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CN118792309A - 大豆bHLH型转录因子GmEGL3在提高大豆籽粒异黄酮含量中的应用 - Google Patents

大豆bHLH型转录因子GmEGL3在提高大豆籽粒异黄酮含量中的应用 Download PDF

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CN118792309A
CN118792309A CN202410778083.0A CN202410778083A CN118792309A CN 118792309 A CN118792309 A CN 118792309A CN 202410778083 A CN202410778083 A CN 202410778083A CN 118792309 A CN118792309 A CN 118792309A
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CN
China
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gmegl
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soybean
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seq
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年海
贾佳
程艳波
陈博
黄子慧
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South China Agricultural University
Beijing Dabeinong Biotechnology Co Ltd
Original Assignee
South China Agricultural University
Beijing Dabeinong Technology Group Co Ltd
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Abstract

本发明公开了大豆bHLH型转录因子GmEGL3基因在提高大豆籽粒异黄酮含量中的应用，所述GmEGL3基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。大豆GmEGL3基因编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。将本发明GmEGL3基因过量表达于栽培型大豆华春6号中，可以提高转基因植物籽粒中异黄酮的含量。本发明首次揭示了大豆GmEGL3调控大豆籽粒异黄酮含量的生物学功能，对大豆的营养品质改良具有重要意义。

Description

大豆bHLH型转录因子GmEGL3在提高大豆籽粒异黄酮含量中的 应用
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种与大豆籽粒异黄酮含量相关基因GmEGL3及其编码蛋白在提高大豆籽粒异黄酮含量中的应用。
背景技术
大豆属于一年生草本双子叶植物，是重要的粮油饲兼用经济作物，能够为人类膳食提供丰富的植物油和蛋白，加工后也可以作为畜禽饲料。近年来，随着国民生活水平的提高，人们对具有丰富营养价值食品的需求不断升高。大豆异黄酮与蛋白质、脂肪酸和维生素E一样，都是人体所需的重要营养物质。大豆异黄酮因其具有与雌激素相似的结构，并具有类似雌激素的生物功能，能够降低人体血压和血液胆固醇浓度，改善人脑的认知能力和缓解女性更年期综合症。
大豆异黄酮的合成途径属于苯丙氨酸代谢途径的一个分支，其合成过程受到多种酶的催化和转录因子的严格调控，从而形成一个复杂的调控网络。关于大豆异黄酮积累途径相关的基因和代谢通路的研究还不够完善。bHLH转录因子具有保守的碱性螺旋-环-螺旋(bHLH)结构域和螺旋-环-螺旋(HLH)结构域，是广泛存在于高等植物中的一类转录因子家族，亚族十分丰富。基因组测序技术的发展大大推进了bHLH蛋白家族的分离鉴定，研究者们利用进化分类的方法可将其分为A～F六类，主要依据为：E-box的结合区域、部分残基的保守性以及是否存在其它的结构域，也可根据不同植物的来源进行分类。按照系统发育关系可以将拟南芥基因组序列中鉴定的162个具有基本螺旋-环-螺旋结构域的bHLH转录因子分为21个亚族；水稻基因组鉴定的167个bHLH转录因子可分为22个亚族；大豆基因组序列中共鉴定到319个bHLH转录因子可以分为24个亚族。bHLH转录因子的基因结构和系统发育关系比较复杂，表明其在不同植物物种之间存在进化差异。
bHLH转录因子因其自身结构特点一般可以通过形成复合物的方式来行使功能。bHLH转录因子的HLH结构域具有形成二聚体的功能，除了与相同的bHLH转录因子之间能结合形成同源二聚体外，也可以与其它转录因子成员形成异源二聚体。bHLH转录因子可以与MYB类转录因子形成二聚体发挥作用，还能与MYB和WD40转录因子家族成员形成三聚体复合物(MYB-bHLH-WD40)MBW调控黄酮类物质在植物体内的积累。还有一些缺少碱性区的bHLH蛋白，能通过与其他bHLH蛋白形成二聚体，抑制目标基因的表达。
bHLH转录因子数量很多，有一些bHLH转录因子能与MYB和WD40蛋白形成复合物调控黄酮类化合物。异黄酮只是众多黄酮类化合物中的一种，不同类型的bHLH转录因子是否能导致异黄酮含量变化目前尚未可知。GmEGL3(基因座位号：Glyma.05G208300，基因登录号：LOC100795524)编码的氨基酸序列与NCBI上的bHLH基因同源性较高，蛋白包括bHLH-MYC_N和HLH结构域，说明这个基因为bHLH转录因子家族MYC类转录因子成员。因其与拟南芥基因AtEGL3(AT5G41315)高度同源，因此将该基因命名为GmEGL3，关于该基因和蛋白的功能鉴定本领域未见报道。因此，对GmEGL3进行克隆和功能研究具有重要的意义。
发明内容
本发明的目的在于提供大豆bHLH型转录因子GmEGL3基因、所述基因编码的蛋白、含有所述GmEGL3基因的重组质粒、转基因细胞、重组菌或重组载体在提高大豆籽粒异黄酮含量中的应用。
本发明的目的还在于提供一种基于过表达GmEGL3基因制备高异黄酮转基因大豆的方法。
本发明的上述第一个目的可以通过以下技术方案来实现：大豆bHLH型转录因子GmEGL3基因在提高大豆籽粒异黄酮含量中的应用，所述GmEGL3基因的核苷酸序列如SEQ IDNo.1所示。
本发明还提供了所述大豆bHLH型转录因子GmEGL3基因编码的蛋白在提高大豆籽粒异黄酮含量中的应用，所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
本发明还提供了含有所述GmEGL3基因的重组质粒、转基因细胞、重组菌或重组载体在提高大豆籽粒异黄酮含量中的应用，所述GmEGL3基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
进一步地，含有所述GmEGL3基因的重组质粒、转基因细胞、重组菌或重组载体是将所述GmEGL3基因插入pTF101.1植物表达载体中获得的，所述pTF101.1植物表达载体含有GmEGL3启动子，所述GmEGL3启动子的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。
在上述应用中，本发明通过促进GmEGL3基因的表达提高大豆籽粒异黄酮含量。
本发明的上述第二个目的可以通过以下技术方案来实现：一种基于过表达GmEGL3基因制备高异黄酮转基因大豆的方法，包括以下步骤：
(1)构建包含GmEGL3基因的启动子序列和GmEGL3基因编码序列的过表达载体，所述GmEGL3基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述GmEGL3基因的启动子序列如SEQ IDNO.3所示；
(2)将过表达载体通过根癌农杆菌介导转化法转化至受体大豆；
(3)筛选能够稳定遗传的高异黄酮含量的转基因大豆株系。
在该基于过表达GmEGL3基因制备高异黄酮转基因大豆的方法中：
优选地，步骤(1)中所述GmEGL3基因的启动子序列获取的具体步骤包括：以瓦窑黄豆叶片基因组DNA为模版，克隆得到GmEGL3基因的启动子序列(起始密码子ATG前3856bp的核苷酸序列)，克隆所述GmEGL3基因启动子序列采用的引物包括上游引物GmEGL3 pro-2F和下游引物GmEGL3 pro-2R，所述上游引物GmEGL3 pro-2F的序列如SEQ ID NO.6所示，所述下游引物GmEGL3pro-2R如SEQ ID NO.7所示。
优选地，步骤(1)中所述GmEGL3基因获取的具体步骤包括：以瓦窑黄豆籽粒叶片cDNA为模版，克隆得到GmEGL3基因，克隆所述GmEGL3基因采用的引物包括上游引物GmEGL3-F和下游引物GmEGL3-R，所述上游引物GmEGL3-F的序列如SEQ ID NO.4所示，所述下游引物GmEGL3-R如SEQ ID NO.5所示。
优选地，步骤(1)中构建包含GmEGL3基因的启动子序列和GmEGL3基因编码序列的过表达载体的具体步骤包括：选择HindⅢ和Xba I酶切位点，对带有3×FLAG标签的过表达载体pTF101.1进行双酶切，并将GmEGL3启动子序列与双酶切载体重组连接，得到GmEGL3pro2-pTF101.1重组质粒，继续选择BamHⅠ和SmaⅠ酶切位点，将GmEGL3基因序列与与双酶切载体GmEGL3pro2-pTF101.1重组连接，得到GmEGL3pro2：GmEGL3-pTF101.1重组载体质粒。
优选地，步骤(2)中所述受体大豆为华春6号。
本发明得到的转基因大豆株系是通过农杆菌介导的大豆子叶节遗传转化大豆品种华春6号过表达大豆基因GmEGL3得到的，再将得到的转基因大豆植株通过分子水平鉴定再繁殖加代，获得稳定的遗传材料。
本发明具有以下有益效果：
(1)本发明克隆了一个与大豆异黄酮含量相关的基因GmEGL3，该基因位于大豆第5号染色体，读码框长度为1896bp，编码632个氨基酸，通过农杆菌介导的大豆子叶节遗传转化法将构建的GmEGL3pro2：GmEGL3-pTF101.1重组质粒转入低异黄酮含量大豆品种华春6号，并通过DNA、RNA以及蛋白水平鉴定阳性转基因大豆植株，收获能够稳定转化的大豆转基因植株的成熟期籽粒并利用高效液相色谱仪测定籽粒中异黄酮含量，与对照相比过表达GmEGL3的大豆转基因株系籽粒中异黄酮的含量显著增加，证明大豆GmEGL3基因促进了转基因大豆成熟籽粒中异黄酮的积累；
(2)使用大豆异黄酮含量相关基因GmEGL3重组植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前加上任何一种增强型启动子或者组成型启动子，如花椰菜花叶病毒病35S启动子、玉米的泛素启动子，它们可单独使用或者与其它植物启动子结合使用；另外为了便于对转基因植物或者细胞的筛选，可对所有植物表达载体进行加工，可以加入在植物中表达可以产生颜色变化的酶基因或者发光化合物基因(荧光素酶基因、GUS基因等)、具有抗性的抗生素标记物(壮观霉素、卡那霉素等)或者是抗化学试剂标记基因(抗草甘膦基因、抗除草剂基因等)，从转基因植物安全性考虑，可以不加任何选择性标记基因，直接测定转化植株的异黄酮含量；
(3)本发明所述基因GmEGL3可通过如下方式导入宿主中：将本发明基因GmEGL3插入植物表达载体中，通过农杆菌导入宿主，携带本发明基因GmEGL3的表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织；
(4)本发明的基因GmEGL3对大豆成熟籽粒异黄酮含量有调控作用，经过实验证明，将该基因在大豆中过表达转化，能够显著提高成熟籽粒中异黄酮的含量，为获得高异黄酮的优质大豆提供了更多可能。
附图说明
图1为实施例1中GmEGL3编码区和启动子序列扩增电泳图；注：(a)图为从瓦窑黄豆籽粒cDNA中扩增GmEGL3编码区序列电泳图；(b)图为从瓦窑黄豆叶片基因组DNA中扩增GmEGL3启动子序列电泳图；
图2为实施例2中含有GmEGL3基因的植物超表达载体GmEGL3pro2：GmEGL3-pTF101.1重组质粒图；
图3为实施例2中过表达GmEGL3转基因大豆阳性植株除草剂筛选鉴定；
图4为实施例2中T2代GmEGL3转基因大豆阳性植株分子水平鉴定；注：(a)为不同阳性转基因植株T2叶片DNA水平鉴定结果，其中1-4表示GmEGL3转基因株系OE-3-1、OE-3-2、OE-3-3和OE-3-4，5-8表示GmEGL3转基因株系OE-17-1、OE-17-2、OE-17-3和OE-17-4，9-12表示GmEGL3转基因株系OE-18-1、OE-18-2、OE-18-3和OE-18-4叶片DNA扩增图；(b)为不同阳性转基因植株T2代叶片RNA水平鉴定结果，其中HC6表示阴性对照品种华春6号，星号代表显著性差异，*P<0.05,**P<0.01。(c)为转基因株系Western Blot检测结果；
图5为实施例3中T3代GmEGL3遗传转化大豆植株籽粒异黄酮表型鉴定；注：(a)为T3代GmEGL3转基因大豆株系籽粒中六种异黄酮单体成分含量总和(mean±SE，n＝4)；(b)为T3代GmEGL3转基因大豆株系籽粒异黄酮单体含量比较(mean±SE，n＝4)，星号代表显著性差异，*P<0.05,**P<0.01。
具体实施方式
下述实施方法和实施例中所使用的术语，除非特殊说明，一般具有本领域的普通技术人员通常理解的含义。
下述实施方法中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规实验方法。所用到的引物，均在首次出现时标明，其后所用相同引物，均与首次标明的内容相同。
下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
下面结合具体的制备实施例和应用实施例，并参照数据进一步详细的描述本发明。应理解这些实施例只是举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明范围。
实施例1：大豆异黄酮含量相关基因GmEGL3启动子和编码区序列的克隆
1、GmEGL3编码区序列引物设计，提取瓦窑黄豆籽粒总RNA，反转录cDNA：
使用植物总RNA提取试剂盒(TR02，GeneMark)提取瓦窑黄豆籽粒总RNA，经1％琼脂糖电泳检测其完整性；cDNA合成参照HiScript III 1st Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒说明书操作。
设计引物：
GmEGL3-F：5’-GGCTATACCTGCAAAGCCAGAA-3’(如SEQ ID NO.4所示)；
GmEGL3-R：5’-GTCACACGGCAGAGGTAAGAA-3’(如SEQ ID NO.5所示)。
PCR扩增，具体步骤如下：
步骤1：按照以下组分顺序分别配置PCR反应液(50μL体系)：2×Phanta MaxBuffer(25μL)，ddH2O(19μL)，dNTP Mix(1μL)，GmEGL3-F(2μL)，GmEGL3-R(2μL)，cDNA(1μL)，Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase(1μL)。
步骤2：在Applied2720热循环仪上设定以下程序：95℃预变性3分钟，95℃变性15秒，51℃退火15秒，72℃延伸1分钟，共32个循环；然后72℃彻底延伸5分钟；用1％琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行检测(图1中a图所示)，4℃保存PCR产物。
步骤3：PCR产物纯化回收参照普通DNA产物纯化试剂盒(DP204，天根)，纯化回收后连接pLB载体(pLB零背景快速连接试剂盒，天根)，转化大肠杆菌感受态DH5α，吸取200μL菌液于含有氨苄青霉素(50mg/L)的固体LB培养基上，用已经在酒精灯上灼烧灭菌的无涂布棒轻匀。待菌液被平板吸收后，37℃倒置培养培养12h。挑取单菌落摇菌测序，测序结果表明，该PCR扩增产物的核苷酸序列是序列表中SEQ ID No.1，将SEQ ID No.1所示的DNA命名为GmEGL3，具体如下：
ATGGTGCCAGAGAACTTGAAGAAACAACTTGCTTTGGCTGTGAGAAGCATCCATTGGAGCTATGCAATCTTCTGGACTGATTCAACTACCCAACCCGGGGTGTTGAGCTGGGGGGAAGGGTATTACAATGGAGACATTAAGACTAGGAAAACAAGTCAAGGAGTAGAGCTCAATTCTGACCAAATAGGGTTGCAGAGGAGTGAACAGCTGCGAGAACTATTCAAATCCCTCAAAACTGTAGAAGTCAGCCCTCAAACTAAAAGGCCTTCAGCAGCACTGTCCCCAGAAGATCTCACAGATGCTGAGTGGTGTTACTTGGTTTGCATGTCCTTCATATTCAACATTGGCCAAGGGTTACCAGGAAGAACTCTAGCGAAGGGTCAATCCATTTGGCTGAACAATGCCCATTCTGCTGATTGTAAAATTTTTAGCCGTTCTCTTCTGGCAAAGAGTGCGTCCATTGAGACGGTTGTGTGCTTTCCGTTTAGGGAAGGGGTTATTGAGCTAGGTACTACTGAACAGGTCTCAGAAGATTTGAGTGTCATTGAACGGATCAA AACTTCTTTCTTGAACAGTCTGCATGTCGATGTTCCCAATAAGTCAGTAGCTACATTGAAATCAAGGAAACAGGAAGATCTTTCTTATGTAGCATTTGATCATAATGACTATAATGTTGAATCGATTCCAGAAGTTGGGTATGAAATAGCCAACACAACCTCTCCTAATGGTAGTTCAAATGCAATCCAAGCCAATCAACCACTAGATGACACACTTATGGTTGAAAGTATAACCAATGGCACTTCTCAAGTCCAAAACTGGCAAGTTATTGATGATGAATTGAGTAACTGTGTCCATAACTCCATGAATTCCAGCGACTGTATATCACCAACTTTTGCCAGCCTTGAGAATATTGCTTCTGCCCCCAAGTGTAACAACCCTTCTGATCCTTGTGCCCGAGATTTTCAAAAGTGCAACAACCCAAAAATGACCTTAGTGGATCCTCGAAGTGATGAGTGGCATTATCAGAGAGTTATTTCCACCCTTATAAAAAACACTGACCAGTTACTTATGGGAATGCATTTGCAAAAATTTCCTCAGGCATCAAGCTTTGTTAGTTGGAGGAAAGGAGAGCCAATGGATTCCCAATGGCCAAGAGCAGGAACCTCACAAAAGTTATTGAAGAAAGTATTGTTTGAAGTTCCTCAAATGCACTTGGATGGGCTTCATGAGTCTCAAGAAGAGAATGACTATAAAGAGGGAATGAGAGTAGAAGCTGATGAAAACGGCATGAACCATGTTATGTCAGAAAGGAGGAGAAGAGCAAAACTAAATCAAAGGTTTTTAACCCTTAGGTCAATGGTCCCTTCAATCAGTAAGGATGACAAAGTTTCGATACTAGATGATGCAATTGAATACCTTAAAAAGCTTGAGAGAAGGATAAACGAGTTGGAAGCTCACAGGGGTGTAACAGATATAGAGACTGGGACTAGAAGATCACCACAAGATACGGTGGAGAGGACTCCTGATCATTATTTTAGCAAAAATAATAATAATAATGGTAAAAAACCAGGGATGAAAAAGAGGAAGGCTTGTGGTGTAGATGAGAAAGGAAGAGAGATTAATTTAGATGCTTTAAAAGGCAGTTATGCTAATGATGTTATTGTGAGTACCAGTGACAATGGAATTGTGATCGAAATGAAGTGCCCCTCGAGAGCAGGAAGGATGCTAGAAATTATGGAAGCAATTAACAGTTTCAATATAGATTTTAGTTCAGTTCAGTCAACAGAAGCTGATGGAAATCTTTATCTGACCATTAAATCTGTGCTCACAGGACCAAGGGTTGCAACAGCCAAAAGAATCAAACTAGCACTACAAAAAGTGGCTTCCAAGTGCTGA。
GmEGL3氨基酸序列如SEQ ID No.2，具体如下：
MVPENLKKQLALAVRSIHWSYAIFWTDSTTQPGVLSWGEGYYNGDIKTRKTSQGVELNSDQIGLQRSEQLRELFKSLKTVEVSPQTKRPSAALSPEDLTDAE WCYLVCMSFIFNIGQGLPGRTLAKGQSIWLNNAHSADCKIFSRSLLAKSASIETVVCFPFREGVIELGTTEQVSEDLSVIERIKTSFLNSLHVDVPNKSVATLKSRKQEDLSYVAFDHNDYNVESIPEVGYEIANTTSPNGSSNAIQANQPLDDTLMVESITNGTSQVQNWQVIDDELSNCVHNSMNSSDCISPTFASLENIASAPKCNNPSDPCARDFQKCNNPKMTLVDPRSDEWHYQRVISTLIKNTDQLLMGMHLQKFPQASSFVSWRKGEPMDSQWPRAGTSQKLLKKVLFEVPQMHLDGLHESQEENDYKEGMRVEADENGMNHVMSERRRRAKLNQRFLTLRSMVPSISKDDKVSILDDAIEYLKKLERRINELEAHRGVTDIETGTRRSPQDTVERTPDHYFSKNNNNNGKKPGMKKRKACGVDEKGREINLDALKGSYANDVIVSTSDNGIVIEMKCPSRAGRMLEIMEAINSFNIDFSSVQSTEADGNLYLTIKSVLTGPRVATAKRIKLALQKVASKC*。
2、GmEGL3启动子克隆引物设计，提取瓦窑黄豆叶片基因组DNA；
使用N96 DNA secure Plant Kit新型植物基因组DNA提取试剂盒(天根生化科技股份有限公司，北京，中国)提取瓦窑黄豆叶片基因组总DNA。
设计引物：
GmEGL3 pro-2F：5’-AAGTGCAATTTCTAGACTGGGAT-3’(如SEQ ID NO.6所示)；
GmEGL3 pro-2R：5’-AGCAAGTTGTTTCTTCAAGTTCT-3’(如SEQ ID NO.7所示)。
按上述步骤1、步骤2和步骤3克隆和测序GmEGL3启动子序列，用1％琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行检测(见图1中b图所示)，PCR产物测序结果表明，该PCR扩增产物GmEGL3启动子序列的核苷酸序列是序列表中SEQ ID No.3，具体如下：
AAGTGCAATTTCTAGACTGGGATTTTTCTCCCCGGCAATTATGATTATTTGAAATTTAAAGATTGTTTCTCATAATCGCTCACATCAATAATTAAAATTTTAAGAATTTCAAATACTTCAATTGAAATTCTTTTATTTTCAAAATTTTATGTTTGGATAAAAAAAAATTAAAATTATGAGAATGAAAAAAATGAATAAAAAAAATATGGTTGATGTGCTACTTATACGTGTTCCTCTATGTTCACATCCGATCGATATTTTAGGAGTTCGGAGAAGACTGTAAGAAAAAAATTTCAATTTCTCACCTTTTAAAAAGAAATTGAAATTCCAGATTTTTAGTTGTTTAAAATTCTAAAATTTTAAATTTTTCATAAAAAACATCCAAACAATAAATTCCAAATTACATAAATTTAAATTCTCTGATAAATTACTTTCGTCAGTTAAAATTTTGTATTCAAACACACTCTTAAGATTCAAGTTTGGAATTACGTTTATAAAACACAAGATTTTTTGAGCTGACGGCTTACGCAACAACTACCTTTCATTCATTGGATTTGGATTTTAGTATACGTTGTTTAATTTGAATGATGAATTCATGAACAATAATGCAATCCGATCGTTTTCCTTTTCCTTGTTTATTAGCAACCACAGAGCAGTACTAGGGAAGAAAATTCATAATAGCAACAACAAAAACAAAAACAAAAGTTCAGATTAAGTATTCATAACGAAAAATAGAGAGGGATGCCAAGTCTTGTATGAAAGAATGGGACGGAGGTGGCTATCTTATTGGCTATTTTGTGTTTGTCAATGGTAAAGCAAGTGGTGATAGCTTTATATGGTCCTCCCTAAGATGGTATGGGAATGATTCGGATTGTTTAGAAAGGAAGAGGGAGAAGGGAGAAGTTTTTCATTTTGAGTGATTTTTCTTTGATTTGAGAATTTTTATGATAAGGAATAAATTAATAAGTGTAAACATTAACACTAATGAATATTGTTAAAGTATTAATTAAGACCGCACCAAACTTATGCACGTTGTCAAATCAATTTTATTACATGAGTTGAAAATCTATCTATCCTGCTTGAATGCATGATTTTGGTCAAATAAAATATTGAGATCTTATTTTGGGTATAAGAAATGAAATGAAAGAAGGAGAGCTTCAAGCTTCTGCTCATAGCGGTTTGAATCGTTGGATTGCTTTCACCGGAGTATTATTCAATCAACTGAGGATTCTCTTGTTTTTTTGGGTAGTGTGAGGAATCTTGTTAAAGAGAAAACATGTGATAGGATAGATGAAGTAATATAAAAAAACAAAAATAAAAGATGTGGTGAAAATAAATAAAAAATACTGCTAAGTTGTATAAATATTTTTCTCTCTCAATATTCCGCTAAACCAGACGTAGCAAAATGGCACAAGTCTCCGGATGATTTGTCAAACTCTTTTATTGTATGGATTTGAAAATTGATTCATGTTAAATTGGCACGTGGTAGTGATCTCCTCGTTTATTTTAAAGTCGTGTTTGATTTAAAGTATAAAAAAAAGATGACAAAATAAAAATATTCAATAAGAAGAGGATGAATTCTCTAACACTTGAATTTAACCCATGGTGTTTTTTTTTTGGCTGAACAACCACGGTGTTCTTGTTCTGAATAATAAAAATATTCAAACCAATTAACTGAGTTTGTCGAACTTGGTGGCATGAAGGCGTGTGACAACATGTACAAAGCCACTTGTCTCCCGAATTGCCAAAGGTTAGGCATGCATGATAGATTGACTCAAGTTCATAAGATTGTCCTCTTGCCGTTGGTCATTATTTGCAAAATGTTTCACTTCCTCGTGGCATTATTATATAGAAACAAATAACATTTATTGATTTAAGTATTTATGTATAGATTTCAATTAAAAAATAGTTTTATTTAGATATCT TGCACAATAATGATTAACGTATATACGTCAAGAAATTAATATTAATAAAGTTTTAGGACTATTGGGTGGAATTGGACCAGATCCAAGTTTGGTGACTGAGTCGACCGGGTGAAACATGACAGAGATGTCAATGTAGCGGTTAGAGTACCAAGGGACACTCCAATACTCAAGTCAATATTTGAGAGAAGTAGAGAATAAATCTTAAGAAGTAGAGATATTTCATAATTAGGCTGTTAGAGTCAGCGATAAGTCGCGTCGCGCTTAGAGGATCATGTGTCTCACATAAGTCTTCTTGTTAGTATTGATGACTTGAGAATGTTGATCTAATTAAACAAAATAACTTTGAATCACCTCGATTTGAAGGGGTCAAAGAGATATTTTAGAATAAGAATCAATCGTTTGATTATTGATCATAAGTCACAACTAAAAACTTATTTATTTGCTTTGGAAATTGTTTTGCATTCATAAATCTTTGTTATATAACTCGTTGAGAGTGTAAATCAACTCATAAAAAAATTCAGCTTAACCAATGTTATTTCACCTTAATTAATGATATCAAATTTGAGTCATCAATATACAATTGGGTTAATATTCAAATAAAAAATTTTGTTTCTTGTAATGATGATATTCCACTCAAATAGAATTATATATCTCATATACATGGTCCGTACCAAAATCATTGTTATATAGAGACACATGTTGGCATATTATACAAACATATACACCGTGCACGCTTTGCTTTCTTTTTTACCTGCGGTCTGGAAATGAGTGTCTAGCTCTCCGTAAAAATAGGTATGAGGATTGTAAAATAATGAAGGTGGTCTAGGCTTTCTAATTCAGTGAAAAACTCTTGGTTCCTTGTGTATAACAAGGGCAGCACTATCCCATTACATTAGTACAAGTAACCAAACCAAGCAACACTACTACTATCTTCCCTCTCAAGTCAACATCTACTGCCACTGCAGTAGTCTTCGATTTGGAATGAATCTCCCTATCTAATCTACCAAACAAAACGTGCTTTTGGAATGCAACCTGGTTGTTTTGTTTTTTTTTGTTGTTGATTATGACAAGGATTTCTATAGTCAGGGAAACAAGGGTCATGGCAAGGGAGTAAATAAATCTACACATATATATAGATTAGAGAGAGAGGTAGACAAGTCCAACAAACAAACTTGCCTTTCTTTTCCCATCTGATCATATAACATAACACACTGCAGGCTTCTTGTGTTGTGTTGTGTTCATTCTGAAATTTTGATCTATGTGAAACAAGTTCTGGCTATACCTGCAAAGCCAGAAACA。
实施例2：大豆籽粒异黄酮含量相关基因GmEGL3转基因大豆的获得
步骤1：选择HindⅢ和Xba I酶切位点，对带有3×FLAG标签的过表达载体pTF101.1进行双酶切，利用诺唯赞ClonExpress IIOne Step Cloning Kit试剂盒将实施例1中克隆得的GmEGL3启动子序列与双酶切载体重组连接，将连接产物转化大肠杆菌感受态DH5α，在含有Spe的LB固体培养基进行培养，37℃培养12小时后挑取单菌落进行菌液PCR检测和测序，将测序成功的单菌落扩摇提取质粒，得到GmEGL3pro2-pTF101.1重组质粒。
步骤2：继续选择BamHⅠ和SmaⅠ酶切位点，按照步骤1用将实施例1中克隆得的GmEGL3基因序列替代载体GmEGL3pro2-pTF101.1的BamHⅠ位点与SmaⅠ位点之间的序列，得到GmEGL3pro2：GmEGL3-pTF101.1重组质粒，其结构如图2所示。
步骤3：将GmEGL3pro2：GmEGL3-pTF101.1重组质粒转入根癌农杆菌EHA105中，-80℃保存。之后通过根癌农杆菌介导转化法转化大豆，方法如下：
(1)将装有正常饱满的大豆种子华春6号的玻璃皿放到干燥器中，在烧杯中倒入NaClO溶液100mL，沿烧杯壁缓慢加入4mL浓盐酸，立即盖上盖子密封，灭菌16h左右。
(2)将灭菌后的玻璃皿移至超净工作台中，打开释放剩余的氯气。之后将豆子泡在装有适量无菌水的三角瓶中，浸泡过夜至完全吸胀。
(4)将含有GmEGL3pro2：GmEGL3-pTF101.1重组质粒的农杆菌菌液，在含有Rif和Spe抗性的YEP固体培养基上划线，28℃，培养2d。
(5)待平板上长出单菌落，挑取单菌落做菌液PCR鉴定，将条带正确的菌液于200mL含有Spe的YEP液体培养基中，28℃，250r/min震荡培养至OD600＝0.8。将上步获得的菌液分装于50mL离心管，5,000r/min，离心15min，弃上清，收集管底菌体。
(6)在含有菌体的离心管中加入共培养液体重悬菌体至OD600＝0.8，制成农杆菌侵染液备用。共培养液体培养基成分：蔗糖30g/L，B5盐0.321g/L，MES培养基3.9g/L，pH＝5.4，1mg/L 6-BA，1mg/L GA3，150mg/L DTT，40mg/L乙酰丁香酮，固体共培养培养基加5g琼脂。
(7)将步骤(2)中用无菌水浸泡过夜的大豆种子在超净工作台中用消毒后的手术刀片将种皮去掉并顺胚轴的方向垂直把种子切成两半，切除顶芽、腋芽，即为外植体。
(8)将外植体放入步骤(6)的农杆菌侵染液中，28℃，100r/min摇床，侵染40min。
(9)侵染完成后倒掉侵染液，用镊子将侵染后的子叶节外植体取出，然后按子叶面朝上的方向将外植体放到表面附有灭菌滤纸的共培养培养基，封口膜封口，25℃，共培养4～6d。
(10)将伸长的下胚轴切除保留3～4mm，将外植体接种到含有相应筛选剂的筛选培养基中进行生长，芽诱导筛选培养基成分(蔗糖30g/L，B5盐3.21g/L，MES培养基0.6g/L，pH＝5.7，3.5g/L植物凝胶，1mg/L 6-BA，1mg/L GA3，200mg/mL特美丁，250mg/mL头孢，10mg/mL草铵膦除草剂)，25℃，培养15d。
(11)培养15d后，将豆子重新再转入芽诱导培养基中，25℃，培养15d。
(12)将分化出不定芽的外植体转移到芽伸长培养基(伸长培养基成分：蔗糖30g/L，4.44g/L M404培养基，0.6g/L MES培养基，3.5g/L植物凝胶，pH＝5.7，100μL IAA，500μLGA3，1mL玉米素，0.8mL头孢，0.8mL特美丁，5mL/L Glu，5mL/L Asp，10mg/mL草铵膦)中，25℃下培养15d。
(13)诱导生根，待不定芽伸长约5～7cm时，将其转入生根培养基(生根培养基成分：20g/L蔗糖，4.44g/L M404培养基，3.3g/L植物凝胶，pH＝5.7，1mg/L IAB)培养。
(14)待外植体长出生长健壮的根系后移栽到小盆中，放在光照培养箱(16h光照/8h黑暗)培养。
载体pTF101.1携带Bar基因，使用草丁膦Basta对植株进行抗性检测，待植株长大后，利用浓度为200mg/L草丁膦溶液均匀涂抹叶片。3～5d后，如转化植株的叶片萎蔫变黄，则该植株未转化成功；如转化植株的叶片生长正常且保持绿色，则植株转化成功，为阳性植株，如图3所示。
将鉴定为阳性的植株繁种直至成熟并单株收获加代，之后每一代都需要种植华春6号作为阴性对照并涂抹除草剂鉴定，在T2代能够稳定遗传的株系里采用目的基因重组载体的特异性引物(SEQ ID No.8和SEQ ID No.9)进行PCR分析，确认转基因植株中是否含有重组载体(图4中a图所示)，其中1-4表示转基因株系OE-3-1、OE-3-2、OE-3-3和OE-3-4，5-8表示OE-17-1、OE-17-2、OE-17-3和OE-17-4，9-12表示OE-18-1、OE-18-2、OE-18-3和OE-18-4的扩增条带。
引物序列为：
IT-GmEGL3-1F：5’-GAGGACTTGTTGCGGAAAGG-3’(如SEQ ID No.8所示)；
IT-GmEGL3-1R：5’-GGGAACATCGACATGCAGACT-3’(如SEQ ID No.9所示)。
接着在PCR结果有条带的株系里面取少量叶片作为样品提取RNA，利用Real TimePCR对目标基因在各株系中的表达水平进行了检测，按照ChamQ Universal SYBR qPCRMaster Mix(诺唯赞生物科技股份有限公司，南京，中国)说明书，利用Bio rad伯乐CFX96荧光定量PCR仪进行实时定量PCR实验(图4中b图所示)，其中，HC6表示阴性对照华春6号叶片RNA中GmEGL3的相对表达量；3-1、3-2和3-3分别表示转基因株系OE-3-1、OE-3-2和OE-3-3；17-1、17-2和17-3分别表示转基因株系OE-17-1、OE-17-2和OE-17-3；18-1、18-2和18-4表示转基因株系OE-18-1、OE-18-2和OE-18-4叶片RNA中GmEGL3的相对表达量。
(1)针对GmEGL3基因序列设计荧光定量PCR引物为：
RT-GmEGL3F：5’-TTAACCCTTAGGTCAATGGTC-3’(如SEQ ID No.10所示)；
RT-GmEGL3R：5’-TCTCTATATCTGTTACACCCC-3’(如SEQ ID No.11所示)。
(2)内参基因选择GmACT3(GenBank：AK285830.1)引物序列如下：
RT-GmActin 6F：5’-GCACCACCGGAGAGAAAATA-3’(如SEQ ID No.12所示)；
RT-GmActin 6R：5’-GTGCACAATTGATGGACCAG-3’(如SEQ ID No.13所示)。
根据图4中b图所示结果，选取其中相对表达量较高的两个转基因株系OE-3-2和OE-18-4植株叶片的这两个株系的叶片利用Western Blot方法进行FLAG抗体GmEGL3蛋白检测，进一步验证GmEGL3蛋白在转基因大豆中的表达情况。以未转基因的华春6号大豆材料为阴性对照，结果显示为阳性过表达植株有条带，阴性对照无条带(图4中c图所示)，继续繁种到T3代收获籽粒进行表型鉴定。
实施例3：大豆籽粒异黄酮含量相关基因GmEGL3基因的功能验证
利用实施例2中的植物过表达载体GmEGL3pro2：GmEGL3-pTF101.1遗传转化大豆最终收获的T3代转基因的大豆种子进行下述实验。
使用磨样机将转基因大豆籽粒研磨成粉末，过60目筛，37℃烘箱烘干至恒重。称取0.1200g粉末到10mL离心管中，加入3mL含有80％甲醇(色谱纯)的提取液混匀后放置于超声波清洗机中120min。取混合完全的提取液于4℃，12,000r/min离心10分钟后取上清，上清液使用孔径为0.22μm的过滤器(有机系)过滤。
使用岛津LC-16HPLC系统(Shimadzu/株式会社岛津制作所)测定异黄酮含量。定量分析选用ZORBAX SB 300 C18柱(4.6mm×250mm，5um)。流动相A和B分别由溶于蒸馏水中的0.1％甲酸水溶液(色谱纯)和乙腈(色谱纯)组成。流动相按照0.1％甲酸溶液A与乙腈B交替等压梯度洗脱，紫外检测器的波长设置为260nm，柱温设置为35℃，溶剂流速为1.0mL/min，进样量为10μL。
将不同浓度梯度的大豆异黄酮混标工作液按上述色谱条件进行测定，最后以测出的峰面积为纵坐标，各成分单体浓度为横坐标绘制标准曲线。根据样品的保留时间和最大吸收光谱进行定性分析，以260nm处波长的紫外吸收值为标准，计算样品中异黄酮各组分含量(μg/g)＝ODλ×V/m(OD260nmλ：异黄酮在260nm波长下的浓度；V：提取液总体积(mL)；m：取样质量(g))，最后计算含量。各株系籽粒异黄酮含量的方差分析采用Prism 8.0软件进行统计分析。
结果表明，对GmEGL3转基因大豆T3代株系OE-3-2和OE-18-4和阴性对照大豆品种华春6号在同一环境下进行种植，成熟后进行收获，测量转基因株系成熟籽粒中的异黄酮含量，发现两个转基因株系籽粒中的总异黄酮含量均显著高于对照华春6号。其中，转基因株系OE-3-2籽粒总异黄酮含量约为华春6号的1.24倍，转基因株系OE-18-4籽粒总异黄酮含量约为华春6号的1.89倍(图5中a图所示)。同时，对转基因大豆株系和对照品种华春6号籽粒各组分异黄酮单体成分也进行了比较分析，结果表明，与华春6号的各组分异黄酮单体成分含量相比，两个转基因株系籽粒中大豆苷和染料木苷的含量均存在显著的提高，黄豆黄苷也有一定程度的提高，大豆苷元与染料木素含量则无明显差异，而转基因株系18-4籽粒中黄豆黄素的含量则存在一定程度的下降(图5中b图所示)。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.大豆bHLH型转录因子GmEGL3基因在提高大豆籽粒异黄酮含量中的应用，所述GmEGL3基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
2.权利要求1所述大豆bHLH型转录因子GmEGL3基因编码的蛋白在提高大豆籽粒异黄酮含量中的应用，所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
3.含有权利要求1所述GmEGL3基因的重组质粒、转基因细胞、重组菌或重组载体在提高大豆籽粒异黄酮含量中的应用，所述GmEGL3基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，含有所述GmEGL3基因的重组质粒、转基因细胞、重组菌或重组载体是将权利要求1所述GmEGL3基因插入pTF101.1植物表达载体中获得的，所述pTF101.1植物表达载体含有GmEGL3启动子，所述GmEGL3启动子的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。
5.根据权利要求1-4任一项所述的应用，其特征在于，通过促进GmEGL3基因的表达提高大豆籽粒异黄酮含量。
6.一种基于过表达GmEGL3基因制备高异黄酮转基因大豆的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)构建包含GmEGL3基因的启动子序列和GmEGL3基因的过表达载体，所述GmEGL3基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述GmEGL3基因的启动子序列如SEQ ID NO.3所示；
(2)将过表达载体通过根癌农杆菌介导转化法转化至受体大豆；
(3)筛选能够稳定遗传的高异黄酮含量的转基因大豆株系。
7.根据权利要求6所述基于过表达GmEGL3基因制备高异黄酮转基因大豆的方法，其特征在于，步骤(1)中所述GmEGL3基因的启动子序列获取的具体步骤包括：以瓦窑黄豆叶片基因组DNA为模版，克隆得到GmEGL3基因的启动子序列，克隆所述GmEGL3基因启动子序列采用的引物包括上游引物GmEGL3pro-2F和下游引物GmEGL3 pro-2R，所述上游引物GmEGL3 pro-2F的序列如SEQ ID NO.6所示，所述下游引物GmEGL3 pro-2R如SEQ ID NO.7所示。
8.根据权利要求6所述基于过表达GmEGL3基因制备高异黄酮转基因大豆的方法，其特征在于，步骤(1)中所述GmEGL3基因获取的具体步骤包括：以瓦窑黄豆籽粒叶片cDNA为模版，克隆得到GmEGL3基因，克隆所述GmEGL3基因采用的引物包括上游引物GmEGL3-F和下游引物GmEGL3-R，所述上游引物GmEGL3-F的序列如SEQ ID NO.4所示，所述下游引物GmEGL3-R如SEQ ID NO.5所示。
9.根据权利要求6所述基于过表达GmEGL3基因制备高异黄酮转基因大豆的方法，其特征在于，步骤(1)中构建包含GmEGL3基因的启动子序列和GmEGL3基因的过表达载体的具体步骤包括：选择HindⅢ和Xba I酶切位点，对带有3×FLAG标签的过表达载体pTF101.1进行双酶切，并将GmEGL3启动子序列与双酶切载体重组连接，得到GmEGL3pro2-pTF101.1重组质粒；继续选择BamHⅠ和SmaⅠ酶切位点，将GmEGL3基因序列与与双酶切载体GmEGL3pro2-pTF101.1重组连接，得到GmEGL3pro2：GmEGL3-pTF101.1重组载体质粒。
10.根据权利要求6所述基于过表达GmEGL3基因制备高异黄酮转基因大豆的方法，其特征在于，步骤(2)中所述受体大豆为华春6号。
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