CN118834297A

CN118834297A - 泌乳素受体抗体及其用途

Info

Publication number: CN118834297A
Application number: CN202310470408.4A
Authority: CN
Inventors: 郭昌月; 陈磊; 贺小琴; 雷丹; 谭肖喻; 徐梦英
Original assignee: Shenzhen Zhenzhen Biomedical Technology Co ltd
Current assignee: Shenzhen Zhenzhen Biomedical Technology Co ltd
Priority date: 2023-04-24
Filing date: 2023-04-24
Publication date: 2024-10-25
Also published as: WO2024222409A1

Abstract

本发明涉及泌乳素受体抗体及其用途，具体涉及一种靶向PRLR的抗体或其抗原结合片段，或与所述抗体或其抗原结合片段具有至少85％序列相同性并保留其PRLR结合活性的变体，所述抗体靶向靶向泌乳素受体的胞外段。本发明抗体以高亲和力结合PRLR。

Description

泌乳素受体抗体及其用途

技术领域

本发明涉及生物学和医学领域；更具体而言，本发明涉及一种特异性结合泌乳素受体的抗体及其用途。

背景技术

泌乳素受体(PRLR)是单次跨膜蛋白，I型细胞因子受体，其与白细胞介素2、3、4、6、7，红细胞生成素以及粒细胞巨噬细胞集落刺激因子受体等属同源蛋白。泌乳素受体的天然配体泌乳素(prolactin)是一种由199个氨基酸组成的多肽荷尔蒙，其主要由人体脑垂体中的泌乳细胞分泌。泌乳素与同二聚体形式的泌乳素受体结合后，诱导受体二聚体构象改变从而活化结合在受体胞内段的Jak2，Jak2催化Stat5形成具有活性的磷酸化二聚体，Stat5磷酸化二聚体进入细胞核调控下游基因表达。除主要的Jak2-Stat5信号通路外，泌乳素受体的活化还可以激活Src，促进细胞增殖；活化MARK等。此外，生长因子荷尔蒙和胎盘催乳素也可以结合并活化泌乳素受体。因此，PRLR的活化可介导多种生物学功能，在某些良性疾病或恶性肿瘤中是可用于疾病干预的潜在靶点。

泌乳素受体介导正常生理学功能包括促进细胞生长、分化、发育以及泌乳。人的泌乳素受体cDNA最初从肝癌及乳腺癌文库中分离得到。成熟蛋白具有全长598个氨基酸，由于mRNA裁剪的不同，泌乳素受体存在不同的亚型，分别为L，I，S1a以及S1b型，几种亚型具有相同的胞外段及不同长度的胞内段。泌乳素受体被认为是潜在的乳腺癌和前列腺癌治疗靶点，但其在乳腺癌发生、发展中的作用一直存在争议。相反，自分泌和/或旁分泌的垂体外合成的PRL被认为涉及前列腺肿瘤发生。在小鼠模型中，前列腺过表达PRL可导致前列腺增生、上皮内瘤样病变甚至前列腺腺瘤。从流行病学角度看，患者的前列腺组织中存在PRL及磷酸化Stat5的表达与肿瘤的恶性级别和疾病侵袭程度正相关。

泌乳素受体不仅是潜在的恶性肿瘤靶点，在多种良性病变中也是重要靶标。临床研究显示增强的PRLR介导的信号传导与妇女子宫内膜异位有关。一项探索性临床研究显示，在诊断为子宫内膜异位症的高泌乳素血症女性中，采用多巴胺激动剂喹高利特(泌乳素合成调节剂)进行治疗超过4个月可显著减小女性患者腹膜子宫内膜异位病灶大小。此外，泌乳素可干扰头发毛囊周期，血液中上升的泌乳素浓度与脱发相关。泌乳素受体在头发毛囊中的表达已被证明，且泌乳素可诱导毛囊周期进入退化期。小鼠模型中，多巴胺受体激动剂(PRL抑制剂)可以促进小鼠毛发生长。综上所述，PRLR是具有潜力的药物作用靶点，靶向PRLR的抗体或抗原结合片段可用于PRLR相关的多种疾病，具有广阔的市场前景。

发明内容

本发明首先提供一种靶向PRLR的抗体或其抗原结合片段，或与所述抗体或其抗原结合片段具有至少85％序列相同性并保留其PRLR结合活性的变体，所述抗体靶向靶向泌乳素受体的胞外段。优选地，所述胞外段包括SEQ ID NO:99或101第1-210位氨基酸。

在一个或多个实施方案中，所述抗体包含：SEQ ID NO:1-23中任一所示的重链可变区的3个HCDR，和/或SEQ ID NO:24-41中任一所示的轻链可变区的3个LCDR。优选地，所述抗体包含：SEQ ID NO:3、5、16、20-23中任一所示的重链可变区的3个HCDR，和/或SEQ IDNO:26、28、36、40、41中任一所示的轻链可变区的3个LCDR。

在一个或多个实施方案中，所述抗体的HCDR1包含选自以下的任一种：SEQ ID NO：42-52，或与其具有至少85％序列相同性的序列。

在一个或多个实施方案中，所述抗体的HCDR2包含选自以下的任一种：SEQ ID NO：53-66，或与其具有至少85％序列相同性的序列。

在一个或多个实施方案中，所述抗体的HCDR3包含选自以下的任一种：SEQ ID NO：67-75，或与其具有至少85％序列相同性的序列。

在一个或多个实施方案中，所述抗体的LCDR1包含选自以下的任一种：SEQ ID NO：76-83，或与其具有至少85％序列相同性的序列。

在一个或多个实施方案中，所述抗体的LCDR2包含选自以下的任一种：SEQ ID NO：84-90，或与其具有至少85％序列相同性的序列。

在一个或多个实施方案中，所述抗体的LCDR3包含选自以下的任一种：SEQ ID NO：91-98，或与其具有至少85％序列相同性的序列。

在一个或多个实施方案中，所述抗体含有表1任一行所示抗体的HCDR1、HCDR2、HCDR3或与其具有至少85％序列同一性的序列。在一个或多个实施方案中，所述抗体含有表1任一行所示抗体的LCDR1、LCDR2和LCDR3，或与其具有至少85％序列同一性的序列。

在一个或多个实施方案中，所述抗体的HCDR1、HCDR2和HCDR3选自以下任一组或与其具有至少85％序列同一性的序列：

(1)SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：55、和SEQ ID NO：67，

(2)SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：66、和SEQ ID NO：67，

(3)SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：56和SEQ ID NO：68，

(4)SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：63和SEQ ID NO：73，和/或

所述抗体的LCDR1、LCDR2和LCDR3选自以下任一组或与其具有至少85％序列同一性的序列：

(1)SEQ ID NO：77、SEQ ID NO：84和SEQ ID NO：91，

(2)SEQ ID NO：82、SEQ ID NO：90和SEQ ID NO：97。

在一个或多个实施方案中，所述抗体含有表1任一行所示抗体的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3。

在一个或多个实施方案中，所述抗体的轻链可变区包含鼠源或人源轻链FR区。在一个或多个实施方案中，所述抗体的重链可变区包含鼠源或人源重链FR区。

在一个或多个实施方案中，所述抗体的重链可变区的FR1、FR2、FR3和FR4各自分别独立选自SEQ ID NO:1-23中任一所示的重链可变区的FR1、FR2、FR3和FR4，和/或，所述抗体的轻链可变区的FR1、FR2、FR3和FR4各自分别独立选自SEQ ID NO:24-41中任一所示的轻链可变区的FR1、FR2、FR3和FR4。

在一个或多个实施方案中，所述抗体的重链可变区的FR区选自SEQ ID NO：3、5、16、20-23中任一所示的重链可变区的FR区。

在一个或多个实施方案中，所述抗体的轻链可变区的FR区选自SEQ ID NO：26、28、36、40、41中任一所示的轻链可变区的FR区。

在一个或多个实施方案中，所述抗体含有表1任一行所示抗体的VH、VL或VH和VL，或与其具有至少85％序列相同性的序列。

在一个或多个实施方案中，所述抗体的VH具有SEQ ID NO:3、5、16、20-23中任一所示的序列或与其具有至少85％序列相同性的序列。或者或此外，所述抗体的VL具有SEQ IDNO：26、28、36、40、41中任一所示的序列或与其具有至少85％序列相同性的序列。

在一个或多个实施方案中，所述抗体中：

VH如SEQ ID NO:3所示、VL如SEQ ID NO:26所示，

VH如SEQ ID NO:5所示、VL如SEQ ID NO:28所示，

VH如SEQ ID NO:16所示、VL如SEQ ID NO:36所示，

VH如SEQ ID NO:20或21所示、VL如SEQ ID NO:40所示，

VH如SEQ ID NO:22所示、VL如SEQ ID NO:40所示，或

VH如SEQ ID NO:23所示、VL如SEQ ID NO:41所示。

在一个或多个实施方案中，所述抗体还包含重链恒定区和/或轻链恒定区。

在一个或多个实施方案中，所述抗体是多特异性抗体，优选双特异性抗体。

在一个或多个实施方案中，所述抗体是单克隆抗体。

在一个或多个实施方案中，所述抗体是嵌合抗体或完全人抗体。

本发明还提供一种融合蛋白或抗体偶联物，其包含本文所述抗体或其抗原结合片段。

本发明还提供多核苷酸，选自：

(1)本文任一实施方案所述抗体或其抗原结合片段、融合蛋白、或抗体偶联物的编码序列；

(2)(1)的互补序列。

本发明还提供一种核酸构建物，其表达本文任一实施方案所述抗体或其抗原结合片段、融合蛋白、或抗体偶联物，或包含本文任一实施方案所述的多核苷酸。

在一个或多个实施方案中，所述核酸构建物是载体，例如整合载体、克隆载体或表达载体。

本发明还提供含本文任一实施方案所述抗体或其抗原结合片段的噬菌体或包含该噬菌体的文库。

在一个或多个实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段展示于所述噬菌体表面。

本发明还提供一种宿主细胞，其：

(1)表达和/或分泌本文任一实施方案所述抗体或其抗原结合片段；

(2)包含本文所述的多核苷酸；和/或

(3)包含本文所述的核酸构建物。

在一个或多个实施方案中，所述宿主细胞选自原核细胞或真核细胞。

在一个或多个实施方案中，所述宿主细胞是哺乳动物细胞。

本发明还提供一种产生抗体或其抗原结合片段的方法，包括：在适合产生抗体或其抗原结合片段的条件下培养本文所述的宿主细胞，和任选的从培养物中纯化所述抗体或其抗原结合片段。

本发明还提供一种药物组合物，包含本文所述抗体或其抗原结合片段、融合蛋白、抗体偶联物、多核苷酸、核酸构建物、噬菌体或宿主细胞，和药学上可接受的辅料。

在一个或多个实施方案中，所述辅料是运载体、稀释剂或赋形剂。

在一个或多个实施方案中，所述药物组合物用于治疗癌症。

在一个或多个实施方案中，所述癌症是PRLR相关癌症。优选地，所述癌症选自卵巢癌、黑色素瘤、前列腺癌、肠癌、胃癌、食管癌、乳腺癌、肺癌、肾癌、胰腺癌、子宫癌、肝癌、膀胱癌、子宫颈癌、口腔癌、脑癌、睾丸癌、皮肤癌、甲状腺癌以及血液学恶性肿瘤。血液学恶性肿瘤选自骨髓瘤、慢性白血病和急性白血病。

本发明还提供本文任一实施方案所述抗体或其抗原结合片段、融合蛋白、抗体偶联物、多核苷酸、核酸构建物或宿主细胞在制备用于预防或治疗疾病的药物中的用途。

在一个或多个实施方案中，所述疾病包括：癌症、子宫内膜异位、脱发、骨质疏松、肥胖、PRLR活化导致的良性病变。

本发明还提供一种抑制受试者中的肿瘤细胞的生长、抑制PRL活化PRLR导致的良性病变、或治疗或预防疾病的方法，所述方法包括给予需要的患者治疗有效量的本发明任一实施方案所述的抗体或其抗原结合片段、融合蛋白、抗体偶联物或药物组合物。

本发明还提供一种检测PRLR的试剂盒，用于评估药物治疗效果或诊断癌症，所述的试剂盒包含本文任一实施方案所述抗体或其抗原结合片段、融合蛋白、抗体偶联物、多核苷酸、核酸构建物、噬菌体或宿主细胞。

在一个或多个实施方案中，所述试剂盒还包括用于检测PRLR与抗体或其抗原结合片段、融合蛋白、或抗体偶联物的结合的试剂。例如通过酶联免疫反应法检测所述结合的试剂。

在一个或多个实施方案中，所述检测结合的试剂是能与抗体或其抗原结合片段、融合蛋白、或抗体偶联物连接的可检测标记物，例如生物素。所述的可检测标记物被连接于所述抗体或其抗原结合片段或分离地存在于试剂盒中。

本发明还提供一种检测样品中PRLR存在情况的非诊断性方法，所述方法包括：以本文任一实施方案所述抗体或其抗原结合片段、融合蛋白、或抗体偶联物与样品孵育，和检测PRLR与抗体或其抗原结合片段、融合蛋白、或抗体偶联物的结合，从而确定样品中PRLR存在情况。所述检测是酶联免疫反应法检测。

本发明还提供本文任一实施方案所述抗体或其抗原结合片段、融合蛋白、或抗体偶联物在制备用于检测样品中PRLR、评估药物治疗效果或诊断癌症的试剂盒中的用途。

附图说明

图1为本公开PRLR人源化抗体介导PRLR内吞的免疫荧光检测。

图2为本公开PRLR人源化抗体介导杀伤PRLR阳性细胞系检测。

具体实施方式

除非另有定义，本发明的实施将采用分子生物学(包括重组技术)、微生物学、细胞生物学、生物化学和免疫学的常规技术，这些都在本领域的技术范围内。这些技术在文献中有充分解释，诸如Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第二版(Sambrook等，1989)；Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait编辑，1984)；Animal Cell Culture(R.I.Freshney编辑，1987)；Methods in Enzymology(Academic Press，Inc.)；Current Protocols inMolecular Biology(F.M.Ausubel等编辑，1987版及其定期更新版本)；PCR：ThePolymerase Chain Reaction(Mullis等编辑，1994)；A Practical Guide to MolecularCloning(Perbal Bernard V.，1988)；Phage Display：A Laboratory Manual(Barbas等，2001)。

泌乳素受体PRLR是单次跨膜蛋白，I型细胞因子受体，与白细胞介素2、3、4、6、7，红细胞生成素以及粒细胞巨噬细胞集落刺激因子受体等属同源蛋白。泌乳素受体可结合人体泌乳素、生长因子荷尔蒙、胎盘催乳素，介导多种生物学功能，包括细胞增殖、分化和泌乳等。泌乳素受体异常活化与多种人类疾病相关如：肿瘤、子宫内膜异位、脱发、高泌乳血症以及骨质疏松等。

本发明利用PRLR蛋白胞外段作为表位肽，获得了抗人PRLR杂交瘤单克隆抗体，然后利用噬菌体展示技术筛选抗体基因库并进行人源化改造，从而获得了一系列PRLR特异性抗体。然后通过ELISA、亲和力、受体内化、阻断试验、靶细胞杀伤等方法鉴定出高亲合力、高特异性、高功能活性的抗体。所述抗体或其抗原结合片段具有良好的安全性和靶向性，能够特异性结合PRLR蛋白胞外段。

抗体

本文中，术语“抗体”包括单克隆抗体(包括全长抗体，其具有免疫球蛋白Fc区)，具有多表位特异性的抗体组合物，多特异性抗体(例如，双特异性抗体)，双抗体和单链分子，以及抗体片段，尤其是抗原结合片段，例如，Fab，F(ab’)2和Fv。本文中，“抗体”与“免疫球蛋白”可互换使用。

传统的“抗体”含有基本的4链抗体单元，是由两条相同的轻链(L)和两条相同的重链(H)构成的异四聚体糖蛋白。每条重链在N-末端具有可变结构域(VH)，接着是三个(对于每种α和γ链，CH1、CH2和CH3)和四个(对于μ和ε同种型，CH1、CH2、CH3和CH4)恒定结构域(CH)以及位于CH1结构域与CH2结构域之间的绞链区(Hinge)。每条轻链在N-末端具有可变结构域(VL)，接着是其另一端的恒定结构域(CL)。成对的VH和VL一起形成一个抗原结合位点。关于不同类别抗体的结构和性质，参见如Basic and Clinical Immunology，第八版，Daniel P.Sties，Abba I.Terr和Tristram G.Parsolw编辑，Appleton&Lange，Norwalk，CT，1994，第71页和第6章。来自任何脊椎动物物种的轻链，根据其恒定结构域氨基酸序列，可归入两种称作κ和λ的截然不同型中的一种。根据CH序列和功能的相对较小差异，γ和α类可进一步分为亚类，例如人表达下列亚类：IgG1、IgG2A、IgG2B、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。所述的抗体重链可进一步包含重链恒定区，所述的重链恒定区包含人源或鼠源的IgG1，2，3，4的恒定区或其突变序列。所述的抗体轻链可进一步包含轻链恒定区，所述的轻链恒定区包含人源或鼠源的κ、λ链的恒定区或其突变序列。

抗体的“可变区”或“可变结构域”是指抗体的重链或轻链的氨基末端结构域。重链和轻链的可变结构域可分别称为“VH”和“VL”。这些结构域通常是抗体的最可变的部分(相对于相同类型的其它抗体)并含有抗原结合位点。

术语“可变的”指可变结构域中的某些区段在抗体序列中差异广泛的情况。可变结构域介导抗原结合并限定特定抗体对其特定抗原的特异性。然而，变异性并非均匀分布于可变结构域跨越的全部氨基酸。相反，其集中在三个称为高变区(HVR)的区段(在轻链和重链可变结构域中均有)，即分别为重链可变区的HCDR1、HCDR2、HCDR3以及轻链可变区的LCDR1、LCDR2和LCDR3。可变结构域中更为高度保守的部分称为构架区(FR)。天然重链和轻链的可变结构域各自包含四个FR区(FR1、FR2、FR3和FR4)，它们大多采取β-折叠构象，通过形成环状连接且在有些情况中形成β-折叠结构一部分的三个HVR连接。每条链中的HVR通过FR区非常接近的保持在一起，并与另一条链的HVR一起促成抗体的抗原结合位点的形成。通常，轻链可变区的结构为FR1-LCDR1-FR2-LCDR2-FR3-LCDR3-FR4，重链可变区的结构为FR1-HCDR1-FR2-HCDR2-FR3-HCDR3-FR4。恒定结构域不直接参与抗体与抗原的结合，但展现出多种效应子功能，如在抗体依赖性细胞介导的细胞毒性中抗体的参与。抗体的有多种可变区标注方案，包括：Chothia、Kabat、IMGT和Contact。本文示例性使用IMGT标注方案。

“Fc区”(可结晶片段区域)或“Fc结构域”或“Fc”是指抗体重链的C-末端区域，其介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，包括与位于免疫系统的各种细胞(例如，效应细胞)上的Fc受体的结合，或者与经典补体系统的第一组分(C1q)的结合。在IgG，IgA和IgD抗体同种型中，Fc区由来自抗体两条重链的CH2结构域和CH3结构域的两个相同的蛋白片段构成；IgM和IgE的Fc区在每个多肽链中包含三个重链恒定结构域(CH结构域2-4)。虽然免疫球蛋白重链的Fc区的边界可以变化，但是人IgG重链Fc区通常定义为从重链位置C226或P230的氨基酸残基到羧基端的序列段，其中该编号是根据EU索引，如在Kabat中一样。如本文所使用的，Fc区可以是天然序列Fc或变体Fc。

“抗原结合片段”通常是指抗体分子的一部分，其包含负责抗体与抗原之间的特异性结合的氨基酸。抗原中由抗体特异性地识别和结合的部分是称作如上文所述的“表位”。如上文所述，抗原结合结构域可典型地包含抗体轻链可变区(VL)和抗体重链可变区(VH)；然而，其并非必须包含两者。抗体片段的例子包括Fab、Fab’、F(ab’)、F(ab’)2、Fd、和Fv片段、二硫键连接的Fv；双抗体；线性抗体；单链抗体分子；scFv-Fc片段；由抗体片段形成的多特异性抗体；以及通过化学修饰或通过掺入脂质体中应能够增加半衰期的任何片段。Fd片段例如具有两个VH区并且通常保留完整抗原结合结构域的一些抗原结合功能。抗体的抗原结合片段的实例包括(1)Fab片段，具有VL、VH、恒定轻链(CL)和CH1结构域的单价片段；(2)F(ab’)2片段，具有由铰链区的二硫桥连接的两个Fab片段的二价片段；(3)具有两个VH和CH1结构域的Fd片段；(4)具有抗体单臂的VL和VH结构域的Fv片段，(5)dAb片段(Ward等人,“Binding Activities of a Repertoire of Single Immunoglobulin Variable DomainsSecreted From Escherichia coli,”Nature341:544-546(1989)，其以引用的方式整体并入本文)，其具有VH结构域；(6)分离的互补决定区(CDR)，和(7)单链Fv(scFv)，例如源于scFV-文库。尽管Fv片段的两个结构域VL和VH是由独立基因编码，但其可通过合成连接子使用重组方法接合，合成连接子使得其被制备为其中VL和VH区配对以形成单价分子的单一蛋白链(称为单链Fv(scFv))(可参见例如Huston等人,“Protein Engineering of AntibodyBinding Sites:Recovery of Specific Activity in an Anti-Digoxin Single-ChainFv Analogue Produced in Escherichia coli,”Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883(1988))。这些抗体片段使用所属领域的技术人员已知的常规技术获得，且以与完整抗体相同的方式评估所述片段的功能。

“Fv”是含有完整抗原识别和结合位点的最小抗体片段。该片段由紧密、非共价结合的一个重链可变结构域和一个轻链可变结构域的二聚体组成。从这两个结构域的折叠中突出了六个高变环(重链和轻链各3个环)，贡献出抗原结合的氨基酸残基并赋予抗体以抗原结合特异性。然而，即使是单个可变结构域(或只包含对抗原特异的三个HVR的半个Fv)也具有识别和结合抗原的能力，尽管亲合力低于完整结合位点。“单链Fv”也可缩写为“sFv”或“scFv”，是包含抗体VH和VL结构域的连接成一条多肽链的抗体片段。优选的是，sFv多肽在VH和VL结构域之间还包含多肽接头，使得sFv形成期望的抗原结合结构。对于重链抗体或纳米抗体而言，scFv即为VHH。

本文中，术语“单克隆抗体”指从一群基本上同质的抗体中获得的抗体，即除了可能以少量存在的可能的天然出现的突变和/或翻译后修饰(例如异构化、酰胺化)之外，构成群体的各个抗体是相同的。单克隆抗体是高度特异性的，针对单个抗原位点。与多克隆抗体制剂(其典型地包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体)相比，每个单克隆抗体针对抗原上的单个决定簇。除它们的特异性外，单克隆抗体的优势在于它们通过杂交瘤培养合成，未受到其它免疫球蛋白的污染。修饰语“单克隆”表明抗体从基本上同质的抗体群获得的特征，不应解释为要求通过任何特定方法来生产抗体。例如，将根据本发明使用的单克隆抗体可通过多种技术来生成，包括例如杂交瘤法、噬菌体展示法、重组DNA法、及用于从具有部分或整个人免疫球蛋白基因座或编码人免疫球蛋白序列的基因的动物生成人或人样抗体的技术、单细胞测序法。

单克隆抗体在本文中也包括“嵌合”抗体，其中重链和/或轻链的一部分与衍生自特定物种或属于特定抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，而链的剩余部分与衍生自另一物种或属于另一抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，以及此类抗体的片段，只要它们展现出期望的生物学活性。

术语“鼠源抗体”在本公开中为根据本领域知识和技能制备的结合人PRLR的来源于小鼠的单克隆抗体。制备时用PRLR抗原注射试验对象，然后分离表达具有所需序列或功能特性的抗体。在本公开一个优选的实施方案中，所述的鼠源PRLR抗体或其抗原结合片段，可进一步包含鼠源κ、λ链或其突变序列的轻链恒定区，或进一步包含鼠源IgG1、IgG2、IgG3或其突变序列的重链恒定区。

术语“嵌合抗体(chimeric antibody)”，是将鼠源性抗体的可变区与人抗体的恒定区融合而成的抗体，可以减轻鼠源性抗体诱发的免疫应答反应。建立嵌合抗体，要先建立分泌鼠源性特异性单抗的杂交瘤，然后从小鼠杂交瘤细胞中克隆可变区基因，再根据需要克隆人抗体的恒定区基因，将小鼠可变区基因与人恒定区基因连接成嵌合基因后插入载体中，最后在真核细胞或原核细胞中表达嵌合抗体分子。在本发明优选的实施方案中，所述的嵌合抗体的抗体轻链进一步包含人源κ、λ链或其突变序列的轻链恒定区。所述的嵌合抗体的抗体重链进一步包含人源IgG1、IgG2、IgG3或IgG4或其突变序列的重链恒定区，优选包含人源IgG1重链恒定区

非人(例如鼠)抗体的“人源化”形式指最低限度包含衍生自非人免疫球蛋白的序列的嵌合抗体。因此，“人源化抗体”通常指可变结构域构架区与在人抗体中发现的序列交换的非人抗体。通常在人源化抗体中，整个抗体(除CDR以外)由人来源的多核苷酸编码或与这种抗体相同(除CDR以外)。CDR(其中一些或全部由源自非人生物体的核酸编码)被移植到人抗体可变区的β-折叠骨架中以产生抗体，其特异性由被移植的CDR来决定。术语“人源化抗体(humanized antibody)”，也称为CDR移植抗体(CDR grafted antibody)。这类抗体的产生方法本领域周知，例如使用具有基因工程免疫系统的小鼠而产生。人种系抗体可变区框架(FR)序列可以从ImMunoGeneTics(IMGT)的网站http：//imgt.cines.fr得到。人源抗体的共同序列可以从网站https://plueckthun.bioc.uzh.ch/antibody/Modelling/HuCAL/index.html得到(J.Mol.Biol.296,57-86(2000))。为避免免疫原性下降的同时，引起的抗体活性下降，可对所述的人抗体可变区进行反向突变(回复突变)，以保持活性。本发明中，抗体包括经人源化的变体。

“人抗体”指这样的抗体，其具有与由人生成的抗体的氨基酸序列对应的氨基酸序列和/或使用本文所公开的用于生成人抗体的任何技术产生。人抗体的这种定义明确排除包含非人抗原结合残基的人源化抗体。人抗体可使用本领域已知的多种技术来生成，包括噬菌体展示文库。

本公开的术语“与PRLR结合”，指能与人PRLR相互作用。

本公开的术语“抗原结合表位”指抗原上不连续的，由本公开抗体或抗原结合片段识别的三维空间位点。

在一些实施方案中，本发明还提供与本发明的任何抗体的抗原接合区竞争结合PRLR上相同表位的纳米抗体、重链抗体、抗体或其抗原结合片段，即能够与本发明的任何抗体的抗原结合区交叉竞争与PRLR的结合的纳米抗体、重链抗体、抗体或其抗原结合片段。

在本发明的具体实施方案中，抗PRLR抗体含有表1任一行所示的CDR组：

表1

本文抗体的FR1、FR2、FR3和FR4可分别独立选自表1中任一行所示的VH或VL的FR1、FR2、FR3和FR4。优选地，在一个或多个实施方案中，所述抗体的重链可变区的FR1、FR2、FR3和FR4各自分别独立选自SEQ ID NO:1-23中任一所示的重链可变区的FR1、FR2、FR3和FR4；所述抗体的轻链可变区的FR1、FR2、FR3和FR4各自分别独立选自SEQ ID NO:24-41中任一所示的轻链可变区的FR1、FR2、FR3和FR4。

在一个或多个实施方案中，所述抗体含有表1任一行所示抗体的VH、VL或VH和VL。优选地，VH如SEQ ID NO:3所示、VL如SEQ ID NO:26所示，或VH如SEQ ID NO:5所示、VL如SEQID NO:28所示，或VH如SEQ ID NO:16所示、VL如SEQ ID NO:36所示，或VH如SEQ ID NO:20或21所示、VL如SEQ ID NO:40所示，或VH如SEQ ID NO:22所示、VL如SEQ ID NO:40所示，或VH如SEQ ID NO:23所示、VL如SEQ ID NO:41所示。

在一个或多个实施方案中，所述抗体还包含重链恒定区和/或轻链恒定区。示例性地，所述抗体的重链包含人源IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的重链恒定区或与其具有至少85％序列相同性的序列；所述抗体的轻链包含人源κ链、λ链的轻链恒定区或与其具有至少85％序列相同性的序列。优选地，所述抗体的重链包含人源IgG1的重链恒定区或与其具有至少85％序列相同性的序列，轻链包含人源κ链的轻链恒定区或与其具有至少85％序列相同性的序列。

本文中，抗体可以是包含一条、两条或多条本文所述的抗体的链或抗原结合片段的多特异性抗体。多特异性可以是针对PRLR和另一种抗原，也可以是针对PRLR的两种不同表位。

本发明还包括所述抗体的衍生物和类似物。“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明抗体相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的衍生物或类似物可以是(i)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(ii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iii)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或与6His标签形成的融合蛋白)。根据本文的教导，这些衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。

本公开中所述的“突变序列”中的“突变”包括但不限于“回复突变”、“保守修饰”或“保守置换或取代”。本公开中所述的“保守修饰”或“保守置换或取代”是指具有类似特征(例如电荷、侧链大小、疏水性/亲水性、主链构象和刚性等)的其它氨基酸置换蛋白中的氨基酸，使得可频繁进行改变而不改变蛋白的生物学活性。本领域技术人员知晓，一般而言，多肽的非必需区域中的单个氨基酸置换基本上不改变生物学活性(参见例如Watson等(1987)Molecular Biology of the Gene，The Benjamin/Cummings Pub.Co.，第224页，(第4版))。另外，结构或功能类似的氨基酸的置换不大可能破环生物学活性。

在不实质性影响抗体活性的前提下，本领域技术人员可以对本发明的抗体序列改变一个或更多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个或更多个)氨基酸，以获得所述抗体或其功能性片段序列的变体。这些变体包括(但并不限于)：一个或多个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行保守性取代时，通常不会改变蛋白质的功能。如在FR和/或Fc区中将具有类似性质的氨基酸进行取代。可进行保守性取代的氨基酸残基为本领域所周知。这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。它们都被视为包括在本发明保护的范围内。

本文所述抗体的变异形式包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧度条件下能与本发明抗体的编码DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用抗本发明抗体的抗血清获得的多肽或蛋白。在一些实施方案中，本发明所述变体的序列可以与其来源序列有至少有95％、96％、97％、98％或99％的一致性。本发明所述的序列一致性可以使用序列分析软件测量。例如使用缺省参数的计算机程序BLAST，尤其是BLASTP或TBLASTN。本发明还包括那些具有带CDR的抗体重链可变区的分子，只要其CDR与此处鉴定的CDR具有90％以上(较佳地95％以上，最佳地98％以上)的同源性。

可采用本领域常规的方法制备本发明的抗体，如杂交瘤技术、噬菌体展示技术。或者，本发明的抗体可在其他细胞系中表达。可用编码本发明抗体的序列转化合适的哺乳动物宿主细胞，然后培养宿主细胞并纯化抗体。转化可采用任何已知的方法进行，例如包括将多核苷酸包装在病毒(或病毒载体中)并用病毒(或载体)转导宿主细胞。所用的转化程序取决于将转化的宿主。用于将异源多核苷酸引入哺乳动物细胞中的方法为本领域所熟知，包括葡聚糖介导的转染、磷酸钙沉淀、聚凝胺介导的转染、原生质体融合、电穿孔、将多核苷酸囊封在脂质体中和将DNA直接微注射至核中等。可用作用于表达的宿主的哺乳动物细胞系为本领域所熟知，包括但不限于可从美国典型培养物保藏中心(ATCC)获得的多种永生化细胞系，包括但不限于中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、HeLa细胞、幼仓鼠肾(BHK)细胞、猴肾细胞(COS)、人肝细胞癌细胞(例如，HepG2)等。

本公开还提供包含PRLR胞外区和小鼠抗体IgG2a Fc片段的融合蛋白。融合蛋白是一种通过DNA重组，将得到的两个基因共表达的蛋白产物。重组PRLR胞外区Fc融合蛋白通过DNA重组，把PRLR胞外区和小鼠抗体IgG2aFc片段共表达的融合蛋白。所述的PRLR胞外区，是指PRLR蛋白表达在细胞膜以外的部分。

本发明还包括含有本文所述抗PRLR抗体和其它多肽的融合蛋白。在一些实施方式中，其他多肽位于所述抗体的N端和/或C端。在一些实施方式中，其他多肽包括将抗体定位到不同细胞器的多肽、用于纯化的标签或者用于免疫反应的标签、跨膜蛋白或其跨膜区、嵌合抗原受体或其组件(胞外结构域、铰链区、跨膜区、信号转导结构域、共刺激结构域等)。

本发明还包括含有本文所述抗PRLR抗体的抗体偶联物，其是通过化学键将具有生物活性的细胞毒药物连接到抗体上，抗体作为载体将细胞毒药物靶向运输到目标细胞中发挥作用的一类药物。本领域技术人员可以根据需要和实际情况选择与本文所述抗PRLR抗体偶联的药物。

核酸

本发明还提供了编码本文所述抗体的多核苷酸。本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。本发明也包括编码融合蛋白的多核苷酸序列的简并变异体，即编码相同的氨基酸序列但核苷酸序列有所不同的核苷酸序列。RNA可以是在体内和/或体外表达抗体的mRNA。

所以，本发明还涉及与上述多核苷酸序列杂交且两个序列之间具有至少50％，较佳地至少70％，更佳地至少80％相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严谨条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，“严谨条件”是指：(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC,0.1％SDS,60℃；或(2)杂交时加有变性剂,如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在90％以上，更好是95％以上时才发生杂交。并且，可杂交的多核苷酸编码的多肽与成熟多肽有相同的生物学功能和活性。

本发明的抗体的核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。一种可行的方法是用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。此外，还可将重链的编码序列和表达标签(如6His)融合在一起，形成融合蛋白。可以如上得到融合蛋白的各部分的序列后再连接得到融合蛋白的全长。

一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。本发明所涉及的生物分子(核酸、蛋白等)包括以分离的形式存在的生物分子。目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。融合蛋白的各部分可以顺序克隆到载体中或者可以整合为全长融合蛋白后再克隆。

本发明也涉及核酸构建物，该核酸构建物含有本文所述的多核苷酸序列，以及与这些序列操作性连接的一个或多个调控序列，例如适合在体内或体外将DNA或RNA表达为抗体的调控序列。本发明所述的多核苷酸序列可以多种方式被操作以保证所述抗体的表达。在将核酸构建物插入载体之前可根据表达载体的不同或要求而对核酸构建物进行操作。利用重组DNA方法来改变多核苷酸序列的技术是本领域已知的。

调控序列可以是合适的启动子序列。启动子序列通常与待表达蛋白的编码序列操作性连接。启动子可以是在所选择的宿主细胞中显示转录活性的任何核苷酸序列，包括突变的、截短的和杂合启动子，并且可以从编码与该宿主细胞同源或异源的胞外或胞内多肽的基因获得。合适的启动子的一个例子为即时早期巨细胞病毒(CMV)启动子序列。该启动子序列是能够驱动可操作地连接至其上的任何多核苷酸序列高水平表达的强组成型启动子序列。合适的启动子的另一个例子为延伸生长因子-1α(EF-1α)。然而，也可使用其他组成型启动子序列，包括但不限于类人猿病毒40(SV40)早期启动子、小鼠乳癌病毒(MMTV)、人免疫缺陷病毒(HIV)长末端重复(LTR)启动子、MoMuLV启动子、鸟类白血病病毒启动子、EB病毒即时早期启动子、鲁斯氏肉瘤病毒启动子、以及人基因启动子，诸如但不限于肌动蛋白启动子、肌球蛋白启动子、血红素启动子和肌酸激酶启动子。进一步地，也可考虑使用诱导型启动子。诱导型启动子的使用提供了分子开关，其能够在期限表达时打开可操作地连接诱导型启动子的多核苷酸序列的表达，而在当表达是不期望的时关闭表达。诱导型启动子的例子包括但不限于金属硫蛋白启动子、糖皮质激素启动子、孕酮启动子和四环素启动子。

调控序列也可以是合适的转录终止子序列，由宿主细胞识别以终止转录的序列。终止子序列与编码该多肽的核苷酸序列的3’末端操作性连接。在选择的宿主细胞中有功能的任何终止子都可用于本发明。调控序列也可以是合适的前导序列，对宿主细胞翻译重要的mRNA的非翻译区。前导序列与编码该多肽的核苷酸序列的5′末端可操作连接。在选择的宿主细胞中有功能的任何终止子都可用于本发明。

其他适合在体内或体外表达DNA或RNA的调控序列是本领域常规知识。

在某些实施方案中，所述核酸构建物是载体，例如克隆载体、表达载体和整合载体。通常通过可操作地连接本发明的多核苷酸序列至表达载体，实现本发明多核苷酸序列的表达。典型的克隆载体包含可用于调节期望核酸序列表达的转录和翻译终止子、起始序列和启动子。整合载体含有将靶序列整合到细胞基因组上的组件。这些载体可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。载体通常含有用于质粒维系和用于克隆与表达外源性核苷酸序列的序列。所述序列(在某些实施方案中总称为“侧翼序列”)通常包括一个或多个以下核苷酸序列：启动子、一个或多个增强子序列、复制起点、转录终止序列、含有供体和受体剪接位点的完全内含子序列、编码用于多肽分泌的前导序列的序列、核糖体结合位点、聚腺苷酸化序列、用于插入编码将要表达的抗体的核酸的多连接子区和可选标记元件。表达载体的示例例如pcDNA3.1。

此外，载体的类型不受限制，例如，质粒、噬菌粒、噬菌体衍生物、动物病毒和粘粒，可根据待导入的宿主细胞而改变。病毒载体技术在本领域中是公知的并在例如Sambrook等(2001，Molecular Cloning:A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，NewYork)和其他病毒学和分子生物学手册中进行了描述。可用作载体的病毒包括但不限于逆转录病毒、腺病毒、腺伴随病毒、疱疹病毒和慢病毒。

为了评估多肽或其部分的表达，被引入细胞的载体也可包含可选择的标记基因或报道基因中的任一个或两者，以便于从通过病毒载体寻求被转染或感染的细胞群中鉴定和选择表达细胞。

细胞

适用于导入本文所述核酸构建物的宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属；鼠伤寒沙门氏菌的细菌细胞；真菌细胞如酵母；果蝇S2或Sf9的昆虫细胞；CHO、COS7、293细胞的动物细胞等。哺乳动物细胞的示例包括免疫细胞，优选免疫效应细胞。“免疫效应细胞”是可执行免疫效应功能的免疫细胞，包括：T细胞、NK细胞、外周血单个核细胞(PBMC)、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、造血干细胞。适用于本发明的T细胞可以是各种来源的各种类型的T细胞。

将核酸或载体引入哺乳动物细胞的方法是本领域已知的，所述载体可以通过物理、化学或生物方法转入细胞。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl2法处理，所用的步骤在本领域众所周知。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔，脂质体包装等。在一些实施方案中，转导的或转染的免疫效应细胞在引入核酸或载体之后离体繁殖。

获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的抗体。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。

在上面的方法中的多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。比如，用Protein A或G Sepharose FF柱进行过柱，洗去非特异性结合的组分，再用酸性缓冲液洗脱结合的抗体，用SDS-PAGE检测抗体片段，收集的抗体可用常规方法进行过滤浓缩。可溶的混合物和多聚体，也可以用常规方法去除，比如凝胶过滤层析、离子交换。得到的产物需立即冷冻，如80℃，或者冻干。

用途和方法

通过构建纳米抗体文库，发明人筛选了可以结合PRLR的纳米抗体及其变体。通过蛋白水平结合检测、亲和力检测和竞争阻断实验和组织交叉反应验证了这些抗体的对抗原的结合能力。

本文所述的抗体、编码序列、核酸构建物、和细胞的所有方面都可用于制备用以预防或治疗本文所述各种病况和疾病的药物，所述病况和疾病是与PRLR表达相关的疾病或病况，指由PRLR表达异常所直接或间接导致的疾病，通常是指由PRLR过表达所导致的疾病，例如癌症，包括但不限于：急性淋巴细胞白血病(ALL)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)和B细胞淋巴瘤，例如复发或难治性急性淋巴细胞白血病(r/r ALL)；复发或难治性弥漫性大B细胞淋巴瘤(r/r DLBCL)；复发或难治性滤泡性淋巴瘤(r/r FL)等。

本文还提供一种药物组合物，该药物组合物中含有抗体或其抗原结合片段、融合蛋白、核酸分子、核酸构建物和细胞中的任意一种或多种，和药学上可接受的辅料。

本发明的抗体、核酸或细胞可被单独施用或作为药物组合物与稀释剂和/或与其他组分诸如相关的细胞因子或细胞群结合施用。在此方面，药物组合物可以通过使具有所需纯度的活性药剂与任选的药学上可接受的载剂混合以冻干制剂或水溶液的形式制备。药学上可接受的载剂在所用的剂量和浓度下对接受者是无毒的，可包括缓冲剂(例如中性缓冲盐水、硫酸盐缓冲盐水)、抗氧化剂、防腐剂、等渗剂、稳定剂、螯合剂(例如EDTA或谷胱甘肽)、佐剂(例如氢氧化铝)和表面活性剂中的至少一种。此外，为了使药物组合物可用于体内施用，它们必须是无菌的。可以通过无菌过滤膜过滤使药物组合物无菌。

在一些实施方案中，药物组合物可以含有：细胞毒性剂、化学治疗剂、细胞因子、免疫抑制剂、生长抑制剂以及待治疗的具体适应症所需的活性药剂中的至少一种添加剂。添加剂的具体添加量可根据实际需要进行调整。

本发明的药物组合物可以以“免疫学上有效量”、“抗肿瘤有效量”、“肿瘤-抑制有效量”或“治疗量”的量施用。“治疗”指向受试者采用本文所述治疗方案以达到至少一种阳性治疗效果(比如，癌症细胞数目减少、肿瘤体积减小、癌细胞浸润至周边器官的速率降低或肿瘤转移或肿瘤生长的速率降低)。当指出“免疫学上有效量”、“抗肿瘤有效量”、“肿瘤-抑制有效量”或“治疗量”时，待施用的本发明组合物的精确量可由医师确定，其考虑患者(对象)的年龄、重量、肿瘤大小、感染或转移程度和病症的个体差异。通常，包括本文描述的T细胞的药物组合物可以以104至109个细胞/kg体重的剂量，优选105至106个细胞/kg体重的剂量。T细胞组合物也可以以这些剂量多次施用。细胞可通过使用免疫疗法中公知的注入技术(见例如Rosenberg等，New Eng.J.of Med.319:1676，1988)施用。对于具体患者的最佳剂量和治疗方案可通过监测患者的疾病迹象并因此调节治疗由医学领域技术人员容易地确定。

组合物的施用可以以任何方便的方式进行，包括通过喷雾法、注射、吞咽、输液、植入或移植。本文描述的组合物可被皮下、皮内、瘤内、结内、脊髓内、肌肉内、通过静脉内注射或腹膜内施用给患者。组合物可被直接注入肿瘤、淋巴结或感染位置。

在本发明的一些实施方案中，本发明的组合物可与本领域已知的其它疗法结合。所述疗法包括但不限于化疗、放疗和免疫抑制剂。例如，可结合本领域周知的治疗PRLR介导的疾病的放疗或化疗制剂进行治疗。

本文中，“抗肿瘤效应”指一种生物学效应，其可由肿瘤体积的减少、肿瘤细胞数的减少、转移数的减少、预期寿命的增加或与癌相关的各种生理症状的改善表示。

“患者”、“对象”、“个体”等等在本文中可交换使用，指可引起免疫应答的活有机体，如哺乳动物。例子包括但不限于人、狗、猫、小鼠、大鼠和其转基因物种。

本发明通过参考以下实验实施例进一步详细地进行描述。这些实施例仅出于说明性的目的提供，并不意欲为限制性的，除非另有规定。因此，本发明决不应被解释为限于以下实施例，而是应被解释为包括由于本文提供的教导变得显而易见的任何和全部的变化。实施例中所用的方法和试剂，除非另有说明，否则为本领域常规的方法和试剂。

诊断、检测和试剂盒

本发明的抗体因其与PRLR的高亲合力可用于测定，例如结合测定来检测和/或定量在组织或细胞中表达的PRLR。抗体可用在进一步研究PRLR在疾病中的作用的研究中。检测PRLR的方法大致如下：获得细胞和/或组织样本；检测样本中PRLR的水平。

本发明的PRLR抗体可用于诊断目的，用来检测、诊断或监控与PRLR相关的疾病和/或病况。本发明提供使用本领域技术人员已知的经典免疫组织学方法检测样本中PRLR的存在。可以体内或体外进行PRLR的检测。适用于检测PRLR的存在的方法实例包括ELISA、FACS、RIA等。

对于诊断应用来说，通常用可检测的标记基团来标记抗体。合适的标记基团包括(但不限于)以下：放射性同位素或放射性核素(例如，3H、14C、15N、35S、90Y、99Tc、111In、125I、131I)、荧光基团(例如，FITC、罗丹明、镧系元素磷光体)、酶促基团(例如，辣根过氧化物酶、β根半乳糖苷酶、荧光素酶、碱性磷酸酶)、化学发光基团、生物素基基团或由二级报导体识别的预定多肽表位(例如，亮氨酸拉链对序列、用于二级抗体的结合位点、金属结合结构域、表位标签)、MRI(磁共振成像)或CT(电子计算机X射线断层扫描技术)造影剂。用于标记蛋白质的各种方法在本领域中已知且可用来进行本发明。

本发明的另一方面提供检测与本发明的抗体竞争结合PRLR的测试分子的存在的方法。一种所述测定的实例将涉及在存在或不存在测试分子的情形下检测含有一定量PRLR的溶液中的游离抗体的量。游离抗体(即，未结合PRLR的抗体)的量增加将表示测试分子能与该抗体竞争结合PRLR。在一个实施方案中，用标记基团标记抗体。或者，标记测试分子并在存在或不存在抗体的情形下监控游离测试分子的量。

本发明还提供了用于检测PRLR水平的检测试剂盒，该试剂盒包括PRLR抗体，用于溶解样本的裂解介质，检测所需的通用试剂和缓冲液，如各种缓冲液、检测标记、检测底物等。该检测试剂盒可以是体外诊断装置。

实施例

以下结合实施例进一步描述本公开，但这些实施例并非限制本公开的范围。本公开实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，如冷泉港的抗体技术实验手册，分子克隆手册；或按照原料或商品制造商所建议的实验条件。未注明具体来源的试剂，为市场购买的常规试剂。

实施例1.PRLR抗原及检测用蛋白的制备

以人的PRLR蛋白(Uniprot号：P16471)胞外结构域(25-234位氨基酸序列)或食蟹猴的PRLR蛋白(Uniprot号：G8F5S4)胞外结构域(25-234位氨基酸序列)为模板，设计带有不同融合标签的抗原及检测用蛋白，包括avi-(his)₆标签(SEQ ID NO:99第211-231位氨基酸)以及小鼠IgG2a Fc(mFc)标签(SEQ ID NO:100第214-446位氨基酸)。带avi-(his)₆标签的人的PRLR蛋白胞外段(hPRLR-ECD-avi-his)如SEQ ID NO：99所示。带小鼠IgG2a Fc(mFc)标签的人PRLR蛋白胞外段(hPRLR-ECD-mFc)如SEQ ID NO：100所示。带avi-(his)6标签的食蟹猴的PRLR蛋白胞外段(cynoPRLR-ECD-avi-his)如SEQ ID NO：101所示。

合成编码上述蛋白的DNA序列(上海生工生物)并插入pcDNA3.1表达载体构建表达重组蛋白的质粒。采用PEI(polyscience)将目的质粒转染至Expi293F(Thermo)细胞中表达蛋白。四天后收集细胞培养液上清，高速离心后收集细胞培养上清液，并用0.22μm的滤膜过滤去除残余的细胞碎片。

抗原蛋白根据所带标签的不同采用镍柱或Protein A柱(GE)进行纯化。纯化后的样品经浓缩、SDS-PAGE及质谱鉴定后，分装冻存于-80℃备用。

实施例2.表达PRLR细胞系的构建

合成编码人PRLR完整序列(Uniprot号：P16471，1-622。)并带有编码P2A-GFP标签序列(SEQ ID NO：102第625-882位)的DNA(编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：102所示)，插入pcDNA3.1表达载体中。纯化后的质粒经Pvu I(NEB)酶切后，采用Lipofectamine LTX(Thermo)转染至HEK293，Cos7或CHO K1细胞中。转染24小时后，加入700-1000μg/mL的G418进行筛选。在含有G418的培养液中连续培养2周后，采用流式细胞术检测GFP表达并分选出GFP阳性细胞。经单细胞分选、扩增培养构建表达PRLR的稳转细胞系HEK293-PRLR、CHOK1-PRLR以及Cos7-PRLR。

实施例3.抗人PRLR杂交瘤单克隆抗体的获得和制备

1.小鼠免疫

选择6-8周龄Balb/c雌鼠(广东药康生物科技有限公司)，将重组表达的蛋白抗原hPRLR-ECD-avi-his或hPRLR-ECD-mFc(蛋白浓度为：1-2mg/mL)与等体积的佐剂[可选用：弗氏完全佐剂(Sigma，F5881-10ML)、弗氏不完全佐剂(344291-10ML)、TiterMax Gold佐剂(Sigma,T2684)、Alum(Thermo,77161)等]充分混合进行免疫。初次免疫采用弗氏完全佐剂或TiterMax Gold佐剂制备的抗原乳化液，每只小鼠皮下注射50-100ug抗原。首次免疫后第14、28天进行加强免疫，加强免疫采用蛋白与弗氏不完全佐剂或Alum混合制备抗原悬液。每只小鼠腹腔或皮下注射25-50ug抗原。第35天采血检测抗体滴度，根据抗体滴度高低确定继续进行加强免疫或进行最后一次冲刺免疫。冲刺免疫采用50-100ug纯蛋白溶液(蛋白溶解于磷酸盐缓冲液或生理盐水)通过小鼠尾静脉进行注射。免疫3天后将小鼠安乐死处理，采集小鼠血液，脾脏及淋巴结样本用于检测及杂交瘤制备。

2.杂交瘤制备

通过本领域技术人员所共知的方法制备杂交瘤细胞。具体来说，通过将新鲜采集的小鼠脾脏细胞或淋巴结细胞制备成单细胞悬液。加入红细胞裂解液(碧云天，C3702)常温处理5分钟裂解红细胞，离心、计数后与Sp2/0骨髓瘤细胞系进行混合(脾细胞:sp2/0细胞比例为2:1)，采用20mL电融合缓冲液(BTX cytofusion mediumc C)充分洗涤后进行电融合(BTX ECM2001)制备杂交瘤细胞。采用9mL融合池，设置电融合参数如下(AC参数:75V/75V/30s/1.0MHz；DC参数:800V/40μs/1/0.000s；AC参数:75V/75V/30s/1.0MHz)融合池，加入充分混匀的细胞悬液体积7.2mL，立即开始融合，融合好的杂交瘤细胞用HAT完全培养基(含10％FBS、1×HAT、1×P/S、1×Glutamax、1×丙酮酸盐的RPMI-1640培养基)重悬，接种于96孔细胞培养板中(1×10⁵/100μl/孔)，37℃，5％CO₂培养。每间隔3天进行换液。融合后第14天，根据细胞生长情况进行ELISA检测。

3.杂交瘤细胞筛选

将3ug/mL的抗原蛋白(100μL/孔)加入96孔高吸附板中(Nunc MaxiSorp^TM，44-2404-21)，4℃孵育过夜。第二天，用含3％脱脂奶粉的PBS封闭液封闭96孔板(300μL/孔)，室温放置1小时，用含有0.1％ Tween-20的PBS洗涤液洗涤96孔板3次后，每孔加入100μL杂交瘤上清，室温放置1小时。洗涤96孔板3次，每孔加入100μL稀释2000倍HRP标记的羊抗鼠抗体(Thermo，A10521)，室温孵育1小时。用洗涤液洗板4次后，加入50μLTMB显色液(Invitrogen，002023)显色2-5分钟。加入1M硫酸终止反应，用酶标仪记录450nm吸光值。阳性杂交瘤进行流式分选，1细胞/孔接种至新的96孔板中，培养、扩增并冻存。

实施例4.抗人PRLR抗体的噬菌体展示文库构建及筛选

通过抽提免疫小鼠脾细胞RNA，合成cDNA后构建单链抗体(scFv)-噬菌体展示文库，通过噬菌体表面展示技术筛选目标抗体。具体来说，合成cDNA后，通过简并引物，如AKrebber等人，Journal ofImmunological Methods 201(1997)35–55给出的引物组合，进行PCR扩增获得目标抗体的重链及轻链序列DNA并构建单链抗体-噬菌体展示的免疫文库。通过本领域技术人员所共知各种淘选方法获得目标克隆序列。

实施例5.抗PRLR抗体重链及轻链可变区序列

表2列出了本公开获得的抗PRLR抗体重链，轻链可变区和CDR区氨基酸序列所对应的序列编号。抗体编号以P作为前缀的序列来自噬菌体展示筛选，编号以H作为前缀的序列来自杂交瘤筛选，编号以HP作为前缀的序列来自用阳性杂交瘤克隆cDNA构建的噬菌体文库。

表2.鼠源抗PRLR抗体重链及轻链序列列表

实施例6.抗PRLR抗体的表达、纯化

设计引物并通过PCR扩增得到表2抗体的VH和VL基因片段，分别与人IgG1重链及轻链的恒定区基因片段CH1-Hinge-CH2-CH3和CL进行overlap PCR得到融合DNA序列，插入哺乳动物表达载体pCDNA3.1中，构建得到表达嵌合抗体的重、轻链质粒载体。经过测序验证序列正确后，采用去内毒素的质粒提取试剂盒提取质粒载体，-20℃条件下保存备用。将Expi293F稀释至密度约为4x10⁶细胞/mL，将分别表达抗体轻、重链的质粒采用PEI40000(polysciences)转染试剂共转染入Expi293F细胞。四天后收集细胞培养液上清，高速离心后收集细胞培养上清液，并用0.22μm的滤膜过滤去除残余的细胞碎片。过滤后的细胞培养上清液用Protein A柱进行纯化，用PBS缓冲液冲洗Protein A柱去除杂蛋白，至A280示数降至基线稳定后，用pH3.2的0.1M乙酸-乙酸钠溶液洗脱目的蛋白，收集目标蛋白峰，用1M的Tris-HCl，pH8.0溶液中和。样品浓缩后，用凝胶层析柱ENrichTM SEC650(Bio-red)进一步纯化，去除聚集体，收集单体峰。收集后的样品经4-12％的SDS-PAGE梯度胶电泳检测后，分装后于-80℃条件下保存备用。

实施例7.抗PRLR抗体种属特异性ELISA检测

将单体鼠、猴及人PRLR胞外域重组抗原蛋白稀释到PBS缓冲液中(终浓度为1μg/mL)，将抗原蛋白加入96孔高吸附板中(100μL/孔)，4℃孵育过夜。第二天，用含3％脱脂奶粉的PBS封闭液封闭96孔板(300μL/孔)，室温放置1小时，用含有0.1％ Tween-20的PBS洗涤液洗涤96孔板3次后，每孔加入100μL纯化后的待测抗体(10μg/mL稀释于PBS)，室温放置1小时。洗涤96孔板3次，每孔加入100μL稀释2000倍HRP标记的羊抗鼠抗体(Thermo)，室温孵育1小时。用洗涤液洗板4次后，加入50μL TMB显色液(Invitrogen)显色2-5分钟。加入1M硫酸终止反应，用酶标仪记录450nm吸光值。表3为本发明所获得抗体的种属特异性ELISA检测结果，对照蛋白为带有相同标签的间皮素重组蛋白。如表3所示，所得到抗体均特异性结合人PRLR胞外段，且由于食蟹猴PRLR胞外段与人PRLR胞外段具有高度序列一致性，仅5个氨基酸位点不同(序列一致性：97.6％)，在23株抗体中，除了18、21以及23号抗体外，大部分抗体均可结合食蟹猴PRLR胞外段。此外，3、7、9、16及19号抗体还可结合鼠的PRLR胞外段。

表3.抗PRLR单克隆抗体种属特异性检测

实施例7.抗PRLR抗体的亲和力检测

采用生物膜干涉技术(OCTET R2，Sartorius)分析抗体与PRLR ECD结合的动力学参数(kon，koff及KD)。将protein A传感器(ProA Biosensors)浸没于含有待分析抗体(200nM)的含0.1％ BSA,0.05％ Tween20,pH 7.4的PBS缓冲液中，使抗体结合到传感器表面。洗涤后将传感器依次浸没于含有不同浓度的单体PRLR抗原缓冲液液中，通过1:1Langmuir模型拟合得到亲和力参数KD。由表4可见大部分抗体可高亲和力结合靶抗原，结合亲和力在nM到pM之间。

表4.抗PRLR的单克隆抗体与单体PRLR胞外段结合动力学参数

实施例10.抗人PRLR单克隆抗体的人源化

通过序列比对挑选与目标鼠源抗体序列同源程度高的人源抗体序列作为模板。通过IMGT编号系统确定鼠源抗体的CDR区域，将重链、轻链的CDR区序列分别移植到人源模板上，同时保留处在下列结构位置的氨基酸为鼠源氨基酸，如Vernier Zone氨基酸(Foote etal.J.Mol.Biol,1992,224,487-499)；处在重轻链界面上，且在结构模型中显示影响重、轻链配对的氨基酸；影响抗体CDR区域结构的氨基酸(Vargas-Madrazo et al.J.Mol.Biol,1995,254,497-504；AI-Lazikani et al.J.Mol.Biol,1997,273,927-948)，从而得到人源化序列。

1.克隆P-PR-C05H的人源化

以人源抗体共同序列作为重链和轻链模板，将鼠的CDR区序列嫁接至人的模板上，且保留对结构功能关键的氨基酸位点为鼠源氨基酸(如表5)，得到P-PR-C05H-v1重链(SEQID NO:20)及轻链序列(SEQ ID NO:40)。对P-PR-C05H-v1重链序列进行S57A突变得到人源化抗体P-PR-C05H-v2(重链序列：SEQ ID NO:21)，抗体序列按IMGT编号规则编号。

表5.P-PR-C05H人源化中保留的鼠源关键氨基酸位点

2.克隆P-PR-C07H的人源化

以人源抗体共同序列作为重链和轻链模板，将鼠的CDR区序列嫁接至人的模板上，且保留对结构功能关键的氨基酸位点为鼠源氨基酸(如表6)，得到P-PR-C07H-v重链(SEQID NO:22)及轻链序列(SEQ ID NO:40)。

表6.P-PR-C07H人源化中保留的鼠源关键氨基酸位点

3.克隆HP-PR01D12的人源化

以人源抗体共同序列作为重链和轻链模板，将鼠的CDR区序列嫁接至人的模板上，且保留对结构功能关键的氨基酸位点为鼠源氨基酸(如表7)，得到HP-PR01D12-v重链(SEQID NO:23)及轻链序列(SEQ ID NO:41)。

表7HP-PR01D12人源化中保留的鼠源关键氨基酸位点

实施例11.人源化PRLR特异性抗体的亲和力检测及表位分析

将单体人或食蟹猴PRLR ECD蛋白进行生物素标记，标记后的蛋白稀释于(100nM)的含0.1％ BSA,0.05％ Tween20,pH 7.4的PBS缓冲液。再将链霉亲和素传感器浸没于含有生物素标记蛋白的溶液中，固化中目的抗原，用缓冲液洗涤传感器后，将传感器依次浸没于含有不同浓度(3.125-100nM)人源化抗体的缓冲液中，结合2分钟，解离8分钟。通过对照传感器扣除后得到人源化抗体标记为P-PR-C05H-v2、P-PR-C07H-v以及HP-PR01D12-v与人PRLR或猴PRLR ECD结合的动力学曲线。通过1:1Langmuir模型拟合得到亲和力参数KD。如表8所示，3个人源化抗体均能高亲和力结合人及猴的PRLR ECD蛋白。

表8.PRLR抗体的动力学及亲和力数据总结

通过BLI对3个人源化抗体的抗原结合表位进行分析。将带有生物素标签的人单体PRLR ECD固定到链酶亲和素(SA)传感器上。用含0.1％ BSA,0.05％ Tween20,pH 7.4的PBS缓冲液将抗P-PR-C05H-v2、hP-PR-C07H-v以及HP-PR01D12-v抗体稀释至终浓度100nM，将传感器浸没于第一个抗体样本中直到信号达到饱和，接着将传感器浸没于100nM的第二个抗体中。识别相同表位的第一、二抗体，在第一抗体饱和了PRLR表面的表位的前提下，第二抗体不能与PRLR结合，有重叠表位时，第二抗体的结合信号有所降低。而针对不同的表位，第二抗体的结合信号与参比(即第一抗体为缓冲液)基本保持一致。通过第二抗体的结合信号与参比的比值进行表位分布的分析。其中比值＜20％，2个抗体为同一表位，在20％-60％之间，表位存在部分重叠，＞60％，表位完全不重叠。3个人源化抗体的表位如表9所示，可见P-PR-C05H-v2与HP-PR01D12-v结合抗原同一表位，而P-PR-C07H-v与P-PR-C05H-v2及HP-PR01D12-v的抗原结合表位接近，但不完全重合。

表9.人源化抗体结合人PRLR的表位分析

	P-PR-C05H-v2	P-PR-C07H-v	HP-PROID12-v
				P-PR-C05H-v2	I12％	350％	155％
P-PR-C07H-v	527％	134％	498％
				HP-PROID12-v	9·2％	318％	144％

实施例12.人源化PRLR特异性抗体介导的受体内化检测

通过免疫荧光检测人源化抗体P-PR-C05H-v2、P-PR-C07H-v以及HP-PR01D12-v与PRLR结合后内化的情况。将10μg/mL的人源化抗体与T47D细胞系(内源性表达人PRLR的乳腺癌细胞系)在4℃条件下共孵育1小时后，洗涤去掉多余的抗体，加入带有FITC荧光标记的抗人Fc抗体，继续在4℃条件下孵育1小时。洗涤去掉多余的抗体，并加入新鲜培养基，将对照组细胞放置于4℃，内化组细胞放置于生理温度条件下(37℃，二氧化碳培养箱)。1小时后，取出细胞，经4％多聚甲醛固定后，在荧光显微镜下观察细胞表面抗原的内化情况。如图1所示，37℃仅孵育1小时，即可明显观察到内化至细胞内部的抗体。

实施例13.人源化PRLR特异性抗体阻断PRL介导的PRLR活化及信号传导

采用荧光素酶报告基因法测定人源化PRLR特异性抗体阻断催乳素(PRL)介导的受体二聚体构象改变及下游信号传导。具体而言，通过Lipofectamine LTX(Thermo，#15338-100)转染编码STAT5依赖性荧光素酶报告基因的质粒pGL4.52(Promega，#E465A)至稳定表达PRLR的HEK293细胞中。转染24小时后，用胰酶消化细胞，计数后，以5x10⁴细胞/孔的比例接种至96孔白板中，再将5nM恒定浓度的PRL与不同浓度的人源化抗体(50pM至100nM)混合后加入细胞中。37℃条件下孵育5小时。孵育结束后，用Bright-Glo^TM试剂(Promega，#E2610)测定每孔中荧光素酶的活性。计算人源化抗体阻断PRL介导受体活化的IC50值。如表10所示，P-PR-C05H-v2、P-PR-C07H-v以及HP-PR01D12-v具有不同的阻断PRL介导受体激活的能力，其中P-PR-C07H-v在100nM的浓度条件下可完全阻断PRL介导的受体活化(信号为基线值)。此外，P-PR-C05H-v2、P-PR-C07H-v以及HP-PR01D12-v本身在(50pM至100nM)的测试浓度下均不激活PRLR。

表10.人源化抗体阻断PRL介导的受体激活

实施例14.抗PRLR抗体-DT3C介导的靶细胞杀伤检测

将293T细胞和293T-PRLR细胞(5000细胞/100μL/孔)分别接种至96孔细胞培养板。培养24小时后，将抗PRLR的抗体与DT3C蛋白加入新鲜培养基，在37℃进行孵育，抗RPLR抗体终浓度分为0.1、1和10μg/mL，对应的DT3C浓度为0.2、2和20μg/mL。孵育结束后，吸弃原96孔板中培养基，将待测样品加入细胞中，同时设置培养基对照组及DT3C对照组。细胞37℃继续培养24h。培养完成后，每孔加入10μL体积CCK8溶液(购自TransGen Biotech，货号为FC101-02)。锡纸包裹96孔板，放入37℃培养箱孵育1h，后使用Synergy H1酶标仪(购于BioTek)进行读数，测定450nm吸光度。如图2所示，3个人源化抗体均可有效介导DT3C对PRLR阳性靶细胞的杀伤而不杀伤不表达PRLR的细胞。

本文序列

Claims

1.一种靶向PRLR的抗体或其抗原结合片段，或与所述抗体或其抗原结合片段具有至少85％序列相同性并保留其PRLR结合活性的变体，所述抗体靶向靶向泌乳素受体的胞外段，

优选地，所述胞外段包括SEQ ID NO:99或101第1-210位氨基酸，

更优选地，所述抗体包含：SEQ ID NO:1-23中任一所示的重链可变区的3个HCDR，和/或SEQ ID NO:24-41中任一所示的轻链可变区的3个LCDR。

2.如权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，

所述抗体的HCDR1包含选自以下的任一种：SEQ ID NO：42-52，或与其具有至少85％序列相同性的序列，和/或

所述抗体的HCDR2包含选自以下的任一种：SEQ ID NO：53-66，或与其具有至少85％序列相同性的序列，和/或

所述抗体的HCDR3包含选自以下的任一种：SEQ ID NO：67-75，或与其具有至少85％序列相同性的序列，和/或

所述抗体的LCDR1包含选自以下的任一种：SEQ ID NO：76-83，或与其具有至少85％序列相同性的序列，和/或

所述抗体的LCDR2包含选自以下的任一种：SEQ ID NO：84-90，或与其具有至少85％序列相同性的序列，和/或

所述抗体的LCDR3包含选自以下的任一种：SEQ ID NO：91-98，或与其具有至少85％序列相同性的序列，

优选地，所述抗体含有表1任一行所示抗体的HCDR1、HCDR2、HCDR3或与其具有至少85％序列同一性的序列，和/或所述抗体含有表1任一行所示抗体的LCDR1、LCDR2和LCDR3，或与其具有至少85％序列同一性的序列，

更优选地，所述抗体含有表1任一行所示抗体的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3。

3.如权利要求1或2所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体的轻链可变区包含鼠源或人源轻链FR区，所述抗体的重链可变区包含鼠源或人源重链FR区，

优选地，所述抗体的重链可变区的FR1、FR2、FR3和FR4各自分别独立选自SEQ ID NO:1-23中任一所示的重链可变区的FR1、FR2、FR3和FR4，和/或，所述抗体的轻链可变区的FR1、FR2、FR3和FR4各自分别独立选自SEQ ID NO:24-41中任一所示的轻链可变区的FR1、FR2、FR3和FR4，

更优选地，所述抗体含有表1任一行所示抗体的VH、VL或VH和VL，或与其具有至少85％序列相同性的序列。

4.如权利要求1或2所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，

所述抗体还包含重链恒定区和/或轻链恒定区，和/或

所述抗体是多特异性抗体，和/或

所述抗体是单克隆抗体，和/或

所述抗体是嵌合抗体或完全人抗体。

5.一种融合蛋白或抗体偶联物，其包含权利要求1-4中任一项所述抗体或其抗原结合片段。

6.一种多核苷酸，选自：

(1)权利要求1-4中任一项所述抗体或其抗原结合片段、或权利要求5所述的融合蛋白或抗体偶联物的编码序列；

(2)(1)的互补序列。

7.一种核酸构建物，其表达权利要求1-4中任一项所述抗体或其抗原结合片段、或权利要求5所述的融合蛋白或抗体偶联物，或包含权利要求6所述的多核苷酸，

优选地，所述核酸构建物是载体。

8.含权利要求1-4中任一项所述抗体或其抗原结合片段的噬菌体或包含该噬菌体的文库。

9.一种宿主细胞，其：

(1)表达和/或分泌权利要求1-4中任一项所述抗体或其抗原结合片段；

(2)包含权利要求6所述的多核苷酸；和/或

(3)包含权利要求7所述的核酸构建物，

优选地，所述宿主细胞是哺乳动物细胞。

10.一种产生抗体或其抗原结合片段的方法，包括：在适合产生抗体或其抗原结合片段的条件下培养权利要求9所述的宿主细胞，和任选的从培养物中纯化所述抗体或其抗原结合片段。

11.一种药物组合物，包含权利要求1-4中任一项所述抗体或其抗原结合片段、融合蛋白、抗体偶联物、多核苷酸、核酸构建物、噬菌体或宿主细胞，和药学上可接受的辅料。

12.权利要求1-4中任一项所述抗体或其抗原结合片段、权利要求5所述的融合蛋白或抗体偶联物、权利要求6所述的多核苷酸、权利要求7所述的核酸构建物或权利要求9所述的宿主细胞在制备用于预防或治疗疾病的药物中的用途，

优选地，所述疾病包括：癌症、子宫内膜异位、脱发、骨质疏松、肥胖、PRLR活化导致的良性病变，

更优选地，所述癌症是PRLR相关癌症，

进一步优选地，所述癌症选自卵巢癌、黑色素瘤、前列腺癌、肠癌、胃癌、食管癌、乳腺癌、肺癌、肾癌、胰腺癌、子宫癌、肝癌、膀胱癌、子宫颈癌、口腔癌、脑癌、睾丸癌、皮肤癌、甲状腺癌以及血液学恶性肿瘤。

13.一种检测PRLR的试剂盒，用于评估药物治疗效果或诊断癌症，所述的试剂盒包含权利要求1-4中任一项所述抗体或其抗原结合片段、权利要求5所述的融合蛋白或抗体偶联物、权利要求6所述的多核苷酸、权利要求7所述的核酸构建物、权利要求8所述的噬菌体或权利要求9所述的宿主细胞，

优选地，所述试剂盒还包括用于检测PRLR与抗体或其抗原结合片段、融合蛋白、或抗体偶联物的结合的试剂。

14.权利要求1-4中任一项所述抗体或其抗原结合片段、或权利要求5所述的融合蛋白或抗体偶联物、权利要求6所述的多核苷酸、权利要求7所述的核酸构建物、权利要求8所述的噬菌体或权利要求9所述的宿主细胞在制备用于检测样品中PRLR、评估药物治疗效果或诊断癌症的试剂盒中的用途。