CN109627337B

CN109627337B - 一种抗prlr的单克隆抗体及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN109627337B
Application number: CN201811635875.3A
Authority: CN
Inventors: 何虹霖; 姜伟东
Original assignee: Shanghai Fuhong Hanlin Biopharmacy Co ltd; Shanghai Henlius Biotech Inc
Current assignee: Shanghai Fuhong Hanlin Biomedical Co ltd; Shanghai Fuhong Hanlin Biopharmacy Co ltd; Shanghai Henlius Biotech Inc
Priority date: 2018-12-29
Filing date: 2018-12-29
Publication date: 2023-07-21
Anticipated expiration: 2038-12-29
Also published as: CN109627337A

Abstract

本发明属于生物医药领域，更具体地，公开了一种抗PRLR的单克隆抗体及其制备方法和应用。本发明的抗PRLR单克隆抗体具有良好的生物活性，能够更有效结合PRLR蛋白，在蛋白水平较好地封闭PRLR蛋白与其受体相结合，本发明所得单克隆抗体对T47D细胞具有显著的ADCC作用，能通过NK细胞，有效地杀伤肿瘤细胞，能够单独或与其它抗肿瘤药物联合应用在肿瘤免疫治疗以及诊断和筛查中，还具有制备治疗肿瘤、抗自身免疫性疾病等药物的良好前景。

Description

一种抗PRLR的单克隆抗体及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及生物医药领域，具体涉及一种抗PRLR的单克隆抗体及其制备方法和应用。

背景技术

催乳素（Prolactin，PRL）又叫促乳素或催乳激素，是一种由脑垂体分泌的蛋白质激素，主要作用为促进乳腺发育生长，刺激并维持乳汁分泌。但是近来研究发现，在女性外周血中，过高的催乳素与乳腺癌的发生高度相关，尤其是对于雌激素受体阳性的病人。PRL通过与位于靶细胞质膜上的一对单跨膜（TM）结构域1型细胞因子受体相互作用激活靶细胞。PRL的同种型受体是通过从单个基因转录的RNA的差异剪接（Kelly PA et al, 1991，Endocr Rev 12:235–251）或通过翻译后修饰得到的。在鉴定和表征人PRL（hPRL）信号通路中涉及的分子方面取得了实质性进展（Clevenger CV et al., 2001.Lupus 10:706–718）；这些途径包括Janus激酶（JAK）/信号转导和转录激活因子（STAT）系统等（Watson CJ etal., 1996. Rev Reprod 1:1–5）。催乳素能促进乳腺上皮细胞的增殖和分化，在乳腺癌发生过程中起到非常重要的作用。另外，催乳素水平的升高，刺激了乳腺癌组织中与碳水化合物合成代谢有关的酶，加速乳腺癌组织中脂质和碳水化合物的代谢，因此在很大程度上加速了乳腺癌的发生。

催乳素通过结合其受体（Prolactin Receptor，PRLR）来发挥其生物学功能。PRLR是一种与乳腺癌高度相关的I型细胞因子受体。人催乳素受体（hPRL）是由三个主要结构域组成的I型细胞因子受体，三种主要结构域包括：EC，TM和IC。 hPRL受体存在通过差异RNA剪接或翻译后切割产生的几种同型受体（Tan D et al., 2008. Biochemistry 47:479–489）。在EC或IC结构域中能够观察到这些结构变异，其中TM结构域在所有报道的同型受体中是相同的。 IC结构域的差异剪接产生了长型受体（Boutin JM et al., 1989. MolEndocrinol 3:1455–1461），中间型受体（Kline JB et al., 1999. J Biol Chem 274:35461–35468）和两种形式的短型hPRL受体（Hu ZZ et al., 2001. J Biol Chem 276:41086–41094）。

虽然PRLR自身缺少细胞内的激酶活性结构域，但当催乳素与PRLR结合时，会诱发PRLR形成二聚体，进而使其细胞内部结构发生改变，活化细胞内部的其它因子从而发挥细胞学功能。主要的信号通路是Jak2/Stat5，除此之外，还有Jak1/Stat3，PI3K/Akt，Raf/MEK/ERK。另外，除了催乳素，生长激素（growth hormone）和胎盘催乳素（placental lactogen）也是PRLR的配体。PRLR还与其它生长因子受体和激素受体信号通路存在交联关系，例如胰岛素生长因子受体1（IGF1R），表皮生长因子受体（EGFR），表皮生长因子受体2（HER2），雌激素受体α（ERα）等。

已有研究表明，通过作用PRLR，阻断其信号通路，在体外可以抑制乳腺癌细胞的增殖。动物体内实验也证明，抗PRLR抗体可以抑制肿瘤细胞在体内的生长，从而预示抗PRLR抗体可能具有治疗与催乳素相关的癌症的作用前景。因此研发抗PRLR单克隆抗体，用于癌症的治疗，使其具有更高的选择性和亲和力、更低的毒副作用以及较为低廉的用药成本，从而为肿瘤患者提供更多的单克隆抗体类药物选择，已经成为亟待解决的问题。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供了一种新的抗PRLR单克隆抗体，从而完成了本发明。

因此，本发明的第一个目的在于提供一种抗PRLR单克隆抗体的氨基酸序列。

本发明的第二个目的在于提供编码所述抗PRLR单克隆抗体的核苷酸分子。

本发明的第三个目的在于提供包含所述核苷酸分子的表达载体。

本发明的第四个目的在于提供包含所述表达载体的宿主细胞。

本发明的第五个目的在于提供一种所述抗PRLR单克隆抗体的制备方法。

本发明的第六个目的在于提供包含所述抗PRLR单克隆抗体的组合物。

本发明的第七个目的在于提供所述抗PRLR的单克隆抗体在制备PRLR分子阻滞药物中的用途。

为了实现上述目的，本发明采取了如下技术方案：

本发明采取的技术方案之一为：一种抗PRLR的单克隆抗体，该单克隆抗体包含重链可变区和轻链可变区，其所述重链可变区的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO:7所示，所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO:13所示。

本发明所述的抗PRLR的单克隆抗体为常规的单克隆抗体，单克隆抗体的结合区通常包括重链可变区和轻链可变区。较佳的，本发明所述抗PRLR的单克隆抗体的重链可变区氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO:7所示，其轻链可变区的氨基酸序列如序列表中SEQ IDNO:13所示。较佳地，所述抗PRLR单克隆抗体为人源的。

本发明所述的抗PRLR的单克隆抗体，重链可变区和轻链可变区序列都包含互补决定区（CDR区）序列，即重链可变区包括CDR1、CDR2和CDR3序列，轻链可变区包括CDR1’、CDR2’和CDR3’序列。较佳地，本发明所述抗PRLR单克隆抗体重链可变区中CDR1的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO:8所述，其中CDR2的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO:9所述，其中CDR3的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO:10所述。

较佳地，本发明所述抗PRLR单克隆抗体轻链可变区CDR1’的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO:14所述，其中CDR2’的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO:15所述，其中CDR3’的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO:16所述。

所述抗PRLR单克隆抗体可以是抗体的全长序列，也可以是抗PRLR人源抗体的片段，所述片段较佳地为Fab、Fab’、F(ab’)₂、Fv或scFv等。优选的，所述抗PRLR人源抗体是人源的。更优选的，所述抗PRLR人源抗体为IgG₁、IgG₂或IgG₄型抗体。

本发明进一步提供所述抗PRLR人源抗体的衍生物，所述衍生物为PRLR人源抗体的片段、抗体/抗体片段-因子融合蛋白、抗体/抗体片段-化学偶联物；所述抗PRLR人源抗体的片段为Fab、Fab’、F(ab’)₂、Fv或scFv等。

较佳地，所述抗体/抗体片段-因子融合蛋白具体为抗体-因子融合蛋白、或抗体片段-因子融合蛋白。较佳地，所述抗体/抗体片段-化学偶联物具体为抗体-化学偶联物、或抗体片段-化学偶联物。

本发明所述单克隆抗体可以由本领域常规技术制备，包括杂交瘤技术、噬菌体展示技术、单淋巴细胞基因克隆技术等，较佳地是通过杂交瘤技术从野生型或转基因小鼠制备单克隆抗体。

本发明采取的技术方案之二为：一种分离的核苷酸分子，其编码所述抗PRLR单克隆抗体的重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示，其编码所述抗PRLR轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO:12所示。

所述核苷酸分子的制备方法为本领域常规制备方法，较佳地包括以下制备方法：通过基因克隆技术例如PCR方法等，获得编码所述单克隆抗体的核苷酸分子，或者通过人工全序列合成的方法得到编码上述单克隆抗体的核苷酸分子。

本领域技术人员知晓，编码上述单克隆抗体的氨基酸序列的核苷酸序列可以适当引入替换、缺失、改变、插入或增加来提供一个多聚核苷酸的同系物或其保守型变异序列。本发明中多聚核苷酸的同系物或其保守型变异序列，可以通过对编码该单克隆抗体基因的一个或多个碱基在保持抗体活性范围内进行替换、缺失或增加来制得。

本发明采取的技术方案之三为：一种表达载体，所述表达载体含有如上所述的核苷酸分子。

其中所述表达载体为本领域常规的表达载体，是指包含适当的调控序列，例如启动子序列、终止子序列、多腺苷酰化序列、增强子序列、标记基因和/或序列以及其他适当的序列的表达载体。所述表达载体可以是病毒或质粒，如适当的噬菌体或者噬菌粒，更多技术细节请参见例如Sambrook等，Molecular Cloning： A Laboratory Manual，第二版，ColdSpring Harbor Laboratory Press，1989。许多用于核酸操作的已知技术和方案请参见Current Protocols in Molecular Biology，第二版，Ausubel等编著。本发明中的表达载体指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒或其他载体。

较佳地，所述表达载体选自pHLX101、pEE14.4、pCHO 1.0或pcDNA3.1中的一种或多种的组合，更佳地为pcDNA3.1。

本发明采取的技术方案之四为：一种宿主细胞，所述宿主细胞包含如上所述的表达载体。

本发明所述的宿主细胞为本领域常规的各种宿主细胞，只要能满足使上述重组表达载体稳定地自行复制，且所携带所述的核苷酸可被有效表达即可。本发明中的宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。所述表达载体较佳地包括：COS、CHO（中国仓鼠卵巢，Chinese H amster Ovary）、HeLa细胞系、骨髓细胞系如SP2/0细胞系、NS0、sf9、sf21、DH5α、BL21(DE3)或E.coliTG1、YB2/0细胞系等以及转化的B-细胞或杂交瘤细胞中的一种或多种的组合。更佳地为E.coliTG1、BL21细胞（表达单链抗体或Fab抗体）或者CHO-K1细胞（表达全长IgG抗体）。

将前述表达载体转化至宿主细胞中，即可得本发明优选的重组表达转化体。其中所述转化方法为本领域常规转化方法，较佳地为化学转化法，热激法或电转法。

本发明采取的技术方案之五为：所述抗PRLR的单克隆抗体的制备方法，其包括以下步骤：

a)在表达条件下，培养如上所述的宿主细胞，表达抗PRLR的单克隆抗体；

b)分离并纯化步骤a)所得抗PRLR的单克隆抗体。

本发明所述的宿主细胞的培养方法，所述抗PRLR的单克隆的分离和纯化方法为本领域常规方法，具体操作方法请参考相应的细胞培养技术手册以及单克隆抗体分离纯化技术手册。

本发明中所用的宿主细胞均为现有技术，可通过商业途径直接获取，培养中所用的培养基亦为各种常规培养基，本领域技术人员可根据经验选择适用的培养基，在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法（如温度转换或化学诱导）诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理（盐析方法）、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析（凝胶过滤）、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析（HPLC）和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。

本发明从单克隆培养的细胞株中筛选获取目的抗体的基因序列，用以构建真核表达载体，表达后即可重建抗体的活性，获得抗PRLR单克隆抗体。

本发明采取的技术方案之六为：一种组合物，其包含有效量的如上所述抗PRLR的单克隆抗体和药学上可接受的载体。

本发明的单克隆抗体可以通过本领域任何已知的方式配制药物组合物来使用。这种组合物以所述单克隆抗体为活性成分，加上一种或多种药物可接受的载体、稀释剂、填充剂、结合剂及其它赋形剂，这依赖于给药方式及所设计的剂量形式。本领域枝术人员已知的治疗惰性的无机或有机的载体包括（但不限于）乳糖、玉米淀粉或其衍生物、滑石、植物油、蜡、脂肪、多羚基化合物例如聚乙二醇、水、蔗糖、乙醇、甘油，诸如此类，各种防腐剂、润滑剂、分散剂、矫味剂。保湿剂、抗氧化剂、甜味剂、着色剂、稳定剂、盐、缓冲液诸如此类也可加入其中，这些物质根据需要用于帮助配方的稳定性或有助于提高活性或它的生物有效性或在口服的情况下产生可接受的口感或气味，在这种组合物中可以使用抑制剂可是其原始化合物本身的形式，或任选地使用其药物学可接受的盐的形式，本发明的单克隆抗体可以单独给药，或以各种组合给药，以及与其它治疗药剂一起结合形式给药。如此配制的组合物根据需要可选择本领域技术人员已知的任何适当的方式把抑制剂进行给药。

本发明提供的抗PRLR单克隆抗体，可以和药学上可以接受的载体一起组成药物制剂组合物从而更稳定地发挥疗效，这些制剂可以保证本发明公开的抗PRLR单克隆抗体的氨基酸核心序列的构像完整性，同时还保护蛋白质的多官能团防止其降解（包括但不限于凝聚、脱氨或氧化）。通常情况下，对于液体制剂，通常可以在2°C-8°C条件下保存至少稳定一年，对于冻干制剂，在30°C至少六个月保持稳定。所述抗PRLR单克隆抗体制剂可为制药领域常用的混悬、水针、冻干等制剂，优选水针或冻干制剂。

对于本发明公开的抗PRLR的单克隆抗体的水针或冻干制剂，药学上可以接受的载体较佳地包括但不限于：表面活性剂、溶液稳定剂、等渗调节剂和缓冲液之一或其组合。其中表面活性剂较佳地包括但不限于：非离子型表面活性剂如聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯（吐温20或80）；poloxamer（如poloxamer 188）；Triton；十二烷基硫酸钠（SDS）；月桂硫酸钠；十四烷基、亚油基或十八烷基肌氨酸；Pluronics；MONAQUAT^TM等，其加入量应使抗PRLR单克隆抗体的颗粒化趋势最小。溶液稳定剂较佳地包括但不限于以下列举之一或其组合：糖类，例如，还原性糖和非还原性糖；氨基酸类，例如，谷氨酸单钠或组氨酸；醇类，例如：三元醇、高级糖醇、丙二醇、聚乙二醇等，溶液稳定剂的加入量应该使最后形成的制剂在本领域的技术人员认为达到稳定的时间内保持稳定状态。等渗调节剂较佳地包括但不限于氯化钠、甘露醇之一或其组合。缓冲液较佳地包括但不限于：Tris、组氨酸缓冲液、磷酸盐缓冲液之一或其组合。

本发明采取的技术方案之七为：如上所述抗PRLR的单克隆抗体在制备PRLR分子阻滞药物中的用途。

所述制备PRLR分子阻滞药物中的用途，更佳地为制备肿瘤治疗或肿瘤诊断类药物上的用途。

本发明所述的药物较佳地为抗肿瘤、治疗自身免疫性疾病、治疗感染性疾病和/或抗移植排斥反应的药物，更佳地为抗肿瘤药物、治疗自身免疫性疾病药物，优选地为抗肿瘤药物。本发明所述抗PRLR的单克隆抗体可以单独使用或与其他抗肿瘤药物联合使用。所述其他抗肿瘤药物为本领域常规抗肿瘤药物，包括抗体类药物或小分子抗肿瘤药物。所述抗体类药物为本领域常规抗体类药物，较佳地包括抗PD-1单克隆抗体、伊匹单抗等。所述小分子抗肿瘤药物为本领域常规药物，包括紫杉醇、5-Fu嘧啶等。

其中所述抗肿瘤药物所针对的肿瘤较佳地包括但不限于：肺癌、肝癌、卵巢癌、宫颈癌、皮肤癌、结肠癌、神经胶质瘤、膀胱癌、乳腺癌、肾癌、食道癌、胃癌、口腔鳞状细胞癌、尿道上皮细胞癌、胰腺癌和/或头颈肿瘤中的一种或多种。

本发明所称的抗肿瘤药物，指具有抑制和/或治疗肿瘤的药物，可以包括伴随肿瘤相关症状发展的延迟和/或这些症状严重程度的降低，进一步还包括已存在的肿瘤伴随症状的减轻并防止其他症状的出现，还包括减少或防止肿瘤的转移等。

本发明中抗PRLR的单克隆抗体及其组合物在对包括人在内的动物给药时，给药剂量因病人的年龄和体重，疾病特性和严重性，以及给药途径而异，可以参考动物实验的结果和种种情况，总给药量不能超过一定范围。具体来说静脉注射的剂量是1-1800mg/天。

在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。

本发明所用试剂和原料均市售可得。

本发明的积极进步效果在于：本发明提供的抗PRLR单克隆抗体具有良好的生物活性，在哺乳动物细胞中具有较高的表达量，并且对PRLR具有明显的亲和力和抑制配体-受体结合的能力，本发明筛选所得抗体PR20对T47D细胞具有显著的ADCC作用，能通过NK细胞，有效地杀伤肿瘤细胞。该单克隆抗体能够单独，或与其它抗肿瘤药物联合应用在肿瘤免疫治疗以及诊断和筛查中，能够有效应用于治疗肿瘤、感染性疾病、自身免疫性疾病以及抗免疫排斥等药物的制备中。

附图说明

图1为抗PRLR单克隆抗体的亲和力能力实验结果。

图2为抗PRLR单克隆抗体的配体-受体结合抑制实验结果。

图3为抗PRLR单克隆抗体与T47D细胞结合的实验结果。

图4为抗PRLR单克隆抗体通过ADCC作用杀伤肿瘤细胞的实验结果。

具体实施方式

下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。实施例中所述的室温为本领域常规的室温，一般为10~30℃。

在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围；在本发明说明书和权利要求书中，除非文中另外明确指出，单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。

当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。

除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见Sambrook等Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Second Edition，Cold Spring HarborLaboratory Press，1989 And Third Edition，2001；Ausubel 等，Current Protocols InMolecular Biology，John Wiley & Sons，New York，1987 And Periodic Updates；TheSeries Methods In Enzymology，Academic Press，San Diego；Wolffe，ChromatinStructure And Function，Third Edition，Academic Press，San Diego，1998；Methods InEnzymology，Vol.304，Chromatin (P.M.Wassarman and A.P.Wolffe，eds.)，AcademicPress，San Diego，1999；和Methods In Molecular Biology，Vol.119，ChromatinProtocols (P.B.Becker，ed.) Humana Press，Totowa，1999等。

实施例1 表达和纯化人PRLR胞外区重组蛋白

合成人PRLR胞外区与碱性磷酸酶的融合基因PRLR-AP（由苏州金唯智生物科技有限公司合成），其中PRLR胞外区基因序列为SEQ ID NO:1，AP基因序列为SEQ ID NO:2，两段序列连接即为PRLR-AP融合基因，设计正向和反向引物分别为：5’-atccgccggcaagccgccaccatgaaggaaaatgtggcatctg -3’（SEQ ID NO:3）和5’-TCACTACGTAtcagtggtggtggtggtggtggcctg-3’（SEQ ID NO:4），用于扩增得到编码PRLR-AP融合蛋白的基因，在基因的上下游分别引入限制性内切酶位点Ngo MIV和SnaBI，PCR条件为95℃ 10s，60℃ 10s，72℃ 15s，35个循环，72℃延伸10min，DNA聚合酶为TAKARA公司产品。

PCR产物经琼脂糖凝胶回收（回收试剂盒为Omega bio-tek公司产品）纯化后，加入限制性内切酶Ngo MIV和SnaBI进行酶切，酶切产物经DNA回收试剂（Omega bio-tek公司产品）纯化后与用相同限制性内切酶酶切的载体pHLX101（由上海复宏汉霖生物技术有限公司构建，参见中国专利201210211812.1）进行连接反应。连接产物转化到DH5α大肠杆菌，涂布在含有50 µg/ml羧苄青霉素的2YT琼脂培养基上。将获得的阳性克隆在含有50 µg/ml羧苄青霉素的2YT液体培养基中培养，经过Invitrogen公司测序验证后，用质粒大抽试剂盒（Omega bio-tek公司产品）提取阳性克隆质粒。

采用聚乙烯亚胺（Polyethylenimine，PEI）的方法将质粒DNA转染到293F细胞中，转染6个小时后，将细胞离心，更换新鲜的293 freestyle Medium培养液（GIBCO公司产品），继续摇床培养。24和48小时后可对细胞进行观察，转染后第3天开始每天对细胞计数，表达时间通常为7-10天，当活细胞密度低于50%时收获细胞培养液上清。

实施例2 抗PRLR人源抗体真核表达载体的构建和表达

抗体重链（SEQ ID NO:5）和轻链（SEQ ID NO:11）基因均由苏州金唯智生物科技有限公司合成。使用PCR反应对上述重链和轻链的编码DNA序列进行扩增，在抗体重链和轻链的基因两端引入适当的酶切位点，其中在抗体重链基因5’端及3’端分别引入Ngo MIV和SnaBI酶切位点，正向和反向引物序列分别为：

5’-ACCTGCCGGCAAGCCGCCACCATGGGTTGGAGCCTCATCTTGCTCTTC-3’（SEQ ID NO:17）和 5’-GCTCTACGTATCATTTACCTGGAGACAGGGAGAGGC-3’（SEQ ID NO:18），在抗体轻链可变区基因5’端及3’端分别引入Ngo MIV和SnaB I，正向和反向引物序列分别为：

5’-ACCTGCCGGCAAGCCGCCACCATGGGTTGGAGCCTCATCTTGCTCTTC-3’（SEQ ID NO:17）和5’-GCATCTTACGTATTATTAACATTCTGTAAGGGCCACTGTCTTC-3’（SEQ ID NO:19）。采用PCR反应，条件为95℃10s，60℃10s，72℃10s，35个循环，72℃延伸10min，DNA聚合酶为TAKARA公司产品。PCR扩增后，将PCR产物经琼脂糖凝胶电泳回收纯化。轻链可变区基因加入限制性内切酶Ngo MIV和SnaB I进行酶切，重链可变区基因加入限制性内切酶Ngo MIV和Sna BI进行酶切，酶切后经DNA纯化试剂盒进行纯化，并与相同限制性内切酶消化的载体pHLX101。连接产物转化到DH5α大肠杆菌，涂布在含有50 µg/ml羧苄青霉素的2YT琼脂培养基上。获得的阳性克隆在含有50 µg/ml羧苄青霉素的2YT液体培养基中培养，经过Invitrogen公司测序验证后，用质粒大抽试剂盒提取阳性克隆质粒。

利用Invitrogen公司的Neon系统，将线性化的质粒DNA转染至CHO细胞。转染后的CHO细胞进行稀释克隆化培养，在含有50 μmol蛋氨酸亚氨基代砜（methioninesulfoximine，MSX）的94113培养基（IrvineScientific公司产品）中进行筛选，从而获得单克隆细胞系，将其命名为PR20细胞系。

将获得的单克隆细胞系PR20在含有50 μmol蛋氨酸亚氨基代砜的94113培养基中进行摇瓶培养，表达时间通常为7-14天，当活细胞密度低于50%时收获细胞培养液上清。利用羊抗人IgG Fd（Meridian公司产品）以及辣根过氧化物酶标记的羊抗人轻链恒定区进行双夹心ELISA法检测表达上清中抗体的含量，以未转染上清作为阴性对照，人的IgG纯品作为标准品。实验结果显示，表达获得的目的蛋白可以被两个抗体识别，具有人IgG抗体特征，并且构建的人源抗体表达量在200~500µg/ml，具有较高的表达水平。采用Protein A亲和层析柱从细胞培养上清中分离纯化目的抗体，获得抗PRLR单克隆抗体，将其命名为PR20。

实施例3 抗PRLR人源抗体亲和力鉴定

将羊抗人IgG Fd（Meridian公司产品）按2µg/ml包被到酶标板中（工作体积30μl），4℃静置过夜。用含有0.05%的Tween 20 的常规磷酸盐缓冲液（PBST）洗3次。用5%的脱脂牛奶室温封闭1小时。用PBST洗3次，将实施例2制备获得的抗体PR20配制成6µg/ml浓度，并进行3倍梯度稀释，共8个梯度，每孔加入30µl，室温静置1小时。用PBST洗3次，加入30µl 实施例1中制备的PRLR-AP细胞表达上清，室温静置1小时。用PBST洗6次，加入pNPP显色，用酶标仪在405nm下读数。图1为抗PRLR单克隆抗体的亲和力能力实验结果，从结果可看出，本发明筛选得到的抗体PR20对PRLR具有很强的亲和力，EC₅₀为0.447µg/ml（3nM）。

实施例4 配体-抗体结合抑制功能鉴定

将PRL（义翘神州）按2µg/ml包被到酶标板中（工作体积30μl），4℃静置过夜。用PBST洗3次。用5%的脱脂牛奶室温封闭1小时。用PBST洗3次。将实施例2制备获得的抗体PR20配制成100µg/ml浓度，并进行3倍梯度稀释，共8个梯度。再将实施例1中制备得到的PRLR-AP细胞表达上清，用PBST按1:16稀释，然后与稀释好的抗体按1:1混合，室温静置0.5小时，再加入到封闭好的酶标板中，室温静置1小时。用PBST洗6次。用pNPP显色，用酶标仪在405nm下读数。图2为抗PRLR单克隆抗体的配体-受体结合抑制实验结果，从结果可以看出，本发明筛选所得抗体PR20在高浓度下能明显抑制PRLR与其配体PRL的结合。

实施例4 利用流式细胞术检测抗PRLR单克隆抗体与PRLR阳性的肿瘤细胞的结合

T47D细胞（ATCC）用加有10% FBS的RPMI-1640培养基进行培养，经胰酶消化成单个细胞。用含有2%FBS的PBS悬浮细胞，按2 X 10⁵个细胞分装到EP管中。分别加入PR20和同型对照抗体（Thermo Fisher），使抗体的终浓度为10µg/ml。将抗体和细胞在4℃孵育1个小时。用含有2%FBS的PBS洗细胞2次。加入FITC偶联的抗人IgG Fab的二抗（Thermo Fisher），4度孵育30分钟。用含有2%FBS的PBS洗细胞1次，并用PBS悬浮细胞，用流式细胞仪检测。图3为抗PRLR单克隆抗体与T47D细胞结合的实验结果，从结果可看出，与阴性对照相比，本发明所得PR20能特异地结合到PRLR阳性的T47D细胞上。

实施例5 利用抗体依赖细胞毒性作用（ADCC）鉴定抗体对于肿瘤细胞的杀伤作用

将T47D细胞按1.0×10⁴ cells/孔接种到96孔板中，置于37 ℃，5% CO₂培养箱中培养过夜。将实施例2制备获得的抗体PR20配制成100µg/ml浓度，并进行3倍梯度稀释，共10个梯度，按每孔50μl加到接种有T47D细胞的96孔培养板中。将其放置于37 ℃，5% CO₂培养箱中孵育15~30 min。按靶效比1:1，加入50μl NK-CD16（ATCC）细胞悬液至细胞培养板中。放置于37 ℃，5% CO₂培养箱中进行杀伤反应，杀伤反应时间20 h~24 h。最后用LDH试剂盒（Clontech）显色，用酶标仪采集A490数据。图4为抗PRLR单克隆抗体通过ADCC作用杀伤肿瘤细胞的实验结果，从结果可看出，本发明筛选得到的抗PRLR的单克隆抗体PR20对T47D细胞具有显著的ADCC作用，能通过NK细胞有效地杀伤肿瘤细胞。

应理解，在阅读了本发明的上述内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 上海复宏汉霖生物技术股份有限公司

上海复宏汉霖生物制药有限公司

<120> 一种抗PRLR的单克隆抗体及其制备方法和应用

<160> 19

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 702

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgaaggaaa atgtggcatc tgcaaccgtt ttcactctgc tactttttct caacacctgc 60

cttctgaatg gacagttacc tcctggaaaa cctgagatct ttaaatgtcg ttctcccaat 120

aaggaaacat tcacctgctg gtggaggcct gggacagatg gaggacttcc taccaattat 180

tcactgactt accacaggga aggagagaca ctcatgcatg aatgtccaga ctacataacc 240

ggtggcccca actcctgcca ctttggcaag cagtacacct ccatgtggag gacatacatc 300

atgatggtca atgccactaa ccagatggga agcagtttct cggatgaact ttatgtggac 360

gtgacttaca tagttcagcc agaccctcct ttggagctgg ctgtggaagt aaaacagcca 420

gaagacagaa aaccctacct gtggattaaa tggtctccac ctaccctgat tgacttaaaa 480

actggttggt tcacgctcct gtatgaaatt cgattaaaac ccgagaaagc agctgagtgg 540

gagatccatt ttgctgggca gcaaacagag tttaagattc tcagcctaca tccaggacag 600

aaataccttg tccaggttcg ctgcaaacca gaccatggat actggagtgc atggagtcca 660

gcgaccttca ttcagatacc tagtgacttc accatgaatg at 702

<210> 2

<211> 1521

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ggaattcctt acgtaagatc ttccggaatc atcccagttg aggaggagaa cccggacttc 60

tggaaccgcg aggcagccga ggccctgggt gccgccaaga agctgcagcc tgcacagaca 120

gccgccaaga acctcatcat cttcctgggc gatgggatgg gggtgtctac ggtgacagct 180

gccaggatcc taaaagggca gaagaaggac aaactggggc ctgagatacc cctggccatg 240

gaccgcttcc catatgtggc tctgtccaag acatacaatg tagacaaaca tgtgccagac 300

agtggagcca cagccacggc ctacctgtgc ggggtcaagg gcaacttcca gaccattggc 360

ttgagtgcag ccgcccgctt taaccagtgc aacacgacac gcggcaacga ggtcatctcc 420

gtgatgaatc gggccaagaa agcagggaag tcagtgggag tggtaaccac cacacgagtg 480

cagcacgcct cgccagccgg cacctacgcc cacacggtga accgcaactg gtactcggac 540

gccgacgtgc ctgcctcggc ccgccaggag gggtgccagg acatcgctac gcagctcatc 600

tccaacatgg acattgacgt gatcctaggt ggaggccgaa agtacatgtt tcccatggga 660

accccagacc ctgagtaccc agatgactac agccaaggtg ggaccaggct ggacgggaag 720

aatctggtgc aggaatggct ggcgaagcgc cagggtgccc ggtatgtgtg gaaccgcact 780

gagctcatgc aggcttccct ggacccgtct gtgacccatc tcatgggtct ctttgagcct 840

ggagacatga aatacgagat ccaccgagac tccacactgg acccctccct gatggagatg 900

acagaggctg ccctgcgcct gctgagcagg aacccccgcg gcttcttcct cttcgtggag 960

ggtggtcgca tcgaccatgg tcatcatgaa agcagggctt accgggcact gactgagacg 1020

atcatgttcg acgacgccat tgagagggcg ggccagctca ccagcgagga ggacacgctg 1080

agcctcgtca ctgccgacca ctcccacgtc ttctccttcg gaggctaccc cctgcgaggg 1140

agctccatct tcgggctggc ccctggcaag gcccgggaca ggaaggccta cacggtcctc 1200

ctatacggaa acggtccagg ctatgtgctc aaggacggcg cccggccgga tgttaccgag 1260

agcgagagcg ggagccccga gtatcggcag cagtcagcag tgcccctgga cgaagagacc 1320

cacgcaggcg aggacgtggc ggtgttcgcg cgcggcccgc aggcgcacct ggttcacggc 1380

gtgcaggagc agaccttcat agcgcacgtc atggccttcg ccgcctgcct ggagccctac 1440

accgcctgcg acctggcgcc ccccgccggc accaccgacg ccgcgcaccc gggttcaggc 1500

caccaccacc accaccactg a 1521

<210> 3

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atccgccggc aagccgccac catgaaggaa aatgtggcat ctg 43

<210> 4

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tcactacgta tcagtggtgg tggtggtggt ggcctg 36

<210> 5

<211> 1428

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

atgggttgga gcctcatctt gctcttcctt gtcgctgttg ctacgcgtgt ccactcccag 60

gttcagctgg tacaatctgg ggctgaggtg aagaagcctg ggtcctcggt gaaggtctcc 120

tgcaaggctt ctggaggcac cttcagcagc tatgctatca gctgggtgcg acaggcccct 180

ggacaagggc ttgagtggat gggaaggatc atccctatct ttggtacagc aaactacgca 240

cagaagttcc agggcagagt cacgattacc gcggacgaat ccacgagcac agcctacatg 300

gagctgagca gcctgagatc tgaggacacg gccgtgtatt actgtgcgag agccccgacc 360

gttcggctcg gataccccag gggaagacac tacggtatgg acgtctgggg ccaaggaacc 420

ctggtcaccg tctcaagcgc tagcaccaag ggcccatcgg tcttccccct ggcaccctcc 480

tccaagagca cctctggggg cacagcggcc ctgggctgcc tggtcaagga ctacttcccc 540

gaaccggtga ccgtgtcgtg gaactcaggc gccctgacca gcggcgtgca caccttccct 600

gctgtcctac agtcctcagg actctactcc ctcagcagcg tggtgaccgt gccctccagc 660

agcttgggca cccagaccta catctgcaac gtgaatcaca agcccagcaa caccaaggtg 720

gacaagaaag cagagcccaa atcttgtgac aaaactcaca catgcccacc gtgcccagca 780

cctgaactcc tggggggacc atcagtcttc ctcttccccc caaaacccaa ggacaccctc 840

atgatctccc ggacccctga ggtcacatgc gtggtggtgg acgtgagcca cgaagaccct 900

gaggtcaagt tcaactggta cgtggacggc gtggaggtgc ataatgccaa gacaaagccg 960

cgggaggagc agtacaacag cacgtaccgt gtggtcagcg tcctcaccgt cctgcaccag 1020

gactggctga atggcaagga gtacaagtgc aaggtctcca acaaagccct cccagccccc 1080

atcgagaaaa ccatctccaa agccaaaggg cagccccgag aaccacaggt gtacaccctg 1140

cccccatccc gggatgagct gaccaagaac caggtcagcc tgacctgcct ggtcaaaggc 1200

ttctatccca gcgacatcgc cgtggagtgg gagagcaatg ggcagccgga gaacaactac 1260

aagaccacgc ctcccgtgct ggactccgac ggctccttct tcctctacag caagctcacc 1320

gtggacaaga gcaggtggca gcaggggaac gtcttctcat gctccgtgat gcatgaggct 1380

ctgcacaacc actacacgca gaagagcctc tccctgtctc caggtaaa 1428

<210> 6

<211> 372

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

caggttcagc tggtacaatc tggggctgag gtgaagaagc ctgggtcctc ggtgaaggtc 60

tcctgcaagg cttctggagg caccttcagc agctatgcta tcagctgggt gcgacaggcc 120

cctggacaag ggcttgagtg gatgggaagg atcatcccta tctttggtac agcaaactac 180

gcacagaagt tccagggcag agtcacgatt accgcggacg aatccacgag cacagcctac 240

atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc gagagccccg 300

accgttcggc tcggataccc caggggaaga cactacggta tggacgtctg gggccaagga 360

accctggtca cc 372

<210> 7

<211> 124

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Arg Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ala Pro Thr Val Arg Leu Gly Tyr Pro Arg Gly Arg His Tyr

100 105 110

Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr

115 120

<210> 8

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

Ser Tyr Ala Ile Ser

1 5

<210> 9

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

Arg Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln

1 5 10 15

Gly

<210> 10

<211> 18

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

Ala Pro Thr Val Arg Leu Gly Tyr Pro Arg Gly Arg His Tyr Gly Met

1 5 10 15

Asp Val

<210> 11

<211> 705

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

atgggttgga gcctcatctt gctcttcctt gtcgctgttg ctacgcgtgt ccactcccag 60

gctgtgctga ctcagccgtc ctcagtgtct ggggccccag ggcagagggt caccatctcc 120

tgcactggga gcagctccaa catcggggca ggttatgatg tacactggta ccagcagctt 180

ccaggaacag cccccaaact cctcatctat ggtaacagca atcggccctc aggggtccct 240

gaccgattct ctggctccaa gtctggcacc tcagcctccc tggccatcac tgggctccag 300

gctgaggatg aggccgatta ttactgccag tcctatgaca gcagcctgag tggttcggta 360

ttcggcggag ggaccaagct gaccgtccta ggtcagccca aggctgcccc ctcggtcact 420

ctgttcccgc cctcctctga ggagcttcaa gccaacaagg ctacactggt gtgtctcata 480

agtgacttct acccgggagc cgtgacagtg gcctggaagg cagatagcag ccccgtcaag 540

gcgggagtgg agaccaccac accctccaaa caaagcaaca acaagtacgc ggccagcagc 600

tacctgagcc tgacgcctga gcagtggaag tcccacagaa gctacagctg ccaggtcacg 660

catgaaggga gcaccgtgga gaagacagtg gcccttacag aatgt 705

<210> 12

<211> 342

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

caggctgtgc tgactcagcc gtcctcagtg tctggggccc cagggcagag ggtcaccatc 60

tcctgcactg ggagcagctc caacatcggg gcaggttatg atgtacactg gtaccagcag 120

cttccaggaa cagcccccaa actcctcatc tatggtaaca gcaatcggcc ctcaggggtc 180

cctgaccgat tctctggctc caagtctggc acctcagcct ccctggccat cactgggctc 240

caggctgagg atgaggccga ttattactgc cagtcctatg acagcagcct gagtggttcg 300

gtattcggcg gagggaccaa gctgaccgtc ctaggtcagc cc 342

<210> 13

<211> 114

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

Gln Ala Val Leu Thr Gln Pro Ser Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln

1 5 10 15

Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly

20 25 30

Tyr Asp Val His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu

35 40 45

Leu Ile Tyr Gly Asn Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe

50 55 60

Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu

65 70 75 80

Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Ser Ser

85 90 95

Leu Ser Gly Ser Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly

100 105 110

Gln Pro

<210> 14

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly Tyr Asp Val His

1 5 10

<210> 15

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

Gly Asn Ser Asn Arg Pro Ser

1 5

<210> 16

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

Gln Ser Tyr Asp Ser Ser Leu Ser Gly Ser Val

1 5 10

<210> 17

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

acctgccggc aagccgccac catgggttgg agcctcatct tgctcttc 48

<210> 18

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

gctctacgta tcatttacct ggagacaggg agaggc 36

<210> 19

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

gcatcttacg tattattaac attctgtaag ggccactgtc ttc 43

Claims

1.一种抗PRLR的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体包含重链可变区和轻链可变区，其所述重链可变区的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO:7所示，所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO:13所示。

2.如权利要求1所述的抗PRLR的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体的重链可变区包括3个CDR区，其中CDR1氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示，CDR2氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示，CDR3氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示。

3.如权利要求1所述的抗PRLR的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体的轻链可变区包括3个CDR’区，其中CDR1’氨基酸序列如SEQ ID NO:14所示，CDR2’氨基酸序列如SEQ IDNO:15所示，CDR3’氨基酸序列如SEQ ID NO:16所示。

4.一种编码如权利要求1所述的抗PRLR的单克隆抗体的分离的核苷酸分子，其特征在于，编码权利要求1所述的抗PRLR的单克隆抗体重链的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示，编码其轻链的核苷酸序列如SEQ ID NO:11所示。

5.如权利要求4所述的核苷酸分子，其特征在于，编码权利要求1所述的抗PRLR单克隆抗体的重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示，编码其轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO:12所示。

6.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体含有编码如权利要求1所述的抗PRLR的单克隆抗体的核苷酸分子。

7.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞含有如权利要求6所述的表达载体。

8.一种如权利要求1所述的抗PRLR的单克隆抗体的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：

a)在表达条件下，培养如权利要求7所述的宿主细胞，表达抗PRLR的单克隆抗体；

b)分离并纯化步骤a)所得抗PRLR的单克隆抗体。

9.一种组合物，其特征在于，所述组合物包含有效量的如权利要求1所述的抗PRLR的单克隆抗体和药学上可接受的载体。

10.如权利要求1所述的抗PRLR的单克隆抗体在制备治疗乳腺癌的药物中的用途。