CN111448206B

CN111448206B - 源自番薯的IbOr-R96H变异体及其用途

Info

Publication number: CN111448206B
Application number: CN201880078459.XA
Authority: CN
Inventors: 郭尚洙; 金昊秀; 金昭恩; 李粲椆; 池昶润
Original assignee: Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology KRIBB
Current assignee: Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology KRIBB
Priority date: 2017-12-19
Filing date: 2018-12-17
Publication date: 2022-11-29
Anticipated expiration: 2038-12-17
Also published as: CN111448206A; WO2019124899A1; KR102110870B1; KR20190074229A

Abstract

本发明涉及一种来源于番薯(Ipomoea batatas)的橘色(Orange)蛋白质的第96个氨基酸由精氨酸被组氨酸取代的变异体及其用途，本发明的IbOr‑R96H变异体能够显著提高植物体的类胡萝卜素的含量，能够赋予高温胁迫抗性高温压力的抵抗性。

Description

源自番薯的IbOr-R96H变异体及其用途

技术领域

本发明涉及一种来源于番薯(Ipomoea batatas)的橘色(Orange)蛋白质的第96个氨基酸由精氨酸(arginine)被取代为组氨酸(histidine)的变异体及其用途。

背景技术

番薯(Ipomoea batatas L.Lam)是一种具有代表性的根作物，不仅可以在比较薄地上种植，而且每公顷产量优秀约为30吨，因此用作粮食和家畜饲料。紫色、黄色等有色番薯包含多种抗氧化物质，尤其，呈黄色的黄色番薯含有14.7～20mg/100g的β-胡萝卜素，紫色番薯含有2.28g/100g左右的花青素，因此去除促进细胞的老化及引起各种成人疾病的活性氧的抗氧化活性非常卓越。并且，自1990年代以来，番薯试图通过农杆菌(Agrobacterium)共培养进行了转化，发展了通过从顶端及侧芽分裂组织中诱导胚芽发生培养细胞以及体细胞胚芽发生的植物体再分化转化系统。

类胡萝卜素(carotenoid)为光合作用体系的必需的成分、果实和花的挥发性成分、作为植物激素的叶落酸(ABA)的前体物质、作为维生素原(provitamin)A的前体，不仅对植物，而且对人类等动物非常有用的物质，因具有很强的抗氧化功效而广泛用在癌症、心脏疾病、眼科疾病等医疗产业上以及营养素的重要物质。

另一方面，韩国授权专利公告第1281071号公开了“来源于番薯的IbOr-Ins基因变异体及其用途”，韩国授权专利公报第1359308号公开了“富含类胡萝卜素及花青素的转化番薯植物体的制备方法及其植物体”，但尚未记载有关本发明的来源于番薯的IbOr-R96H变异体及其用途。

发明内容

技术问题

本发明即为满足上述需求而得出的，本发明人制备了来源于番薯的橘色蛋白质的第96个氨基酸由精氨酸被取代为组氨酸的IbOr-R96H变异体，使用包含编码上述变异体的基因的重组载体转化番薯细胞的结果，确认与未转化番薯培养细胞、使用野生型IbOrange基因及IbOr-Ins变异体基因转化的番薯培养细胞相比，使用IbOr-R96H变异体转化的番薯培养细胞中的总类胡萝卜素的含量，尤其是β-胡萝卜素的含量有着显著增加，与未转化番薯植物体及野生型IbOrange基因转化的番薯植物体相比，确认使用IbOr-R96H变异体基因转化的番薯植物体的高温胁迫抗性更优秀，从而完成了本发明。

技术方案

为了解决上述问题，本发明提供一种来源于番薯的橘色蛋白质的第96个氨基酸由精氨酸(arginine，R)被取代为组氨酸(histidine，H)的由序列1的氨基酸序列组成的IbOr-R96H变异体。

并且，本发明提供一种编码上述IbOr-R96H变异体的基因。

并且，本发明提供一种包含上述基因的重组载体。

并且，本发明提供一种类胡萝卜素含量增加及高温胁迫抗性提高的转化植物体，包括使用上述重组载体转化植物细胞来过表达用于编码IbOr-R96H变异体的基因的步骤。

并且，本发明提供一种通过上述方法制备的类胡萝卜素含量增加及高温胁迫抗性提高的转化植物体及其转化的种子。

并且，本发明提供一种提高植物体的高温胁迫抗性及类胡萝卜素含量的方法，包括使用上述重组载体转化植物细胞来过表达用于编码IbOr-R96H变异体的基因的步骤。

并且，本发明提供一种包含编码上述IbOr-R96H变异体的基因作为有效成分的用于提高植物体的高温胁迫抗性及类胡萝卜素含量的组合物。

发明的效果

使用本发明的IbOr-R96H变异体转化的植物体可富含作为功能性物质的类胡萝卜素，因此可以以多种方式用作保健食品、化妆品、饲料等的材料，可通过使用IbOr-R96H变异体来开发类胡萝卜素含量提高的高质量植物体。并且，使用本发明的IbOr-R96H变异体转化的植物体也可以栽培在普通植物体难以生长的高温地区。

附图说明

图1为包含IbOrange蛋白质的第96个氨基酸由精氨酸(R)变为组氨酸(H)的IbOr-R96H基因变异体的重组载体的示意图。

图2为对分别使用未转化番薯培养细胞(YM)和野生型IbOrange基因(IbOr-wt)及IbOrange基因变异体(IbOr-Ins及IbOr-R96H)转化的番薯细胞的表型进行确认的照片。

图3示出IbOrWT或IbOrR96H过表达转化番薯植物体的制备过程，其中(a)部分为载体图，(b)部分为使用从转化植物体中提取的基因组脱氧核糖核酸(DNA)进行聚合酶链式反应(PCR)的结果，(c)部分为利用实时荧光定量聚合酶链式反应(quantitative real-timePCR)来分析每个转化的植物体中基因表达水平的结果。

图4为利用IbOrWT或IbOrR96H过表达转化番薯植物体的叶盘进行高温胁迫(47℃)抗性实验的结果，其中(a)部分为3，3'-二氨基联苯胺四盐酸盐(DAB)染色的表型，(b)部分为测量每个叶盘的离子渗漏(ion leakage)的结果。

具体实施方式

为了实现本发明的目的，本发明提供一种来源于番薯的橘色蛋白质的第96个氨基酸由精氨酸被取代为组氨酸的由序列1的氨基酸序列组成的IbOr-R96H变异体。

当本发明的IbOr-R96H变异体在转化的植物体内过表达时，可以显著增加植物体的总类胡萝卜素以及高温胁迫抗性。

并且，本发明还提供编码上述IbOr-R96H变异体的基因。

编码本发明的IbOr-R96H变异体的基因的范围可以是精氨酸的编码碱基被组氨酸的编码碱基(CAT或CAC)取代，以使野生型IbOr蛋白质的第96个氨基酸可以被取代为组氨酸，优选地，可以为由序列2的碱基序列组成，但不限于此。

并且，本发明还提供一种包含编码IbOr-R96H变异体的基因的重组载体。

术语“重组”是指细胞复制异源核酸，或者表达上述核酸，或者表达由肽、异源肽或异源核酸编码的蛋白质的细胞。重组细胞可以将上述细胞的天然形态下未发现的基因或基因片段表达为有义或反义形态中的一种。并且，重组细胞可以表达在天然状态的细胞中发现的基因，但是上述基因已被修饰并通过人工方式重新引入细胞中。

术语“载体”用于指向细胞内传递的(多个)脱氧核糖核酸片段、核酸分子。载体复制脱氧核糖核酸，并可以在宿主细胞中独立地进行再生成。而术语“转运体”经常与“载体”互换使用。术语“表达载体”是指重组脱氧核糖核酸分子，其包含用于表达所需的编码序列和在特定宿主生物中可操作地连接的编码序列必不可少的适当核酸序列。可利用于真核细胞中的启动子、增强子、终止信号及多腺苷酸化信号时公知的。

作为植物表达载体的优选例有Ti-质粒载体，当存在于根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)等适当的宿主中时，其能够将其自身的一部分，所谓的转移脱氧核糖核酸(T-DNA)区域转移到植物细胞。目前其他类型的Ti-质粒载体(参照EP0116718B1)被用在将杂合脱氧核糖核酸序列转移到植物细胞，或可通过将杂合脱氧核糖核酸适当插入植物的基因组来生成新植物的原生质体中。Ti-质粒载体特别优选的形态为如EP0120516B1及美国专利第4940838号所要求的所谓的二元(binary)载体。可以用于将本发明的脱氧核糖核酸引入植物宿主中的其他合适的载体为可选自双链植物病毒(例如，花椰菜花叶病毒(CaMV))、单链病毒以及可以衍生自双生病毒等的病毒载体，例如不完整的植物病毒。特别是在难以适当转化植物宿主时，此类载体的使用可能有利的。

优选地，表达载体包含一个以上的选择性标记。上述标记是具有通常可用化学方法选择的特性的核酸序列，所有能够区分转化的细胞从未转化的细胞的基因对应于此，作为其例包括：抗除草剂基因，如甘草膦(glyphosate)、草铵膦(phosphinothricin)、草丁膦(glufosinate)等；以及抗生素内生基因，如卡那霉素(Kanamycin)、G418、博来霉素(Bleomycin)、潮霉素(Hygromycin)、氯霉素(Chloramphenicol)，但不限于此。

在本发明的植物表达载体中，启动子可以为CaMV35S、肌动蛋白、泛素、pEMU、MAS或组蛋白启动子，但不限于此。

术语“启动子”是指从结构基因的脱氧核糖核酸的上游区域，是指为了开始转录的而与核糖核酸(RNA)聚合酶结合的脱氧核糖核酸分子。“植物启动子”是指能够在植物细胞中开始转录的启动子。“组成型(constitutive)启动子”是指在大部分环境条件及发育状态或细胞分化中具有活性的启动子。由于可以在各种阶段中通过各种组织来进行转换体的选择，在本发明中组成型启动子可能是优选的。因此，组成型启动子不限制选择的可能性。

在本发明的植物表达载体中，可以使用常规的终止子，作为其例包括一氧化氮酶(NOS)、水稻α-淀粉酶RAmy1A终止子、菜豆碱(phaseoline)终止子、根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)的真蛸碱(Octopine)基因终止子等，但不限于此。关于终止子的需要，一般认为这样的区域增加在植物细胞内转录的确定性及效率。因此，终止子的使用在本发明中极为优选。

并且，本发明提供一种类胡萝卜素含量增加及高温胁迫抗性提高的转化植物体的制备方法，包括使用上述重组载体转化植物细胞，过表达编码IbOr-R96H变异体的基因的步骤。

在根据本发明的一实例的方法中，上述IbOr-R96H变异体可以由序列1的氨基酸序列组成。

上述“基因过表达”是指使上述基因的以在野生型植物中的表达水平以上表达。作为向植物体内引入上述基因的方法，使用包含受启动子调节的上述基因的表达载体来转化植物体的方法。在上述方法中，对于启动子没有特别限制，只要是可以在植物体中过表达插入基因即可。

植物的转化是指将脱氧核糖核酸转移至植物的任意方法。这样的转化方法不一定具有再生和(或)组织培养期间。现在，植物的转化在包括在双子叶植物以及单子叶植物两者的植物物种中都很普遍。原则上，任意的转化方法都可使用于根据本发明的将杂合脱氧核糖核酸引入适当的祖细胞的过程中。方法可适当地选自对于原生质体的钙/聚乙二醇方法(Negrutiu et al.，1987，Plant Mol.Biol.8：363-373)、原生质体的电穿孔法(Shillitoet al.，1985，Bio/Technol.3：1099-1102)、植物因素的显微注射法(Crossway et al.，1986，Mol.Gen.Genet.202：179-185)、各种植物因素的(脱氧核糖核酸或核糖核酸编码的)粒子冲击法(Klein et al.，1987，Nature 327：70)、以通过植物的浸润或成熟花粉或小孢子转化的根癌农杆菌为媒介的基因转移(不完整)的病毒的感染(EP 0301316B1)等。根据本发明的优选方法包括以农杆菌介导的脱氧核糖核酸传递。尤其，优选地，使用如EPA120516号及美国专利第4940838号中公开的所谓二元载体技术。

使用于植物的转化的“植物细胞”可以是任意植物细胞。植物细胞是培养细胞、培养组织、培养器官或植物整体。“植物组织”为分化或未分化的植物组织，例如，包括根、茎、叶、花粉、种子、瘤组织及用于培养的多种形态的细胞，即，单一细胞、原生质体(protoplast)、芽及愈伤组织，但不限于此。植物组织可处于原位(in planta)或器官培养、组织培养或细胞培养状态。

并且，本发明提供一种通过上述方法制备的类胡萝卜素含量增加及高温胁迫抗性提高的转化植物体及其种子。

相对未转化植物体，本发明转化植物体的总胡萝卜素的含量增加约34倍，尤其，β-胡萝卜素的含量可能增加了约300倍，但不限于此。

并且，与未转化植物体及由编码野生型IbOr的基因转化的植物体相比，可能本发明转化的植物体的高温胁迫抗性优秀。上述高温可以为40～55℃，优选地，可以为45～49℃，更为优选地，可以为47℃，但不限于此。

并且，本发明的类胡萝卜素含量增加及高温胁迫抗性提高的上述转化植物体可以为旋花科(Convolvulaceae)、豆科(Leguminosae)、五加科(Araliaceae)等双子叶植物体或禾本科(Gramineae)等单子叶植物体，优选地，可以为旋花科的双子叶植物提，更为优选地，可以为番薯，但不限于此。

并且，本发明提供一种提高植物体的类胡萝卜素含量及高温胁迫抗性的方法，包括使用包含编码上述IbOr-R96H变异体的基因的重组载体转化植物细胞，过表达编码IbOr-R96H变异体的基因的步骤。本发明的上述IbOr-R96H变异体可以由序列1的氨基酸序列组成，若IbOr-R96H变异体在植物体中过表达，则包括β-胡萝卜素等的植物体的总胡萝卜素的含量得以提高，植物体的高温胁迫抗性得以提高。

并且，本发明提供一种包含编码上述IbOr-R96H变异体的基因作为有效成分的用于提高植物体的类胡萝卜素含量及高温胁迫抗性的组合物。本发明的组合物包含编码IbOr-R96H变异体的基因作为有效成分，上述IbOr-R96H变异体为使用组氨酸(H)取代由序列1的氨基酸序列组成且来源于番薯的橘色蛋白质的第96个氨基酸由精氨酸被取代为组氨酸，可通过使用编码上述变异体的基因转化植物细胞来提高植物体的类胡萝卜素含量及高温胁迫抗性。

以下，通过实施例详细说明本发明。但下述实施例仅为例示本发明，本发明的内容不限于下述实施例。

实施例1.IbOr-R96H变异体基因的克隆及碱基序列分析

基于聚合酶链式反应-介导的定点诱变方法，通过使用QuickChange^TM定点诱变试剂盒试剂盒(美国安捷伦(Agilent)公司)来进行IbOr-R96H变异体基因的克隆，以克隆于pDONR207载体的IbOr野生型(WT)互补脱氧核糖核酸(cDNA)为模板并使用正向引物(5'-GAAATTCAAGACAATATTCGGAGTCACCGGAATAAAATATTTTTGCA-3'，序列3)及反向引物(5'-TGCAAAAATATTTTATTCCGGTGACTCCGAATATTGTCTTGAATTTC-3'，序列4)。通过对聚合酶链式反应产物的序列分析确认IbOr野生型的作为第96个氨基酸的精氨酸被组氨酸取代，将其命名为IbOr-R96H变异体。

实施例2.包含IbOr-R96H变异体基因的重组载体的制备以及使用上述载体过表达IbOr-R96H变异体的转化体的开发

为了制备过表达IbOr-R96H变异体的转化体，使用英杰(Invitrogen)公司的gateway反应系统，制备pDONR207和作为植物表达载体的pGWB5载体和通过LR反应克隆的IbOr-R96H变异体的重组载体。重组载体使用根癌农杆菌EHA105菌株转化作为白色(米色)果肉的番薯的Yulmi培养细胞。转化的培养细胞选自包含潮霉素的MS(Murashige andSkoog)培养基。以转化的培养细胞为对象，使用BIOFACT公司的HiGene^TM基因组脱氧核糖核酸提取试剂盒(植物用)提取基因组脱氧核糖核酸后，通过聚合酶链式反应分析作为转化体的选择标记的潮霉素基因潮霉素磷酸转移酶(hygromycin phosphotransferase，HPT)的表达。

实施例3.使用IbOr-R96H重组载体转化的番薯培养细胞中的类胡萝卜素含量的分析

对使用包含IbOr-R96H变异体基因的重组载体转化的番薯培养细胞的表型进行观察的结果，用肉眼确认未转化的番薯培养细胞呈米色，相反，使用野生型IbOr基因转化的番薯培养细胞呈黄色，使用以往发表(韩国授权专利公报第1281071号)的IbOr-Ins变异体转化的番薯培养细胞呈深黄色，而使用本发明的IbOr-R96H变异体转化的番薯培养细胞用肉眼具有接近橘色的颜色(图2)。

并且，通过高效液相色谱法(HPLC，High-performance liquid chromatography)分析对每个转化的番薯培养细胞的类胡萝卜素含量进行定量(表1)。其结果，使用IbOr-R96H变异体转化的番薯培养细胞的总类胡萝卜素含量比未转化的番薯培养细胞增加约24倍以上。尤其，在β-胡萝卜素的含量的情况下，使用IbOr-R96H变异体转化的番薯培养细胞比未转化的番薯培养细胞增加约88倍以上。并且，确认与使用野生型IbOr(IbOr-WT)转化的番薯培养细胞相比，使用IbOr-R96H变异体转化的番薯培养细胞的总类胡萝卜素含量增加13倍以上，β-胡萝卜素的含量增加39倍以上，由此可知本发明的IbOr-R96H变异体提高植物体的类胡萝卜素的含量的效果非常优秀。

表1

实施例4.IbOr-R96H过表达转化的番薯植物体的制备

使用番薯品种中的徐薯29(在中国北方地区栽培较多的品种中的一种)来制备过表达野生型IbOr基因(IbOr^WT)或IbOr-R96H变异体基因(IbOr^R96H)的转化番薯植物体。将各个上述IbOr^WT或IbOr^R96H克隆至具有35S启动子和C-末端具有FLAG标签的pGWB11载体来制备载体(图3的(a)部分)。在番薯转化实验中，将含有重组载体的根癌农杆菌的EHA105菌株与番薯胚性愈伤组织共培养3天后，使用MS基本培养基清洗，在选择培养基中培养，每隔3周进行传代培养后，从存活的胚性愈伤组织中诱导地上部和根部，再分化为小植物体，从而制备转化番薯的植物体。对通过在25℃的生长室中每天光照16小时的条件下培养3周的番薯植物体的第三叶或第四叶进行采样来提取基因组脱氧核糖核酸，制备正向(5'-CGCACAATCCCACTATCCTT-3'，序列5)以及反向(5'-TTCCCAAGCTCAGCATTCTT-3'，序列6)引物组来执行基因组脱氧核糖核酸聚合酶链式反应。聚合酶链式反应的条件如下，最初在94℃的温度下变性5分钟后，重复变性、退火、延伸过程30次，在94℃的温度下变性30秒钟，在58℃的温度下退火30秒钟，在72℃的温度下延伸60秒钟。而后最终延伸在72℃的温度下进行5分钟。通过上述结果确保了10株在基因组脱氧核糖核酸中鉴定IbOr^WT或bOr^R96H的转化植物体确(图3的(b)部分)。

使用Ribospin^TM Plant试剂盒(韩国GeneAll公司)从以与上述相同的方式采样的叶子中提取总核糖核酸。通过处理不含核糖核酸酶的脱氧核糖核酸酶I(RNase-free DNaseI)(韩国GeneAll公司)来去除基因组脱氧核糖核酸污染，使用TOPscript^TM RT DryMIX(dT18)(韩国Enzynomics公司)，并用1000μg的总核糖核酸合成互补脱氧核糖核酸。聚合酶链式反应条件如下，最初在42℃的温度下进行5分钟后，在50℃的温度下进行60分钟、在95℃的温度下进行5分钟。用于比较基因表达的实时定量(quantitative real-time)聚合酶链式反应的引物制备为正向(5'-GCACTGGATCACTAGTCCTT-3'，序列7)及反向(5'-GTCAATTCGTGGGTCATGCT-3'，序列8)。实时定量聚合酶链式反应使用96孔培养板通过CFXreal-time PCR system(Bio-Rad公司，美国)来进行。每个反应(最终20μl)通过添加2μl的稀释的互补脱氧核糖核酸和10μl的EvaGreen PCR Master Mix(韩国Solgent公司)以及各1μl的引物来进行。聚合酶链式反应的条件如下，最初在95℃的温度下进行15分钟后，在95℃的温度下进行20秒钟、在60℃的温度下进行40秒钟、在72℃的温度下进行20秒钟并重复40次。分析结果，选择IbOr^WT或IbOr^R96H的基因表达高的3株(图3的(c)部分)。

实施例5.IbOr-R96H过表达的转化番薯植物体的环境胁迫抗性评价

在过去的研究中，确认与未转化番薯植物体相比，IbOr过表达的转化番薯植物体(cv.Sinzami)在高温胁迫条件下具有抗性。本发明人基于过去的研究结果，对IbOr^R96H过表达转化番薯植物体和IbOr^WT过表达转化的番薯植物体对高温胁迫抗性进行比较分析。在土壤中繁殖IbOr^WT或IbOr^R96H过表达转化番薯植物体，在25℃、每天光照16小时的条件下生长室中生长4周后，切割植物体的(从上数第3、4个)叶子来制备叶盘(leaf disc)。以5个叶盘为1次重复，共进行3次重复。首先，将叶盘置于高温(47℃)下12小时后进行3，3'-二氨基联苯胺四盐酸盐(DAB)染色并测量离子渗漏(ion leakage)。为了观察承受胁迫诱导细胞凋亡时产生的活性氧的产生程度，进行了3，3'-二氨基联苯胺四盐酸盐染色，使用离子电导率仪(ion conductivity meter)以6小时为单位在0～12小时内测量由于胁迫导致的细胞的离子损失，以12小时后将试样在80℃的温度下处理2小时以完全破坏细胞来测量的离子损失值为100％来计算每个检测值。其结果，确认IbOr过表达转化植物体的叶盘的损伤比未转化的番薯植物体(NT)轻，可知其对高温具有抗性，尤其可知，IbOrR96H过表达转化番薯植物体比IbOrWT过表达转化的番薯植物体具有更强的高温抗性(图4)。

<110> 韩国生命工学研究院

<120> 源自番薯的IbOr-R96H变异体及其用途

<130> P20112485WP

<160> 8

<170> KoPatentIn 3.0

<210> 1

<211> 313

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> IbOr-R96H

<400> 1

Met Val Tyr Ser Gly Arg Ile Leu Ser Leu Ser Ser Ser Thr Thr Pro

1 5 10 15

Phe His Leu Ser Thr Ser Pro Phe His Ser Ser Arg Tyr His Leu His

20 25 30

Gly Arg Leu Lys Ser Arg Val Arg Leu Arg Pro Met Ala Ala Asp Ala

35 40 45

Asp Ser Ser Ser Phe Ser Ser Ser Val Asp Thr Glu Ala Pro Asp Lys

50 55 60

Asn Ala Ala Gly Phe Cys Ile Ile Glu Gly Pro Glu Thr Val Gln Asp

65 70 75 80

Phe Ala Gln Met Glu Leu Lys Glu Ile Gln Asp Asn Ile Arg Ser His

85 90 95

Arg Asn Lys Ile Phe Leu His Met Glu Glu Val Arg Arg Leu Arg Ile

100 105 110

Gln Gln Arg Ile Lys Asn Ala Glu Leu Gly Asn Leu Asn Glu Lys Gln

115 120 125

Glu Asn Lys Leu Pro Asn Phe Pro Ser Phe Ile Pro Phe Leu Pro Pro

130 135 140

Leu Thr Ser Ala Asn Leu Lys Gln Tyr Tyr Ala Thr Cys Phe Ser Leu

145 150 155 160

Ile Ala Gly Val Met Leu Phe Gly Gly Leu Leu Ala Pro Thr Leu Glu

165 170 175

Leu Lys Leu Gly Leu Gly Gly Thr Ser Tyr Ala Asp Phe Ile Arg Ser

180 185 190

Met His Leu Pro Met Gln Leu Ser Asp Val Asp Pro Ile Val Ala Ser

195 200 205

Phe Ser Gly Gly Ala Val Gly Val Ile Ser Ala Leu Met Val Val Glu

210 215 220

Ile Asn Asn Val Lys Gln Gln Glu His Lys Arg Cys Lys Tyr Cys Leu

225 230 235 240

Gly Thr Gly Tyr Leu Ala Cys Ala Arg Cys Ser Ser Thr Gly Ser Leu

245 250 255

Val Leu Ile Glu Pro Val Ser Thr Val Asn Arg Gly Asp Gln Pro Leu

260 265 270

Ser Pro Pro Lys Thr Glu Arg Cys Thr Asn Cys Ser Gly Ser Gly Lys

275 280 285

Val Met Cys Pro Thr Cys Leu Cys Thr Gly Met Ala Met Ala Ser Glu

290 295 300

His Asp Pro Arg Ile Asp Pro Phe Asp

305 310

<210> 2

<211> 942

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> IbOr-R96H

<400> 2

atggtatatt caggtagaat cttgtcgctc tcgtcctcca cgacgccgtt tcatctctcc 60

acttcgccgt tccacagttc ccggtatcat ctccatggaa ggctcaaatc cagagtcaga 120

ttgcgtccta tggccgccga tgccgattcc tcctcctttt cttcatccgt cgacaccgaa 180

gcacccgata aaaacgcagc cgggttttgt attatagaag ggcctgagac agtgcaggac 240

tttgctcaaa tggaattgaa agaaattcaa gacaatattc ggagtcaccg gaataaaata 300

tttttgcata tggaagaggt tcgtaggctg agaatacagc aacgaattaa gaatgctgag 360

cttgggaatc ttaatgaaaa gcaagaaaat aaacttccga attttccttc gttcattcct 420

tttttgcctc ctctgacatc cgcaaatctt aaacaatatt atgccacttg tttctctctc 480

atagccggag ttatgctttt tggcggactg ctagcaccta ctttggaact aaaattgggc 540

ttaggaggta catcgtacgc tgatttcatt cgcagcatgc accttccgat gcaattaagt 600

gatgtggacc ccattgtggc gtccttctcc ggtggagcag tcggggtaat ctctgccttg 660

atggtagttg aaataaacaa tgtgaaacag caggagcata agaggtgcaa gtactgttta 720

ggaacagggt atcttgcatg tgctcgctgt tcaagcactg gatcactagt ccttatcgaa 780

cctgtctcca cagttaatcg tggagatcag ccactatcac cacctaaaac agaaagatgc 840

acaaactgct cgggttcagg gaaggtcatg tgccctacat gtctttgtac tgggatggct 900

atggcaagcg agcatgaccc acgaattgac ccatttgatt aa 942

<210> 3

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 3

gaaattcaag acaatattcg gagtcaccgg aataaaatat ttttgca 47

<210> 4

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 4

tgcaaaaata ttttattccg gtgactccga atattgtctt gaatttc 47

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 5

cgcacaatcc cactatcctt 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 6

ttcccaagct cagcattctt 20

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 7

gcactggatc actagtcctt 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 8

gtcaattcgt gggtcatgct 20

Claims

1.一种IbOr-R96H变异体，其特征在于，由序列1的氨基酸序列组成，来源于番薯的橘色蛋白质的第96个氨基酸由精氨酸被取代为组氨酸。

2.一种基因，其特征在于，编码权利要求1所述的IbOr-R96H变异体。

3.一种重组载体，其特征在于，包含权利要求2所述的基因。

4.一种类胡萝卜素含量增加及高温胁迫抗性提高的转化植物体的制备方法，其特征在于，包括使用权利要求3所述的重组载体转化植物细胞使编码IbOr-R96H变异体的基因过表达的步骤；

所述转化植物体为番薯。

5.一种提高植物体的类胡萝卜素含量及高温胁迫抗性的方法，其特征在于，包括使用权利要求3所述的重组载体转化植物细胞使编码IbOr-R96H变异体的基因过表达的步骤；

所述植物体为番薯。

6.一种用于提高植物体的类胡萝卜素含量及高温胁迫抗性的组合物，其特征在于，包含权利要求2所述的基因作为有效成分。