组合。

在一些方面，缓冲液包含至少约10mM MES、至少约15mM MES、至少约20mM MES、至少约25mM MES或至少约30mM MES。在一些方面，缓冲液包含至少约20mM MES。

在一些方面，缓冲液包含至少约1mM Tris、至少约2mM Tris、至少约3mM Tris、至少约4mM Tris、至少约5mM Tris、至少约6mM Tris、至少约7mM Tris、至少约8mM Tris、至少约9mM Tris和至少约10mM Tris。在一些方面，缓冲液包含至少约5mM Tris。

在一些方面，缓冲液包含至少约1mM双-Tris、至少约2mM双-Tris、至少约3mM双-Tris、至少约4mM双-Tris、至少约5mM双-Tris、至少约6mM双-Tris、至少约7mM双-Tris、至少约8mM双-Tris、至少约9mM双-Tris和至少约10mM双-Tris。在一些方面，缓冲液包含至少约5mM双-Tris。

在一些方面，缓冲液包含至少约1mM 1,3二氨基丙烷、至少约2mM 1,3二氨基丙烷、至少约3mM 1,3二氨基丙烷、至少约4mM 1,3二氨基丙烷、至少约5mM 1,3二氨基丙烷、至少约6mM 1,3二氨基丙烷、至少约7mM 1,3二氨基丙烷、至少约8mM 1,3二氨基丙烷、至少约9mM1,3二氨基丙烷和至少约10mM 1,3二氨基丙烷。在一些方面，缓冲液包含至少约5mM 1,3二氨基丙烷。

在一些方面，缓冲液包含至少约1mM二乙醇胺、至少约2mM二乙醇胺、至少约3mM二乙醇胺、至少约4mM二乙醇胺、至少约5mM二乙醇胺、至少约6mM二乙醇胺、至少约7mM二乙醇胺、至少约8mM二乙醇胺、至少约9mM二乙醇胺和至少约10mM二乙醇胺。在一些方面，缓冲液包含至少约5mM二乙醇胺。

在一些方面，缓冲液包含至少约1mM哌嗪、至少约2mM哌嗪、至少约3mM哌嗪、至少约4mM哌嗪、至少约5mM哌嗪、至少约6mM哌嗪、至少约7mM哌嗪、至少约8mM哌嗪、至少约9mM哌嗪和至少约10mM哌嗪。在一些方面，缓冲液包含至少约5mM哌嗪。

在一些方面，缓冲液包含至少约1mM咪唑、至少约2mM咪唑、至少约3mM咪唑、至少约4mM咪唑、至少约5mM咪唑、至少约6mM咪唑、至少约7mM咪唑、至少约8mM咪唑、至少约9mM咪唑和至少约10mM咪唑。在一些方面，缓冲液包含至少约5mM咪唑。

在一些方面，缓冲液包含至少约1mM乙酸、至少约2mM乙酸、至少约3mM乙酸、至少约4mM乙酸、至少约5mM乙酸、至少约6mM乙酸、至少约7mM乙酸、至少约8mM乙酸、至少约9mM乙酸和至少约10mM乙酸。在一些方面，缓冲液包含至少约5mM乙酸。

在一些方面，缓冲液包含至少约1mM丙二酸、至少约2mM丙二酸、至少约3mM丙二酸、至少约4mM丙二酸、至少约5mM丙二酸、至少约6mM丙二酸、至少约7mM丙二酸、至少约8mM丙二酸、至少约9mM丙二酸和至少约10mM丙二酸。在一些方面，缓冲液包含至少约5mM丙二酸。

在一些方面，缓冲液包含至少约1mM甲酸、至少约2mM甲酸、至少约3mM甲酸、至少约4mM甲酸、至少约5mM甲酸、至少约6mM甲酸、至少约7mM甲酸、至少约8mM甲酸、至少约9mM甲酸和至少约10mM甲酸。在一些方面，缓冲液包含至少约5mM甲酸。

在一些方面，缓冲液包含至少约1mM MOPSO、至少约2mM MOPSO、至少约3mM MOPSO、至少约4mM MOPSO、至少约5mM MOPSO、至少约6mM MOPSO、至少约7mM MOPSO、至少约8mMMOPSO、至少约9mM MOPSO和至少约10mM MOPSO。在一些方面，缓冲液包含至少约5mM MOPSO。

在一些方面，缓冲液包含至少约1mM HEPES、至少约2mM HEPES、至少约3mM HEPES、至少约4mM HEPES、至少约5mM HEPES、至少约6mM HEPES、至少约7mM HEPES、至少约8mMHEPES、至少约9mM HEPES和至少约10mM HEPES。在一些方面，缓冲液包含至少约5mM HEPES。

在一些方面，缓冲液包含至少约1mM BICINE、至少约2mM BICINE、至少约3mMBICINE、至少约4mM BICINE、至少约5mM BICINE、至少约6mM BICINE、至少约7mM BICINE、至少约8mM BICINE、至少约9mM BICINE和至少约10mM BICINE。在一些方面，缓冲液包含至少约5mM BICINE。

在一些方面，缓冲液包含至少约1mM CHES、至少约2mM CHES、至少约3mM CHES、至少约4mM CHES、至少约5mM CHES、至少约6mM CHES、至少约7mM CHES、至少约8mM CHES、至少约9mM CHES和至少约10mM CHES。在一些方面，缓冲液包含至少约5mM CHES。

在一些方面，缓冲液包含至少约1mM CAPS、至少约2mM CAPS、至少约3mM CAPS、至少约4mM CAPS、至少约5mM CAPS、至少约6mM CAPS、至少约7mM CAPS、至少约8mM CAPS、至少约9mM CAPS和至少约10mM CAPS。在一些方面，缓冲液包含至少约5mM CAPS。

在一些方面，色谱柱包含AEX基质，其中pH梯度流动相包含约5mM 1,3二氨基丙烷、约5mM二乙醇胺、约5mM tris、约5mM咪唑、约5mM双-tris和约5mM哌嗪，pH为约11.1。在一些方面，色谱柱包含AEX基质，其中pH梯度的流动相包含约5mM 1,3二氨基丙烷、约5mM二乙醇胺、约5mM tris、约5mM咪唑、约5mM双-tris、约5mM哌嗪和约5mM乙酸，pH为约3.5。

在一些方面，色谱柱包含CEX基质，其中pH梯度流动相包含约5mM丙二酸、约5mM甲酸、约5mM乙酸、约5mM MES、约5mM MOPSO、约5mM HEPES、约5mM BICINE、约5mM CHES和约5mMCAPS，pH为约4.0。在一些方面，色谱柱包含CEX基质，其中pH梯度流动相包含约5mM丙二酸、约5mM甲酸、约5mM乙酸、约5mM MES、约5mM MOPSO、约5mM HEPES、约5mM BICINE、约5mM CHES和约5mM CAPS，pH为约11.0。

B.多肽

本文公开的方法可以用于分离和/或纯化任何多肽种类。在一些方面，多肽是蛋白质。在一些方面，种类是蛋白质的电荷变体。在一些方面，种类是酸性种类。在一些方面，种类是碱性种类。在一些方面，种类是主要种类。

在一些方面，在经受本文公开的方法前，蛋白质已经经受了之前的纯化过程。在一些方面，蛋白质已经经受先前的亲和色谱法(例如通过先前的亲和色谱法进行了部分纯化)。在一些方面，先前的亲和色谱法包括蛋白A亲和色谱法。

在一些方面，蛋白质包括融合蛋白。在一些方面，蛋白质包括与生物活性多肽融合的免疫球蛋白组分。在一些方面，免疫球蛋白组分包含抗体的片段。在一些方面，免疫球蛋白组分包含抗体的恒定区的片段。在一些方面，免疫球蛋白组分包含Fc。

在一些方面，蛋白质包括与生长因子、凝血因子、细胞因子、趋化因子、酶、激素或其任何组合融合的免疫球蛋白。在一些方面，蛋白质包括与CTLA-4多肽融合的Fc。在一些方面，蛋白质包括阿巴西普。在一些方面，蛋白质包括贝拉西普。在一些方面，蛋白质包括与白介素融合的Fc。

在一些方面，蛋白质包括抗体或其抗原结合部分。在一些方面，抗体或其抗原结合部分结合肿瘤抗原。在一些方面，抗体或其抗原结合部分结合检查点抑制剂。在一些方面，所述抗体或其抗原结合部分结合选自以下的抗原：PD-1、PD-L1、CTLA-4、LAG-3、TIGIT、GITR、CXCR4、CD73、HER2、VEGF、CD20、CD40、CD11a、组织因子(TF)、MICA/B PSCA、IL-8、EGFR、HER3、HER4及其任何组合。

在一些方面，所述抗体或其抗原结合部分特异性结合PD-1。以高亲和力与PD-1特异性结合的各种人单克隆抗体已经披露于美国专利号8,008,449、6,808,710、7,488,802、8,168,757和8,354,509、美国公开号2016/0272708和PCT公开号WO 2012/145493、WO 2008/156712、WO 2015/112900、WO 2012/145493、WO 2015/112800、WO 2014/206107、WO 2015/35606、WO 2015/085847、WO 2014/179664、WO 2017/020291、WO 2017/020858、WO 2016/197367、WO 2017/024515、WO 2017/025051、WO 2017/123557、WO 2016/106159、WO 2014/194302、WO 2017/040790、WO 2017/133540、WO 2017/132827、WO 2017/024465、WO 2017/025016、WO 2017/106061、WO 2017/19846、WO 2017/024465、WO 2017/025016、WO 2017/132825和WO 2017/133540中，将其各自通过引用以其整体并入。

在一些方面，所述抗PD-I抗体选自纳武单抗(也称为5C4、BMS-936558、MDX-1106和ONO-4538)、派姆单抗(Merck；也称为兰洛利珠单抗和MK-3475；参见WO 2008/156712)、PDR001(Novartis；参见WO 2015/112900)、MEDI-0680(AstraZeneca；也称为AMP-514；参见WO 2012/145493)、西米普利单抗(Regeneron；也称为REGN-2810；参见WO 2015/112800)、JS001(TAIZHOU JUNSHIPHARMA；也称为特瑞普利单抗(toripalimab)；参见Si-Yang Liu等人,J Hematol.Oncol.10:136(2017))、BGB-A317(Beigene；也称为替雷利珠单抗；参见WO 2015/35606和US 2015/0079109)、INCSHR1210(Jiangsu Hengrui Medicine；也称为SHR-1210；参见WO 2015/085847；Si-Yang Liu等人,JHematol.Oncol.10:136(2017))、TSR-042(Tesaro Biopharmaceutical；也称为ANB011；参见WO 2014/179664)、GLS-010(Wuxi/Harbin Gloria Pharmaceuticals；也称为WBP3055；参见Si-Yang Liu等人,J Hematol.Oncol.10:136(2017))、AM-0001(Armo)、STI-1110(Sorrento Therapeutics；参见WO 2014/194302)、AGEN2034(Agenus；参见WO 2017/040790)、MGA012(Macrogenics，参见WO 2017/19846)、BCD-100(Biocad；Kaplon等人,mAbs10(2):183-203(2018)、和IBI308(Innovent；参见WO 2017/024465、WO 2017/025016、WO2017/132825和WO 2017/133540)。

在一个方面，抗PD-1抗体是纳武单抗。在另一方面，抗PD-1抗体是派姆单抗。

在一些方面，所述抗体或其抗原结合部分特异性结合PD-L1。抗PD-L1抗体的例子包括但不限于在美国专利号9,580,507中披露的抗体。在某些方面，抗PD-L1抗体选自BMS-936559(也称为12A4，MDX-1105；参见例如，美国专利号7,943,743和WO 2013/173223)、阿替利珠单抗(Roche；也称为MPDL3280A、RG7446；参见US 8,217,149；还参见Herbst等人(2013)J Clin Oncol31(增刊):3000)、度伐鲁单抗(AstraZeneca；也称为IMFINZI^TM、MEDI-4736；参见WO 2011/066389)、阿维鲁单抗(Pfizer；也称为MSB-0010718C；参见WO 2013/079174)、STI-1014(Sorrento；参见WO2013/181634)、CX-072(Cytomx；参见WO2016/149201)、KN035(3DMed/Alphamab；参见Zhang等人,Cell Discov.7:3(2017年3月))、LY3300054(Eli Lilly Co.；参见例如，WO 2017/034916)、BGB-A333(BeiGene；参见Desai等人,JCO 36(15增刊):TPS3113(2018))和CK-301(CheckpointTherapeutics；参见Gorelik等人,AACR:摘要4606(2016年4月))。

在某些方面，PD-L1抗体是阿替利珠单抗在某些方面，PD-L1抗体是度伐鲁单抗(IMFINZI^TM)。在某些方面，PD-L1抗体是阿维鲁单抗

在一些方面，所述抗体或其抗原结合部分特异性结合CTLA-4。以高亲和力与CTLA-4特异性结合的人单克隆抗体已经披露于美国专利号6,984,720中。其他抗CTLA-4单克隆抗体已经描述于例如以下中：美国专利号5,977,318、6,051,227、6,682,736和7,034,121，以及国际公开号WO 2012/122444、WO 2007/113648、WO 2016/196237和WO 2000/037504，将其中每一项通过引用以其整体并入本文。在某些方面，CTLA-4抗体选自伊匹单抗(也称为MDX-010，10D1；参见美国专利号6,984,720)、MK-1308(Merck)、AGEN-1884(Agenus Inc.；参见WO 2016/196237)和曲美木单抗(AstraZeneca；也称为替西木单抗，CP-675,206；参见WO 2000/037504和Ribas,Update Cancer Ther.2(3):133-39(2007))。在特定方面，抗CTLA-4抗体是伊匹单抗。在特定方面，CTLA-4抗体是曲美木单抗。在特定方面，CTLA-4抗体是MK-1308。在特定方面，CTLA-4抗体是AGEN-1884。

在一些方面，所述抗体或其抗原结合部分特异性结合LAG-3。结合LAG-3的抗体已经披露于国际公开号WO/2015/042246以及美国公开号2014/0093511和2011/0150892中，将其中每一项通过引用以其整体并入本文。抗LAG-3抗体的非限制性例子包括但不限于25F7(描述于美国公开号2011/0150892)、BMS-986016、IMP731(H5L7BW)、MK-4280(28G-10)、REGN3767、人源化BAP050、IMP-701(LAG-5250)、TSR-033、BI754111、MGD013或FS-118。可用于所要求保护的发明的这些和其他抗LAG-3抗体可以见于例如：WO 2016/028672、WO 2017/106129、WO 2017/062888、WO 2009/044273、WO 2018/069500、WO 2016/126858、WO 2014/179664、WO 2016/200782、WO 2015/200119、WO 2017/019846、WO 2017/198741、WO 2017/220555、WO 2017/220569、WO 2018/071500、WO 2017/015560、WO 2017/025498、WO 2017/087589、WO 2017/087901、WO 2018/083087、WO 2017/149143、WO 2017/219995、US2017/0260271、WO 2017/086367、WO 2017/086419、WO 2018/034227和WO 2014/140180中，将其中每一项通过引用以其整体并入本文。

在一些方面，所述抗体或其抗原结合部分特异性结合CD137。结合CD137的抗体已经披露于以下中：美国公开号2005/0095244；以及美国专利号7,288,638、6,887,673、7,214,493、6,303,121、6,569,997、6,905,685、6,355,476、6,362,325、6,974,863和6,210,669，将其中每一项通过引用以其整体并入本文。在一些方面，抗CD137抗体是乌瑞芦单抗(urelumab，BMS-663513)，其描述于美国专利号7,288,638中(20H4.9-IgG4[10C7或BMS-663513])。在一些方面，抗CD137抗体是BMS-663031(20H4.9-IgGl)，其描述于美国专利号7,288,638中。在一些方面，抗CD137抗体是4E9或BMS-554271，其描述于美国专利号6,887,673中。在一些方面，抗CD137抗体是以下披露的抗体：美国专利号7,214,493、6,303,121、6,569,997、6,905,685或6,355,476。在一些方面，抗CD137抗体是1D8或BMS-469492；3H3或BMS-469497；或3E1，描述于美国专利号6,362,325中。在一些方面，抗CD137抗体是以下披露的抗体：授权的美国专利号6,974,863(如53A2)。在一些方面，抗CD137抗体是以下披露的抗体：授权的美国专利号6,210,669(如1D8、3B8或3E1)。在一些方面，抗体是Pfizer的PF-05082566(PF-2566)。

在一些方面，抗体或其抗原结合部分特异性结合KIR。抗KIR抗体的例子已经披露于国际公开号WO/2014/055648、WO 2005/003168、WO 2005/009465、WO 2006/072625、WO2006/072626、WO 2007/042573、WO 2008/084106、WO 2010/065939、WO 2012/071411和WO/2012/160448，将其中每一项通过引用以其整体并入本文。可用于本公开文本的一种抗KIR抗体是首先在国际公开号WO 2008/084106中描述的利瑞鲁单抗(lirilumab)(也称为BMS-986015、IPH2102、或1-7F9的S241P变体)。可用于本公开文本的另外的抗-KIR抗体是在国际公开号WO 2006/003179中描述的1-7F9(也称为IPH2101)。

在一些方面，抗体或其抗原结合部分特异性结合GITR。抗GITR抗体的例子已经披露于国际公开号WO/2015/031667、WO 2015/184,099、WO 2015/026,684、WO 11/028683和WO/2006/105021、美国专利号7,812,135和8,388,967以及美国公开号2009/0136494、2014/0220002、2013/0183321和2014/0348841，将其中每一项通过引用以其整体并入本文。在一个方面，可用于本公开文本中的抗GITR抗体是TRX518(描述于例如Schaer等人Curr OpinImmunol.(2012)4月；24(2):217-224和WO/2006/105021)。在另一个方面，抗GITR抗体选自MK4166、MK1248以及在WO 11/028683和U.S.8,709,424中描述的抗体。在某些方面，抗GITR抗体是WO 2015/031667中披露的抗GITR抗体。在某些方面，抗GITR抗体是在WO 2015/184099中披露的抗GITR抗体，例如抗体Hum231#1或Hum231#2，或其CDR，或其衍生物(例如，pab1967、pab1975或pab1979)。在某些方面，抗GITR抗体是在JP 2008278814、WO 09/009116、WO 2013/039954、US20140072566、US20140072565、US20140065152或WO 2015/026684中披露的抗GITR抗体，或者是INBRX-110(INHIBRx)、LKZ-145(Novartis)或MEDI-1873(MedImmune)。在某些方面，抗GITR抗体是PCT/US 2015/033991中描述的抗GITR抗体(例如，包含28F3、18E10或19D3的可变区的抗体)。

在一些方面，所述抗体或其抗原结合部分特异性结合TIM3。在一些方面，抗TIM3抗体选自披露于以下中的抗TIM3抗体：国际公开号WO 2018013818、WO/2015/117002(例如MGB453，Novartis)、WO/2016/161270(例如TSR-022，Tesaro/AnaptysBio)、WO 2011155607、WO 2016/144803(例如STI-600，Sorrento Therapeutics)、WO 2016/071448、WO 17055399；WO 17055404、WO 17178493、WO 18036561、WO 18039020(例如Ly-3221367，Eli Lilly)、WO2017205721、WO 17079112；WO 17079115；WO 17079116、WO 11159877、WO 13006490、WO2016068802、WO 2016068803、WO 2016/111947、和WO/2017/031242，将其中每一项通过引用以其整体并入本文。

在一些方面，抗体或其抗原结合部分特异性结合OX40(也称为CD134、TNFRSF4、ACT35和/或TXGP1L)。在一些方面，抗OX40抗体是国际公开号WO 20160196228中描述的BMS-986178(Bristol-Myers Squibb公司)。在一些方面，抗OX40抗体选自描述于以下中的抗OX40抗体：国际公开号WO 95012673、WO 199942585、WO 14148895、WO 15153513、WO15153514、WO 13038191、WO 16057667、WO 03106498、WO 12027328、WO 13028231、WO16200836、WO 17063162、WO 17134292、WO 17096179、WO 17096281、和WO 17096182，将其中每一项通过引用以其整体并入本文。

在一些方面，所述抗体或其抗原结合部分特异性结合NKG2A。在一些方面，抗NKG2A抗体是BMS-986315。在一些方面，抗NKG2A抗体选自描述于以下中的抗NKG2A抗体：例如，WO2006/070286(Innate Pharma S.A.；热那亚大学)；美国专利号8,993,319(Innate PharmaS.A.；热那亚大学)；WO 2007/042573(Innate Pharma S/A；Novo Nordisk A/S；热那亚大学)；美国专利号9,447,185(Innate Pharma S/A；Novo Nordisk A/S；热那亚大学)；WO2008/009545(Novo Nordisk A/S)；美国专利号8,206,709；8,901,283；9,683,041(NovoNordisk A/S)；WO 2009/092805(Novo Nordisk A/S)；美国专利号8,796,427和9,422,368(Novo Nordisk A/S)；WO 2016/134371(Ohio State Innovation Foundation)；WO 2016/032334(Janssen)；WO 2016/041947(Innate)；WO 2016/041945(Academisch ZiekenhuisLeiden H.O.D.N.LUMC)；WO 2016/041947(Innate Pharma)；以及WO 2016/041945(InnatePharma)，将其中每一项通过引用以其整体并入本文。

在一些方面，抗体或其抗原结合部分特异性结合ICOS。在一些方面，抗ICOS抗体是BMS-986226。在一些方面，抗ICOS抗体选自描述于例如以下中的抗ICOS抗体：WO 2016/154177(Jounce Therapeutics,Inc.)、WO 2008/137915(MedImmune)、WO 2012/131004(INSERM，French National Institute of Health and Medical Research)、EP3147297(INSERM，French National Institute of Health and Medical Research)、WO 2011/041613(Memorial Sloan Kettering Cancer Center)、EP 2482849(Memorial SloanKettering Cancer Center)、WO 1999/15553(Robert Koch Institute)、美国专利号7,259,247和7,722,872(Robert Kotch Institute)；WO 1998/038216(Japan TobaccoInc.)、美国专利号7,045,615；7,112,655和8,389,690(Japan Tobacco Inc.)、美国专利号9,738,718和9,771,424(GlaxoSmithKline)以及WO 2017/220988(Kymab Limited)，将其中每一项通过引用以其整体并入本文。

在一些方面，抗体或其抗原结合部分特异性结合TIGIT。在一些方面，抗TIGIT抗体是BMS-986207。在一些方面，抗TIGIT抗体是如WO 2016/106302中所述的克隆22G2。在一些方面，抗TIGIT抗体是MTIG7192A/RG6058/RO7092284或如WO 2017/053748中所述的克隆4.1D3。在一些方面，抗TIGIT抗体选自描述于例如WO 2016/106302(Bristol-Myers SquibbCompany)和WO 2017/053748(Genentech)中的抗TIGIT抗体。

在一些方面，所述抗体或其抗原结合部分特异性结合CSF1R。在一些方面，抗CSF1R抗体是国际公开案WO 2013/132044、WO 2009/026303、WO2011/140249或WO 2009/112245中的任一个中披露的抗体种类，如卡比利珠单抗、RG7155(艾马珠单抗)、AMG820、SNDX 6352(UCB 6352)、CXIIG6、IMC-CS4、JNJ-40346527、MCS110，或将方法中的抗CSF1R抗体用抗CSF1R抑制剂或抗CSF1抑制剂(如BLZ-945、培达替尼(PLX3397、PLX108-01)、AC-708、PLX-5622、PLX7486、ARRY-382、或PLX-73086)替代。

C.治疗方法

本公开文本的一些方面涉及治疗受试者的方法，所述方法包括施用根据本文公开的方法分离和/或纯化的蛋白质种类。在一些方面，受试者患有肿瘤。在一些方面，肿瘤选自源自以下的肿瘤：肝细胞癌、胃食道癌、黑色素瘤、膀胱癌、肺癌(例如，NSCLC或SCLC)、肾癌、肾细胞癌、头颈癌(例如，头颈的小细胞癌)、结肠癌、前列腺癌、乳腺癌及其任何组合。在一些方面，肿瘤是复发的或难治的。在一些方面，肿瘤是局部晚期的或转移性的。

III.本公开文本的组合物

本公开文本的一些方面涉及多肽种类，例如，根据本文公开的任何方法分离和/或纯化的融合蛋白和/或抗体。在一些方面，多肽是蛋白质。在一些方面，种类是蛋白质的电荷变体。在一些方面，种类是蛋白质的酸性种类。在一些方面，种类是蛋白质的碱性种类。在一些方面，种类是蛋白质的主要种类。

在以下小节中进一步详细描述了本公开文本的各个方面。通过以下实施例进一步说明本公开文本，所述实施例不应当被视为进一步限制。

实施例

实施例1：材料和方法

以下描述的实施例使用以下材料和方法中的一种或多种。

设备

对于色谱分离，使用以下设备：AKTA^TMAvant 25色谱系统(FPLC)(由Cytiva(原来称为GE Healthcare)制造)、ALLIANCE E2695(HPLC)联用级分收集器III(二者由WatersCorporation制造)以及CUBE 30(MCC)(由ChromaCon制造)。HPLC系统被设计用于分析分离，并且当与级分收集器配对时，可以提供高分离度分离，但通量非常低。FPLC系统被设计用于制备型色谱法应用，其提供低分离度分离，但通量比HPLC系统高得多。最后，MCC过程提供与FPLC系统等效的分离，但可以利用多个(两个)柱以及允许样品富集的内置方法(N-Rich)。

在适当的情况下，还使用了以下分析设备：iCE3^TM系统和Alcott 720自动进样器(由Protein Simple制造)、DropSense96(由Unchained Labs(原来为Trinean)制造)以及ACQUITY UPLC^TM系统(Waters Corporation)联用Maxis II^TM四级杆飞行时间质谱仪(由Bruker Daltonics Inc制造)。

化学物质和材料

四种重组人单克隆IgG抗体(mAb1-3)在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中表达，并且通过亲和色谱法纯化。胰蛋白酶购自Promega(美国威斯康星州麦迪逊)。肽N-糖苷酶F酶(PNGaseF)获自New England Biolabs(美国马萨诸塞州伊普斯威奇)。除非另有说明，所有其他试剂购自Sigma-Aldrich(美国密苏里州圣路易斯)。

使用液相色谱法进行电荷变体分级和富集

使用HPLC和FPLC进行电荷变体分级：

将单克隆抗体样品分别注射到在Waters Alliance e2695 HPLC系统和GE Avant25FPLC系统上的MabPac SCX-10(4mm X 250mm)和MabPac SCX-10(9mm X 250mm)柱(ThermoFisher Scientific，美国特拉华州威明顿市)中。基于供应商的建议，使用按质量计的最大注射量来最大化分离生产率。盐梯度流动相是具有和不具有250mM氯化钠的20mM MES(pH为6.0)，以及具有和不具有400mM氯化钠的20mM MES(pH为5.8)。优化流速和洗脱梯度持续时间以实现期望的分离。使用Waters级分收集器III收集来自HPLC系统的级分。将来自FPLC的级分收集至Avant内置级分收集器中。将级分进一步汇集并且表征。

使用连续色谱法进行电荷变体富集：

两个Mono S CEX柱(10mm X 100mm)和两个Mono Q AEX柱(10mm X 100mm)购自Cytiva(美国伊利诺伊州芝加哥)。在连续操作模式期间，当两个柱串联连接时，选择100mm的柱长度以适合连续色谱系统的压力极限(<50bar)。将上述MES缓冲液和50mM Tris(具有和不具有250mM氯化钠，pH为9.0)分别用于CEX柱和AEX柱，以用于盐梯度洗脱。AEX pH梯度流动相是5mM 1,3二氨基丙烷、5mM二乙醇胺、5mM tris、5mM咪唑、5mM双-tris、5mM哌嗪，pH11.1，以及5mM 1,3二氨基丙烷、5mM二乙醇胺、5mM tris、5mM咪唑、5mM双-tris、5mM哌嗪、5mM乙酸，pH 3.5。CEX pH梯度流动相是5mM丙二酸、5mM甲酸、5mM乙酸、5mM MES、5mM MOPSO、5mM HEPES、5mM BICINE、5mM CHES、5mM CAPS，pH 4.0，以及5mM丙二酸、5mM甲酸、5mM乙酸、5mM MES、5mM MOPSO、5mM HEPES、5mM BICINE、5mM CHES、5mM CAPS，pH 11.0。使用FPLC系统优化这些柱中的电荷变体分离条件，然后将它们转移到Contichrom CUBE(ChromaCon)连续色谱系统中。在ChromIQ软件中使用转移方法进行单次运行。使用单次运行的色谱图来定义含有目的电荷变体的区域。在CUBE系统中10个富集循环和2个耗尽循环后，使用外部级分收集器收集来自CUBE系统的级分用于进一步汇集或分析表征。

电荷变体样品表征

成像毛细管等电聚焦(iCIEF)：

为了确认分离，使用iCE3^TM系统和Alcott 720自动进样器(Protein Simple)进行iCIEF以定量电荷变体(酸性、主要和碱性)的相对量。分离柱筒以及毛细管购自ConvergentBioscience。将该毛细管固定在玻璃基板上，并且通过两片中空纤维膜与阴极电解液和阳极电解液分开。通过以下方式制备样品：将2g/L的蛋白质与含有相关pI标记物(ProteinSimple)、1％甲基纤维素溶液(Protein Simple)和3-10(Cytiva)的储备预混液以及尿素混合，并且用去离子水稀释至0.25g/L。在将制备的样品注射到柱筒中后，应用在1500V下的1-1.5分钟的预聚焦期和在3000V下的8-12min的聚焦期以实现最佳分离度。IEF迹线的最终图像由280nm氘灯检测器捕获。使用Protein Simple iCE软件通过pI校准处理结果，同时使用Waters Empower3软件计算积分和定量。mAB级分的质谱表征：

为了鉴定电荷变体的根本原因，将样品作为完整的、去糖基化后的和使用胰蛋白酶的蛋白水解切割后的形式进行分析。

完整和去糖基化mAb的分子质量的液相色谱-质谱(LC-MS)分析：

通过以下方式制备去糖基化样品：将样品与PNGase F(New England Biolabs，马萨诸塞州伊普斯威奇)以12.5单位/μg的蛋白质在37℃混合1小时。

使用ACQUITY UPLC^TM系统(Waters Corporation，马萨诸塞州米尔福德)联用MaxisII^TM四级杆飞行时间质谱仪(Bruker，Daltonics Inc.，马萨诸塞州比勒利卡)和POROS^TMR2/10PERFUSION CHROMATOGRAPHY^TM柱(2.1mm x100mm，Thermo Scientific，马萨诸塞州沃尔瑟姆)以测量mAb样品的分子质量。在整个分析中，将流速设定为0.2mL/min并且将柱温设定为65℃。将样品以90％流动相A(在LC-MS级水中的0.1％甲酸)和10％流动相B(在LC-MS级乙腈中的0.1％甲酸)注射到柱中。使用从10％至90％流动相B的线性梯度在10分钟内洗脱mAb。

Maxis II质谱仪由COMPASS HYSTAR^TM软件控制并且在具有以下设置的正模式下运行：m/z 500-4000的扫描范围，220℃的气体温度，6L/min的干燥气体，2.5Bar的雾化器和4500V的毛细管电压。COMPASSDATAANALYSIS^TM(4.4版)用于质谱解卷积。

使用LC/MS/MS的肽作图：

将一百微升富集的样品用8M盐酸胍(pH 8)变性，用10mM DTT在37℃下还原20min，并且用15mM IAA在37℃下在黑暗中烷基化20min。通过穿过Micro Bio-Spin 6柱(Bio-Rad，加利福尼亚州赫拉克勒斯)将烷基化的样品经缓冲液交换至消化缓冲液(2M尿素，50mMTRIS和10mM CaCh，pH 7.6)。使用1:25(w/w，酶/蛋白质)的比率，将洗脱液在37℃下用胰蛋白酶酶促消化3小时。消化完成后，通过添加1N盐酸来酸化消化的样品。

在通过Thermo Scientific ORBITRAP Q-EXACTIVE^TMPLUS质谱仪(ThermoScientific，德国不来梅)分析前，使用Waters ACQUITY UPLC^TM系统(美国马萨诸塞州米尔福德)对胰蛋白酶消化物进行色谱分离。使用Waters Acquity BEH C18柱(1.7μm，2.1x150mm)在45℃下进行分离，用在水中的0.1％甲酸作为流动相A，并且用在乙腈中的0.1％甲酸作为流动相B。使用经105分钟1％至80％流动相B的线性梯度以0.2mL/min的流速洗脱肽。将QEXACTIVE PLUS^TM质谱仪在数据相关模式下运行，以在MS与MS/MS采集之间切换。使用40单位的鞘气流速、10单位的辅助气体流速、3kV的喷雾电压、275℃的毛细管温度和60单位的S-Lens RF水平产生离子。对于调查扫描和MS/MS事件，分辨率分别设置为70,000(AGC靶标3e6)和17,500(AGC靶标le5)。用单次重复计数，使用10秒的动态排除持续时间。使用THERMOPROTEOME DISCOVERER^TM软件包(1.4版)(Thermo Scientific，德国不来梅)协助质谱法数据分析。

实施例2：使用多柱连续色谱法方法进行富集

如本文所述，本文提供的富集方法总体上涉及两个相同的(双)柱和MCSGP方法的使用。整个过程的示意图概述于图1A-图1B中。如所示，通过三个阶段操作实现富集，所述三个阶段操作包括富集(绿色的，即目的种类)、耗尽(红色和蓝色的，即，非目的种类)和洗脱(绿色的)。首先，开关被称为在单柱上运行，而循环是指所述两个柱中的每一个柱上的运行，并且相当于两个开关。进料材料由三种组分或种类(以红色、绿色和蓝色示出)的混合物表示，绿色种类表示用于富集的目的种类。

在富集阶段期间(参见图1A)，将进料材料加载到第一柱上。在丢弃从第一柱中洗脱的种类(蓝色)后，通过将柱2的入口连接到柱1的出口，将用于富集的种类(绿色)再循环到第二柱。在所有用于富集的种类(绿色)从第一柱再循环到第二柱后，经由汽提步骤从第一柱中丢弃后面的洗脱种类(红色)，然后重新平衡柱1。在柱1重新平衡期间，将另外的加载物(混合物)注射到柱2中以加入从柱1再循环的绿色种类中。然后在柱2上进行与柱1相同的分离操作(丢弃蓝色，再循环绿色以及丢弃红色)。所期望的种类(绿色)随着循环次数的增加而富集。在耗尽阶段期间(参见图1B)，再次进行在富集阶段中完成的分离循环模式，除了再循环已完成后，不向柱中添加另外的加载材料。该阶段由1个循环组成，这意味着在所述两个柱中的每一个上进行一次分离。目的种类(绿色)保留在柱中，并且当耗尽发生时，对于系统将不需要的种类(蓝色和红色)去除。耗尽随后是阶段3(称为洗脱)，以从系统中回收绿色种类。洗脱阶段是用于富集绿色种类的分离梯度的延长形式，其中可以实施剩余产物的分级。

图1C提供了使用上文概述的富集方法进行的UV迹线的模拟的结果。左小图示出了存在于初始进料材料中的三种种类(红色、蓝色和绿色)的存在。中间小图示出了在10个绿色种类富集循环后所得到的产物。右小图示出了在1个耗尽循环后，系统中几乎没有留下非目的种类(即，蓝色和红色种类)，而目的种类(即，绿色)保持不变。如本文所展示的，目的种类在处理的最后阶段期间被洗脱，并且被收集用于随后的分析。

实施例3：用于电荷变体富集的分批和多柱连续色谱方法的比较

为了评估本文提供的富集方法(例如，连续色谱法MCSGP)的能力，使用HPLC、FPLC和连续色谱法(CUBE)来分离重组人IgG抗体(mAb 1)的酸性变体。使用的具体方法提供于实施例1中。

如图2A和图2B所示，使用HPLC(图2A)和FPLC(图2B)的分离模式总体上类似，其中在收集的早期洗脱级分中存在酸性变体(在箭头之前)。在HPLC与FPLC之间，用HPLC观察到改进的分离度。但是与HPLC相比，FPLC的益处在于能够处理更大量的初始材料(注射量为10倍或更多)。图2C提供了使用CUBE系统的分离图谱。如所示，在色谱图上仅可见酸性种类的分离，因为富集方法丢弃了任何不是富集靶标的材料。与FPLC类似，CUBE系统允许处理更大量的材料(即，每次注射能够将更大量的材料加载到CUBE系统中)。至于分离度，它显现在使用HPLC与FPLC系统实现的分离度之间。如图2C所示，使用CUBE系统的富集方法的关键益处在于在10个富集循环(红色)后，酸性峰显著大于在2个循环(黑色)后观察到的酸性峰，证明了CUBE系统高度富集目的种类(酸性变体)的能力。耗尽后，实施分级是洗脱阶段的一种选择，这允许灵活地汇集产物。

从使用这三种不同方法产生的数据，估计从含有17％酸性变体含量的加载样品中产生10mg酸性变体所需的时间的预测。如图2D所示，估计为300、48和10小时，并且对于HPLC、FPLC和CUBE系统，使用iCIEF方法确定的样品的所得纯度(或酸性百分比)分别为87％、78％和95％。这些结果证实，本文提供的连续色谱富集方法能够在最短的时间量内实现最高纯度。

本文提供的富集方法的另一个重要特性是使用洗脱分级在富集的酸性或碱性峰区域中分离变体的亚种类的能力。为了进一步评估该方面，进行两次连续色谱富集运行(一次运行集中于酸性峰区域，并且另一次运行集中于碱性峰区域)以分离mAb1抗体的不同变体。

如图3(小图1)所示，对于每个运行，两个峰被分级：区域1和区域2。如小图2和小图3所示，酸性变体在酸性区域1和2中富集，酸性区域1含有更多的酸性变体。此外，酸性区域1和2的酸性变体分布不同。酸性区域1还含有更多的酸性变体，所述酸性变体含有两个另外的负电荷(分别迁移至约7.2和约7.4的pI)，这在加载材料中几乎检测不到(参见图3的小图1)。如小图4和小图5所示，在碱性区域富集中观察到类似的分离效率和模式。这些结果证明，通过组合特定峰区域的这种富集和对洗脱峰的进一步分级，本文提供的富集方法允许鉴定给定样品中存在的特定电荷变体。

实施例4：富集电荷变体时分离条件的比较

为了进一步评估不同的分离/富集条件，CEX和AEX柱二者以盐梯度和pH梯度用来分离mAb3抗体的酸性和碱性电荷变体。

如图6所示，当以盐梯度使用时，观察到CEX(Mono S)的最佳分离结果。对于AEX(Mono Q)，以pH梯度观察到最好的分离结果。使用这些优化的分离条件，收集来自FPLC分级运行的样品和来自连续色谱运行的富集样品，以用于使用iCIEF和MS进行进一步分析。如图6中提供的iCIEF数据所示，与使用分批模式分离的FPLC分级方法(小图2和小图4)相比，使用连续色谱方法(小图3和小图5)观察到富集的更大改善。

单独使用具有盐梯度的CEX(小图3)和具有pH梯度的AEX(小图5)的iCIEF图谱的比较，不可能在视觉上区分这些方法之间的分离效率的差异。但是使用LC/MS肽作图，观察到几种酸性变体，包括聚糖唾液酸化、脱酰胺和糖化(参见图7A、图7B和图7C)。有趣的是，如所示，基于MS分析，上述两种不同的方法导致不同酸性变体的富集程度不同。不受任何理论的束缚，这可以是由于在离子交换色谱期间分离不仅仅依赖于电荷相互作用的事实。

如图7B和图7C所示，与使用具有盐梯度的CEX相比，使用具有pH梯度的AEX导致更有效地分离脱酰胺和糖化(酸性)种类。在不同Asn位点(包括N84、N325、N384和N389)的脱酰胺水平示出了来自具有盐梯度的CEX柱的酸性、主要和碱性级分的非常小的差异。图7B(顶部小图)。即使在酸性级分中，在PENNY环中在N384和N389处观察到的脱酰胺水平也不高于7％。然而，脱酰胺种类在来自具有pH梯度的AEX柱的酸性级分中显著富集。N384和N389的脱酰胺水平在从FPLC收集的酸性样品中为约20％，并且在从CUBE收集的酸性样品中为约9％(图7B，底部小图)。

如图7C所示，在两种鉴定的肽中的糖化水平中观察到类似的趋势，表明使用具有pH梯度的AEX柱(Mono Q)更有效地富集糖化种类。相比之下，如图7D和图7E所示，具有盐梯度的CEX(Mono S)在富集含有未环化的N末端谷氨酰胺和C末端脯氨酸酰胺化的碱性种类方面更有效。来自AEX的所有级分中的N末端谷氨酰胺和C末端赖氨酸二者以类似的水平存在。然而，在碱性级分中以更高的水平检测到N末端谷氨酰胺和C末端赖氨酸，如图7D和图7E中的顶部小图所示。总体上，与来自FPLC系统的分级样品相比，从CUBE系统收集的富集样品含有相同或更高水平的靶种类，除了脱酰胺种类。

总的来说，上述结果证明使用本文提供的富集方法(MCSGP方法)产生样品是高度有效和高效的，促进了建立结构和功能关系的研究。

实施例5：改进的样品纯度对分析表征的影响

如以上实施例中所证明的，本文提供的富集方法允许鉴定在初始加载样品中或在使用FPLC产生的样品中不可清楚地检测到的种类。本文提供的富集方法的另外的益处在下文进一步强调。

iCIEF

图4中提供了mAb2抗体样品的酸性区域富集之前和之后的成像毛细管电泳图谱的比较。在富集之后，在富集之前存在的两个肩峰信号在富集之后变成更加明确的峰信号(参见图4的顶部和小图中的箭头)。此外，观察到在富集前在加载样品中不可检测的两个酸性峰(参见图4的底部小图中的*)。

质谱法

如本文所述，本文提供的富集方法不仅能够富集在初始样品中观察到的电荷变体，而且还允许鉴定先前不可检测到的另外的变体。如图5A所示，来自去糖基化LC-MS测定的糖化信号在富集的酸性样品中变得更强(从顶部起的第三个小图)。此外，在mAb1的酸性变体分离中，在富集酸性区域1的样品中检测到新的峰(图3的小图2中的最左侧的峰)。在mAb2的酸性变体分离中观察到类似的新峰(参见图4的底部小图中的*)。

基于MS分析，在富集的碱性变体样品中也观察到新的峰(144557.8m/z附近)(图5A的底部小图中的左峰)。该峰归因于C末端甘氨酸去除后具有脯氨酸酰胺化的种类。如图5B(底部小图)所示，仅在富集的酸性变体样品中清楚地观察到131538m/z附近的峰。所述峰被指定为重链截短种类，其中一条重链缺失在330后的残基。在不使用本文提供的连续色谱富集方法的情况下，此类峰的检测将是不可能的，尤其是在如此短的时间范围内。

除了以上和如以下描述的之外，本文提供的富集方法还导致某些翻译后修饰(PTM)的检测改进。提供了在不同重组人单克隆IgG抗体的分级和富集的样品中鉴定的所有PTM的结果，例如，在图3(mAb1)、图4(mAb2)以及图5A-图5B和图6(mAb3)中。

唾液酸

如图5A所示，MS分析示出了使用本文提供的富集方法，在酸性级分中(特别是在mAb3的富集酸性级分中)Fc-唾液酸化的水平升高。MS分析进一步表明检测到的唾液酸化发生在N-聚糖(G1F和G2F)的末端(图7A)。

脱酰胺和天冬氨酸异构化

在抗体的CDR和恒定区两者中的残基上观察到Asn脱酰胺。两个最主要的脱酰胺残基是N384和N389。N384随后是Gly残基，并且N389在PENNY基序NG中，并且PENNY基序先前被报道为脱酰胺热点。其他两个检测到的脱酰胺位点是N84和N325，随后分别是Ser和Lys(图7B)。

糖化

使用本文提供的富集方法，还观察到位于靠近mAb的N末端的可变区中的肽的糖化。如图7C所示，对使用盐梯度从CEX柱产生的级分中的糖化的鉴定不同于使用AEX柱和pH梯度产生的样品的糖化的鉴定。使用具有pH梯度的AEX柱产生的样品中存在更多的可变性，表明该分离方法为该电荷变体种类提供了更好的分离度。

N末端谷氨酰胺修饰

在碱性级分中还检测到高百分比的N-谷氨酰胺(图7D)。与分批模式分级相比，连续色谱富集示出了更好的分离。使用具有盐梯度的Mono S(CEX)导致增强了焦谷氨酸化的检测。由于两个原因，预计该PTM不会对产物活性产生影响：(1)第一个残基不在抗原结合界面中，和(2)一旦将产物注射到人体中，由于谷氨酰胺酰基环化酶(glutaminyl cyclase)的存在，非裂解的N末端将转化为裂解的N末端。

C末端赖氨酸

使用Mono Q(AEX)柱和pH梯度富集mAb1抗体的碱性变体(图3的小图4和小图5)。用羧肽酶B(CpB)处理后，对这些富集的碱性种类的随后的分析证实了C末端Lys的存在。因为互补决定区(CDR)在mAb的与发现Lys变体的地方相反的一端，所以这些变体的抗原亲和力的差异是最小的。

C末端脯氨酸酰胺化

根据LC-MS数据，使用具有盐梯度的Mono S(CEX)柱观察到mAb3碱性种类中的C末端酰胺化修饰。使用本文提供的方法(MCSGP)富集该样品使碱性种类样品中该修饰的相对含量比加载材料增加6倍，并且比FPLC分级的样品增加20％(图7E)。

截短的种类

如图5B所示，使用本文提供的富集方法，使用MS分析观察到去糖基化中131538Da的截短的种类。该种类归因于截短，所述截短导致重链中的一条从330至446的残基缺失。切割位点(P329)在CH2结构域中的最后一条β链前的环区中。另外，还观察到酸性级分中97.5kDa的截短种类。该截短的种类归因于从铰链区至其末端的重链片段。

总的来说，本文提供的结果证明，与传统的分批模式方法相比，本公开文本的连续色谱富集方法(MCSGP)允许以高生产率和高纯度富集靶电荷种类。使用用连续色谱法富集的样品为分析表征提供了显著的益处。

***

应理解，具体实施方式部分而不是发明内容和摘要部分旨在用于解释权利要求。发明内容和摘要部分可以阐述如诸位发明人所设想的本发明的一个或多个但并非所有示例性实施方案，因此，并不旨在以任何方式限制本发明和所附权利要求。

上文已经借助于说明指定功能及其关系的实施的功能构建模块描述了本发明。为了描述方便，本文已经任意定义了这些功能构造模块的边界。只要适当执行特定功能及其关系，就可以定义替代边界。

具体实施方案的前述描述将如此充分地揭示本发明的一般性质，使得其他人可以通过应用本领域技术范围内的知识，在无需过度实验并且不脱离本发明一般概念的情况下容易地修改和/或调整此类具体实施方案用于各种应用。因此，基于本文给出的传授内容和指导，此类调整和修改旨在包含在所公开的实施方案的等效方案的含义和范围内。应理解，本文中的措辞或术语是出于描述而非限制的目的，因此本说明书的术语或措辞将由熟练技术人员根据传授内容和指导来解释。

本发明的广度和范围不应当由任何上述示例性实施方案来限制，而应当仅根据以下权利要求及其等效物来定义。

除非另有定义，否则本文所用的所有技术和科学术语都具有与本领域普通技术人员通常所理解的相同的含义。尽管与本文所述的方法和材料类似或等同的那些方法和材料可以用于本发明的实践或测试，但本文描述了合适的方法和材料。

本文提及的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献均通过引用以其整体而并入。本公开文本中公开的数据库条目和电子公开案通过引用以其整体并入。通过引用并入本申请的数据库条目或电子公开案的版本是在提交本申请时公开可用的数据库条目或电子公开案的最新版本。本申请中公开的对应于基因或蛋白质标识符(例如，通过公共数据库如Genbank、Refseq或Uniprot的登录号或数据库标识符来标识的基因或蛋白质)的数据库条目通过引用以其整体并入。并入的与基因或蛋白质相关的信息不限于数据库条目中包含的序列数据。通过引用并入的信息包括在提交本申请时公开可用的数据库的最新版本中的数据库条目的全部内容。在发生冲突的情况下，将以包括定义在内的本说明书为准。此外，材料、方法以及实施例仅仅是说明性的并不意在是限制性的。

Claims

1.一种从包含蛋白质种类和一种或多种杂质的混合物中分离所述蛋白质种类的方法，所述方法包括以连续操作模式使所述混合物与两个或更多个色谱柱接触。

2.一种从包含所述蛋白质种类和一种或多种杂质的混合物中增加所述蛋白质种类的纯度和/或产率的方法，所述方法包括以连续操作模式使所述混合物与两个或更多个色谱柱接触。

3.一种用于富集用于分析表征的蛋白质种类的方法，所述方法包括：

(a)从包含所述蛋白质种类和一种或多种杂质的混合物中分离所述蛋白质种类，包括在色谱分离系统中以连续操作模式使所述混合物与两个或更多个色谱柱接触；以及

(b)使来自(a)的所述种类经受分析表征。

4.一种用于进行蛋白质种类的分析表征的方法，所述方法包括：

(b)对来自(a)的所述种类进行分析表征。

5.根据权利要求3或4所述的方法，其中所述分析表征通过以下进行：HPLC系统、毛细管等电聚焦(cIEF)凝胶电泳、成像毛细管等电聚焦(iCIEF)、阳离子交换色谱法(CEX)、阴离子交换色谱法(AEX)、MFI、SEC-MALS、SEC或质谱法。

6.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，与HPLC或FPLC相比，所述方法产生所述蛋白质种类的增加的纯度和/或增加的产率。

7.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述两个或更多个色谱柱富集所述种类。

8.根据权利要求7所述的方法，所述方法进一步包括将所述混合物加载到所述第一色谱柱上。

9.根据权利要求8所述的方法，其中所述加载的混合物通过所述第一色谱柱并且被分离成包含所述种类的富集种类和丢弃种类(“富集阶段I”)。

10.根据权利要求9所述的方法，其中所述富集种类通过第二柱，并且将所述丢弃种类在所述第一色谱柱后丢弃(“富集阶段II”)。

11.根据权利要求10所述的方法，所述方法进一步包括重新平衡所述第一色谱柱。

12.根据权利要求10或11所述的方法，所述方法进一步包括使所述富集种类与所述第一色谱柱接触。

13.根据权利要求8至12中任一项所述的方法，所述方法进一步包括将另外的混合物加载到所述第一柱中，其中所述另外的混合物包含所述种类和一种或多种杂质。

14.根据权利要求13所述的方法，其中在将所述富集种类添加至所述第一色谱柱中的同时添加所述另外的混合物。

15.根据权利要求13所述的方法，其中在将所述富集种类添加至所述第一色谱柱中之后并且在所述富集种类通过所述第一色谱柱之前添加所述另外的混合物。

16.根据权利要求13至15中任一项所述的方法，其中所述富集阶段I和II重复至少两次、至少三次、至少四次、至少五次、至少六次、至少七次、至少八次、至少九次或至少十次。

17.根据权利要求16所述的方法，所述方法进一步包括耗尽阶段。

18.根据权利要求17所述的方法，其中所述耗尽阶段包括在不存在另外的混合物的情况下使所述富集种类与所述第一色谱柱接触。

19.根据权利要求18所述的方法，其中所述耗尽阶段进一步包括使所述富集种类通过所述第一色谱柱并且将所述种类与一种或多种杂质分离。

20.根据权利要求19所述的方法，其中所述耗尽阶段进一步包括使所述富集种类通过所述第二色谱柱，将所述种类与一种或多种杂质分离。

21.根据权利要求1至20中任一项所述的方法，所述方法进一步包括洗脱所述种类。

22.根据权利要求1至21中任一项所述的方法，其中所述方法产生至少88％、89％、90％、91％、92％、93％、95％、96％、97％、98％、99％或100％纯的所述蛋白质种类。

23.根据权利要求21或22所述的方法，其中所洗脱的所述种类的浓度是所述混合物中所述种类的浓度的至少约1.5倍、至少约1.6倍、至少约1.7倍、至少约1.8倍、至少约1.9倍、至少约2.0倍、至少约2.5倍、至少约3.0倍、至少约3.5倍、至少约4.0倍、至少约4.5倍、至少约5.0倍、至少约5.5倍、至少约6.0倍、至少约6.5倍、至少约7.0倍、至少约7.5倍、至少约8.0倍、至少约8.5倍、至少约9.0倍、至少约9.5倍或至少约10.0倍。

24.根据权利要求1至23中任一项所述的方法，其中所述色谱柱中的一个或多个包括盐梯度、pH梯度或两者。

25.根据权利要求24所述的方法，其中所述盐梯度包括氯化钠梯度。

26.根据权利要求24或25所述的方法，其中所述盐梯度包括有或没有盐。

27.根据权利要求24-26中任一项所述的方法，其中所述盐的浓度在约50mM与约600mM之间、在约100mM与约550mM之间、在约150mM与约500mM之间、在约200mM与约450mM之间、在约250mM与约400mM之间、在约100mM与约400mM之间、在约100mM与约350mM之间、在约100mM与约300mM之间、在约100mM与约250mM之间、在约300mM与约600mM之间、在约350mM与约550mM之间、在约400mM与约500mM之间或在约350mM与约450mM之间。

28.根据权利要求24至26中任一项所述的方法，其中所述盐的浓度为至少50mM、至少约100mM、至少约150mM、至少约200mM、至少约250mM、至少约260mM、至少约270mM、至少约280mM、至少约290mM、至少约300mM、至少约310mM、至少约320mM、至少约330mM、至少约340mM、至少约350mM、至少约360mM、至少约370mM、至少约380mM、至少约390mM、至少约400mM、至少约450mM、至少约500mM、至少约550mM或至少约600mM。

29.根据权利要求24至28中任一项所述的方法，其中所述pH梯度的pH在约pH 3与约pH11之间。

30.根据权利要求1至29中任一项所述的方法，其中所述混合物在缓冲液中。

31.根据权利要求30所述的方法，其中所述缓冲液包括MES、磷酸盐缓冲液、Tris或其任何组合。

32.根据权利要求1至31中任一项所述的方法，所述方法进一步包括测量翻译后修饰。

33.根据权利要求32所述的方法，其中所述翻译后修饰包括N-谷氨酰胺焦谷氨酸化、C末端赖氨酸截短、C末端脯氨酸酰胺化、糖化、唾液酸化、脱酰胺化、天冬氨酸异构化、通用截短或其任何组合。

34.根据权利要求1至33中任一项所述的方法，其中所述蛋白质包括融合蛋白或抗体或其抗原结合部分。

35.根据权利要求34所述的方法，其中所述抗体或其抗原结合部分结合选自以下的抗原：PD-1、PD-L1、CTLA-4、LAG-3、TIGIT、GITR、CXCR4、CD73、HER2、VEGF、CD20、CD40、CD11a、组织因子(TF)、MICA/B PSCA、IL-8、EGFR、HER3、HER4及其任何组合。

36.根据权利要求34所述的方法，其中所述融合蛋白包含免疫球蛋白组分和生长因子。

37.根据权利要求36所述的方法，其中所述融合蛋白包括Fc融合蛋白。

38.根据权利要求36或37所述的方法，其中所述融合蛋白包括与CTLA-4融合的Fc。

39.根据权利要求36至38中任一项所述的方法，其中所述融合蛋白包括阿巴西普或贝拉西普。

40.根据权利要求36或37所述的方法，其中所述融合蛋白包括与白介素融合的Fc。

41.根据权利要求34至40中任一项所述的方法，其中所述融合蛋白或抗体的种类是酸性种类、碱性种类或主要种类。

42.根据权利要求34至40中任一项所述的方法，其中通过蛋白A亲和色谱法部分地纯化所述融合蛋白或抗体。

43.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中通过逆流纯化系统富集所述种类。

44.根据权利要求43所述的方法，其中所述逆流纯化系统是多柱逆流溶剂梯度纯化(MCSGP)系统。

45.一种通过根据权利要求1至44中任一项所述的方法制备的蛋白质种类。

46.根据权利要求45所述的蛋白质种类，其是电荷变体。

47.一种治疗有需要的受试者的疾病或病症的方法，所述方法包括向所述受试者施用根据权利要求45或46所述的蛋白质种类。