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CN118792335A - 一种重组载体质粒、酵母生物传感器及其构建方法和应用 - Google Patents

一种重组载体质粒、酵母生物传感器及其构建方法和应用 Download PDF

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CN118792335A
CN118792335A CN202410806832.6A CN202410806832A CN118792335A CN 118792335 A CN118792335 A CN 118792335A CN 202410806832 A CN202410806832 A CN 202410806832A CN 118792335 A CN118792335 A CN 118792335A
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plasmid
arnt
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ahr
recombinant
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CN202410806832.6A
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张桂敏
梁颖颖
刘海林
王淋
赵菁
蒋思婧
卢争辉
李顺意
易犁
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Hubei University
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Hubei University
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Abstract

本发明涉及一种重组载体质粒、酵母生物传感器及其构建方法和应用，所述重组载体质粒包括重组传感质粒和报告质粒；所述重组传感质粒包括启动子PGal1，10、蛋白AhR的编码基因和AhR核移位蛋白ARNT的编码基因；所述报告质粒为重组报告质粒或过表达的重组报告质粒，所述重组报告质粒包括二恶英调节元件、细胞色素启动子和报告蛋白的编码基因，所述过表达的重组报告质粒包括二恶英调节元件、细胞色素启动子、报告蛋白的编码基因和AhR核移位蛋白ARNT的编码基因；本发明的酵母生物传感器能够高效检测环境中的二恶英类污染物、β‑萘黄酮、苯并芘、2‑氯联苯、2，2’‑二氯联苯等含有苯环的芳烃衍生物，检测下限小于1pM。

Description

一种重组载体质粒、酵母生物传感器及其构建方法和应用
技术领域
本发明涉及生物检测技术领域，具体涉及一种重组载体质粒、酵母生物传感器及其构建方法和应用。
背景技术
二恶英类(DLCs)污染物是指具有相似化学结构和理化性质的一类多氯取代的含氧三环芳香烃化合物，包括两大类：多氯代二苯-对-二噁英(polychlorinated dibenzo-p-dioxin，PCDDS)和多氯代二苯并呋喃(polychlorinated dibenzofuran，PCDFS)，根据氯原子取代的位置和数量的不同可将二恶英类污染物细分为七十五种PCDD和一百三十五种PCDF，共计二百一十种同分异构体，在这些二恶英类污染物中以PCDD中的TCDD毒性最强。二恶英主要通过焚烧城市和医疗固体废物、纸张和木浆氯漂白、化学冶金和水泥生产等过程释放到环境中，会污染大气、土壤和水体。这些化合物是对人类健康构成重大威胁和危害的环境外来生物，由于其在食物链中的生物积累和持久性，导致通过生物放大过程在人体组织中不断积累，造成生殖系统、神经系统、内分泌和免疫系统的损伤。因此，开发一种快速、灵敏、低成本的检测环境中二恶英浓度的方法非常重要。
目前，定量二恶英浓度的常规方法是高分辨率气相色谱-高分辨率质谱联用(HRGC-HRMS)，该方法在大多数官方国际标准方法中被广泛接受。尽管HRGC-HRMS具有很高的灵敏度和选择性，但由于需要复杂的仪器、训练有素的操作人员和昂贵的化学品，因此操作成本高。而由于微生物的低成本以及合适的pH和温度范围，已被用作生物传感器。全细胞生物传感器通过将应答启动子与报告基因进行组合，得到易被识别的信号。其中调控蛋白或启动子需要能够对待检测物的浓度变化做出响应，然后将信号转换成易于检测的报告蛋白信号。基于这一机制，各种类型的生物测定方法已经被开发出来，作为二恶英类化合物筛选的更便宜、更简单的替代方法。
最广泛采用的二恶英类化合物生物测定是化学激活荧光素酶表达(CALUX)。CALUX利用转基因细胞系(美国专利号5854010)表达一种荧光素酶，响应二恶英类化合物与AhR的结合，是一种新的快速检测技术，可用于筛选土壤、水、烟气、污泥、饲料、添加剂和生物组织中的类二恶英污染物。由于其快速生长，成本效益和稳定性，酿酒酵母也被用作宿主，通过表达人类AhR和ARNT蛋白来开发一种生物测定法来检测二恶英类化合物。Miller开发了CROMIS AhR试剂盒，以酿酒葡萄球菌W303为宿主，β-半乳糖苷酶lacZ为报告基因。Xu等人通过在酿酒酵母中功能性表达合成的细菌荧光素酶报告基因盒(luxcdabfrp)，创建了二恶英类化合物响应的自身生物发光生物报告基因BLYAhS，从而无需细胞裂解即可连续产生生物发光信号。而BLYAhS对二恶英2，3，7，8-四氯二苯并对二恶英(TCDD)的检出限(LOD)为500pM。鉴于此，本发明提供一种重组载体质粒、酵母生物传感器及其构建方法和应用。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种重组载体质粒、酵母生物传感器及其构建方法和应用。目的是提供检测含有苯环的芳烃衍生物(例如二恶英)的低成本、快速且灵敏度更高的生物传感器。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下：
第一方面，一种重组载体质粒，所述重组载体质粒包括重组传感质粒和报告质粒；所述重组传感质粒包括启动子PGal1，10、蛋白AhR的编码基因和AhR核移位蛋白ARNT的编码基因；所述报告质粒为重组报告质粒或过表达的重组报告质粒，所述重组报告质粒包括二恶英调节元件、细胞色素启动子和报告蛋白的编码基因，所述过表达的重组报告质粒包括二恶英调节元件、细胞色素启动子、报告蛋白的编码基因和AhR核移位蛋白ARNT的编码基因；所述启动子PGal1，10的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述蛋白AhR的氨基酸序列如SEQ IDNO:2所示或所述SEQ ID NO:2的核苷酸序列的第381位Val突变成Ala的序列所示，所述AhR核移位蛋白ARNT的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。
本发明的机理：本发明利用重组传感质粒中的蛋白AhR的编码基因和AhR核移位蛋白ARNT的编码基因，在半乳糖的诱导下表达蛋白AhR和AhR核移位蛋白ARNT，AhR蛋白识别并结合DLCs，随后移位到细胞核中，与核移位蛋白ARNT结合形成三聚体(AHR-ARNT)，此三聚体识别并结合到重组报告质粒上的启动子上游的二恶英调节元件的序列(特异性DNA)，进而调控下游报告蛋白的编码基因的表达，产生纳米荧光素酶，通过添加纳米荧光素酶底物后，产生生物发光，通过检测生物发光值，实现对含有苯环的芳烃衍生物的定性和/或定量检测。
本发明的有益效果是：本发明构建的生物传感器能够高效检测环境中的含有苯环的芳烃衍生物类污染物，例如TCDD、β-萘黄酮、苯并芘、2-氯联苯、2，2’-二氯联苯等，检测下限小于1pM。
进一步，所述重组报告质粒包括二恶英调节元件XRE、细胞色素启动子PCYC1和报告蛋白Nluc的编码基因，所述过表达的重组报告质粒包括所述二恶英调节元件XRE、所述细胞色素启动子PCYC1、所述报告蛋白Nluc的编码基因和AhR核移位蛋白ARNT的编码基因；所述二恶英调节元件XRE的核心保守序列为N-GCGTG-C，所述细胞色素启动子PCYC1的核苷酸序列如SEQ IDNO:5所示，所述报告蛋白Nluc的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示；
所述重组传感质粒和报告质粒均还包括载体骨架。
进一步，所述二恶英调节元件XRE为至少2个二恶英调节元件XRE串联的二恶英调节元件；
所述载体骨架为pESD。
进一步，所述二恶英调节元件XRE为5个二恶英调节元件XRE串联的二恶英调节元件XRE5，所述二恶英调节元件XRE5的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。
其中，所述二恶英调节元件XRE是一段特异性的DNA序列，其核心保守序列为：N-GCGTG-C。当有蛋白复合体识别并结合后，激活XRE元件下游启动子启动下游基因的转录表达。当多个XRE元件串联在报告基因的上游时，可增加AHR-ARNT复合体与XRE元件的结合概率，由此AHR-ARNT复合体激活下游报告基因的能力也随之加强。因此，本发明使用了五个XRE串联来作为调节元件。
第二方面，一种酵母生物传感器，所述酵母生物传感器包括宿主细胞及位于所述宿主细胞内的如所述的重组载体质粒；所述宿主细胞为酿酒酵母EBY100细胞。
第三方面，一种酵母生物传感器的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)对载体骨架pESD采用Not I进行单酶切，得到线性化载体骨架pESD；对载体pESD采用EcoR I和BamH I进行双酶切，得到线性化载体骨架pESD-1；
(2)以pUC57-AhR-ARNT质粒为模板，扩增得到ARNT片段和AhR片段；将所述线性化载体骨架pESD和所述ARNT片段通过同源重组得到质粒pESD-ARNT；对所述质粒pESD-ARNT采用BamH I进行单酶切，得到线性化质粒pESD-ARNT；将所述线性化质粒pESD-ARNT和所述AhR片段通过同源重组，得到重组传感质粒pESD-ARNT-AhR；和/或
以pUC57-XRE5-PCYC1-Nluc-TCYC1质粒为模板，扩增得到XRE5-PCYC1-Nluc-TCYC1片段；将所述线性化载体骨架pESD和所述XRE5-PCYC1-Nluc-TCYC1片段通过同源重组，得到重组报告质粒pESD-XRE5-Nluc；和/或
以pUC57-AhR-ARNT质粒为模板，扩增得到ARNT片段，对重组报告质粒pESD-XRE5-Nluc采用BglⅡ和SacⅠ进行双酶切，得到线性化pESD-XRE5-Nluc，将所述线性化pESD-XRE5-Nluc和所述ARNT片段通过同源重组，得到过表达的重组报告质粒pESD-XRE5-Nluc-ARNT；
(3)以所述传感质粒pESD-ARNT-AhR为模板，扩增得到ARNT-GAL 1,10-AhR片段；以pUG6质粒为模板，扩增得到G418片段；以酿酒酵母EBY100基因组为模板，在DTP 1与YCL49C基因之间的位置，扩增得到上游同源臂H-up和下游同源臂H-down，并在H-up的N端和H-down的C端引入Xho I酶切位点；通过三次重叠PCR的方法得到H-up-ARNT-GAL 1,10-AhR-G418-H-down片段；将所述线性化载体骨架pESD-1和所述H-up-ARNT-GAL 1,10-AhR-G418-H-down片段通过同源重组，得到整合型传感质粒pESD-AHRC；
(4)对所述整合型传感质粒pESD-AHRC采用XhoⅠ进行单酶切，得到线性化H-up-ARNT-GAL 1,10-AhR-G418-H-down片段，通过电转的方法转入酿酒酵母EBY100细胞中，孵育后涂布在加入了G418的YPD平板上，所述线性化H-up-ARNT-GAL 1,10-AhR-G418-H-down片段通过同源重组的方式整合到所述酿酒酵母细胞的三号染色体上，通过抗性筛选得到阳性菌株EBY100-AHRC；
(5)将所述重组报告质粒pESD-XRE5-Nluc或过表达的重组报告质粒pESD-XRE5-Nluc-ARNT电转到所述阳性菌株EBY100-AHRC中，得到检测二恶英的生物传感器。
进一步，步骤(4)中所述G418片段的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示，所述上游同源臂H-up的核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示；所述下游同源臂H-down的核苷酸序列如SEQID NO:9所示。
第四方面，一种酵母生物传感器的应用，将所述的一种酵母生物传感器用于含有苯环的芳烃衍生物的检测中。
进一步，所述含有苯环的芳烃衍生物包括二恶英、β-萘黄酮、苯并芘、2-氯联苯、2，2’-二氯联苯中的任意一种。
第五方面，一种含有苯环的芳烃衍生物的检测方法，采用所述的一种酵母生物传感器进行检测。具体的，将所述的酵母生物传感器与待检测的含有苯环的芳烃衍生物共培养，后测定生物发光值，通过所述发光值来判断待测的含有苯环的芳烃衍生物中的浓度。
附图说明
图1为重组传感质粒pESD-ARNT-AhR图谱示意图；
图2为重组报告质粒pESD-XRE5-Nluc图谱示意图；
图3为检测二恶英的生物传感器示意图；
图4为AHRC传感器检测TCDD；
图5为AHRC-ARNT传感器检测TCDD；
图6为AHRC381传感器检测TCDD；
图7为DnaSc传感器检测TCDD；
图8为DnaSc传感器检测不同芳烃底物。
具体实施方式
以下对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购得的常规产品。
材料和试剂的来源说明：
所用的大肠杆菌感受态通过CaCl2法制备；所用的酿酒酵母感受态通过电转化法制备；所使用的PCR试剂、质粒提取和纯化的DNA的胶回收试剂盒和无缝克隆试剂盒均购自诺维赞公司；所有实验涉及的基因合成、质粒合成、引物合成及测序均由生工生物有限公司完成；限制性核酸内切酶购自Takara公司；试剂详细使用方法参考使用说明书。如无特殊说明，大肠杆菌所使用的培养基均为LB培养基(1％胰蛋白胨、0.5％酵母提取物和1％氯化钠，溶剂为水，固体平板含有1.5％琼脂)；酿酒酵母所使用的培养基有YPD液体培养基(1％酵母提取物，2％蛋白胨，2％葡萄糖，溶剂为水，固体平板含有1.5％琼脂)、CAA-1(0.67％ YNB、2％葡萄糖、0.5％ Casamino acids，溶剂为水，固体平板含有1.5％琼脂)、CAA-2(0.67％YNB、2％半乳糖、0.5％ Casamino acids，溶剂为水，固体平板含有1.5％琼脂)、SD-Trp(0.67％ YNB、2％葡萄糖、0.19％ DO Supplement-Trp，溶剂为水，固体平板含有1.5％琼脂)；上述LB培养基、YPD培养基、CAA-1、CAA-2中的％代表的是质量百分含量；培养基大肠杆菌的培养条件均为37℃、220rpm，酿酒酵母的培养条件均为30℃、200rpm。检测生物发光所使用的仪器为Glo Max 20/20Luminometer。
实施例1
1、重组传感质粒的构建
本实施例中构建一种含有PGal1，10诱导型双向启动子(SEQ ID NO:1)、胞质芳烃受体蛋白基因AhR(SEQ ID NO:2)和AhR核移位蛋白基因ARNT(SEQ ID NO:3)的重组传感质粒，具体操作步骤如下：
使用引物ARNT-F和ARNT-R，以从生工合成的pUC57-AhR-ARNT质粒为模板，用高保真酶PCR扩增ARNT片段，PCR扩增反应条件为：98℃，30s；98℃，10s，57℃，10s，72℃，15s，25个循环；72℃，5min；4℃保温。获得PCR产物后进行琼脂糖凝胶电泳，并使用胶回收试剂盒进行DNA片段的回收。
引物如下：
ARNT-F:GTTAATTAACTGCAGGAATTCATCATTCTGAAAAGGGGGGAAACATAGTTAG；
ARNT-R:GCAGTCAACCCTCACTAAAGGGCGGCCGCACATGGCGGCGACTACTGCC。
使用限制性内切酶Not I对载体pESD(来源湖北大学省部共建生物催化与与酶工程国家重点实验室)引用文献进行酶切，参考文献：Yi L,Gebhard MC,Li Q,Taft JM,Georgiou G,Iverson BL.Engineering of TEV protease variants by yeast ERsequestration screening(YESS)of combinatorial libraries.Proc Natl Acad Sci US A.2013Apr 30；110(18):7229-34.doi:10.1073/pnas.1215994110.Epub2013Apr15.PMID:23589865；PMCID:PMC3645551.)，并进行琼脂糖凝胶电泳，使用胶回收试剂盒对线性化的质粒进行回收。
使用无缝克隆试剂盒对上述经过纯化的ARNT片段和线性化pESD进行连接。通过化学转化的方法将连接产物导入到大肠杆菌DH5α(擎科生物)中，将5μL的连接产物与50μL的大肠杆菌DH5α感受态混合，冰上孵育20-30min，放入42℃水浴锅热击45s，在冰上静置1-2min，加入200μL的LB孵育液复苏培养1h后，收集菌体涂布在含有100μg/mL的氨苄抗生素的固体LB平板中，过夜培养后挑取单菌落进行使用引物ARNT-F和ARNT-R进行PCR验证，得到质粒pESD-ARNT。
使用引物AhR-F和AhR-R，以从生工合成的pUC57-AhR-ARNT质粒为模板，用高保真酶PCR扩增AhR片段，PCR扩增反应条件为：98℃，30s；98℃，10s，57℃，10s，72℃，15s，25个循环；72℃，5min；4℃保温。获得PCR产物后进行琼脂糖凝胶电泳，并使用胶回收试剂盒进行DNA片段的回收。
引物如下：
AhR-F：CTATACTTTAACGTCAAGGAGAAAAAACATGAACAGCAGCAGCGCC；
AhR-R：GTTATCAGATCTCGAGGGATCCGGGTTACAGGAATCCACTGGATGTCAAATC。
使用限制性内切酶BamH I对本实验构建的载体pESD-ARNT进行酶切，并进行琼脂糖凝胶电泳，使用胶回收试剂盒对线性化的质粒进行回收。
使用无缝克隆试剂盒对上述经过纯化的AhR片段和线性化pESD-ARNT进行连接。通过化学转化的方法将连接产物导入到大肠杆菌DH5α(擎科生物)中，将5μL的连接产物与50μL的大肠杆菌DH5α感受态混合，冰上孵育20-30min，放入42℃水浴锅热击45s，在冰上静置1-2min，加入200μL的LB孵育液复苏培养1h后，收集菌体涂布在含有100μg/mL的氨苄抗生素的固体LB平板中，过夜培养后挑取单菌落进行使用引物AhR-F和AhR-R进行PCR验证，得到重组传感质粒pESD-ARNT-AhR(图1)。
2、重组报告质粒的构建
本实施例中构建一种含有细胞色素启动子PCYC1(SEQ ID NO:5)、二恶英调节元件基因XRE(SEQ ID NO:4)和纳米荧光素酶报告基因Nluc(SEQ ID NO:6)的重组报告质粒。
使用引物XRE5-F和TCYC1-R，以从生工合成的pUC57-XRE5-PCYC1-Nluc-TCYC1质粒为模板，用高保真酶PCR扩增XRE5-PCYC1-Nluc-TCYC1片段，PCR扩增反应条件为：98℃，30s；98℃，10s，57℃，10s，72℃，10s，25个循环；72℃，5min；4℃保温。获得PCR产物后进行琼脂糖凝胶电泳，并使用胶回收试剂盒进行DNA片段的回收。
引物如下：
XRE5-F：GAAGAATTGTTAATTAACTGCAGTTGGATCCTTGCGTGACAATTC；
TCYC1-R：CTAAAGGGCGGCCGCACTGAATTCGCAAATTAAAGCCTTCGAGCG。
使用限制性内切酶Not I对实验室保存的载体pESD进行酶切，并进行琼脂糖凝胶电泳，使用胶回收试剂盒对线性化的质粒进行回收。
使用无缝克隆试剂盒对上述经过纯化的XRE5-PCYC1-Nluc-TCYC1片段和线性化pESD进行连接。通过化学转化的方法将连接产物导入到大肠杆菌DH5α(擎科生物)中，将5μL的连接产物与50μL的大肠杆菌DH5α感受态混合，冰上孵育20-30min，放入42℃水浴锅热击45s，在冰上静置1-2min，加入200μL的LB孵育液复苏培养1h后，收集菌体涂布在含有100μg/mL的氨苄抗生素的固体LB平板中，过夜培养后挑取单菌落进行使用引物XRE5-F和TCYC1-R进行PCR验证，得到重组报告质粒pESD-XRE5-Nluc(图2)。
3、整合型重组传感质粒的构建
本实施例中构建一种含有PGal1，10诱导型双向启动子、胞质芳烃受体蛋白基因AhR、AhR核移位蛋白基因ARNT、上游同源臂H-up、下游同源臂H-down和抗生素筛选标记基因KanMX的重组传感质粒，具体操作步骤如下：
将验证后的重组传感质粒pESD-ARNT-AhR(pESD-AHRC)作为模板，使用引物ARNT-F和AhR-R，用高保真酶PCR扩增ARNT-GAL 1，10-AhR片段，PCR扩增反应条件为：98℃，30s；98℃，10s，57℃，10s，72℃，35s，25个循环；72℃，5min；4℃保温；使用引物G418-F和G418-R，以质粒pUG6为模板来自北京中原公司，用高保真酶PCR扩增G418片段，PCR扩增反应条件为：98℃，30s；98℃，10s，57℃，10s，72℃，10s，25个循环；72℃，5min；4℃保温；获得PCR产物后进行琼脂糖凝胶电泳，并使用胶回收试剂盒进行DNA片段的回收。
使用引物H-up-F和H-up-R，以酿酒酵母EBY100基因组DNA(参考文献：Yi L,Gebhard MC,Li Q,Taft JM,Georgiou G,Iverson BL.Engineering of TEV proteasevariants by yeast ER sequestration screening(YESS)of combinatoriallibraries.Proc Natl Acad Sci U S A.2013Apr 30；110(18):7229-34.doi:10.1073/pnas.1215994110.Epub 2013Apr 15.PMID:23589865；PMCID:PMC3645551.)为模板，用高保真酶PCR扩增上游同源臂H-up片段，并在H-up的N端引入Xho I酶切位点，PCR扩增反应条件为：98℃，30s；98℃，10s，57℃，10s，72℃，5s，25个循环；72℃，5min；4℃保温；获得PCR产物后进行琼脂糖凝胶电泳，并使用胶回收试剂盒进行DNA片段的回收。使用引物H-down-F和H-down-R，以酿酒酵母基因组DNA为模板，用高保真酶PCR扩增下游同源臂H-down片段，并在H-down的C端引入Xho I酶切位点，PCR扩增反应条件为：98℃，30s；98℃，10s，57℃，10s，72℃，5s，25个循环；72℃，5min；4℃保温；获得PCR产物后进行琼脂糖凝胶电泳，并使用胶回收试剂盒进行DNA片段的回收。
使用引物ARNT-F和G418-R，以ARNT-GAL 1,10-AhR片段和G418片段为模板，用高保真酶通过重叠PCR方法扩增ARNT-GAL 1,10-AhR-G418片段，PCR扩增反应条件为：98℃，30s；98℃，10s；57℃，10s；72℃，45s；25个循环；72℃，5min；4℃保温；获得PCR产物后进行琼脂糖凝胶电泳，并使用胶回收试剂盒进行DNA片段的回收。
使用引物H-up-F和G418-R，以ARNT-GAL 1,10-AhR-G418片段和H-up片段为模板，用高保真酶通过重叠PCR方法扩增H-up-ARNT-GAL 1,10-AhR-G418片段，PCR扩增反应条件为：98℃，30s；98℃，10s；57℃，10s；72℃，45s；25个循环；72℃，5min；4℃保温；获得PCR产物后进行琼脂糖凝胶电泳，并使用胶回收试剂盒进行DNA片段的回收。
使用引物H-up-F和H-down-R，以H-up-ARNT-GAL 1,10-AhR-G418片段和H-down片段为模板，用高保真酶通过重叠PCR方法扩增H-up-ARNT-GAL 1,10-AhR-G418-H-down片段，PCR扩增反应条件为：98℃，30s；98℃，10s，57℃，10s，72℃，45s，25个循环；72℃，5min；4℃保温；获得PCR产物后进行琼脂糖凝胶电泳，并使用胶回收试剂盒进行DNA片段的回收。
引物如下：
ARNT-F：GTTAATTAACTGCAGGAATTCATCATTCTGAAAAGGGGGGAAACATAGTTAG；
AhR-R：GTTATCAGATCTCGAGGGATCCGGGTTACAGGAATCCACTGGATGTCAAATC。
G418-F：GATTTGACATCCAGTGGATTCCTGTAATCATGTAATTAGTTATGTCACGC；
G418-R：GTGTTGGTTTTTATATGTTTTCAGTATAGCGACCAGCATTCAC；
H-up-F：GTTAATTAACTGCAGGAATTCCTCGAGGGATTGAGGCCACAGCAAGACCGGCC；
H-up-R：
CTATGTTTCCCCCCTTTTCAGAATAAGTTATGTATTGTTTATTTTCCCTTTAATTTTAG；
H-down-F：
GTGAATGCTGGTCGCTATACTGAAAACATATAAAAACCAACACAATAAAAAAAAGG；
H-down-R：CAGATCTCGAGGGATCCCTCGAGTCTTAGTTGGTAGCACTTTGATGAG。
使用限制性内切酶EcoR I和BamH I对实验室保存的载体pESD进行酶切，并进行琼脂糖凝胶电泳，使用胶回收试剂盒对线性化的质粒进行回收。
使用无缝克隆试剂盒对上述经过纯化的H-up-ARNT-GAL 1,10-AhR-G418-H-down片段和线性化pESD进行连接。通过化学转化的方法将连接产物导入到大肠杆菌DH5α(擎科生物)中，将5μL的连接产物与50μL的大肠杆菌DH5α感受态混合，冰上孵育20-30min，放入42℃水浴锅热击45s，在冰上静置1-2min，加入200μL的LB孵育液复苏培养1h后，收集菌体涂布在含有100μg/mL的氨苄抗生素的固体LB平板中，过夜培养后挑取单菌落使用引物H-up-F和H-down-R进行PCR验证，得到整合传感质粒pESD-AHRC。
4、二恶英生物传感器AHRC的构建
本实施例中在酿酒酵母中构建二恶英的生物传感器，具体步骤如下：
(1)将验证后的整合传感质粒pESD-AHRC使用限制性核酸内切酶XhoⅠ进行酶切，并进行琼脂糖凝胶电泳，使用胶回收试剂盒对线性化的片段进行回收；将回收的H-up-ARNT-GAL 1,10-AhR-G418-H-down片段通过电转的方法转入酿酒酵母EBY100细胞中，将1μg DNA与100μL的酿酒酵母100μL感受态混合(加入DNA的总体积低于感受态体积的1/10)，用移液枪吸取全部的电转化体系，并加入到预冷的电转杯的电击池中，于电转仪中进行电击，条件设置为2.5kV，25μF，立即向电转杯中加入1mL 1:1混合的1M山梨醇和YPD液体培养基的混合液，并于30℃，200rpm的恒温摇床中孵育2-3h；孵育完成后，收集菌体涂布添加在G418(终浓度为200μg/mL)的YPD平板上，在30℃培养箱培养48-72h，挑取单菌落接种于YPD+G418液体培养基中过夜培养并抽提基因组，并以基因组为模板分别使用三对引物H-up-F与YZ-R、AhR-F与AhR-R、YZ-F与H-down-R通过PCR验证，得到阳性菌株EBY100-AHRC。
YZ-R：GATGGACTGGCCAGCTACAATC；
YZ-F：GGTAGCGTTGCCAATGATGTTAC。
将酿酒酵母菌株EBY100-AHRC在YPD平板上划线，于30℃恒温培养箱中培养48-72h；于50mL锥形瓶中提前倒入10mL YPD液体培养基，并从平板上挑取单菌落接种，于30℃恒温摇床中培养12-15h；将菌液转接入100mL YPD液体培养基，使得起始OD600为0.3，并于30℃恒温摇床中扩大培养至OD600值为1.6；菌液于4℃预冷，分装于预冷的50mL离心管中4℃、3800rpm离心2min，收集菌体弃上清；使用20mL预冷的无菌水重悬菌体，于冰上轻柔打散并充分混匀菌体，4℃、3800rpm离心2min，收集菌体弃上清，此步骤重复操作两次；使用20mL预冷的1MSorbitol/0.75mM CaCl2于冰上轻柔重悬细胞，3800rpm离心2min，收集菌体弃上清；使用20mL预冷的0.1M Li Ac/12mM DTT轻柔重悬细胞，30℃摇床培养30min；3800rpm离心2min，收集菌体弃上清，使用20mL预冷的1M Sorbitol/0.75mM CaCl2于冰上轻柔重悬细胞，3800rpm离心2min，收集菌体弃上清；使用预冷的1M Sorbitol/0.75mM CaCl2于冰上轻柔重悬细胞，最后使总体积为1mL，即为酿酒酵母电转感受态细胞，100μL分装，-80℃冰箱保存。
将验证后的重组报告质粒pESD-XRE5-Nluc吸取1μg加入到100μL的酿酒酵母EBY100-AHRC感受态细胞中(加入DNA的总体积低于感受态体积的1/10)，用移液枪吸取全部的电转化体系，并加入到预冷的电转杯的电击池中，于电转仪中进行电击，条件设置为2.5kV，25μF，立即向电转杯中加入1ml1:1混合的1M山梨醇和YPD液体培养基的混合液，并于30℃，200rpm的恒温摇床中孵育2-3h；孵育完成后，收集菌体涂布在色氨酸缺陷型SD-Trp平板，挑取单菌落使用引物Nluc-F和Nluc-R进行PCR验证，得到二恶英的生物传感器AHRC。
引物如下：
Nluc-F：GATGGACTGGCCAGCTACAATC；
Nluc-R：CATGATTACGCCAGAATGCGTTC。
5、二恶英检测中的应用
利用构建的二恶英的生物传感检测器检测二恶英的浓度，具体操作步骤如下：
(1)将检测二恶英的生物传感器，划线活化在YNB-CAA-Glu平板上，挑取单菌落接种在15mL YNB-CAA-Glu培养基(培养基的成分和用量详见上文CAA-1的记载)中，置于30℃、200rpm摇床培养约12h；
(2)将培养的菌液于6000rpm离心2min收集菌体弃上清，使用无菌水重悬洗涤菌体两次；
(3)使用YNB-CAA-Gal液体培养基(培养基的成分和用量详见上文CAA-2的记载)重悬菌体，使起始OD600为0.3，分别吸取2mL重选菌液到无菌的20mL玻璃样品瓶中，分别加入不同浓度的TCDD(DMSO溶解)，使其终浓度分别达到10-12、10-11、10-10、10-9、10-8M，空白对照加入相同加样体积的DMSO。放置于30℃200rpm培养6h后开始检测；
(4)将Nano-Glo-Live Cell-Substrate(购自普咯麦格(北京)生物技术有限公司)和Nano-Glo-LCS-Dilution Buffer(购自普咯麦格(北京)生物技术有限公司)按1:19混合，配置成Nano-Glo-Live Cell-Reagent(现配现用，Nano-Glo-Live Cell-Reagent内含有可透细胞的Nluc底物Furimazine和减少自发光和降低检测背景的专用试剂)。
(5)吸取100μL步骤(3)中的菌液与25μL Nano-Glo-Live Cell-Reagent混合后，立即使用Glo Max 20/20Luminometer进行检测。以生物发光值指示TCDD浓度的高低。以全细胞生物传感器最低的检测下限和最大信号输出来反应传感器的性能。
实验结果：如图4所示，本实施例中检测的二恶英同系物TCDD的浓度在1pM至10nM范围内评价其生物测定性能，TCDD的最大诱导发生在1nM TCDD处，相对生物发光信号输出为对照的170％。AHRC传感器对TCDD的LOD为100pm。
实施例2
1、过表达ARNT的二恶英的生物传感器AHRC-ARNT的构建
本实施例中将AhR核移位蛋白基因ARNT过表达构建二恶英的生物传感器，具体步骤如下：
使用引物ARNT-1-F和ARNT-1-R，以从生工合成的pUC57-AhR-ARNT质粒为模板，用高保真酶PCR扩增ARNT-1片段，PCR扩增反应条件为：98℃，30s；98℃，10s，57℃，10s，72℃，15s，25个循环；72℃，5min；4℃保温。获得PCR产物后进行琼脂糖凝胶电泳，并使用胶回收试剂盒进行DNA片段的回收。
引物如下：
ARNT-1-F：GTCAAGGAGAAAAAACCCCGGATCCCTCGAATGGCGGCGACTACTGCC；
ARNT-1-R：CTCACTATAGGGCGAATTGGTTATTCTGAAAAGGGGGGAAACATAGTTAG。
使用限制性内切酶BglⅡ和SacⅠ对重组报告质粒pESD-XRE5-Nluc进行酶切，并进行琼脂糖凝胶电泳，使用胶回收试剂盒对线性化的质粒进行回收。
使用无缝克隆试剂盒对上述经过纯化的ARNT-1片段和线性化pESD-XRE5-Nluc进行连接。通过化学转化的方法将连接产物导入到大肠杆菌DH5α(擎科生物)中，将5μL的连接产物与50μL的大肠杆菌DH5α感受态混合，冰上孵育20-30min，放入42℃水浴锅热击45s，在冰上静置1-2min，加入200μL的LB孵育液复苏培养1h后，收集菌体涂布在含有100μg/mL的氨苄抗生素的固体LB平板中，过夜培养后挑取单菌落进行使用引物ARNT-1-F和ARNT-1-R进行PCR验证，得到过表达的重组报告质粒pESD-XRE5-Nluc-ARNT。
将验证后的过表达的重组报告质粒pESD-XRE5-Nluc-ARNT吸取1μg加入到100μL的酿酒酵母EBY100-AHRC感受态细胞中(加入DNA的总体积低于感受态体积的1/10)，用移液枪吸取全部的电转化体系，并加入到预冷的电转杯的电击池中，于电转仪中进行电击，条件设置为2.5kV，25μF，立即向电转杯中加入600μL混合的1M山梨醇和YPD的混合液体培养基，并于30℃，200rpm的恒温摇床中孵育2-3h；孵育完成后，收集菌体涂布在色氨酸缺陷型SD-Trp平板，挑取单菌落使用引物Nluc-F和Nluc-R进行PCR验证，得到ARNT过表达的二恶英的生物传感器AHRC-ARNT。
2、二恶英检测中的应用
利用构建的ARNT过表达的二恶英的生物传感检测器AHRC-ARNT检测二恶英的浓度，具体操作步骤与实施例1记载相同。
实验结果：如图5所示，在100pM TCDD条件下，相对生物发光提高了约30％；AHRC-ARNT传感器对TCDD的检出限从100pM降低到1pM。因此，ARNT过表达对信号输出有积极的影响。
实施例3
1、AhR V381A单点突变的二恶英的生物传感器AHRC381的构建
本实施例中将胞质芳烃受体蛋白基因AhR 381位Val突变成Ala构建二恶英的生物传感器AHRC381，具体步骤如下：
使用引物AHR381-F和AHR381-R，以质粒pESD-AHRC为模板，用高保真酶PCR反扩质粒pESD-AHRC，将AHR蛋白381位Val突变成Ala，PCR扩增反应条件为：95℃，30s；98℃，10s，57℃，10s，72℃，65s，25个循环；72℃，5min；4℃保温；获得PCR产物后进行琼脂糖凝胶电泳，并使用胶回收试剂盒进行DNA片段的回收。
引物如下：
AhR381-F：GGAAGACCAGATTATATCATTGCCACTCAGAGACCACTAACAG；
AhR381-R：ATCTGTTAGTGGTCTCTGAGTGGCAATGATATAATCTGGTCTTCC。
通过化学转化的方法将回收产物导入到大肠杆菌DH5α(擎科生物)中，将5μL的连接产物与50μL的大肠杆菌DH5α感受态混合，冰上孵育20-30min，放入42℃水浴锅热击45s，在冰上静置1-2min，加入200μL的LB孵育液复苏培养1h后，收集菌体涂布在含有100μg/mL的氨苄抗生素的固体LB平板中，过夜培养后挑取单菌落进行使用引物AhR-F和AhR-R进行PCR验证，得到质粒pESD-AHRC381-G418。
将验证后的质粒pESD-AHRC381-G418使用限制性核酸内切酶XhoⅠ进行酶切，并进行琼脂糖凝胶电泳，使用胶回收试剂盒对线性化的片段进行回收。
将回收的H-up-ARNT-GAL 1,10-AhR381-G418-H-down片段通过电转的方法转入酿酒酵母EBY100细胞中，将1μg DNA与100μL的酿酒酵母100μL感受态混合(加入DNA的总体积低于感受态体积的1/10)，用移液枪吸取全部的电转化体系，并加入到预冷的电转杯的电击池中，于电转仪中进行电击，条件设置为2.5kV，25μF，立即向电转杯中加入1mL 1:1混合的1M山梨醇和YPD液体培养基的混合液，并于30℃，200rpm的恒温摇床中孵育2-3h；孵育完成后，收集菌体涂布添加在G418(终浓度为200μg/mL)的YPD平板上，在30℃培养箱培养48-72h，挑取单菌落接种于YPD+G418液体培养基中过夜培养并抽提基因组，并以基因组为模板分别使用三对引物H-up-F与R1、AhR-F与AhR-R、F1与H-down-R通过PCR验证，得到阳性菌株EBY100-AHRC381。
采用与实施例1相同的步骤将阳性菌株EBY100-AHRC381转化为酿酒酵母电转EBY100-AHRC381感受态细胞，再将验证后的重组报告质粒pESD-XRE5-Nluc电转化酿酒酵母电转EBY100-AHRC381感受态细胞，得到二恶英的生物传感器AHRC381。
2、二恶英检测中的应用
利用构建的二恶英的生物传感检测器AHRC-381检测二恶英的浓度，具体操作步骤除了步骤(3)中加入不同浓度的TCDD(DMSO溶解)，使其终浓度分别达到10-13、10-12、10-11、10-10、10-9M，空白对照加入相同加样体积的DMSO外，其余均与实施例1的记载相同。
实验结果：如图6所示，在AHRC381传感器中，TCDD的检出限较低，为1pM。AHRC381传感器的最大信号输出与AHRC传感器几乎相同，而TCDD的最大感应发生在10pM时，比AHRC传感器低100倍。说明381位点的突变是有效的。
实施例4
1、ARNT过表达和AhR V381A单点突变组合的二恶英的生物传感器DnaSc的构建
本实施例中将AhR核移位蛋白基因ARNT过表达和胞质芳烃受体蛋白基因AhR 381位Val突变成Ala组合构建二恶英的生物传感器DnaSc，具体步骤如下：
将验证后的重组报告质粒pESD-XRE5-Nluc-ARNT(详见实施例2的记载)吸取1μg加入到100μL的酿酒酵母EBY100-AHRC381感受态细胞(详见实施例3的记载)中(加入DNA的总体积低于感受态体积的1/10)，用移液枪吸取全部的电转化体系，并加入到预冷的电转杯的电击池中，于电转仪中进行电击，条件设置为2.5kV，25μF，立即向电转杯中加入1Ml1:1混合的1M山梨醇和YPD液体培养基的混合液，并于30℃，200rpm的恒温摇床中孵育2-3h；孵育完成后，收集菌体涂布在色氨酸缺陷型SD-Trp平板，挑取单菌落使用引物Nluc-F和Nluc-R进行PCR验证，得到ARNT过表达和AhR V381A单点突变组合的二恶英的生物传感器DnaSc。
2、二恶英检测中的应用
然后利用构建的ARNT过表达和AhR V381A单点突变组合的二恶英的生物传感DnaSc检测器检测二恶英的浓度，具体操作步骤除了步骤(3)分别加入不同浓度的TCDD(DMSO溶解)，使其终浓度分别达到10-14、10-13、10-12、10-11、10-10、10-9M，空白对照加入相同加样体积的DMSO外，其余与实施例1记载相同。
实验结果：如图7所示，AHRC381-A传感器对TCDD的检出限降至10fM。并且，当DnaSc传感器暴露于浓度为10fM-1nM的TCDD中时，可诱导出明显的生物发光信号。
3、ARNT过表达和AhR V381A单点突变组合的二恶英的生物传感检测器DnaSc检测芳烃衍生物
在本次实施例中使用ARNT过表达和AhR V381A单点突变组合的二恶英的生物传感检测器AHRC381-A检测不同的芳烃衍生物，具体操作步骤除了步骤(3)与实施例1记载的二恶英检测中的应用不同外，其余均与实施例1相同，步骤(3)具体如下：
(3)使用YNB-CAA-Gal液体培养基重悬菌体，使起始OD600为0.3，分别吸取2mL重悬菌液到无菌的20mL玻璃样品瓶中，分别加入TCDD、β-NF、苯并芘、2-氯联苯(2-CBP)、3-氯联苯(3-CBP)、4-氯联苯(4-CBP)、2，2’-二氯联苯(2，2’-DiCBP)、(均为DMSO溶解)，使其终浓度为10-13M，空白对照加入相同加样体积的DMSO。放置于30℃200rpm培养6h后开始检测；
实验结果：如图8所示，构建的DnaSc传感器能够高效检测环境中的芳烃衍生物，可以有效的检测10-13M浓度下的TCDD、β-萘黄酮、苯并芘、2-氯联苯(2-CBP)、3-氯联苯(3-CBP)、4-氯联苯(4-CBP)、2，2’-二氯联苯(2，2’-DiCBP)，其中对TCDD的响应效果最好，相对生物发光信号输出为对照的159％，苯并芘、3-氯联苯(3-CBP)、4-氯联苯(4-CBP)、也有明显的响应效果。
综上可知，本发明构建的二恶英生物传感器能够高效检测环境中的二恶英类污染物TCDD，并且对β-萘黄酮、苯并芘、2-氯联苯、2，2’-二氯联苯、等含有苯环的芳烃衍生物的检测下限小于1pM。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims (10)

1.一种重组载体质粒，其特征在于，所述重组载体质粒包括重组传感质粒和报告质粒；所述重组传感质粒包括启动子PGal1，10、蛋白AhR的编码基因和AhR核移位蛋白ARNT的编码基因；所述报告质粒为重组报告质粒或过表达的重组报告质粒，所述重组报告质粒包括二恶英调节元件、细胞色素启动子和报告蛋白的编码基因，所述过表达的重组报告质粒包括二恶英调节元件、细胞色素启动子、报告蛋白的编码基因和AhR核移位蛋白ARNT的编码基因；所述启动子PGal1，10的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述蛋白AhR的氨基酸序列如SEQ IDNO:2所示或所述SEQ ID NO:2的核苷酸序列的第381位Val突变成Ala的序列所示，所述AhR核移位蛋白ARNT的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。
2.根据权利要求1所述一种重组载体质粒，其特征在于，所述重组报告质粒包括二恶英调节元件XRE、细胞色素启动子PCYC1和报告蛋白Nluc的编码基因，所述过表达的重组报告质粒包括所述二恶英调节元件XRE、所述细胞色素启动子PCYC1、所述报告蛋白Nluc的编码基因和AhR核移位蛋白ARNT的编码基因；所述二恶英调节元件XRE的核心保守序列为N-GCGTG-C，所述细胞色素启动子PCYC1的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示，所述报告蛋白Nluc的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示；
所述重组传感质粒和报告质粒均还包括载体骨架。
3.根据权利要求2所述一种重组载体质粒，其特征在于，所述二恶英调节元件XRE为至少2个二恶英调节元件XRE串联的二恶英调节元件；
所述载体骨架为pESD。
4.根据权利要求3所述一种重组载体质粒，其特征在于，所述二恶英调节元件XRE为5个二恶英调节元件XRE串联的二恶英调节元件XRE5，所述二恶英调节元件XRE5的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。
5.一种酵母生物传感器，其特征在于，所述酵母生物传感器包括宿主细胞及位于所述宿主细胞内的如权利要求1至4任一项所述的重组载体质粒；所述宿主细胞为酿酒酵母EBY100细胞。
6.基于权利要求5所述一种酵母生物传感器的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)对载体骨架pESD采用Not I进行单酶切，得到线性化载体骨架pESD；对载体pESD采用EcoR I和BamH I进行双酶切，得到线性化载体骨架pESD-1；
(2)以pUC57-AhR-ARNT质粒为模板，扩增得到ARNT片段和AhR片段；将所述线性化载体骨架pESD和所述ARNT片段通过同源重组得到质粒pESD-ARNT；对所述质粒pESD-ARNT采用BamH I进行单酶切，得到线性化质粒pESD-ARNT；将所述线性化质粒pESD-ARNT和所述AhR片段通过同源重组，得到重组传感质粒pESD-ARNT-AhR；和/或
以pUC57-XRE5-PCYC1-Nluc-TCYC1质粒为模板，扩增得到XRE5-PCYC1-Nluc-TCYC1片段；将所述线性化载体骨架pESD和所述XRE5-PCYC1-Nluc-TCYC1片段通过同源重组，得到重组报告质粒pESD-XRE5-Nluc；和/或
以pUC57-AhR-ARNT质粒为模板，扩增得到ARNT片段，对重组报告质粒pESD-XRE5-Nluc采用BglⅡ和SacⅠ进行双酶切，得到线性化pESD-XRE5-Nluc，将所述线性化pESD-XRE5-Nluc和所述ARNT片段通过同源重组，得到过表达的重组报告质粒pESD-XRE5-Nluc-ARNT；
(3)以所述传感质粒pESD-ARNT-AhR为模板，扩增得到ARNT-GAL 1,10-AhR片段；以pUG6质粒为模板，扩增得到G418片段；以酿酒酵母EBY100基因组为模板，在DTP 1与YCL49C基因之间的位置，扩增得到上游同源臂H-up和下游同源臂H-down；通过三次重叠PCR的方法得到H-up-ARNT-GAL 1,10-AhR-G418-H-down片段；将所述线性化载体骨架pESD-1和所述H-up-ARNT-GAL 1,10-AhR-G418-H-down片段通过同源重组，得到整合型传感质粒pESD-AHRC；
(4)对所述整合型传感质粒pESD-AHRC采用XhoⅠ进行单酶切，得到线性化H-up-ARNT-GAL 1,10-AhR-G418-H-down片段，通过电转的方法转入酿酒酵母EBY100细胞中，所述线性化H-up-ARNT-GAL 1,10-AhR-G418-H-down片段通过同源重组的方式整合到所述酿酒酵母EBY100细胞的三号染色体上，通过抗性筛选得到阳性菌株EBY100-AHRC；
(5)将所述重组报告质粒pESD-XRE5-Nluc或过表达的重组报告质粒pESD-XRE5-Nluc-ARNT电转到所述阳性菌株EBY100-AHRC中，得到检测二恶英的生物传感器。
7.根据权利要求6所述一种酵母生物传感器的构建方法，其特征在于，步骤(3)中所述G418片段的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示，所述上游同源臂H-up的核苷酸序列如SEQ IDNO:8所示；所述下游同源臂H-down的核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示。
8.一种酵母生物传感器的应用，其特征在于，将权利要求5所述的一种酵母生物传感器用于含有苯环的芳烃衍生物的检测中。
9.根据权利要求8所述一种酵母生物传感器的应用，其特征在于，所述含有苯环的芳烃衍生物包括二恶英、β-萘黄酮、苯并芘、2-氯联苯、2，2’-二氯联苯、中的任意一种。
10.一种含有苯环的芳烃衍生物的检测方法，其特征在于，采用如权利要求5所述的一种酵母生物传感器进行检测。
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