CN1188703C

CN1188703C - 区分血中白血球的试剂和方法

Info

Publication number: CN1188703C
Application number: CNB971127913A
Authority: CN
Inventors: 李毅; C·尤恩格; S·C·维兰斯
Original assignee: Coulter International Corp
Current assignee: Beckman Coulter Inc
Priority date: 1997-06-17
Filing date: 1997-06-17
Publication date: 2005-02-09
Anticipated expiration: 2017-06-17
Also published as: CN1202621A

Abstract

本发明涉及一种溶解剂和使用该溶解剂自动区分血液中白血球亚群的方法。尤其是，新的溶解剂溶解红血球并作用于能够区分至少一种白血球亚群的嗜酸性细胞。该溶解剂为酸，含有烷基硫酸的碱金属盐的高渗水溶液，嗜酸性细胞溶解剂，非离子表面活性剂和生理盐分。当与第二种溶解剂一起使用时，能够用DC和RF测量区分白血球的至少五个部分。

Description

区分血中白血球的试剂和方法

发明领域

本发明涉及一种溶解剂和一种通过适宜的电子仪器手段区分血样中白血球亚群的方法。

发明背景

由血样分析白血球群体是诊断众多疾病方法中必要的和基本的部分。测量白血球亚群的嗜酸性细胞对于诊断某些疾病来说是重要的。例如，发现在何杰金病、寄生虫和过敏性疾病中，嗜酸性细胞的数量增加。

传统血样分析包括将血样涂在显微镜的载玻片上，然后观察分析该载玻片。这种方法极为耗时，而且对载玻片分析的解释存在有个体差异。因此发展了利用流动性白细胞计数来自动分析白血球的方法。利用自动血液仪器分析白血球方法中的一个必要步骤是溶解红细胞。到目前为止，已经开发了用于全血样品的一些溶解试剂。

美国专利4485175(Ledis等)描述了一种试剂系统和用自动细胞计数装置将白血球区分为三种亚群的方法。该试剂系统含有血稀释剂和溶解试剂。该溶解试剂含有季铵表面活性剂的混合物。然而，该试剂系统将其用途限定到将白血球区分为三种亚群：淋巴细胞、单核细胞和粒细胞。该试剂系统不能进一步将粒细胞区分为另外的三种亚群。

美国专利4751179(Ledis等)公开了一种试剂系统和用自动细胞计数装置区分白血球的方法。该试剂系统含有：1)溶解试剂，其含有含皂草甙的单一溶解稀释剂或者含有由预稀释剂和含皂草甙的溶解试剂组成的顺序加入两种溶液；和2)一种活性交联剂，如作为固定剂的戊二醛。加热血样溶解试剂系统混合物并通过DC和浑浊度对其分析之后，可确定四种白血球亚群。这四种亚群为淋巴细胞、单核细胞，嗜中性细胞和嗜酸性细胞。该方法要求，在通过仪器测定之前，需将样品混合物在60-75℃下加热。

美国专利5155044(Ledis等)公开了一种试剂系统和用于全血样品的快速分离和白血球分析并能使用可测量传导率(DC)、放射频率(RF)和光散射(LS)的自动血液分析仪来自动区分为五种亚群。该试剂系统由含有酸或酸和皂草甙混合物的水性溶解试剂和水性盐淬灭(quench)溶液组成。该方法是快速的并且在一步测量中能够从全血样品中区分5部分白血球。该单一测量步骤是用相同的溶解试剂系统测量单个血液等分试样来区分白血球。然而，使用该试剂和方法来将白血球区分为五种亚群需要高级和昂贵的激光装置。如果仅仅用这种试剂系统的DC和RF检测，粒细胞亚群不会被完全区分为嗜碱性细胞、嗜酸性细胞和嗜中性细胞亚群。不能区分粒细胞，这是因为在该专利所述条件下，亚群的DC和RF信号相互重叠。

通过DC和RF测量将白血球区分为四或五种亚群的另一方法是使用多种试剂和进行多步测量。各个试剂用于区分特定的亚群。通常，使用第一种溶解试剂(如美国专利5116539(Hamaguchi等)和美国专利5389549(Hamaguchi等)所述)来通过测量DC和RF将白血球区分为三种亚群(即，单核细胞、淋巴细胞和粒细胞)。

在美国专利5116539中，使用另一种溶解试剂进行另一个测量而获得嗜酸性细胞亚群。这能够区分为淋巴细胞、单核细胞、嗜酸性细胞和剩余的粒细胞四部分。该溶解试剂是一种由聚氧乙烯非离子表面活性剂和将溶液PH调节在3-11范围内的缓冲剂组成的低渗水溶液。该溶解试剂除了嗜酸性细胞之外不仅溶解红血球也溶解白血球，这样可根据其剩余细胞核的体积对嗜酸性细胞计数。然而，为了分离嗜酸性细胞，使用该溶解试剂的方法需要在40℃温度下将样品混合物培养50秒钟。这种升高温度需要明显更复杂的仪器，因为必须控制反应的温度。另外，延长反应时间会直接减少自动分析仪的工作效率。

在美国专利5389549中，需要两种另外的溶解试剂并需要进行另外两次测量，获得嗜酸性细胞和嗜碱性细胞以便区分出五个部分。在该文献中，从总粒细胞群中减去分别测定的嗜酸性细胞和嗜碱性细胞的和而获得嗜中性细胞亚群。

美国专利5196346(Lefevre等)公开了一种溶解试剂和使用该溶解试剂通过溶解除嗜碱性细胞之外的所有血细胞(包括红血球和白血球)来自动测定全血样品中的嗜碱性细胞的方法。溶解试剂由聚氧乙烯醚类表面活性剂、苯二甲酸/HCL混合物、十二烷基硫酸钠(SDS)和丁基化的羟基甲苯型抗氧剂。SDS用作蛋白质变性剂来减少测量仪器中沉淀的形成并且还发现可促进细胞溶解。所公开的方法要求将反应温度控制在30-40℃并局限于仅记录嗜碱性细胞的数目。

未决的美国专利申请08/488630(于1995年6月8日申请)公开了一种溶解试剂系统和使用DC、RF和光散射测量装置将白血球自动区分为五种亚群的方法。该溶解试剂系统由含有乙氧基化的长链胺化合物和酸的水溶性溶解试剂和含有高渗的碱性试剂组合物的稳定剂组成。该公开的溶解试剂系统使用DC、RF和光散射测量经一次测量区分白血球的五个部分。然而，如果在仅装有DC和RF测量装置的血液分析仪上使用该溶解试剂时，仅获得四种亚群，即单核细胞、淋巴细胞、嗜碱性细胞和嗜中性细胞与嗜酸性细胞总数。

另外，未决的美国专利申请08/496469(1995年6月29日申请)公开了溶解试剂和使用DC、RF和光散射测量仪将白血球自动区分为五种亚群的方法。该溶解试剂由含有聚氧乙烯表面活性剂和酸的水性溶解试剂和高渗的碱性稳定试剂组合物组成。公开的溶解试剂系统使用DC、RF和光散射测量时也一步区分白血球为五个部分。然而，如果在仅装有DC和RF测量装置的血液分析仪上使用该溶解试剂时，仅获得四种亚群，即单核细胞、淋巴细胞、嗜碱性细胞和嗜中性细胞与嗜酸性细胞总数。

发明概述

本发明涉及新的溶解试剂组合物。所述溶解试剂组合物为酸性高渗水溶液，其含有烷基硫酸的碱金属盐、嗜酸性细胞溶解剂(eosinolyticagent)、非离子表面活性剂和生理性盐。此新的溶解试剂组合物可溶解红血球并通过选择皱缩嗜酸性细胞而从其它粒细胞亚群中选择性地影响和分离嗜酸性细胞亚群。这样至少能够区分一种白血球亚群。

该溶解试剂组合物具有完全在室温下操作的优点。为了完全分离嗜酸性细胞亚群，现有技术在升高的温度(30℃或更高)下进行。这种升高温度需要明显更复杂的仪器，因为必须控制反应的温度。本发明通过在室温下最佳操作克服了需要控制温度的缺陷。

另外，本发明涉及使用溶解试剂组合物自动测定血中白血球亚群的方法。本发明的方法包括将血样与溶解试剂组合物混合、在室温下将样品混合物培养不超过25秒钟并用自动血液仪分析样品混合物。表面活性剂的协同效果对嗜酸性亚群产生快速选择性的作用，通过简单的DC和RF测量快速从其它白血球亚群中分出嗜酸性细胞亚群。而且，该方法具有不需要昂贵的激光装置测定嗜酸性细胞亚群的优点。

另外，本发明涉及使用新的溶解试剂组合物和第二种溶解试剂来仅通过DC和RF测量而获得至少白血球的五个部分区分。

附图简述

图1a和1b显示按实施例I所述方法由正常全血样品中区分的嗜酸性细胞。图1a显示DC与OP(混浊度，RF和DC的函数)的二维图且图1b分别显示RF与OP的图。白血球亚群作为标记物来显示。

图2显示按实施例I所述方法进行的全血样品DC与旋转光散射(RLS)图，与实施例I不同的是用装有DC、RF和光散射装置的实验性血液分析仪通过集中流动法(focused flow method)进行分析。

图3a和3b显示按实施例II的方法使用本发明列举的溶解试剂组合物所进行的全血样品二维图。

图4显示使用实施例IV所述第二种溶解试剂的例子和实施例VI所述的稳定剂并按实施例VII的方法进行的全血样品二维图。每组代表一个或多个标记的白血球亚群。

发明的详细描述

本发明涉及水性溶解试剂组合物和通过DC和RF测量快速区分至少一种白血球亚群的方法。该溶解试剂组合物溶解红血球并从其它粒细胞亚群中选择性地皱缩嗜酸性细胞亚群。更具体讲，本发明涉及，该溶解试剂和该溶解试剂基于血样与溶解试剂组合物混合后细胞体积的不同区分和计数嗜酸性细胞而不用激光测量的方法。另外，提供一种仅仅使用DC和RF测量来区分至少五种白血球亚群的方法。

在本发明的第一个实施方案中，水性溶解试剂组合物含有烷基硫酸的碱金属盐，酸，促进嗜酸性细胞亚群选择皱缩的选自有机磷酸酯、有机磷酸酯的碱金属盐、乙氧基化磷酸酯、乙氧基化硫醇、乙氧基化羊毛醇、乙氧基化烷基苯酚、乙氧基化烷醇、乙氧基化烯醇及其混合物的嗜酸性细胞溶解剂，保护嗜中性细胞不受溶解的非离子表面活性剂和足以将所述溶解试剂组合物的重量克分子渗透压浓度调节在370-720mOsm之间的生理盐分。这些具有膜活性的化学物质的协同作用能够使溶解试剂快速溶解红血球，同时选择性地皱缩并从白血球的其它亚群中区分嗜酸性细胞。

本发明溶解剂中烷基硫酸碱金属盐的功能是决定性的。它溶解红血球从而给白血球区分分析提供了机会。另外，它也选择性地影响嗜酸性细胞亚群细胞膜并皱缩细胞体积快速下降。烷基硫酸碱金属盐的烷基链长为10-18个碳原子，优选12-14个碳原子。烷基硫酸碱金属盐的优选实例包括十二烷基硫酸钠和十四烷基硫酸钠。最优选使用十二烷基硫酸钠。烷基硫酸碱金属盐的浓度大约为0.02％-0.16％，优选大约0.04％-0.12％。

所述酸的功能有助于选择溶解红血球并为选择皱缩嗜酸性细胞亚群提供酸性环境。已经发现嗜酸性细胞亚群的选择皱缩仅仅在酸性介质中发生。

本发明可使用各种各样的酸。然而，优选使用PK低于3的那些酸。该酸可为有机酸、无机酸或其混合物。本发明溶解剂中合适酸的实例为乙酸、柠檬酸、甲酸、丙酸、盐酸、磷酸、硫酸及其混合物。酸的量需要足以快速溶解红血球，但同时不能引起其它粒细胞亚群的损伤。溶解剂的PH应当保持在大约1.4-3.4的范围之内，优选大约1.8-2.6。

一组表面活性剂起嗜酸性细胞溶解剂的功能。其存在于溶解试剂组合物中有助于嗜酸性细胞的皱缩并帮助皱缩嗜酸性细胞形成区分分析的有区别组。这些嗜酸性细胞溶解剂包括有机磷酸酯、有机磷酸酯的碱金属盐、乙氧基化的磷酸酯、乙氧基化硫醇、乙氧基化羊毛醇、乙氧基化烷基苯酚、乙氧基化烷醇、乙氧基化烯醇及其混合物。

由于这些表面活性剂显著不同的化学特性，本发明条件下的这些表面活性剂的作用方式现在是未知的。总之，非离子嗜酸性细胞溶解剂具有低于约15的亲水亲脂平衡值(HLB)。已知这些非离子嗜酸性细胞溶解剂在广泛的PH下是由强到温和的红血球溶解剂。然而，这不能解释其对嗜酸性细胞胞质膜的选择作用及其从其它粒细胞亚群中区分嗜酸性细胞亚群的能力。根据所使用具体化学物质的效力决定嗜酸性细胞溶解剂的浓度范围为0.05％-0.8％，可通过实验来确定。

另一组表面活性剂起白血球保护剂的功能。白血球保护剂具有两个功能。一个功能是帮助选择性地溶解红血球。第二个功能是保护白血球，特别是嗜中性细胞亚群在溶解反应期间免受损伤。合适的实例包括具有HLB为16或更大的乙氧基化的烷醇或乙氧基化的烯醇及其混合物。

如果在分析期间嗜中性细胞亚群受溶解剂的影响，它们也会在大小上皱缩并干扰嗜酸性细胞的分类。然而，如果使用过量的白血球保护剂，嗜酸性细胞亚群的分离只会在大于约45秒钟的延长反应时间下进行，或者变得不能完成。所以，需要合适浓度的白血球保护剂(可通过实验来确定)。乙氧基化的烷醇或乙氧基化的烯醇的浓度大约为0.5-3％，优选约为0.8-2％。

使用生理盐分调节溶解试剂的重量克分子渗透压浓度。本发明人已经发现嗜酸性细胞的皱缩仅仅在大约370-720mOsm，优选大约400-570mOsm范围的高渗环境下发生。在优选的实施方案中，为此目的而使用碱金属氯化物和硫酸碱金属盐。适当组合碱金属氯化物和硫酸碱金属盐，嗜酸性细胞的皱缩可快速发生并且嗜酸性细胞皱缩后形成有区别的群体。

合适的生理盐分的例子包括氯化钠或氯化钾和硫酸钠或硫酸钾。碱金属氯化物的浓度范围约为0.1％-1.2％，优选约为0.3-1.0％。硫酸碱金属盐的浓度范围约为0.4-2％，优选约为0.6-1.5％。

任选地，可使用聚氧乙烯和聚氧丙烯共聚物来帮助溶解红血球碎片并减少由碎片产生的噪音。另外，已经发现共聚物有助于嗜酸性细胞亚群形成区别组。本发明优选的方案是使用Pluronic共聚物(由BASF公司生产，Parsippany，New Jersey)，如Pluronicl OR5和Pluronic L35。

其它可有可无的添加剂也可包含在溶解试剂组合物中，其浓度为[所存在的量]与溶解试剂组合物的主要组分相容。其中这些添加剂为具有抗氧特性的(以增加组合物的贮存时间)和具有抗微生物特性的保鲜剂。具有抗氧特性的防腐剂包括但不限于EDTA和丁基甲基苯酚。具有抗微生物特性的防腐剂包括但不限于二羟甲基二甲基海因和异硫状杀磷(isothiozolone)衍生物。

在本发明的第二个实施方案中，提供一种溶解血样中红血球并分析所剩白血球亚群的方法。该方法包括：步骤1)将血样暴露于溶解组合物一定时间，该时间足以溶解红血球并在所述血样中分出至少一种白血球亚群，所述溶解剂含有烷基硫酸的碱金属盐，酸，促进嗜酸性细胞亚群选择皱缩的选自有机磷酸酯、有机磷酸酯的碱金属盐、乙氧基化磷酸酯、乙氧基化巯醇、乙氧基化羊毛醇、乙氧基化烷基苯酚、乙氧基化烷醇、乙氧基化烯醇及其混合物的嗜酸性细胞溶解剂，保护嗜中性细胞亚群不受溶解的非离子表面活性剂和足以将所述溶解试剂组合物的重量克分子渗透压浓度调节在370-720mOsm之间的生理盐分，步骤2)从嗜酸性细胞、淋巴细胞、单核细胞和嗜中性细胞中区别出至少一种白血球亚群，和步骤3)报告所述区分的结果。

将血样暴露于溶解组合物一定时间，该时间足以溶解红血球并在所述血样中分出至少一种白血球亚群。通过溶解剂与血样混合来使血样暴露于溶解剂，将血样稀释大约45-70倍。在室温下培养稀释的样品混合物。优选的，温度大约在15-30℃。培养时间大约为10-25秒，优选少于18秒钟。用自动血液分析仪分析样品混合物。该仪器测量并至少区分一种白血球亚群，优选嗜酸性细胞亚群或嗜中性细胞亚群，而且最优选嗜酸性细胞亚群。

使用至少两种选自DC、RF和光散射测量中的测量方式来进行区分。优选仅仅使用DC和RF测量进行区分。DC方法检测样品混合物通过狭窄的液体通道时因颗粒与液体介质之间导电率的不同而在电流上会发生任何变化。在DC方法中，检测信号的强度基本与颗粒体积成比例。在RF方法中，样品混合物通过紧密相邻电极之间的狭窄液体通道，因颗粒和液体介质之间电介质常数的不同故可测得在电极之间电阻抗上所发生的变化。在RF方法中，检测反映信息的信号涉及颗粒的结构和组成它们材料的性质。DC和RF检测规则和技术的详细情况在受让于CoulterElectronic，Inc.的美国专利2656508和受让于Coulter Electronic，Inc.的美国专利4298836中有所教导。

使用本发明溶解试剂组合物来对血样进行白血球区别分析的方法是一种使用溶解试剂的快速方法。溶解试剂组合物溶解红血球并选择性地影响嗜酸性细胞亚群的胞质膜并皱缩嗜酸性细胞亚群细胞体积。除嗜酸性细胞外以在溶解反应期间基本保持完整。

实施例I描述应有所公开的溶解试剂组合物来区别并记录全血样品中白血球的数目的优选实施方案。图1显示使用DC和RF测量按照实施例I描述的方法区别分析全血样品。细胞流过一个孔，该孔处有一记录细胞对放射频率和直流电反应的阻抗测量装置。处理电信号并分别绘制图1a和1b所述的DC与混浊度或RF与混浊度的二维图。如图所示，血样与本发明溶解试剂组合物混合之后，嗜酸性细胞亚群从其它白血球群中完全分离出来。尽管实施例用非集中流动仪器进行，如图2所示使用集中流动系统会获得相同结果。

注意到，尽管与溶解试剂混合后嗜酸性细胞的大小被巨大地减小，但其RF信号未察觉受到影响。使用DC和RF检测技术区别嗜中性细胞和嗜酸性细胞主要是通过它们大小和混浊度的显著差异来完成的。如图1a和1b所述，嗜酸性细胞亚群的混浊度右移并完全从嗜中性细胞和其它白血球亚群中移出。

图2显示按实施例I的方法在装有DC、RF和光散射装置的实验性血液分析仪上通过集中流动法使用相同的血样由DC与旋转光散射图确证本发明的嗜酸性细胞组。在DC与光散射二维图中，通过其大小和光散射的区别从嗜中性细胞中分出嗜酸性细胞。通过本发明方法分出的嗜酸性细胞的数目与通过常规手工方法记录的嗜酸性细胞的数目一致。

在本发明的第三个实施方案中，提供一种溶解血样中红血球并将剩余的白血球亚群分为至少五种白血球亚群的方法。该方法包括：步骤1)用第一种溶解剂组合物处理第一个血液等分试样足够时间，以使红血球溶解，并从所述血样中分出至少一种白血球亚群，步骤2)用第二种溶解剂系统处理所述血液的第二个等分试样，以使红血球溶解，并且从所述血样中分出四种白血球亚群，步骤3)使用DC和RF测量分析所述处理血液的第一个等分试样，步骤4)使用DC和RF测量分析所述处理血液的第二个等分试样，步骤5)报告至少五种白血球亚群。

处理第一个血液等分试样的步骤1是使用本发明第一个实施方案中所述的溶解剂组合物来完成的。直接分析第一个血液等分试样的步骤3是通过本发明第二个实施方案中所述的方法来完成的。

步骤2是通过用第二种溶解剂系统处理血液样品的第二个等分试样，足以使得红血球溶解，并且从所述血样中分出四种白血球亚群来完成的。第二个溶解剂系统将白血球分为淋巴细胞、单核细胞、嗜碱性细胞和除嗜碱性细胞之外的粒细胞。血样与第二种溶解剂的混合时间少于10秒钟。

第二种溶解剂通常将包括溶解试剂和稳定剂组合物。第二种溶解剂系统的一个实例是包含溶解试剂，它含有下式所示的乙氧基化的长链胺化合物：

其中R为具有12-22个碳原子的烷基、链烯基或炔基，m和n各为1或更大并且m+n在20和40之间；和将溶解试剂的PH调节在2.0-3.6范围之内的酸；和高渗碱性稳定剂组合物。优选R为具有14-20个碳原子的烷基。另外，优选地，用于调节PH的酸含有有机酸。更优选调节PH的酸含有甲酸和选自乙酸、柠檬酸、草酸、乙醇酸、丙酸、盐酸、硫酸和磷酸及其混合物的酸的有效混合物。

第二种溶解剂系统的另一实例是含有溶解试剂，它含有下式所示的聚氧乙烯表面活性剂：

R₁-R₂-(CH₂CH₂O)_n-H

其中R₁为具有10-22个碳原子的烷基，链烯基或炔基，R₂为-O-或-COO-，且n在20-35之间；和将溶解试剂的PH调节在2.0-4.0范围之内的酸；和高渗碱性稳定剂组合物。优选R为具有14-20个碳原子的烷基。另外，优选地，用于调节PH的酸含有有机酸。优选调节PH的酸含有甲酸和选自乙酸、柠檬酸、草酸、乙醇酸、丙酸、盐酸、硫酸和磷酸及其混合物的酸的有效混合物。

在实施例IV和V中提供了第二种溶解剂的两个实例。实施例VI中提供了实施例IV和V的第二种溶解剂中使用的稳定剂的实例。

步骤4是通过使用DC和RF分析溶解血液的第二个等分试样来完成的。图4描述四种白血球亚群，它是通过使用实施例IV中所述的第二种溶解剂和实施例VI中所述的稳定剂组合物按实施例VII所述的方法分析血液样品获得的。如图4所述，使用DC和RF测量清楚地分离出淋巴细胞、单核细胞、嗜碱性细胞和除嗜碱性细胞之外的粒细胞的四种细胞亚群。

步骤5报告至少五种白血球亚群。如上所示，步骤4中直接获得淋巴细胞、单核细胞、嗜碱性细胞。通过由步骤4中获得的除嗜碱性细胞之外的粒细胞减去由步骤3中获得的嗜酸性细胞亚群而获得嗜中性细胞亚群。

溶解剂组合物、第二种溶解试剂系统或其组合均可以试剂盒的形式出售，其中可将溶解试剂包装在容器(如塑料容器)中。优选地将如何按照本发明使用这些组分的说明书包括在容器内或容器上。

通过参考下列实施例进一步描述本发明，这些实施例是说明性的而不限定本发明的范围。

实施例I

用下列组分配制溶解剂组合物：

1、T-mulz(Harcros Chemical，Inc.，50％有机磷酸酯的钾盐) 5.0g

2、十二烷基硫酸钠 1.0g

3、Hetoxol STA30(Heterene，乙氧基化的十八烷醇) 10.0g

4、Pluronic 10R5(BASF) 15.0g

5、甲酸 0.2ml

6、硫酸钠 9.0g

7、氯化钾 6.0g

8、预溶解在乙醇中的BHT 0.05g

9、proclin300(Rohm & Haas Co.) 0.5ml

10、PH(通过4M HCl来调节) 2.2

11、去离子水调节到1L

往28ml EDTA抗凝的正常全血样品中，加入1800ml的溶解剂组合物，并且在室温(大约212℃)下，通过振荡将混合物轻轻混合9秒钟，在加入溶解剂组合物后的大约13秒钟时准备进行区别分析。血液混合物保持在酸性(PH约为2.2)和重量克分子渗透压浓度484mOsm的条件下。在装有DC和RF装置的实验性血液分析仪上使用非集中流动技术进行区别分析。图1a和1b中描述了所得的二维图。图1a的竖轴和横轴分别为DC和混浊度，并且图1b的竖轴和横轴分别为RF和混浊度。嗜酸性细胞群被区分并计数，而且按绝对值或者相对于总白血球数计算的百分数来报告结果。

实施例II

用下列组分配制溶解剂组合物，并用于白血球亚群区别分析。往28μlEDTA抗凝的正常全血样品中，加入1600μl的溶解剂组合物，并且在室温(大约212℃)下，通过振荡将混合物轻轻混合8秒钟，在加入溶解剂组合物后的大约12秒钟时准备进行区别分析。图3a和3b显示两个DC与混浊度的图。图3a与正常血样相对应，图3b对应于嗜酸性细胞升高(手工区别计数为12％)的血样。

1、Burco TME(Burlington Chemical Co.Inc.， 1.5g乙氧基化的十二烷基硫醇，HLB＝13.0)

2、十二烷基硫酸钠 1.0g

3、Hetoxol STA30(Heterene，乙氧基化的十八烷 8.0g醇)

4、Pluronic L35(BASF) 10.0g

5、柠檬酸 17.0ml

6、硫酸钠 9.0g

7、氯化钾 6.0g

8、去离子水调节到1L

9、PH 2.2

实施例III

用下列组分配制溶解剂组合物，并用于白血球亚群区别分析。在28μlEDTA抗凝的正常全血样品中，加入大约1880μl的溶解剂组合物，并且在室温(大约212℃)下，通过振荡将混合物轻轻混合11秒钟，在加入溶解剂组合物后的大约15秒钟时准备进行区别分析。然后在实验性血液分析仪上分析样品。

1、Tergitol NP-13(Union Carbide，乙氧基化的壬基苯酚) 1.0g

2、十四烷基硫酸钠 1.0g

3、Hetoxol STA30(Heterene) 10.0g

4、甲酸 0.2g

5、硫酸钠 9.0ml

6、氯化钾 5.0g

7、Pluronic 10R5 15.0g

8、去离子水调节到1L

9、PH 2.2

实施例IV：

第二种溶解剂的第一个实例

用下列组分配制包含乙氧基化的长链胺化合物的溶解剂组合物：

将下式的阳离子乙氧基化的长链胺化合物：

其中m+n的值为30，溶于去离子水，浓度为20g/L。用甲酸将PH调到3.2。另外加入下列保鲜剂：0.2g/L EDTA，0.5g/L Proclin300(Rohm &Haas Co.)，和0.05g/L 2，6-二-叔丁基-4-甲基苯酚(预先溶于乙醇)。

实施例V

第二种溶解剂的第二个实例

用下列组分配制包含聚氧乙烯表面活性剂的溶解剂组合物：

将下式的聚氧乙烯表面活性剂：

C₁₈H₃₇O(CH₂CH₂O)_nH

其中n的值为30，溶于去离子水，浓度为20g/L。加入0.8g/L的十二烷基硫酸钠(SDS，Aldrich)。用甲酸将PH调到2.8。

使用第二种溶解剂和稳定剂来制备将白血球分离为淋巴细胞、单核细胞、嗜碱性细胞和除嗜碱性细胞亚群的粒细胞的溶解剂系统。实施例VI描述了稳定剂的一个实例。

实施例VI

第二种溶解剂的稳定剂

如上文所述来配制稳定剂，它包括14g/L NaCl，32g/L Na₂SO₄和6.6g/LNa₂CO₃的缓冲剂，PH调到11.0。该试剂的重量克分子渗透压浓度为1080mOsm。

实施例VII

区分血样的白血球群

往28ml EDTA抗凝的正常全血样品中，加入488ml实施例IV的溶解剂组合物，并且在室温(大约212℃)下，通过振荡将混合物轻轻混合4秒钟。通过加入实施例VI的稳定剂209μl阻止溶解反应。轻轻混合血样混合物并在加入稳定剂后的大约15秒钟时准备进行区别分析。最终血液混合物保持在中性PH(约为7)和重量克分子渗透压浓度约为445mOsm的高渗条件下。图4显示用DC和RF进行的区别分析。

尽管出于说明本发明的目的而显示某些有代表性的实施方案和细节，但在不脱离本发明如所附的权利要求定义的范围下可进行各种变化和改进。

Claims

1、一种水性溶解剂组合物，含有：

a)烷基硫酸的碱金属盐，以有助于溶解红细胞和使嗜酸性细胞亚群皱缩的0.02％-0.16％w/w的浓度存在，

b)酸，以有助于溶解红细胞和提供用于使嗜酸性细胞亚群皱缩的pH值为1.4-3.4的酸性环境的有效量存在，

c)促进嗜酸性细胞亚群选择皱缩的选自有机磷酸酯、有机磷酸酯的碱金属盐、乙氧基化磷酸酯、乙氧基化硫醇、乙氧基化羊毛醇、乙氧基化烷基苯酚、乙氧基化烷醇、乙氧基化烯醇及其混合物的具有低于15的亲水亲脂平衡值的嗜酸性细胞溶解剂，

d)保护白细胞的嗜中性细胞亚群不受溶解的具有大于16的亲水亲脂平衡值的非离子表面活性剂，和

e)足以将所述溶解剂组合物的重量克分子渗透压浓度调节在370-720mOsm之间的生理盐分。

2、权利要求1的溶解剂组合物，其中烷基硫酸的碱金属盐的烷基具有10-18个碳原子。

3、权利要求1的溶解剂组合物，其中用于调节PH的酸选自有机酸、无机酸及其混合物。

4、权利要求3的溶解剂组合物，其中酸选自乙酸、柠檬酸、甲酸、丙酸、盐酸、磷酸、硫酸及其混合物。

5、权利要求1的溶解剂组合物，其中所述嗜酸性细胞溶解剂的浓度范围为0.05-0.8％w/v。

6、权利要求1的溶解剂组合物，其中所述保护嗜中性细胞亚群不受溶解的非离子表面活性剂包括具有亲水亲脂平衡值至少为16的乙氧基化烷醇，或具有亲水亲脂平衡值至少为16的乙氧基化烯醇或其混合物。

7、权利要求6的溶解剂组合物，其中非离子表面活性剂的浓度范围为0.5-3.0％w/v。

8、权利要求1的溶解剂组合物，其中还包含足以促进红血球碎片溶解量的聚氧乙烯和聚氧丙烯共聚物。

9、权利要求1的溶解剂组合物，其中所述生理盐分包括碱金属的氯化物，或硫酸的碱金属盐或其混合物。

10、权利要求9的溶解剂组合物，其中碱金属的氯化物的浓度为0.2％-1.3％w/v。

11、权利要求9的溶解剂组合物，其中硫酸的碱金属盐的浓度为0.4％-2.0％w/v。

12、一种溶解血样红血球和分析剩余白血球的方法，包括：

a)将血样暴露于溶解剂组合物一定时间，该时间足以溶解红血球，并在所述血样中分出至少一种白血球亚群，所述溶解剂组合物含有：

1)烷基硫酸的碱金属盐，其浓度为0.02％-0.16％w/v；

2)酸，足以将所述溶解剂组合物的pH值保持在1.4-3.4范围内；

3)促进嗜酸性细胞亚群选择皱缩的选自有机磷酸酯、有机磷酸酯的碱金属盐、乙氧基化磷酸酯、乙氧基化硫醇、乙氧基化羊毛醇、乙氧基化烷基苯酚、乙氧基化烷醇、乙氧基化烯醇及其混合物的嗜酸性细胞溶解剂，

4)保护嗜中性细胞不受溶解的非离子表面活性剂，和

5)足以将所述溶解剂组合物的重量克分子渗透压浓度调节在370-720mOsm之间的生理盐分，和

b)从嗜酸性细胞、淋巴细胞、单核细胞和嗜中性细胞中区别出至少一种白血球亚群，

c)报告所述区分的结果。

13、权利要求12的方法，其中足以溶解红血球并在所述血样中分出至少一种白血球亚群的时间为10-25秒钟。

14、权利要求12的方法，其中在室温下溶解红血球并在所述血样中分出至少一种白血球亚群。

15、权利要求14的方法，其中室温为15-30℃。

16、权利要求12的方法，其中所述白血球亚群为嗜酸性细胞亚群。

17、权利要求12的方法，其中所述白血球亚群为嗜中性细胞亚群。

18、权利要求12的方法，所述区分是通过使用至少两种类型选自传导率、放射频率和光散射的测量方式来进行的。

19、权利要求18的方法，其中所述区分是通过使用传导率和放射频率测量方式来进行的。

20、一种溶解血样红血球并分析剩余白血球亚群的方法，该方法包括：

a)用权利要求1-11任一项的溶解剂组合物处理第一个血液等分试样足够时间，以使红血球溶解，并且从所述血样中分出至少一种白血球亚群，

b)用第二种溶解剂系统处理所述血液的第二个等分试样，足以使得红血球溶解，并且从所述血样中分出四种白血球亚群，包括淋巴细胞、单核细胞、嗜碱粒细胞和嗜碱粒细胞以外的粒细胞，

c)使用传导率和放射频率测量方式分析所述处理血液的第一个等分试样，以获得至少一种白细胞亚群的检测，

d)使用传导率和放射频率测量方式分析所述处理血液的第二个等分试样，以获得包括淋巴细胞、单核细胞、嗜碱粒细胞和嗜碱粒细胞以外的其它粒细胞的四种白细胞亚群的检测，和

e)利用步骤c和d的结果报告至少五种白血球亚群。

21、权利要求20的方法，其中足以使得红血球溶解，并且从所述血样中分出至少一种白血球亚群的时间为10-25秒钟。

22、权利要求21的方法，其中足以使得红血球溶解，并且从所述血样中分出四种白血球亚群的时间为10秒钟。

23、权利要求20的方法，其中在室温下使得红血球溶解，并且从所述血样的第一和第二等分试样中分出白血球亚群。

24、权利要求23的方法，其中室温为15-30℃。

25、权利要求20的方法，其中所述使用传导率和放射频率测量分析所述处理血液的第一个等分试样是区分嗜酸性细胞亚群。

26、权利要求20的方法，其中所述使用传导率和放射频率测量分析所述处理血液的第二个等分试样是将白血球区分为包括淋巴细胞、单核细胞、嗜碱性细胞和除嗜碱性细胞之外的粒细胞的四种类型。

27、权利要求20的方法，其中第二种溶解剂系统含有：

a)包含下式所示的乙氧基化的长链胺化合物和将溶解试剂的PH调节在2.0-3.6范围之内的酸的溶解试剂：

其中R为具有12-22个碳原子的烷基、链烯基或炔基，m和n各为1或更大并且m+n在20和40之间；和

b)高渗碱性稳定剂组合物。

28、权利要求20的方法，其中第二种溶解剂系统包含：

a)溶解试剂，它含有下式所示的聚氧乙烯表面活性剂：

R₁-R₂-(CH₂CH₂O)_n-H其中R₁为具有10-22个碳原子的烷基，链烯基或炔基，R₂为-O-或-COO-，且n在20-35之间；和将溶解试剂的PH调节在2.0-4.0范围之内的酸；和

b)高渗碱性稳定剂组合物。

29、权利要求28的方法，其中第二种溶解剂系统还含有加入的十二烷基硫酸钠。