CN118851444A - 利用海洋生物被膜混合群落去除高盐废水中无机磷的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于微生物技术和环境保护技术领域，公开了利用海洋生物被膜混合群落去除高盐废水中无机磷的方法，采集海洋生物被膜样本并进行微生物培养；提取培养菌株的DNA进行PCR扩增和Sanger测序，确定分离物的分类；对各个菌株的基因组进行注释，以是否存在ppk1、ppk2和pap基因判断是否为聚磷菌；将具有除磷能力的细菌菌株接种培养并调整吸光值，得到海洋生物被膜混合群落；以海水盐浓度培养基（marine broth 2216E）对海洋生物被膜混合群落进行富集培养，以添加磷酸盐的2216E液体培养基对混合群落进行磷酸盐去除效率的测定。在初始磷浓度为26.5mg/L时，本发明在72h的除磷效率达到73.97%，为生物除磷提供新方向。
Description
技术领域
本发明属于微生物技术和环境保护技术领域，尤其涉及利用海洋生物被膜混合群落去除高盐废水中无机磷的方法。
背景技术
由于磷矿的不断采集以及磷相关产品的不断生产和利用，越来越多的磷被排放到环境水体中，导致水体中磷酸盐含量日益增高，致使水体富营养化，环境污染加重，污水处理难度变高。
目前的污水除磷方法主要为物理法，化学法和生物法。由于物理法和化学方法往往会产生大量沉淀，这些沉淀物很难回收和再利用，导致污染和回收成本升高，污水处理厂广泛采用生物方法，即主要依靠聚磷微生物进行污水中磷酸盐的去除。
污水处理厂主要依靠活性污泥中的聚磷微生物进行磷酸盐的富集与回收。但是，其中的细菌种类多样，作用复杂，且目前的有除磷能力的菌株没有获得纯培养，每个处理厂之间的发挥作用的微生物组成并不统一，无法进一步扩大应用。并且由于污水处理厂中的菌株依靠污泥及其中的细菌进行除磷，污泥的存在会使工艺流程变得复杂：即需要先对污泥进行沉淀才能回收磷酸盐，且由于污泥密度较大，更改氧气浓度较为困难。同时，由于污水处理厂的菌种来自活性污泥，而微生物活性在高盐浓度（>10‰）下减弱或丧失，导致污染物去除效率下降，面对一些高盐度的废水时需要先降低盐度再进行除磷，流程相对复杂，效率较慢，成本也相应提高。
通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：
（1）目前具有除磷能力的菌株没有获得纯培养，无法扩大应用。
（2）现有废水除磷方法流程相对复杂，对装置和条件要求较高。
（3）目前的除磷微生物来自污泥，在应对高盐污水时，除磷效率较低。
发明内容
为克服相关技术中存在的问题，本发明公开实施例提供了利用海洋生物被膜混合群落去除高盐废水中无机磷的方法，可以不依赖复杂装置进行高盐废水中无机磷的去除，所述技术方案如下：
本发明是这样实现的，利用海洋生物被膜混合群落去除高盐废水中无机磷的方法，包括：
S1，采集用于细菌分离的海洋生物被膜样本并进行微生物培养；提取培养菌株的DNA进行PCR扩增16SrRNA基因和Sanger测序，确定分离物的分类；
S2，对各个菌株的基因组进行提取，组装、比对、预测开放阅读框以及进行功能基因注释，以是否存在ppk1、ppk2和pap基因为目标，判断是否为聚磷菌，确定具有除磷能力的菌株；
S3，分别制备富集培养基和磷酸盐去除培养基，将筛选得到的具有除磷能力的细菌菌株接种培养，测定生长阶段，按比例混合菌液得到海洋生物被膜混合群落；
S4，以2216E液体培养基对海洋生物被膜混合群落进行富集培养，添加磷酸盐的2216E液体培养基对混合群落进行磷酸盐去除效率的测定。
在步骤S1中，采集用于细菌分离的海洋生物被膜样本并进行微生物培养，包括：
利用无菌棉签采集位于潮下带1-2米深的岩石表面天然生物被膜，利用经0.1μm滤膜过滤和高压灭菌后的海水冲洗棉签，并分别稀释10倍和100倍；
取生物被膜样本100μL涂布在海洋琼脂培养基2216平板后在25℃、有光有氧条件下进行微生物培养；在解剖显微镜下检查菌落形态特征，分离明显的菌落类型；
在100℃下加热5min提取细胞中的DNA；使用通用引物27F（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'）和1492R（5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'）进行PCR扩增16SrRNA基因；然后进行 Sanger测序，以确定分离物的分类。
在步骤S2中，对各个菌株的基因组进行提取，组装、比对、预测开放阅读框以及进行功能基因注释，包括：
基因组测序前，使用TIANamp基因组DNA试剂盒提取培养菌株的DNA，溶菌酶的最终浓度为10mg/mL，在37℃温育30min；按照试剂盒提供的方法加入裂解缓冲液GA和缓冲液GB、GD和GW；在Mini-Sub Cell GT系统中通过琼脂糖凝胶电泳检测DNA的完整性；对于每个细菌菌株，采用NovaSeq 6000系统进行Illumina测序。
使用SPAdes中的spades.py对返回的纯净读数进行基因组组装，以CheckM中的Lineage_wf评估基因组的完整性和潜在污染，基因组污染<5%且完整性大于90%的基因组被视为高质量基因组，并用于进一步分析；
再使用fastANI进行全基因组比较后，去除了冗余基因组，保留了平均核苷酸同一性ANI小于99.9%的基因组，开放阅读框ORFs采用Prodigal在单基因组分析模式下进行预测，进行闭合终止的ORF预测；
为了进行功能基因注释，使用DIAMOND和BLASTP将与ORFs对应的蛋白质序列在京都基因与基因组百科全书KEGG数据库中进行搜索，E值设为<1e-7；基于与磷酸盐代谢相关的基因，包括phoU（K02039）、pstSCAB（K02036、K02037、K02038和K02040）、pgk（K00927）、ppx（K01524）、ppk1（K00937）、ppk2（K22468）、phoB（K07657）、ppnK（K00858）和pit（K03306）初步判断菌株是否具有除磷能力；将筛选到的细菌培养至对数期，之后加入保种液置于-80℃冰箱保存；保种液为甘油和无菌水按1:1混合后灭菌得到。
在步骤S3中，确定具有除磷能力的菌株包括：Psychrobacter nivimaris，Psychrobacter marincola，Psychrobacter namhaensis，Psychrobacter halodurans，Psychrobacter fulvigenes，Psychrobacter celer，Psychrobacter maritimus，Psychrobacter faecalis，Roseibium aggregatum，Stappia taiwanensis。
富集培养基以2216E液体培养基加无菌水配置2216E液体培养基，该培养基成分包括：蛋白胨5.0g，酵母浸粉1.0g，柠檬酸铁0.1g，氯化钠19.45g，氯化镁5.98g，硫酸钠3.24g，氯化钙8g，氯化钾0.55g，碳酸钠0.16g，溴化钾0.08g，氯化锶0.034g，硼酸0.022g，硅酸钠0.004g，氟化钠0.0024g，硝酸铵0.0016g，磷酸氢二钠0.008g。
磷酸盐去除培养基：将2216E液体培养基灭菌后，加入已灭菌的2g/L-P磷酸氢二钠母液，使磷浓度为26.5mg/L，以1mol/L的NaOH和HCl调节pH在7.6±0.2；之后按比例混合菌液得到海洋生物被膜混合群落。
将筛选到的且已保种的具有除磷能力的12株细菌按1%的接种量接种至含2216E液体培养基的EP管中，在25℃恒温摇床以180rpm有光有氧条件下培养2-3天；待所有菌株的菌液长至对数期，吸取每个菌株的菌液，用Thermo scientific multiskan FC酶标仪在600nm波长下测定每个菌株菌液的吸光值；根据各个菌株菌液的吸光值，以纯净的已灭菌的2216E液体培养基作为调整液，以稀释或离心重悬的方法调整每个菌株菌液的吸光值，使12株菌菌液吸光值统一在0.2；将12株菌按相同的量混合并加入和菌液相等量的保种液，分装保种好的混合菌群置于-80℃冰箱保存；保种液为甘油和无菌水按1:1混合后灭菌得到
以2216E液体培养基对海洋生物被膜混合群落进行富集培养，具体为：将冰箱中保存的混合群落的菌液按1%的比例接种至含2216E液体培养基的EP管中活化培养2-3天；取EP管中的菌液按1%的比例接种至含2216E液体培养基的锥形瓶中，在25℃恒温摇床以180rpm有光有氧条件培养3天；取锥形瓶内的菌液按1%接种量接种至每孔含2216E液体培养基的六孔板中静置培养16-18h成膜。
还包括用移液管吸出六孔板中含有浮游细菌的培养上清液，然后加入8ml 2216E液体培养基，使用钼锑比色法每12小时测定一次培养基中的磷浓度
结合上述的所有技术方案，本发明所具备的有益效果为：本发明筛选并培养了由12株细菌组成的细菌群落，将12株菌与NCBI数据库比对，分别是Psychrobacter nivimaris，Psychrobacter marincola，Psychrobacter namhaensis，Psychrobacter halodurans，Psychrobacter fulvigenes，Psychrobacter celer，Psychrobacter maritimus，Psychrobacter faecalis，Roseibium aggregatum，Stappia taiwanensis。在初始磷浓度为26.5mg/L时，本发明的72h的除磷效率高达73.97%，为生物除磷提供了一种新方向。
本发明筛选并混合了来自海洋生物被膜的12株纯培养细菌，此群落在正常实验室环境未经调整氧气浓度下下即可发挥较高除磷能力；培养群落的富集培养基和磷酸盐去除培养基均与海水盐度（30‰）相同，可以处理高盐度废水；且所用碳源较易获得（蛋白胨，酵母粉等中的，较污水处理厂需提供特定的醋酸盐而言，较易获得的，更经济的碳源）、菌群也倾向于形成生物膜方便磷回收，为废水除磷提供了一种新思路。
本发明利用海洋生物被膜混合群落去除高盐废水中无机磷的方法，构建了一个由12株细菌构成的高效除磷群落，可以对高盐废水中的磷进行去除。本发明拓宽了废水除磷的选择，有助于废水除磷的扩大应用，为去除废水中多余的磷酸盐并回收利用提供了有益信息。
本发明在高盐度的培养基中与已经商业化的除磷菌剂相比，具有更快的除磷速度和更强的除磷能力，有望开发出针对高盐废水的具有更高效率的除磷菌剂。本发明的除磷群落可以在高盐条件下去除磷酸盐，解决了目前污水处理的难点：即面对盐度较高的废水时，活性污泥菌株除磷效率下降，导致高盐废水难以去除磷酸盐。
附图说明
此处的附图被并入说明书中并构成本说明书的一部分，示出了符合本公开的实施例，并与说明书一起用于解释本公开的原理；
图1是本发明实施例提供的利用海洋生物被膜混合群落去除高盐废水中无机磷的方法流程图；
图2是本发明实施例提供的群落除磷效率示意图；
图3是本发明实施例提供的群落除磷效率与在售除磷菌剂的对比图。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图对本发明的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。但是本发明能够以很多不同于在此描述的其他方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进，因此本发明不受下面公开的具体实施的限制。
本发明的创新点在于：本发明的12株细菌均来自海洋生物被膜，且由它们混合为细菌群落，以有无ppk2和pap基因判断是否为聚磷菌，为核心创新点，使得除磷群落在较高盐度下有较强的除磷能力，较单个细菌而言有更强的稳定性，可适用于多种环境，且有基因组信息支持，可以进一步扩大应用或进行菌株改造以进一步提高除磷效率和拓宽应用场景；以2216E液体培养基为富集培养基及用2216E液体培养基加磷酸氢二钠作为磷酸盐去除培养基；混菌时以OD600 0.2为标准；菌群在接种至磷酸盐去除培养基前先在6孔板里经过16-18h的成膜；以无机磷酸盐检测试剂盒（磷钼酸法）测定培养基中磷酸盐浓度变化。
实施例，如图1所示，本发明实施例提供的利用海洋生物被膜混合群落去除高盐废水中无机磷的方法的包括以下步骤：
S1，采集用于细菌分离的海洋生物被膜样本并进行微生物培养；提取培养菌株的DNA进行PCR扩增16SrRNA基因和Sanger测序，确定分离物的分类；
S2，对各个菌株的基因组进行提取，组装、比对、预测开放阅读框以及进行功能基因注释，以是否存在ppk1、ppk2和pap基因判断是否为聚磷菌，确定具有除磷能力的菌株；
S3，分别制备富集培养基和磷酸盐去除培养基，将筛选得到的具有除磷能力的细菌菌株接种培养，测定生长阶段，按比例混合菌液得到海洋生物被膜混合群落；
S4，以2216E液体培养基对海洋生物被膜混合群落进行富集培养，以添加磷酸盐的2216E液体培养基对混合群落进行磷酸盐去除效率的测定。
本发明实施例提供的生物被膜采样和细菌分离包括：利用无菌棉签采集位于潮下带1-2米深的岩石表面天然生物被膜，利用经0.1μm滤膜过滤和高压灭菌后的海水冲洗棉签，并分别稀释10倍和100倍；取生物被膜样本涂布在海洋琼脂培养基2216平板后在25℃、有光有氧条件下进行微生物培养；在解剖显微镜下检查菌落形态特征，分离明显的菌落类型；在100℃下加热5min提取细胞中的DNA；使用通用引物27F（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'）和1492R（5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'）进行PCR扩增16SrRNA基因，然后在中国北京基因组研究所进行Sanger测序，以确定分离物的分类。分离海洋中的细菌有利于使最终得到的除磷菌株对盐度有较高的耐受性，分离可培养细菌有利于区分各个细菌的功能，有利于进一步的扩大应用，以及深入分析和菌株改造以获得更高效率的除磷菌株。
本发明实施例提供的基因组提取及分析包括：基因组测序前，使用TIANamp基因组DNA试剂盒提取培养菌株的DNA，溶菌酶的最终浓度为10mg/mL，在37℃温育30min；按照试剂盒提供的方法加入裂解缓冲液GA和缓冲液GB、GD和GW；在Mini-Sub Cell GT系统中通过琼脂糖凝胶电泳检测DNA的完整性；对于每个细菌菌株，采用NovaSeq 6000系统进行Illumina测序。使用SPAdes（v3.13.0）中的spades.py对返回的纯净读数进行基因组组装。以CheckM（v1.1.2）中的Lineage_wf评估基因组的完整性和潜在污染。基因组污染<5%且完整性大于90%的基因组被视为高质量基因组，并用于进一步分析。在使用fastANI进行全基因组比较后，去除了冗余基因组，保留了平均核苷酸同一性（ANI）小于99.9%的基因组。开放阅读框（ORFs）采用Prodigal（v2.60）在单基因组分析模式下进行预测，进行闭合终止的ORF预测。为了进行功能基因注释，使用DIAMOND和BLASTP将与ORFs对应的蛋白质序列在京都基因与基因组百科全书（KEGG）数据库（v2022）中进行搜索，E值设<1e-7。基于与磷酸盐代谢相关的基因，包括phoU（K02039）、pstSCAB（K02036、K02037、K02038和K02040）、pgk（K00927）、ppx（K01524）、ppk1（K00937）、ppk2（K22468）、phoB（K07657）、ppnK（K00858）和pit（K03306）初步判断菌株是否具有除磷能力。将筛选到的细菌培养至对数期，之后加入保种液置于-80℃冰箱保存；保种液为甘油和无菌水按1:1混合后灭菌得到。测定细菌的基因组有利于对细菌的基因进行挖掘，通过功能基因的有无可以推断细菌的某些代谢功能，有利于在基因组水平上筛选除磷菌株，且能为具有除磷能力的菌株提供基因水平上的证据，且定位到功能基因时，有利于菌株在基因组水平上的改造，从而提高除磷效率。以除磷相关基因筛选除磷菌株，较传统平板划线筛选方法，工作量更低，效率更高，且可以定位到发挥作用的功能基因，对筛选到的除磷菌株有更为清晰的除磷原理认识。
本发明实施例提供的具有除磷能力的菌株包括：Psychrobacter nivimaris，Psychrobacter marincola，Psychrobacter namhaensis，Psychrobacter halodurans，Psychrobacter fulvigenes，Psychrobacter celer，Psychrobacter maritimus，Psychrobacter faecalis，Roseibium aggregatum，Stappia taiwanensis。
本发明实施例提供的富集培养基是以2216E液体培养基加无菌水配置2216E液体培养基，该培养基成分包括：蛋白胨5.0g，酵母浸粉1.0g，柠檬酸铁0.1g，氯化钠19.45g，氯化镁5.98g，硫酸钠3.24g，氯化钙8g，氯化钾0.55g，碳酸钠0.16g，溴化钾0.08g，氯化锶0.034g，硼酸0.022g，硅酸钠0.004g，氟化钠0.0024g，硝酸铵0.0016g，磷酸氢二钠0.008g；
磷酸盐去除培养基是将2216E液体培养基灭菌后，加入已灭菌的2g/L-P磷酸氢二钠母液，使磷浓度为26.5mg/L，以1mol/L的NaOH和HCl调节pH在7.6±0.2。
本发明实施例提供的菌群混合包括：将已保种的具有除磷能力的12株细菌按1%的接种量接种至含2216E液体培养基的EP管中，在25℃恒温摇床以180rpm有光有氧条件下培养2-3天；待所有菌株的菌液长至指数期，吸取每个菌株的菌液，用Thermo scientificmultiskan FC酶标仪在600nm波长下测定每个菌株菌液的吸光值；根据各个菌株菌液的吸光值，以纯净的已灭菌的2216E液体培养基作为调整液，以稀释或离心重悬的方法调整每个菌株菌液的吸光值，使12株菌菌液吸光值统一在0.2；将12株菌按相同的量混合并加入和菌液相等量的保种液，分装保种好的混合菌群置于-80℃冰箱保存；保种液为甘油和无菌水按1:1混合后灭菌得到。
本发明实施例提供的混合群落的富集培养包括：将冰箱中保存的混合群落的菌液按1%的比例接种至含2216E液体培养基的EP管中活化培养2-3天；取EP管中的菌液按1%的比例接种至含2216E液体培养基的锥形瓶中，在25℃恒温摇床以180rpm有光有氧条件培养3天；取锥形瓶内的菌液按1%接种量接种至每孔含2216E液体培养基的六孔板中静置培养16-18h成膜。用移液管小心吸出六孔板中含有浮游细菌的培养上清液，然后加入8ml 2216E液体培养基。使用钼锑比色法每12小时测定一次培养基中的磷浓度。将筛选验证具有除磷功能的菌株混合成群落，比单个除磷菌株更为稳定，更适合应用于多种环境，不易丢失除磷功能，且混合群落有较强的成膜能力，可以更牢固的附着在固体载体上，使生物吸附得到的磷更为集中，有利于磷酸盐的富集和回收。
在上述实施例中，对各个实施例的描述都各有侧重，某个实施例中没有详述或记载的部分，可以参见其它实施例的相关描述。
为进一步证明上述实施例的积极效果，本发明基于上述技术方案进行如下实验。
一、生物被膜采样和细菌分离：
用于细菌分离的生物被膜于2019年3月在中国青岛沿海地区（36.05，120.43）采集。用无菌棉签刮下位于潮下带1-2米深的岩石表面天然生物被膜，并立即转移到实验室。用10mL经0.1μm滤膜过滤和高压灭菌后的海水彻底冲洗棉签，然后分别稀释10倍和100倍。每个生物被膜样本取100µL涂布在海洋琼脂培养基2216平板（海博生物）上。随后在25℃、有光有氧条件下进行微生物培养。在解剖显微镜下检查菌落的形态特征，包括大小、颜色、形状和表面形貌，分离出明显的菌落类型。在100℃下加热5min提取细胞中的DNA；使用通用引物27F（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'）和1492R（5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'）进行PCR扩增16SrRNA基因，然后在中国北京基因组研究所进行Sanger测序，以确定分离物的分类。本发明用到的菌株及其16SrRNA基因与NCBI数据库比对的结果：
H023，16s-NCBI比对结果：Psychrobacter nivimaris，16SrRNA序列：ATAGCACGGGGAAACTCGTATTAATACCGCATACGACCTACGGGAGAAAGGGGGCAGTTTACTGCTCTCGCTATTAGATGAGCCTAAGTCGGATTAGCTAGATGGTGGGGTAAAGGCCTACCATGGCGACGATCTGTAGCTGGTCTGAGAGGATGATCAGCCACACCGGGACTGAGACACGGCCCGGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACAATGGGGGAAACCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGCCTTTTGGTTGTAAAGCACTTTAAGCAGTGAAGAAGACTCTTCGGTTAATACCCGGAGACGATGACATTAGCTGCAGAATAAGCACCGGCTAACTCTGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACAGAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGAGCGTAGGTGGCTTGATAAGTCAGATGTGAAATCCCCGGGCTTAACCTGGGAACTGCATCTGAAACTGTTAGGCTAGAGTAGGTGAGAGGGAAGTAGAATTTCAGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATCTGAAGGAATACCGATGGCGAAGGCAGCTTCCTGGCATCATACTGACACTGAGGCTCGAAAGCGTGGGTAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGTCTACTAGTCGTTGGGTCCCTTGAGGACTTAGTGACGCAGCTAACGCAATAAGTAGACCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTGGTCTTGACATATCTAGAATCCTGCAGAGATGCGGGAGTGCCTTCGGGAATTAGAATACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTCCTTAGTTACCAGCGGGTTAAGCCGGGAACTCTAAGGATACTGCCAGTGACAAACTGGAGGAAGGCGGGGACGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGACCAGGGCTACACACGTGCTACAATGGTAGGTACAGAGGGCAGCTACACAGCGATGTGATGCGAATCTCAAAAAGCCTATCGTAGTCCAGATTGGAGTCTGCAACTCGACTCCATGAAGTAGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGAATGCCGCGGTGAA，
L010，16s-NCBI比对结果：Psychrobacter marincola，16SrRNA序列：AGTGGGGGATAGCTCGGGGAAACTCGAATTAATACCGCATACGTCCTACGGGAGAAAGGGGGCAACTTGTTGCTCTCGCTATTAGATGAGCCTAAGTCGGATTAGCTAGTTGGTGGGGTAAAGGCCTACCAAGGCGACGATCTGTAGCTGGTCTGAGAGGATGATCAGCCACACCGGGACTGAGACACGGCCCGGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACAATGGGGGAAACCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGCCTTTTGGTTGTAAAGCACTTTAAGCAGTGAAGAAGACCTAACGGTTAATACCCGTTAGCGATGACATTAGCTGCAGAATAAGCACCGGCTAACTCTGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACAGAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGAGCGTAGGTGGCTTGATAAGTCAGATGTGAAATCCCCGGGCTTAACCTGGGAACTGCATCTGATACTGTCAGGCTAGAATAGGTGAGAGGAAGGTAGAATTCCAGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATCTGGAGGAATACCGATGGCGAAGGCAGCCTTCTGGCATCATATTGACACTGAGGTTCGAAAGCGTGGGTAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGTCTACTAGTCGTTGGGTCCCTTGAGGACTTAGTGACGCAGCTAACGCAATAAGTAGACCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTGGTCTTGACATATCTAGAATCCTGCAGAGATGCGGGAGTGCCTTCGGGAATTAGAATACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTCCTTAGTTACCAGCGGGTTAAGCCGGGAACTCTAAGGATACTGCCAGTGACAAACTGGAGGAAGGCGGGGACGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGACCAGGGCTACACACGTGCTACAATGGTAGGTACAGAGGGCAGCTACACAGCGATGTGATGCGAATCTTTCAAAGCCTATCGTAGTCCAGATTGGAGTCTGCAACTCGACTCCATGAAGTAGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGAATGCCGCGGTGAAT；
L022，16s-NCBI比对结果：Psychrobacter namhaensis，16SrRNA序列：GCTCGGGGAAACTCGAATTAATACCGCATACGACCTACGGGAGAAAGGGGGCAGTTTACTGCTCTCGCTATTAGATGAGCCTAAGTCGGATTAGCTAGATGGTGGGGTAAAGGCCTACCATGGCGACGATCTGTAGCTGGTCTGAGAGGATGATCAGCCACACCGGGACTGAGACACGGCCCGGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACAATGGGGGAAACCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGCCTTTTGGTTGTAAAGCACTTTAAGCAGTGAAGAAGACCATATGGTTAATACCCATATGCGATGACATTAGCTGCAGAATAAGCACCGGCTAACTCTGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACAGAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGAGCGTAGGTGGCTTGATAAGTCAGATGTGAAATCCCCGGGCTTAACCTGGGAACTGCATCTGATACTGTTAAGCTAGAGTAGGTGAGAGGGAAGTAGAATTCCAGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATCTGGAGGAATACCGATGGCGAAGGCAGCTTCCTGGCATCATACTGACACTGAGGCTCGAAAGCGTGGGTAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGTCTACTAGTCGTTGGGTCCCTTGAGGACTTAGTGACGCAGCTAACGCAATAAGTAGACCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTGGTCTTGACATATCTAGAATCCTGCAGAGATGCGGGAGTGCCTTCGGGAATTAGAATACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTCCTTAGTTACCAGCGGGTTAAGCCGGGAACTCTAAGGATACTGCCAGTGACAAACTGGAGGAAGGCGGGGACGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGACCAGGGCTACACACGTGCTACAATGGTAGGTACAGAGGGCAGCTACACAGCGATGTGATGCGAATCTCAAAAAGCCTATCGTAGTCCAGATTGGAGTCTGCAACTCGACTCCATGAAGTAGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGAATGCCGCGGTGAATA，
L037，16s-NCBI比对结果：Psychrobacter halodurans，16SrRNA序列：CGGGGAAACTCGAATTAATACCGCATACGACCTACGGGAGAAAGGGGGCAGTTTACTGCTCTCGCTATTAGATGAGCCTAAGTCGGATTAGCTAGATGGTGGGGTAAAGGCCCACCATGGCGACGATCTGTAGCTGGTCTGAGAGGATGATCAGCCACACCGGGACTGAGACACGGCCCGGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACAATGGGGGCAACCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGCCTTTTGGTTGTAAAGCACTTTAAGCAGTGAAGAAGACCTAATGGTTAATACCCATTAGCGATGACATTAGCTGCAGAATAAGCACCGGCTAACTCTGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACAGAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGAGCGTAGGTGGCTTGATAAGTCAGATGTGAAATCCCCGGGCTTAACCTGGGAACTGCATCTGATACTGTTAAGCTAGAGTAGGTGAGAGGGAAGTAGAATTTCAGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATCTGAAGGAATACCGATGGCGAAGGCAGCTTCCTGGCATCATACTGACACTGAGGCTCGAAAGCGTGGGTAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGTCTACTAGTCGTTGGGTCCCTTGAGGACTTAGTGACGCAGCTAACGCAATAAGTAGACCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTGGTCTTGACATATCTAGAATCCTGCAGAGATGCGGGAGTGCCTTCGGGAATTAGAATACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTTTCCTTAGTTACCAGCGGTTTGGCCGGGAACTCTAAGGATACTGCCAGTGACAAACTGGAGGAAGGCGGGGACGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGACCAGGGCTACACACGTGCTACAATGGTAGGTACAGAGGGCAGCTACACAGCGATGTGATGCGAATCTCAAAAAGCCTATCGTAGTCCAGATTGGAGTCTGCAACTCGACTCCATGAAGTAGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGAATGCCGCGGTGAAT，
S259，16s-NCBI比对结果：Psychrobacter fulvigenes，16SrRNA序列：CTCGGGGAAACTCGAATTAATACCGCATACGACCTACGGGAGAAAGGGGGCAGTTTACTGCTCTCGCTATTAGATGGGCCTAAGTCGGATTAGCTAGATGGTGGGGTAAAGGCCTACCATGGCGACGATCTGTAGCTGGTCTGAGAGGATGATCAGCCACACCGGGACTGAGACACGGCCCGGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACAATGGGGGCAACCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGCCTTTTGGTTGTAAAGCACTTTAAGCAGTGAAGAAGACCATATGGCTAATACCCATATGCGATGACATTAGCTGCAGAATAAGCACCGGCTAACTCTGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACAGAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGAGCGTAGGTGGCTTGATAAGTCAGATGTGAAATCCCCGGGCTTAACCTGGGAACTGCATCTGATACTGTTAAGCTAGAGTAGGTGAGAGGGAAGTAGAATTCCAGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATCTGGAGGAATACCGATGGCGAAGGCAGCTTCCTGGCATCATACTGACACTGAGGCTCGAAAGCGTGGGTAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGTCTACTAGTCGTTGGGTCCCTTGAGGACTTAGTGACGCAGCTAACGCAATAAGTAGACCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTGGTCTTGACATATCTAGAATCCTGCAGAGATGCGGGAGTGCCTTCGGGAATTAGAATACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTCCTTAGTTACCAGCGGGTTAAGCCGGGAACTCTAAGGATACTGCCAGTGACAAACTGGAGGAAGGCGGGGACGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGACCAGGGCTACACACGTGCTACAATGGTAGGTACAGAGGGCAGCTACACAGCGATGTGATGCGAATCTCAAAAAGCCTATCGTAGTCCAGATTGGAGTCTGCAACTCGACTCCATGAAGTAGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGAATGCCGCGGTGA，
S270，16s-NCBI比对结果：Psychrobacter namhaensis，16SrRNA序列：AGTAGTGGGGGATAGCTCGGGGAAACTCGAATTAATACCGCATACGACCTACGGGAGAAAGGGGGCAGTTTACTGCTCTCGCTATTAGATGAGCCTAAGTCGGATTAGCTAGATGGTGGGGTAAAGGCCTACCATGGCGACGATCTGTAGCTGGTCTGAGAGGATGATCAGCCACACCGGGACTGAGACACGGCCCGGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACAATGGGGGCAACCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGCCTTTTGGTTGTAAAGCACTTTAAGCAGTGAAGAAGACCATGTGGTTAATACCCATATGCGATGACATTAGCTGCAGAATAAGCACCGGCTAACTCTGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACAGAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGAGCGTAGGTGGCTTGATAAGTCAGATGTGAAATCCCCGGGCTTAACCTGGGAACTGCATCTGATACTGTTAAGCTAGAGTAGGTGAGAGGGAAGTAGAATTCCAGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATCTGGAGGAATACCGATGGCGAAGGCAGCTTCCTGGCATCATACTGACACTGAGGCTCGAAAGCGTGGGTAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGTCTACTAGTCGTTGGGTCCCTTGAGGACTTAGTGACGCAGCTAACGCAATAAGTAGACCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTGGTCTTGACATATCTAGAATCCTGCAGAGATGCGGGAGTGCCTTCGGGAATTAGAATACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTCCTTAGTTACCAGCGGGTTAAGCCGGGAACTCTAAGGATACTGCCAGTGACAAACTGGAGGAAGGCGGGGACGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGACCAGGGCTACACACGTGCTACAATGGTAGGTACAGAGGGCAGCTACACAGCGATGTGATGCGAATCTCAAAAAGCCTATCGTAGTCCAGATTGGAGTCTGCAACTCGACTCCATGAAGTAGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGAATGCCGCGGTGAATACGTTC，
S279，16s-NCBI比对结果：Psychrobacter celer，16SrRNA序列：AGTGGGGGATAGCTCGGGGAAACTCGAATTAATACCGCATACGACCTACGGGAGAAAGGGGGCAGTTTACTGCTCTCGCTATTAGATGAGCCTAAGTCGGATTAGCTAGATGGTGGGGTAAAGGCCTACCATGGCGACGATCTGTAGCTGGTCTGAGAGGATGATCAGCCACACCGGGACTGAGACACGGCCCGGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACAATGGGGGCAACCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGCCTTTTGGTTGTAAAGCACTTTAAGCAGTGAAGAAGACCTAACGATTAATACCCGTTAGCGATGACATTAGCTGCAGAATAAGCACCGGCTAACTCTGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACAGAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGAGCGTAGGTGGCTTGATAAGTCAGATGTGAAATCCCCGGGCTTAACCTGGGAACTGCATCTGATACTGTTAAGCTAGAGTAGGTGAGAGGGAAGTAGAATTCCAGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATCTGGAGGAATACCGATGGCGAAGGCAGCTTCCTGGCATCATACTGACACTGAGGCTCGAAAGCGTGGGTAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGTCTACTAGTCGTTGGGTCCCTTGAGGACTTAGTGACGCAGCTAACGCAATAAGTAGACCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTGGTCTTGACATATCTAGAATCCTGCAGAGATGCGGGAGTGCCTTCGGGAATTAGAATACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTCCTTAGTTACCAGCGGGTTAAGCCGGGAACTCTAAGGATACTGCCAGTGACAAACTGGAGGAAGGCGGGGACGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGACCAGGGCTACACACGTGCTACAATGGTAGGTACAGAGGGCAGCTACACAGCGATGTGATGCGAATCTCAAAAAGCCTATCGTAGTCCAGATTGGAGTCTGCAACTCGACTCCATGAAGTAGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGAATGCCGCGGTGAATACG，S308，16s-NCBI比对结果：Psychrobacter faecalis，16SrRNA序列：GTAGTGGGGGATAGCTCGGGGAAACTCGAATTAATACCGCATACGACCTACGGGAGAAAGGGGGCAACTTGTTGCTCTCGCTATTAGATGAGCCTAAGTCGGATTAGCTAGATGGTGGGGTAAAGGCCTACCATGGCGACGATCTGTAGCTGGTCTGAGAGGATGATCAGCCACACCGGGACTGAGACACGGCCCGGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACAATGGGGGCAACCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGCCTTTTGGTTGTAAAGCACTTTAAGCAGTGAAGAAGACTCTATGGTTAATACCCATGGGCGATGACATTAGCTGCAGAATAAGCACCGGCTAACTCTGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACAGAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGAGCGTAGGTGGCTTGATAAGTCAGATGTGAAATCCCCGGGCTTAACCTGGGAACTGCATCTGATACTGTTAAGCTAGAATAGGTGAGAGGAAGGTAGAATTCCAGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATCTGGAGGAATACCGATGGCGAAGGCAGCCTCCTGGCATCATACTGACACTGAGGCTCGAAAGCGTGGGTAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGTCTACTAGTCGTTGGGGCACCTTGATTGACTTAGTGACGCAGCTAACGCAATAAGTAGACCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTTGACGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGATGCA，
S310，16s-NCBI比对结果：Psychrobacter celer，16SrRNA序列：TAGTAGTGGGGGATAGCTCGGGGAAACTCGAATTAATACCGCATACGACCTACGGGAGAAAGGGGGCAGTTTACTGCTCTCGCTATTAGATGAGCCTAAGTCGGATTAGCTAGATGGTGGGGTAAAGGCCTACCATGGCGACGATCTGTAGCTGGTCTGAGAGGATGATCAGCCACACCGGGACTGAGACACGGCCCGGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACAATGGGGGGAACCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGCCTTTTGGTTGTAAAGCACTTTAAGCAGTGAAGAAGACCTAACGGTTAATACCCGTTAGCGATGACATTAGCTGCAGAATAAGCACCGGCTAACTCTGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACAGAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGAGCGTAGGTGGCTTGATAAGTCAGATGTGAAATCCCCGGGCTTAACCTGGGAACTGCATCTGATACTGTTAAGCTAGAGTAGGTGAGAGGGAAGTAGAATTCCAGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATCTGGAGGAATACCGATGGCGAAGGCAGCTTCCTGGCATCATACTGACACTGAGGCTCGAAAGCGTGGGTAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGTCTACTAGTCGTTGGGTCCCTTGAGGACTTAGTGACGCAGCTAACGCAATAAGTAGACCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTGGTCTTGACATACACAGAATCTTGTAGAGATACGAGAGTGCCTTCGGGAATTGTGATACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTCCTTAGTTACCAGCGGGTTAAGCCGGGAACTCTAAGGATACTGCCAGTGACAAACTGGAGGAAGGCGGGGACGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGACCAGGGCTACACACGTGCTACAATGGTAGGTACAGAGGGCAGCTACACAGCGATGTGATGCGAATCTCAAAAAGCCTATCGTAGTCCAGATTGGAGTCTGCAACTCGACTCCATGAAGTAGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGAATGCCGCGGTGAAT，S344，16s-NCBI比对结果：Psychrobacter maritimus，16SrRNA序列：CCTAGTAGTGGGGGATAGCTCGGGGAAACTCGAATTAATACCGCATACGACCTACGGGAGAAAGGGGGCAACTTGTTGCTCTCGCTATTAGATGAGCCTAAGTCGGATTAGCTAGATGGTGGGGTAAAGGCCTACCATGGCGACGATCTGTAGCTGGTCTGAGAGGATGATCAGCCACACCGGGACTGAGACACGGCCCGGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACAATGGGGGCAACCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGCCTTTTGGTTGTAAAGCACTTTAAGCAGTGAAGAAGACTCCATGGTTAATACCCATGGACGATGACATTAGCTGCAGAATAAGCACCGGCTAACTCTGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACAGAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGAGCGTAGGTGGCTTGATAAGTCAGATGTGAAATCCCCGGGCTTAACCTGGGAACTGCATCTGATACTGTTAGGCTAGAATAGGTGAGAGGAAGGTAGAATTCCAGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATCTGGAGGAATACCGATGGCGAAGGCAGCCTTCTGGCATCATATTGACACTGAGGTTCGAAAGCGTGGGTAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGTCTACTAGTCGTTGGGTCCCTTGAGGACTTAGTGACGCAGCTAACGCAATAAGTAGACCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTGGTCTTGACATATCTAGAATCCTGCAGAGATGCGGGAGTGCCTTCGGGAATTAGAATACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTCCTTAGTTACCAGCGGGTTAAGCCGGGAACTCTAAGGATACTGCCAGTGACAAACTGGAGGAAGGCGGGGACGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGACCAGGGCTACACACGTGCTACAATGGTAGGTACAGAGGGCAGCTACACAGCGATGTGATGCGAATCTCAAAAAGCCTATCGTAGTCCAGATTGGAGTCTGCAACTCGACTCCATGAAGTAGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGAATGCCGCGGTGAATA，
S419，16s-NCBI比对结果：Roseibium aggregatum，16SrRNA序列：ACAACAGTTGGAAACGACTGCTAATACCGTATGTGCCCTATGGGGGAAAGATTTATCGCCTAAGGATGGGCCCGCGTTGGATTAGCTAGTTGGTGGGGTAAAGGCCTACCAAGGCGACGATCCATAGCTGGTCTGAGAGGATGATCAGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACAATGGGCGCAAGCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGAGTGATGAAGGCCCTAGGGTTGTAAAGCTCTTTCAGCGAGGAGGATAATGACGTTACTCGCAGAAGAAGCCCCGGCTAACTTCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGAAGGGGGCTAGCGTTGTTCGGAATCACTGGGCGTAAAGCGCACGTAGGCGGACTTTTAAGTCAGGGGTGAAATCCCGGGGCTCAACCCCGGAACTGCCTTTGATACTGGAAGTCTTGAGTCCGAGAGAGGTGAGTGGAACTCCGAGTGTAGAGGTGAAATTCGTAGATATTCGGAAGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTCACTGGCTCGGTACTGACGCTGAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGGAAGCTAGCCGTCAGGTAGCATGCTATTTGGTGGCGCAGCTAACGCATTAAGCTTCCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGATTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGCAGAACCTTACCAGCCCTTGACATTTGGTGCTACTTCCAGAGATGGAAGGTTCCCTTCGGGGACGCCAGGACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTCGCCCTTAGTTGCCAGCATTCAGTTGGGCACTCTAGGGGGACTGCCGGTGATAAGCCGAGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCCTCATGGCCCTTACGGGCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGCGGTGACAGTGGGCAGCGAACTCGCGAGAGGGAGCTAATCTCCAAAAGCCGTCTCAGTTCGGATTGTTCTCTGCAACTCGAGAGCATGAAGTTGGAATCGCTAGTAATCGCGTAACAGCATGACGCGGTGAATACGTT，
Z008，16s-NCBI比对结果：Stappia taiwanensis，16SrRNA序列：AACAGTTGGAAACGACTGCTAATACCGTATACGCCCTATTGGGGAAAGATTTATTGCCGAGAGATGGGCCCGCGTTGGATTAGCTAGTTGGTGGGGTAATGGCCTACCAAGGCGACGATCCATAGCTGGTCTGAGAGGATGATCAGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACAATGGGGGCAACCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGAGTGATGAAGGCCTTAGGGTTGTAAAGCTCTTTCGCCGGTGAAGATAATGACGGTAACCGGTAAAGAAGCCCCGGCTAACTTCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGAAGGGGGCTAGCGTTGTTCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCACGTAGGCTGACTTTTAAGTCAGGGGTGAAATCCCGGGGCTCAACCTCGGAATTGCCTTTGATACTGGAAGTCTTGAGTCCGAGAGAGGTGAGTGGAACTCCGAGTGTAGAGGTGAAATTCGTAGATATTCGGAAGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTCACTGGCTCGGTACTGACGCTGAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGGAAGCTAGCTGTCAGGTAGCATGCTATTTGGTGGCGCAGCTAACGCATTAAGCTTCCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGATTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGCAGAACCTTACCAGCCCTTGACATGTCCGGCACACACCAGAGATGGTGTTTTCCCTTCGGGGACCGGAGCACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTCGCCCTTAGTTGCCAGCATTCAGTTGGGCACTCTAGGGGGACTGCCGGTGATAAGCCGAGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCCTCATGGCCCTTACGGGCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGCGGTGACAATGGGCAGCGAACCCGCGAGGGGGAGCTAATCTTTAAAAACCGTCTCAGTTCGGATTGTTCTCTGCAACTCGAGAGCATGAAGTTGGAATCGCTAGTAATCGCGTAACAGCATGACGCGGTGAATACGTTCCCG。
本发明中选取12株细菌的所有三个属中的代表菌株各一株保藏，保藏编号为：S344: CCTCCM 20241514, S419: CCTCCM 20241515, Z008: CCTCCM 20241516。
二、基因组提取及分析：
基因组测序前，使用TIANamp基因组DNA试剂盒提取培养菌株的DNA，溶菌酶的最终浓度为10 mg/mL，在37℃温育30min；按照试剂盒提供的方法加入裂解缓冲液GA和缓冲液GB、GD和GW；在Mini-Sub Cell GT系统中通过琼脂糖凝胶电泳检测DNA的完整性；对于每个细菌菌株， 采用NovaSeq 6000系统进行Illumina测序。使用 SPAdes（v3.13.0）中的spades.py 对返回的纯净读数进行基因组组装。以CheckM（v1.1.2）中的Lineage_wf评估基因组的完整性和潜在污染。基因组污染<5%且完整性大于90%的基因组被视为高质量基因组，并用于进一步分析。在使用fastANI进行全基因组比较后，去除了冗余基因组，保留了平均核苷酸同一性（ANI）小于99.9%的基因组。开放阅读框（ORFs）采用Prodigal（v2.60）在单基因组分析模式下进行预测，进行闭合终止的ORF预测。为了进行功能基因注释，使用DIAMOND和BLASTP将与ORFs对应的蛋白质序列在京都基因与基因组百科全书（KEGG）数据库（v2022）中进行搜索，E值设为<1e-7。基于与磷酸盐代谢相关的基因，包括phoU（K02039）、 pstSCAB（K02036、K02037、K02038和K02040）、pgk（K00927）、ppx（K01524）、ppk1（K00937）、 ppk2（K22468）、phoB（K07657）、ppnK（K00858）和pit（K03306）初步判断菌株是否具有除磷能力。将筛选到的细菌培养至对数期，之后加入保种液置于-80℃冰箱保存；保种液为甘油和无菌水按1:1混合后灭菌得到。
三、培养基制备：
以2216E液体培养基对所有细菌及群落进行富集培养，以添加了磷酸盐的2216E液体培养基对群落进行磷酸盐去除效率的测定。以下为各培养基的具体配方，富集培养基：以2216E液体培养基加无菌水配置2216E液体培养基。成分（g/L）：蛋白胨5.0g，酵母浸粉1.0g，柠檬酸铁0.1g，氯化钠19.45g，氯化镁5.98g，硫酸钠3.24g，氯化钙8g，氯化钾0.55g，碳酸钠0.16g，溴化钾0.08g，氯化锶0.034g，硼酸0.022g，硅酸钠0.004g，氟化钠0.0024g，硝酸铵0.0016g，磷酸氢二钠0.008g。
磷酸盐去除培养基：上述2216E液体培养基灭菌后，加入已灭菌的2g/L-P的磷酸氢二钠母液，使磷浓度在26.5mg/L左右，以1mol/L的NaOH和HCl调节pH在7.6±0.2。
四、混合菌群：
按上述步骤共筛选到12株潜在的具有除磷能力的细菌菌株，将已经保种的12株细菌按1%的接种量接种至含5mL 2216E液体培养基的15mL EP管中，在25℃恒温摇床以180rpm有光有氧条件下培养2-3天。待所有菌株的菌液长至一定程度，吸取每个菌株的菌液，用Thermo scientific multiskan FC酶标仪在600nm波长下测定每个菌株菌液的吸光值。根据各个菌株菌液的吸光值，以纯净的已灭菌的2216E液体培养基作为调整液，以稀释或离心重悬的方法调整每个菌株菌液的吸光值，使12株菌菌液吸光值统一在0.2。之后把12株菌按相同的量混合到一起，并加入和菌液相等量的保种液，分装保种好的混合菌群置于-80℃冰箱保存便于以后利用。保种液为甘油和无菌水按1:1混合后灭菌得到。
五、富集培养：
将在冰箱中保存的混合群落的菌液按1%的比例接种至含5mL 2216E液体培养基的15mL EP管中培养2-3天以活化在冰箱中保存的低活力群落，之后吸取15mL EP管中的菌液，按1%的比例接种至含200mL 2216E液体培养基500mL锥形瓶中，在25℃恒温摇床以180rpm有光有氧条件下培养3天。然后接取锥形瓶内的菌液按1%接种量接种至每孔含8mL 2216E液体培养基的六孔板中静置培养16-18h使其成膜。
六、除磷效率测定：
将上述六孔板中成膜的菌液上清以移液枪小心吸走，再加入800μL 2216E液体培养基，之后用新的移液枪枪头吹打，摩擦六孔板底部使成膜的细菌重悬至菌液中。然后将六孔板中已经重悬的菌液吸走，接种至每孔有8mL含额外加入的磷酸盐的2216E液体培养基的六孔板中静置培养，每个样品分3个重复。用无机磷测试盒（南京建成生物工程研究所）每隔12h测定培养基中的总磷浓度。试剂盒测定磷酸盐的原理为磷钼酸法。具体测量过程为，取300μL六孔板中的菌液，以6000rpm离心5min取200μL上清进行后续的测定，按试剂盒的操作方法制定标准曲线，按每个样品的吸光值与标准曲线的公式求剩余磷酸盐浓度。以去除的磷酸盐比总磷酸盐计算磷酸盐去除效率。六孔板中菌液含有的磷酸盐浓度随时间变化如图2所示。
七、除磷效率对比：
将已经商业化的两种在售菌剂，分别为广州引能生物环境科技有限公司的除磷菌及利博源环保材料的除总磷菌，与合成的群落按照六流程测定除磷效率，得到的除磷效率如图3所示。
以上所述，仅为本发明较优的具体的实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种利用海洋生物被膜混合群落去除高盐废水中无机磷的方法，其特征在于，该方法包括：
S1，采集用于细菌分离的海洋生物被膜样本并进行微生物培养；提取培养菌株的DNA进行PCR扩增16SrRNA基因和Sanger测序，确定分离物的分类；
S2，对各个菌株的基因组进行提取，组装、比对、预测开放阅读框以及进行功能基因注释，以是否存在ppk1、ppk2和pap基因为目标，判断是否为聚磷菌，确定具有除磷能力的菌株；
S3，分别制备富集培养基和磷酸盐去除培养基，将筛选得到的具有除磷能力的细菌菌株接种培养，测定生长阶段，按比例混合菌液得到海洋生物被膜混合群落；
S4，以2216E液体培养基对海洋生物被膜混合群落进行富集培养，添加磷酸盐的2216E液体培养基对混合群落进行磷酸盐去除效率的测定。
2.根据权利要求1所述利用海洋生物被膜混合群落去除高盐废水中无机磷的方法，其特征在于，在步骤S1中，采集用于细菌分离的海洋生物被膜样本并进行微生物培养，包括：
利用无菌棉签采集位于潮下带1-2米深的岩石表面天然生物被膜，利用经0.1μm滤膜过滤和高压灭菌后的海水冲洗棉签，并分别稀释10倍和100倍；
取生物被膜样本100μL涂布在海洋琼脂培养基2216平板后在25℃、有光有氧条件下进行微生物培养；在解剖显微镜下检查菌落形态特征，分离明显的菌落类型；
在100℃下加热5min提取细胞中的DNA；使用通用引物27F（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'）和1492R（5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'）进行PCR扩增16SrRNA基因；然后进行Sanger测序，以确定分离物的分类。
3.根据权利要求1所述利用海洋生物被膜混合群落去除高盐废水中无机磷的方法，其特征在于，在步骤S2中，对各个菌株的基因组进行提取，组装、比对、预测开放阅读框以及进行功能基因注释，包括：
基因组测序前，使用TIANamp基因组DNA试剂盒提取培养菌株的DNA，溶菌酶的最终浓度为10 mg/mL，在37℃温育30min；按照试剂盒提供的方法加入裂解缓冲液GA和缓冲液GB、GD和GW；在Mini-Sub Cell GT系统中通过琼脂糖凝胶电泳检测DNA的完整性；对于每个细菌菌株，采用NovaSeq 6000系统进行Illumina测序。
4.根据权利要求3所述利用海洋生物被膜混合群落去除高盐废水中无机磷的方法，其特征在于，还包括：使用SPAdes中的spades.py对返回的纯净读数进行基因组组装，以CheckM中的Lineage_wf评估基因组的完整性和潜在污染，基因组污染<5%且完整性大于90%的基因组被视为高质量基因组，并用于进一步分析；
再使用fastANI进行全基因组比较后，去除了冗余基因组，保留了平均核苷酸同一性ANI小于99.9%的基因组，开放阅读框ORFs采用Prodigal在单基因组分析模式下进行预测，进行闭合终止的ORF预测；
为了进行功能基因注释，使用DIAMOND和BLASTP将与ORFs对应的蛋白质序列在京都基因与基因组百科全书KEGG数据库中进行搜索，E值设为< 1e-7；基于与磷酸盐代谢相关的基因，包括phoU（K02039）、pstSCAB（K02036、K02037、K02038和K02040）、pgk（K00927）、ppx（K01524）、ppk1（K00937）、ppk2（K22468）、phoB（K07657）、ppnK（K00858）和pit（K03306）初步判断菌株是否具有除磷能力；将筛选到的细菌培养至对数期，之后加入保种液置于-80℃冰箱保存；保种液为甘油和无菌水按1:1混合后灭菌得到。
5.根据权利要求1所述利用海洋生物被膜混合群落去除高盐废水中无机磷的方法，其特征在于，在步骤S3中，确定具有除磷能力的菌株包括：Psychrobacter nivimaris，Psychrobacter marincola，Psychrobacter namhaensis，Psychrobacter halodurans，Psychrobacter fulvigenes，Psychrobacter celer，Psychrobacter maritimus，Psychrobacter faecalis，Roseibium aggregatum，Stappia taiwanensis。
6.根据权利要求5所述利用海洋生物被膜混合群落去除高盐废水中无机磷的方法，其特征在于，富集培养基以2216E液体培养基加无菌水配置2216E液体培养基，该培养基成分包括：蛋白胨5.0g，酵母浸粉1.0g，柠檬酸铁0.1g，氯化钠19.45g，氯化镁5.98g，硫酸钠3.24g，氯化钙8g，氯化钾0.55g，碳酸钠0.16g，溴化钾0.08g，氯化锶0.034g，硼酸0.022g，硅酸钠0.004g，氟化钠0.0024g，硝酸铵0.0016g，磷酸氢二钠0.008g。
7.根据权利要求6所述利用海洋生物被膜混合群落去除高盐废水中无机磷的方法，其特征在于，磷酸盐去除培养基：将2216E液体培养基灭菌后，加入已灭菌的2g/L-P磷酸氢二钠母液，使磷浓度为26.5mg/L，以1mol/L的NaOH和HCl调节pH在7.6±0.2；之后按比例混合菌液得到海洋生物被膜混合群落。
8.根据权利要求7所述利用海洋生物被膜混合群落去除高盐废水中无机磷的方法，其特征在于，还包括：将筛选到的且已保种的具有除磷能力的12株细菌按1%的接种量接种至含2216E液体培养基的EP管中，在25℃恒温摇床以180rpm有光有氧条件下培养2-3天；待所有菌株的菌液长至对数期，吸取每个菌株的菌液，用Thermo scientific multiskan FC酶标仪在600nm波长下测定每个菌株菌液的吸光值；根据各个菌株菌液的吸光值，以纯净的已灭菌的2216E液体培养基作为调整液，以稀释或离心重悬的方法调整每个菌株菌液的吸光值，使12株菌菌液吸光值统一在0.2；将12株菌按相同的量混合并加入和菌液相等量的保种液，分装保种好的混合菌群置于-80℃冰箱保存；保种液为甘油和无菌水按1:1混合后灭菌得到。
9.根据权利要求8所述利用海洋生物被膜混合群落去除高盐废水中无机磷的方法，其特征在于，以2216E液体培养基对海洋生物被膜混合群落进行富集培养，具体为：将冰箱中保存的混合群落的菌液按1%的比例接种至含2216E液体培养基的EP管中活化培养2-3天；取EP管中的菌液按1%的比例接种至含2216E液体培养基的锥形瓶中，在25℃恒温摇床以180rpm有光有氧条件培养3天；取锥形瓶内的菌液按1%接种量接种至每孔含2216E液体培养基的六孔板中静置培养16-18h成膜。
10.根据权利要求9所述利用海洋生物被膜混合群落去除高盐废水中无机磷的方法，其特征在于，还包括用移液管吸出六孔板中含有浮游细菌的培养上清液，然后加入8ml 2216E液体培养基，使用钼锑比色法每12小时测定一次培养基中的磷浓度。
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