CN118773191A

CN118773191A - 靶向LPA基因的RNAi剂及其用途

Info

Publication number: CN118773191A
Application number: CN202410405283.1A
Authority: CN
Inventors: 朴峻贤; 崔正容
Original assignee: Hansen Shanghai Health Technology Co ltd; Jiangsu Hansoh Pharmaceutical Group Co Ltd; Shanghai Hansoh Biomedical Co Ltd
Current assignee: Hansen Shanghai Health Technology Co ltd; Jiangsu Hansoh Pharmaceutical Group Co Ltd; Shanghai Hansoh Biomedical Co Ltd
Priority date: 2023-04-03
Filing date: 2024-04-03
Publication date: 2024-10-15
Also published as: WO2024210530A1; CN119384503A

Abstract

提供了靶向脂蛋白(a)(LPA)基因的RNAi剂及其用途，更特别地，提供了包括与LPA mRNA序列具有序列互补性的反义链和与该反义链具有序列互补性的有义链的RNAi剂，以及包括该RNAi剂的、用于预防或治疗心血管疾病的药物组合物。

Description

靶向LPA基因的RNAi剂及其用途

技术领域

本披露涉及靶向LPA基因的RNAi剂及其用途，更特别地，涉及包括与LPA mRNA序列具有序列互补性的反义链和与该反义链具有序列互补性的有义链的RNAi剂，以及包括该RNAi剂的用于预防或治疗心血管疾病的药物组合物。

背景技术

近年来，由于生活环境的变化以及经常食用肉类、快餐和方便食品的西化饮食习惯导致的动物源性食品的摄入量不断增加，心血管疾病的发病率日益增加。据世界卫生组织(WHO)称，心血管疾病是全球发病率和死亡率的主要原因，据报道，2019年全球大约有890万人由于心血管疾病而死亡。心血管疾病是指循环系统(如心脏和血管)的疾病，而动脉硬化被认为是其直接和主要原因。动脉硬化是一种胆固醇或甘油三酯在血管中积聚，使血管变窄、硬化、阻塞的疾病，目前尚无确定的方法可以减少或消除上述症状。当前，当已经存在动脉粥样硬化时，重点是防止进一步进展或预防由于动脉粥样硬化导致的死亡或并发症，而在尚未发生动脉粥样硬化的情况下，会采用通过控制或去除动脉粥样硬化风险因素来预防的方法。

同时，LPA或Lp(a)(脂蛋白(a))主要在肝组织中表达，并且已知是与心血管疾病发生相关的遗传风险因素之一。欧洲心脏病学会(ESC)和动脉粥样硬化学会(EAS)建议一生中至少测量一次LPA，以确定心血管疾病风险。此外，已确定180mg/dL或更高的遗传高水平LPA具有与杂合子家族性高胆固醇血症相似的心血管疾病风险，并建议治疗目标为低于50mg/dL。也就是说，降低LPA的疗法可用于治疗疾病，如卒中、动脉粥样硬化、血栓形成和心血管疾病(如冠心病和主动脉瓣狭窄)。然而，由于LPA水平因饮食、运动或其他生命周期变化带来的可变性非常有限，因此需要一种能够控制LPA基因表达水平的新技术。

相应地，作为开发用于治疗心血管疾病的新药的深入研究努力的结果，本发明诸位发明人开发了能够特异性抑制LPA mRNA表达(通过与LPA mRNA结合)的RNAi剂，从而完成了本披露。

发明内容

本披露的目的是提供特异性抑制LPA表达的RNAi剂。

本披露的另一目的是提供用于预防或治疗心血管疾病的药物组合物(包括RNAi剂)，或预防或治疗心血管疾病的方法(包括向受试者施用该药物组合物)。

为实现上述目的，一方面提供了RNAi剂，其包括：与LPA mRNA序列具有序列互补性且长度为19nt至21nt的反义链；以及与该反义链具有序列互补性且长度为15nt至17nt的有义链，其中该反义链的5'端和该有义链的3'端形成平端。

另一方面提供了包括RNAi剂作为活性成分的药物组合物，用于预防或治疗心血管疾病。

又另一方面提供了预防或治疗心血管疾病的方法，该方法包括向受试者施用该RNAi剂。

又另一方面提供了该RNAi剂用于制造用于预防或治疗心血管疾病的药物产品的用途。

附图说明

从以下结合附图的描述中，本披露的某些实施例的上述及其他方面、特征和优点将更加明显，其中：

图1是示意性地示出由16-mer有义链和21-mer反义链组成的LPA asiRNA的结构的图；

图2a示出了用根据一方面的55种LPA asiRNA(asiLPA-001至asiLPA-055)以10nM的浓度分别处理Hep3B细胞后确认LPA mRNA的表达水平的结果；

图2b示出了用根据一方面的54种LPA asiRNA(asiLPA-056至asiLPA-109)以10nM的浓度分别处理Hep3B细胞后确认LPA mRNA的表达水平的结果；

图3a示出了用根据一方面的55种LPA asiRNA(asiLPA-110至asiLPA-164)以10nM的浓度分别处理Hep3B细胞后确认LPA mRNA的表达水平的结果；

图3b示出了用根据一方面的54种LPA asiRNA(asiLPA-165至asiLPA-218)以10nM的浓度分别处理Hep3B细胞后确认LPA mRNA的表达水平的结果；

图4a示出了用根据一方面的55种LPA asiRNA(asiLPA-219至asiLPA-273)以10nM的浓度分别处理Hep3B细胞后确认LPA mRNA的表达水平的结果；

图4b示出了用根据一方面的54种LPA asiRNA(asiLPA-274至asiLPA-327)以10nM的浓度分别处理Hep3B细胞后确认LPA mRNA的表达水平的结果；

图5a示出了用根据一方面的54种LPA asiRNA(asiLPA-328至asiLPA-381)以10nM的浓度分别处理Hep3B细胞后确认LPA mRNA的表达水平的结果；

图5b示出了用根据一方面的53种LPA asiRNA(asiLPA-382至asiLPA-434)以10nM的浓度分别处理Hep3B细胞后确认LPA mRNA的表达水平的结果；

图6示出了用65种LPA asiRNA以1nM的浓度分别处理Hep3B细胞后确认LPA mRNA的表达水平的结果；

图7示出了用65种LPA asiRNA以1nM的浓度分别处理Hep3B细胞后确认LPA mRNA的表达水平的结果；

图8示出了用根据一方面的40种LPA asiRNA以0.1nM的浓度分别处理Hep3B细胞后确认LPA mRNA的表达水平的结果；

图9示出了用根据一方面的40种LPA asiRNA以10nM的浓度分别处理原代人肝细胞后确认LPA mRNA的表达水平的结果；

图10示出了用根据一方面的40种LPA asiRNA以10nM的浓度分别处理原代食蟹猴肝细胞后确认LPA mRNA的表达水平的结果；

图11示出了在以8mg/kg(mpk)的单剂量向SEAP-LPA(P1)HDI小鼠皮下施用根据一方面的6种LPA GalNAc-asiRNA(OLX706A-006-1、OLX706A-032-1、OLX706A-033-1、OLX706A-034-1、OLX706A-036-1、OLX706A-043-1)(其中引入化学修饰)后，确认LPA表达水平随时间变化的结果；

图12示出了在以8mg/kg(mpk)的单剂量向SEAP-LPA(P2)HDI小鼠皮下施用根据一方面的9种LPA GalNAc-asiRNA(OLX706A-006-1、OLX706A-007-1、OLX706A-033-1、OLX706A-043-1、OLX706A-062-1、OLX706A-064-1、OLX706A-092-1、OLX706A-108-1、OLX706A-369-1)后，确认LPA表达水平随时间变化的结果；

图13示出了在以8mg/kg(mpk)的单剂量向SEAP-LPA(P3)HDI小鼠皮下施用根据一方面的5种LPA GalNAc-asiRNA(OLX706A-006-1、OLX706A-064-1、OLX706A-170-1、OLX706A-171-1、OLX706A-187-1)(其中引入化学修饰)后，确认LPA表达水平随时间变化的结果；

图14示出了用根据一方面的14种LPA GalNAc-asiRNA(OLX706A-033-4、OLX706A-062-2、OLX706A-062-12、OLX706A-092-4、OLX706A-033-1、OLX706A-062-1、OLX706A-092-1、OLX706A-006-12、OLX706A-007-12、OLX706A-007-4、OLX706A-033-12、OLX706A-062-4、OLX706A-006-1、OLX706A-007-1)(其中引入化学修饰)以200nM的浓度分别处理原代人肝细胞后，确认LPA mRNA表达水平的结果；并且

图15示出了在以5mg/kg(mpk)的单剂量向SEAP-LPA(P2)HDI小鼠皮下施用根据一方面的6种LPA GalNAc-asiRNA(OLX706A-033-4、OLX706A-033-12、OLX706A-062-2、OLX706A-062-4、OLX706A-062-12、OLX706A-092-4)(其中引入化学修饰)后，确认LPA表达水平变化的结果；

图16a示出了在以3mg/kg(mpk)的单剂量向Apo(a)TG小鼠皮下施用根据一方面的4种LPA GalNAc-asiRNA(OLX706A-033-4、OLX706A-062-2、OLX706A-062-12、OLX706A-092-4)(其中引入化学修饰)后，确认Apo(a)表达水平随时间变化的结果；

图16b示出了在以1mg/kg(mpk)的单剂量向Apo(a)TG小鼠皮下施用根据一方面的3种LPA GalNAc-asiRNA(OLX706A-033-4、OLX706A-062-2、OLX706A-062-12)(其中引入化学修饰)后，确认Apo(a)表达水平随时间变化的结果；

图17示出了在以3mg/kg(mpk)的单剂量向食蟹猴皮下施用根据一方面的2种LPAGalNAc-asiRNA(OLX706A-033-4、OLX706A-062-12)(其中引入化学修饰)后，确认Lp(a)表达水平随时间变化的结果；

具体实施方式

现在将详细参考实施例，其实施例在附图中示出，其中相同的附图标记通篇是指代相同的元件。在此方面，本发明实施例可具有不同形式，且不应解释为限于本文列出的描述。因此，如下所述仅通过引用图来描述实施例，以解释本描述的各方面。如本文所用，术语“和/或”包括至少一个相关联的列出项目的任何和所有组合。当表达(例如“至少一个，”)在元件列表前面时，是修饰整个元件列表，而不是修饰列表中的单个元件。

本申请中披露的每个描述和实施例也可以应用于其他描述和实施例。也就是说，本申请中披露的多种元件的所有组合均在本申请的范围内。此外，不应解释为本申请的范围受到如下所述详细描述的限制。

一方面提供了RNAi剂，其包括：与LPA mRNA序列具有序列互补性且长度为19nt至21nt的反义链；以及与该反义链具有序列互补性且长度为15nt至17nt的有义链，其中该反义链的5'端和该有义链的3'端形成平端。

RNAi剂

术语“RNA干扰(RNAi)”是指通过引入由与靶基因的mRNA具有序列同源性的链和具有与上述链互补的序列的链组成的双链RNA(dsRNA)来诱导靶基因的mRNA降解来抑制靶基因表达的机制。

本文所用的术语“RNAi剂”或“诱导RNAi的核酸分子”是指能够通过以序列特异性方式介导RNA干扰来抑制或下调基因表达或病毒复制的任何药剂或核酸分子。该术语可以指单个核酸分子、多个核酸分子或核酸分子池。在实施例中，RNAi剂可以是siRNA。

本文所用的术语“小干扰RNA(siRNA；短干扰RNA)”是指序列特异性介导有效基因沉默的短双链RNA(dsRNA)。

本文所用的术语“基因”应考虑其最广泛的含义，并且可以编码结构蛋白或调节蛋白。在此方面，调节蛋白包括转录因子，热休克蛋白或参与DNA/RNA复制、转录和/或翻译的蛋白质。在本披露中，待抑制的靶基因是病毒基因组所固有的，且可整合到动物基因组中或作为染色体外组分存在。

本文所用的术语“反义链”是指与目的靶核酸基本上或100％互补并且可以与例如信使RNA(mRNA)、非mRNA RNA序列(例如微小RNA、piwiRNA、tRNA、rRNA和hnRNA)或编码或非编码DNA序列完全或部分互补的多核苷酸。

本文所用的术语“有义链”是指与靶核酸具有相同核酸序列的多核苷酸，或与例如信使RNA(mRNA)、非mRNA RNA序列(例如微小RNA、piwiRNA、tRNA、rRNA和hnRNA)或编码或非编码DNA序列完全或部分相同的多核苷酸。

本文所用的术语“互补性”或“互补”是指本领域中普遍接受的含义。该术语通常可以指一个核酸序列与另一个核酸序列之间通过传统沃森-克里克键合或如本文所述的其他非传统类型的键合形成或存在氢键。完全互补性可以意指核酸序列的所有连续残基与第二核酸序列中相同数量的连续残基形成氢键。核酸分子内的部分互补性可包括多个错配或非碱基对核苷酸(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个或更多个错配，例如，1至3个错配、非核苷酸接头或非碱基对核苷酸)。部分互补性可能导致在核酸分子的有义链与反义链之间或核酸分子的反义链与相应靶核酸分子之间产生凸起、环、突出端或平端。

本文所用的术语“平端”是指本领域中普遍接受的含义。关于本文中的RNAi剂或核酸分子，该术语可以指缺乏突出核苷酸的双链siRNA分子的末端。本文所述的siRNA分子可使得反义链的5'-端和有义链的3'-端形成平端。

用于沉默LPA表达的RNAi剂

“脂蛋白(a)(LPA)”是一种主要在肝脏中表达的异质性低密度脂蛋白颗粒，由通过ApoB多肽与低密度脂蛋白(LDL)连接的载脂蛋白(a)(Apo(a))构成。据报道，血清中的高水平LPA不受饮食或运动的影响，并且通过增加发生动脉粥样硬化的可能性而与心血管疾病风险增加密切相关。此外，就诊断和预防医学而言，已知患者血清中的高水平LPA是冠心病和主动脉瓣狭窄的一个显著显性、独立和遗传风险因素。因此，LPA基因可能是心血管疾病的潜在治疗靶标。LPA蛋白可以解释为包括天然存在的野生型LPA及其功能变体，并且可以从已知数据库(例如美国国立卫生研究院的GenBank)获得LPA蛋白或编码其的基因的序列。

本文所用的术语“表达”是指本领域中普遍接受的含义。该术语通常指基因最终产生蛋白质的过程。该表达包括但不限于转录、剪接、转录后修饰或翻译。如本文所用，可通过检测mRNA水平或蛋白质水平来确定或监测表达水平。

术语“抑制”或“降低”(如涉及受试者中的LPA基因表达时所用)是指与未治疗组或正常对照组相比统计学上显著的减少。该降低可以是例如至少30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％或更高，但根据检测或测量方法，其可能低于检测限。

siRNA是一种小干扰RNA，参与RNA干扰(RNAi)。RNAi是1998年首次在秀丽隐杆线虫中发现的一种细胞内基因调节机制，已知其作用机制是通过反义链诱导靶基因降解，该反义链是引入细胞中的RNA双链之一，与靶基因的mRNA互补结合，并且最近RNAi已成为开发新药最流行的候选技术之一。

然而，与这种可能性相反，siRNA的副作用和缺点不断被报道。为了开发基于RNAi的治疗剂，必须要克服一些障碍，如1)缺乏有效的递送系统，2)脱靶效应，3)诱导免疫应答，以及4)细胞中RNAi机制饱和。尽管siRNA是直接调节靶基因表达的有效方法，但由于这些问题而难以开发治疗剂。在此方面，不对称较短双链体siRNA(asiRNA)是与本领域siRNA的19+2结构相比具有较短双螺旋长度的不对称RNAi诱导结构。asiRNA技术克服了现有siRNA结构技术中存在的脱靶效应、RNAi机制饱和及TLR3免疫应答等问题，因此有可能开发出新的低副作用RNAi药物。

基于此，在该实例中呈现了包括有义链和与有义链互补的反义链的不对称siRNA，且根据实例的siRNA不会引起脱靶效应、RNAi机制饱和等问题，且因此可在稳定地维持高递送效率的同时将LPA基因的表达抑制到期望的程度。

在一个实例中，设计并制备了靶向LPA的不对称siRNA(asiRNA)，并且在将asiRNA转染至表达LPA的细胞后，选择以优异的敲低效率诱导RNAi的核酸分子，即LPA asiRNA。

在实施例中，RNAi剂的特征为有义链的长度为15nt至17nt，并且反义链的长度为19nt至21nt。更优选地，有义链的长度可以是16nt，与其互补的反义链的长度可以是19nt、20nt或21nt，但不限于此。

反义链的5'-端和有义链的3'-端可以形成平端。反义链的3'端可包括例如2nt至6nt的突出端。

在实施例中，有义链可以是选自表1、表2、表3、表4、表5、表6、表7、表8和表9中列出的有义链序列的序列，并且反义链可以包括选自表1、表2、表3、表4、表5、表6、表7、表8和表9中列出的反义链序列的序列。

在实施例中，有义链可以是例如选自以下的至少一种：SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:51、SEQ IDNO:53、SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:71、SEQ ID NO:77、SEQ IDNO:79、SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:87、SEQ ID NO:103、SEQ ID NO:123、SEQID NO:125、SEQ ID NO:127、SEQ ID NO:183、SEQ ID NO:215、SEQ ID NO:339、SEQ ID NO:341、SEQ ID NO:373、SEQ ID NO:375、SEQ ID NO:471、SEQ ID NO:477、SEQ ID NO:495、SEQID NO:701、SEQ ID NO:709、SEQ ID NO:711、SEQ ID NO:713、SEQ ID NO:715、SEQ ID NO:735、SEQ ID NO:737、SEQ ID NO:739、SEQ ID NO:743和SEQ ID NO:775。

在实施例中，有义链可以是例如选自以下的至少一种：SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:71、SEQ ID NO:85、SEQ IDNO:123、SEQ ID NO:127、SEQ ID NO:183、SEQ ID NO:215、SEQ ID NO:339、SEQ ID NO:341、SEQ ID NO:373和SEQ ID NO:737，例如，其可以是选自以下的任一种：SEQ ID NO:11、SEQID NO:13、SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:123和SEQ ID NO:183。优选地，有义链可以是选自以下的任一种：SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:123和SEQ ID NO:183。

在实施例中，反义链可以是例如选自以下的至少一种：SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:52、SEQ IDNO:54、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:78、SEQ IDNO:80、SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:86、SEQ ID NO:88、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:124、SEQID NO:126、SEQ ID NO:128、SEQ ID NO:184、SEQ ID NO:216、SEQ ID NO:340、SEQ ID NO:342、SEQ ID NO:374、SEQ ID NO:376、SEQ ID NO:472、SEQ ID NO:478、SEQ ID NO:496、SEQID NO:702、SEQ ID NO:710、SEQ ID NO:712、SEQ ID NO:714、SEQ ID NO:716、SEQ ID NO:736、SEQ ID NO:738、SEQ ID NO:740、SEQ ID NO:744和SEQ ID NO:776。

在实施例中，反义链可以是例如选自以下的至少一种：SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:86、SEQ IDNO:124、SEQ ID NO:128、SEQ ID NO:184、SEQ ID NO:216、SEQ ID NO:340、SEQ ID NO:342、SEQ ID NO:374和SEQ ID NO:738，例如，反义链可以是选自以下的任一种：SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:124和SEQ ID NO:184。优选地，反义链可以是选自以下的任一种：SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:124和SEQ ID NO:184。在优选的实施例中，所述RNAi剂具有如SEQ ID NO:65所示的有义链以及如SEQ ID NO:66所示的反义链；所述RNAi剂具有如SEQ ID NO:123所示的有义链以及如SEQ ID NO:124所示的反义链；或者所述RNAi剂具有如SEQ ID NO:183所示的有义链以及如SEQ ID NO:184所示的反义链。

引入化学修饰的RNAi剂

在RNAi剂中，有义链或反义链可包括一种或多种化学修饰。在一方面，本披露提供了新的化学修饰模式以改善RNAi剂的性质和效果。

一般的siRNA由于高负电荷和高分子量的磷酸骨架结构而无法穿过细胞膜，并且被快速降解并从血液中消除，导致难以将足够的量递送至实际靶位点以进行RNAi诱导。当前，对于体外递送，已经开发了许多使用阳离子脂质和阳离子聚合物的高效递送方法，然而，对于体内，很难像体外一样高效递送siRNA，并且存在由于与生物体中存在的多种蛋白质相互作用而降低siRNA递送效率的问题。

因此，在该实例中提供了通过向不对称siRNA结构引入化学修饰而具有改善的肝细胞靶向递送能力的RNAi剂，更特别地，提供了能够在没有单独的载剂的情况下进行有效细胞内递送的不对称siRNA构建体(GalNAc不对称siRNA，GalNAc-asiRNA)。

在本披露中，有义链或反义链中的化学修饰可包括选自以下的一种或多种：与N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)衍生物或细胞穿透肽结合；用硫代磷酸酯、硼烷磷酸酯或膦酸甲酯修饰核苷酸键；用-H、-CH₃(甲基)、-OCH₃(-O-甲基)、-NH₂、-F、-O-2-甲氧基乙基-O-丙基、-O-2-甲基甲硫基乙基、-O-3-氨基丙基或-O-3-二甲基氨基丙基取代核苷酸的糖结构2'碳位处的-OH基团；以及用E-乙烯基膦酸酯取代5'端的-OH基团。

在实施例中，N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)衍生物可具有下式1的结构。N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)衍生物识别肝细胞表面的无唾液酸糖蛋白(ASGPR)受体，并帮助RNAi剂流入肝细胞，即充当靶向ASGPR的部分，因此，RNAi剂(其中N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)衍生物与其末端结合)改善了向肝细胞的递送，并可能为肝病提供有效的靶向治疗。

式1

在实施例中，有义链可包括选自以下的一种或多种化学修饰：用硫代磷酸酯、硼烷磷酸酯或膦酸甲酯修饰与5'端相邻的2至4个核苷酸键；用-H、-CH₃(甲基)、-OCH₃(-O-甲基)、-NH₂、-F、-O-2-甲氧基乙基-O-丙基、-O-2-甲基甲硫基乙基、-O-3-氨基丙基或-O-3-二甲基氨基丙基取代至少一种核苷酸的糖结构2'碳位处的-OH基团；以及3'端与N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)衍生物或细胞穿透肽结合。

在实施例中，反义链可包括选自以下的一种或多种化学修饰：用硫代磷酸酯、硼烷磷酸酯或膦酸甲酯修饰与3'端或5'端相邻的2至7个核苷酸键；用-H、-CH₃(甲基)、-OCH₃(-O-甲基)、-NH₂、-F、-O-2-甲氧基乙基-O-丙基、-O-2-甲基甲硫基乙基、-O-3-氨基丙基或-O-3-二甲基氨基丙基取代至少一种核苷酸的糖结构2'碳位处的-OH基团；以及将5'端的-OH基团取代为E-乙烯基膦酸酯。

在另一个实施例中，RNAi剂可包括选自以下的至少一种修饰：将与有义链或反义链中的3'端或5'端相邻的2至7个核苷酸键修饰为硫代磷酸酯；将有义链或反义链中至少一种核苷酸的糖结构2'碳位处的-OH基团修饰为-H、-OCH₃(-O-甲基)或-F；有义链的3'端与N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)衍生物结合；以及将反义链5'端的-OH基团取代为E-乙烯基膦酸酯。

在另一个实施例中，如上所述的RNAi剂具有反义链和有义链，其中在反义链中，从5’至3’，2、14、16位被2’-氟修饰，5和7位是脱氧核苷，并且其余位置被2’-OMe修饰，3’端有六个硫代磷酸酯键，5’端有一个5’(E)-乙烯基膦酸酯核苷酸；在有义链中，从5’至3’，2、4、5、6位被2’-氟修饰，并且任选地，3'端有一个与N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)衍生物连接的核苷酸。

在实施例中，如上所述的RNAi剂具有有义链，从5’至3’：2、4、5、6、14和16位被2’-氟修饰，并且其余位置被2’-OMe修饰。在实施例中，如上所述的RNAi剂具有有义链，从5’至3’：2、4、5、6和12位被2’-氟修饰，并且其余位置被2’-OMe修饰。在一些实施方案中，化学修饰方式为：在RNAi剂的反义链中，从5’至3’，使第2、14、16位被2’-氟修饰，第5和7位是修饰为脱氧核苷，并且其余位置被2’-OMe修饰，3’端有六个硫代磷酸酯键修饰，5’端有一个5’(E)-乙烯基膦酸酯核苷酸；在RNAi剂的有义链中，从5’至3’，使第2、4、5、6、14和16位被2’-氟修饰，并且其余位置被2’-OMe修饰,并且任选地，3'端有一个与N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)衍生物连接的核苷酸。在一些实施方案中，化学修饰方式为：在RNAi剂的反义链中，从5’至3’，使第2、14、16位被2’-氟修饰，第5和7位是修饰为脱氧核苷，并且其余位置被2’-OMe修饰，3’端有六个硫代磷酸酯键修饰，5’端有一个5’(E)-乙烯基膦酸酯核苷酸；在RNAi剂的有义链中，从5’至3’，使第2、4、5、6和12位被2’-氟修饰，并且其余位置被2’-OMe修饰,并且任选地，3'端有一个与N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)衍生物连接的核苷酸。在实施例中，在如上所述的RNAi剂的有义链中，从5’至3’可以修饰为：

(m)*(f)*(m)(f)(f)(f)(m)(m)(m)(m)(m)(m)(m)(f)(m)(f)(GAL)；

并且在如上所述的RNAi剂的反义链中，从5’至3’可以修饰为：

[EVP](m)*(f)*(m)(m)(d)(m)(d)(m)(m)(m)(m)(m)(m)(f)(m)*(f)*(m)*(m)*(m)*(m)*(m)；

其中，*表示硫代磷酸酯键，(m)表示2'-O-甲基，(f)表示2'-氟，(d)表示现有的2'-OH被-H取代的形式，[EVP]表示E-乙烯基膦酸酯，(GAL)表示三价GalNAc衍生物。优选地，三价GalNAc衍生物为式1。

在实施例中，在如上所述的RNAi剂的有义链中，从5’至3’可以修饰为：

(m)*(f)*(m)(f)(f)(f)(m)(m)(m)(m)(m)(f)(m)(m)(m)(m)(GAL)；

[EVP](m)*(f)*(m)(m)(d)(m)(d)(m)(m)(m)(m)(m)(m)(f)(m)*(f)*(m)*(m)*(m)*(m)*(m)；

在实施例中，有义链可以是选自表15中列出的有义链序列的序列，并且反义链可以包括选自表15中列出的反义链序列的序列。在优选的实施例中，RNAi剂可以选自表15中列出的GalNAc-asiRNA缀合物。

在实施例中，有义链可以是选自以下的任一种：下表中的(A)至(D)，并且反义链可以是选自以下的任一种：下表中的(a)至(d)。

在上述序列中，*表示硫代磷酸酯键，m表示2'-O-甲基，f表示2'-氟，d表示现有的2'-OH被-H取代的形式，EVP表示E-乙烯基膦酸酯，GAL表示具有式1的三价GalNAc衍生物。

特别地，RNAi剂的有义链和反义链可以是选自上表的以下有义链和反义链的序列，例如，RNAi剂可以具有有义链(A)和反义链(a)的组合；有义链(B)和反义链(b)的组合；有义链(C)和反义链(c)的组合；或有义链(D)和反义链(d)的组合。

又另一方面提供了RNAi剂用于制造用于预防或治疗心血管疾病的药品的用途。

由于药物组合物原样含有或使用上述RNAi剂，因此为避免本说明书过于复杂，省略对其的描述。

心血管疾病

该药物组合物可以用作通过抑制LPA基因的表达来预防或治疗心血管疾病的药物组合物的活性成分。

心血管疾病可统指由体内循环系统异常、功能障碍、损伤等多种原因直接引起的原发性疾病，以及由原发性疾病衍生的继发性疾病。心血管疾病是一种与LPA基因表达水平密切相关的疾病，例如可以是选自以下的任一种：伯格氏病、外周动脉疾病、冠状动脉疾病、代谢综合征、急性冠脉综合征、主动脉瓣狭窄、心肌梗死、主动脉瓣反流、主动脉夹层、视网膜动脉阻塞、脑血管疾病、肠系膜缺血、肠系膜上动脉阻塞、肾动脉狭窄、稳定/不稳定型心绞痛、急性冠脉综合征、杂合子或纯合子家族性高胆固醇血症、高β脂蛋白血症、脑血管动脉粥样硬化和静脉栓塞形成，但不限于此。

药物组合物

本文所用的术语“有效成分”意指产生有益或期望的临床或生物化学结果的适当有效量的成分。特别地，该术语可以指有效量的药剂、活性剂或RNAi剂。

有效量可施用一次或多次，并且在无限情况下可以是用于预防疾病、缓解症状、降低疾病程度、稳定(即，不加重)疾病状态、延迟或降低疾病进展速率、或改善或暂时缓解和改善(部分或完全)疾病状态的适当量。

本文所用的术语“预防”是指预先阻止疾病发生、抑制疾病或延迟其进展的任何行动。例如，该术语是指预防心血管疾病或其特征的发生、阻止发生、或防御或防止心血管疾病或其特征的发生。

本文所用的术语“治疗”是指治疗性治疗和预防(preventive或prophylactic)措施。此外，它是指使疾病症状出现改善或有益地变化的任何行动。例如，该术语是指在受试者中预防、减少或改善心血管疾病或其特征，或延迟(减弱)心血管疾病或其特征的进展。

本文所用的术语“有效量”是指本领域中普遍接受的含义。该术语通常是指研究人员、兽医、医生或其他临床医生等寻求的在细胞、组织、系统、动物或人类中引起预期生物应答(例如，有益应答)的分子、化合物或构建体的量。特别地，“治疗有效量”是指分子、化合物或构建体能够引起期望的医学应答(达到特定临床治疗可能被认为有效的程度)的量，例如由于与疾病或障碍相关的可测参数的治疗相关变化。用于治疗疾病或障碍的药物的治疗有效量可以是引起参数的治疗相关变化所必需的量。

本领域技术人员可基于患者的症状和疾病的严重程度来确定施用药物组合物的方法。此外，药物组合物可以配制成多种形式，如粉末、片剂、胶囊、溶液、注射剂、软膏、糖浆等，并且可以在单位剂量或多剂量容器(例如密封安瓿和瓶)中提供。

本披露的药物组合物可口服或肠胃外施用。根据本披露的组合物的施用途径可以是例如口服、静脉内、肌内、动脉内、髓内、鞘内、心内、经皮、皮下、腹膜内、肠道、舌下或局部，但不限于此。根据本披露的组合物的剂量根据患者的体重、年龄、性别、健康状况、饮食、施用时间、方法、排泄率或疾病严重程度等而变化，并且可以由本领域普通技术人员很容易地确定。此外，本披露的组合物可使用已知技术配制成用于临床施用的合适配制品。

由于治疗心血管疾病的方法原样包括或使用上述药物组合物，因此为避免本说明书过于复杂，省略对其的描述。

本文所用的术语“受试者”是指需要治疗疾病(特别地，心血管疾病)的受试者，并且更特别地，该术语可以包括所有哺乳动物，如人或非人灵长类动物、小鼠、犬、猫、马、牛、绵羊、猪、山羊、骆驼和羚羊。

在下文中，将通过实例更详细地描述本披露。然而，这些实例旨在说明本披露，且本披露的范围不限于这些实例。

实例1：用于诱导靶向LPA的RNAi的核酸分子的筛选

1-1.LPA asiRNA的设计和制备

在本实例中，为获得诱导靶向LPA的高效RNA干扰的双链核酸分子，在选择LPA基因的靶序列后，设计了其的LPA不对称siRNA(LPA asiRNA)(有义链(16-mer)、反义链(21-mer)，参见图1)。

特别地，在通过检索NCBI数据库获得LPA基因信息后，结合动物实验设计了总计434种asiRNA，并由OliX US公司以4nmole规模合成。此后，通过使用15％聚丙烯酰胺凝胶对合成的asiRNA进行凝胶电泳，然后通过使用ChemiDoc UV透射仪(transilluminator)(伯乐公司(Biorad))进行质量控制(QC)。根据上述方法制备的LPA asiRNA的序列信息如下表1至表9所示。

[表1]

[表2]

[表3]

[表4]

[表5]

[表6]

[表7]

[表8]

[表9]

1-2. 130种LPA asiRNA的选择

将Hep3B细胞(人肝癌细胞)用浓度为10nM的434种LPA asiRNA转染，并进行双萤光素酶报告基因测定，以测量LPA mRNA的表达水平。特别地，通过使用lipofectamine 2000(英杰公司(Invitrogen)，11668019，0.2μl/孔)将LPA asiRNA(10nM)和psiCHECK-2-LPA质粒DNA(10ng/孔)递送至Hep3B细胞中。然后，通过使用双萤光素酶报告基因测定系统(普洛麦格公司(Promega)，目录号E1980)测量海肾萤光素酶(由LPA mRNA表达)和萤火虫萤光素酶的强度，并用在引入psiCHECK-2-LPA质粒DNA的状态下组成性表达的萤火虫萤光素酶的强度水平对LPA mRNA的表达水平进行归一化来评估LPA mRNA的表达水平。

结果如图2至图5所示，确认了按照LPA asiRNA处理抑制海肾萤光素酶表达的作用。此外，还鉴定出显示相对良好的表达抑制效率的130种LPA asiRNA(asiLPA-001、002、003、004、005、006、007、008、009、010、013、016、017、018、019、020、021、022、023、024、025、026、027、031、033、032、034、035、036、038、039、040、041、042、043、044、050、051、052、053、054、055、056、059、061、062、063、064、066、070、079、088、092、098、102、105、108、110、119、120、121、124、129、130、131、146、147、149、152、161、167、168、170、171、178、187、188、204、213、214、216、217、221、230、236、238、239、240、244、245、248、249、250、251、258、265、275、334、343、349、351、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、364、365、367、368、369、370、371、372、373,374、379、388、400、406、411、418、422、431、434)。

1-3. 40种LPA asiRNA的选择

以与实例1-2中相同的方式，将Hep3B细胞(人肝癌细胞)用浓度为1nM的130种所选的LPA asiRNA转染，并进行双萤光素酶报告基因测定，以测量LPA mRNA的表达水平。

结果如图6和图7所示，确认了按照LPA asiRNA处理抑制LPA mRNA表达的作用。此外，还鉴定出40种显示相对良好的表达抑制效率的LPA asiRNA(asiLPA-002、006、007、008、016、018、020、024、026、027、032、033、034、036、039、040、042、044、052、063、064、092、102、108、170、171、187、188、213、236、351、355、356、357、365、368、369、370、372、388)。

1-4. 40种LPA asiRNA抑制表达的作用的确认

分别用40种LPA asiRNA转染Hep3B细胞、原代人肝细胞或原代食蟹猴肝细胞，并进行双萤光素酶报告基因测定或qRT-PCR，以测量LPA mRNA的表达水平。

特别地，对于Hep3B细胞的实验，用浓度为0.1nM的总计40种LPA asiRNA转染Hep3B细胞，并测量LPA mRNA的表达水平(以与实例1-2中相同的方式)。此外，对于原代人肝细胞的实验，用浓度为10nM的总计40种LPA asiRNA转染原代人肝细胞，并通过进行qRT-PCR测量LPA mRNA的表达水平。特别地，将原代人肝细胞以1.0×10⁴个细胞/孔接种在96孔板中，并通过使用lipofectamine 2000(英杰公司，13778150)用LPA asiRNA(10nM)转染。转染后24小时，通过使用用于qPCR的SuperPrepTM细胞裂解和RT试剂盒(试剂盒II，东洋纺公司(TOYOBO)，SCQ-401)制备细胞裂解物，并使用裂解物中包含的mRNA作为模板，通过逆转录合成cDNA。然后，通过使用合成的cDNA作为模板，通过使用基因表达测定和探针(Hs00916691_m1：人LPA，Hs03928985_g1：RNA18S5，应用生物系统公司(AppliedBiosystems))进行定量PCR。然后，通过使用CFXOpus 384实时PCR系统(伯乐公司(Bio-Rad))鉴定LPA mRNA的表达水平。此外，对于原代食蟹猴肝细胞的实验，用浓度为10nM的40种LPA asiRNA转染原代食蟹猴肝细胞，并通过进行qRT-PCR测量LPA mRNA的表达水平。特别地，将原代食蟹猴肝细胞以4.5×10⁴个细胞/孔接种在96孔板中，并通过使用lipofectamine 2000(英杰公司，13778150)用LPA asiRNA(10nM)转染。转染后24小时，使用用于qPCR的SuperPrepTM细胞裂解和RT试剂盒(试剂盒II，东洋纺公司，SCQ-401)制备细胞裂解物，并使用裂解物中含有的mRNA作为模板，通过逆转录合成cDNA。然后，通过使用合成的cDNA作为模板，通过使用基因表达测定和探针(Mf02789271_m1：食蟹猴LPA，Mf04354341_g1：ACTB，应用生物系统公司)进行定量PCR。然后，通过使用CFX Connect实时PCR系统(伯乐公司)鉴定LPA mRNA的表达水平。

结果如图8至图10所示，在Hep3B细胞、原代人肝细胞或原代食蟹猴肝细胞中均确认了按照LPA asiRNA处理抑制LPA mRNA表达的作用。

综合实例1的所有实验结果，鉴定出显示相对良好表达抑制效率的40种LPAasiRNA(asiLPA-006、007、016、018、020、024、026、027、032、033、034、036、039、040、042、043、044、052、062、063、064、092、108、170、171、187、188、236、239、248、351、355、356、357、358、368、369、370、372、388)，用于进一步的筛选。

实例2：通过使用引入化学修饰的诱导RNAi的核酸分子进行筛选

2-1.引入化学修饰的用于诱导RNAi的核酸分子

在本实例中，设计了引入化学修饰的LPA GalNAc-asiRNA，作为诱导靶向LPA的高效RNA干扰的双链核酸分子。特别地，考虑到实例1的实验结果，选择15种LPA asiRNA(asiLPA-006、007、032、033、034、036、043、062、064、092、108、170、171、187、369)作为基本骨架。然后，根据每种基本骨架设计了15种LPA GalNAc-asiRNA，其中引入了1)用-OMe或-F取代有义链和反义链的核苷酸糖结构2'碳位处的-OH基团，2)在反义链的5'端或3'端和有义链的5'端的骨架中引入硫代磷酸酯修饰，3)在反义链的5'端引入磷酸酯，以及4)在有义链的3'端引入GalNAc。

本实例中制备的经化学修饰的LPA GalNAc-asiRNA的序列信息在下表10中示出。特别地，在表10中，“*”意指现有的磷酸二酯键被硫代磷酸酯键取代的形式，并且“m”意指现有的2'-OH被2'-O-甲基取代的形式。此外，“f”意指(例如在fG的情况下)现有鸟嘌呤(G)的2'-OH被氟取代的形式。此外，“Phos”是指5'-OH被磷酸酯取代的形式，并且“GAL”是指具有式1的三价GalNAc衍生物与有义链的3'端键合的形式(参见表11)。

[表10]

[表11]

符号	化学修饰
		*	硫代磷酸酯键
m	2'-O-甲基
		f	2'-氟
Phos	磷酸酯
		GAL	具有式1的三价GalNAc衍生物

式1

2-2.通过使用动物模型的LPA表达抑制作用的确认

将引入上述化学修饰的15种LPA GalNAc-asiRNA分别施用于注射了3种质粒(P1、P2和P3)的SEAP-LPA HDI小鼠，并相应地测量LPA水平的变化。在此方面，通过将从KringleIV位点至蛋白酶结构域位点的LPA划分为P1(从Kringle IV-1至Kringle IV-6)、P2(从Kringle IV-7至Kringle IV-34)和P3(从Kringle IV-35至蛋白酶结构域)，来制备3种质粒。特别地，将3种质粒(包括LPA和分泌性胚胎碱性磷酸酶(SEAP))通过流体动力学注射(HDI)分别注射入小鼠(Balb/c，雌性，6周龄)中。以8mg/kg(mpk)的单剂量向小鼠皮下注射LPA GalNAc-asiRNA。自向小鼠皮下注射之日起第2天、第7天和第21天，通过使用Phospha-Light^TMSEAP报告基因测定系统(Invitrogen^TM，T1015)来测量血清中的SEAP水平，并通过用在测量LPA水平当天施用盐水的对照组血清中的SEAP水平和施用LPA GalNAc-asiRNA前血清中的SEAP水平归一化测得的值来确认源自小鼠的血清中的LPA水平。

结果如图11至图13和表12至表14所示，根据15种LPA GalNAc-asiRNA(OLX706A-006-1、OLX706A-007-1、OLX706A-032-1、OLX706A-033-1、OLX706A-034-1、OLX706A-036-1、OLX706A-043-1、OLX706A-062-1、OLX706A-064-1、OLX706A-092-1、OLX706A-108-1、OLX706A-170-1、OLX706A-171-1、OLX706A-187-1、OLX706A-369-1)的治疗确认了抑制SEAP报告基因表达的作用。特别地，图11和表12在引入P1质粒的小鼠中，图12和表13在引入P2质粒的小鼠中，图13和表14在引入P3质粒的小鼠中确认了根据LPA GalNAc-asiRNA的治疗抑制SEAP报告基因表达的作用。

[表12]

[表13]

[表14]

实例3：引入化学修饰的用于诱导RNAi的核酸分子的制备

在本实例中，设计了引入化学修饰的LPA GalNAc-asiRNA，作为诱导靶向LPA的高效RNA干扰的双链核酸分子。为此，设计了不同类型的LPA GalNAc-asiRNA，其中在LPAGalNAc-asiRNA中，1)有义链和反义链的核苷酸中糖结构2'碳位处的-OH基团被-OMe或-F取代，2)将硫代磷酸酯修饰引入反义链的5'或3'端和有义链的5'端的骨架中，3)在反义链的5'端引入E-乙烯基膦酸酯，并且4)在有义链的3'端引入GalNAc。特别地，将实例2中对LPAmRNA表达具有有效抑制作用的5种LPA asiRNA(asiLPA-006、asiLPA-007、asiLPA-033、asiLPA-062和asiLPA-092)用作基本框架，并将根据表16的化学修饰设计的各种修饰模式引入基本框架以获得许多不同的GalNAc-asiRNA缀合物，例如，制备OLX706A-006-12、OLX706A-007-12、OLX706A-007-4、OLX706A-033-4、OLX706A-033-12、OLX706A-062-2、OLX706A-062-4、OLX706A-062-12和OLX706A-092-4。同时，以与实例2中相同的方式制备本实例中的OLX706A-006-1、OLX706A-007-1、OLX706A-033-1、OLX706A-062-1和OLX706A-092-1。

本实例中制备的经化学修饰的LPA GalNAc-asiRNA的序列信息在下表15中示出。特别地，在表15中，“*”意指现有的磷酸二酯键被硫代磷酸酯键取代的形式，并且“m”意指现有2'-OH被2'-O-甲基取代的形式。此外，“f”意指(例如在fG的情况下)现有鸟嘌呤(G)的2'-OH被氟取代的形式。此外，“d”是指现有的2'-OH被-H取代的形式，“EVP”是指5'端的现有-OH基团被E-乙烯基膦酸酯取代的形式，并且“GAL”是指具有下式1的三价GalNAc衍生物与有义链的3'端键合的形式(参见表16)。

[表15]

[表16]

符号	化学修饰
		*	硫代磷酸酯键
m	2'-O-甲基
		f	2'-氟
d	脱氧
		EVP	E-乙烯基膦酸酯
GAL	具有式1的三价GalNAc衍生物

实例4：用于诱导RNAi的引入化学修饰的核酸分子抑制LPA表达的作用的确认

4-1.体外LPA表达抑制作用的确认

用上述GalNAc-asiRNA处理原代人肝细胞后，进行qRT-PCR，以测量LPAmRNA的表达水平。特别地，将原代人肝细胞以3.0×10⁴个细胞/孔接种在96孔板中，并用LPA GalNAc-asiRNA(200nM)处理。转染后24小时，使用用于qPCR的SuperPrepTM细胞裂解和RT试剂盒(试剂盒II，东洋纺公司，SCQ-401)制备细胞裂解物，并使用裂解物中含有的mRNA作为模板，通过逆转录合成cDNA。然后，通过使用合成的cDNA作为模板，通过使用基因表达测定和探针(Hs00916691_m1：人LPA，Hs03928985_g1：RNA18S5，应用生物系统公司(AppliedBiosystems))进行定量PCR。然后，通过使用CFXOpus 384实时PCR系统(伯乐公司(Bio-Rad))鉴定LPA mRNA的表达水平。

结果如图14和表17所示，在原代人肝细胞中在OLX706A-006-12、OLX706A-007-12、OLX706A-007-4、OLX706A-033-4、OLX706A-033-12、OLX706A-062-2、OLX706A-062-4、OLX706A-062-12和OLX706A-092-4处理后确认了抑制LPA mRNA表达的作用。

[表17]

4-2.通过使用动物模型的LPA表达抑制作用的确认

将引入上述化学修饰的LPA GalNAc-asiRNA施用于引入LPA的HDI小鼠，并测量所得LPA水平变化。特别地，将质粒(包括LPA和分泌性胚胎碱性磷酸酶(SEAP))通过流体动力学注射(HDI)注射入小鼠(Balb/c，雌性，6周龄)中。以5mg/kg(mpk)的单剂量向小鼠皮下注射LPA GalNAc-asiRNA。自向小鼠皮下注射之日起第7天、第21天和第35天，通过使用Phospha-Light^TMSEAP报告基因测定系统(Invitrogen^TM，T1015)测量血清中的SEAP水平，并将测得的值用施用LPA GalNAc-asiRNA前血清中的SEAP水平和施用盐水的对照组血清中的SEAP水平归一化，以确认源自小鼠的血清中的LPA水平。

结果如图15和表18所示，在小鼠中根据OLX706A-033-4、OLX706A-033-12、OLX706A-062-2、OLX706A-062-4、OLX706A-062-12和OLX706A-092-4的治疗确认了抑制SEAP报告基因表达的作用。

[表18]

实例5.Apo(a)转基因模型中的LPA敲低功效研究

由文献(Merki等人,2011,JACC[美国心脏病学会杂志],doi:10.1016/j.jacc.2010.10.052)中所述的小鼠的冷冻储备物生成Apo(a)8K TG小鼠。在研究第-2天采集血液样品(治疗前采血)，并通过人脂蛋白A ELISA试剂盒(艾博抗公司(Abcam)，ab108878)确定血清apo(a)蛋白水平。将小鼠分组，使其初始apo(a)水平在实验组之间均匀。每个队列含有三只动物(至少两只雌性受试者)。在研究第0天，以1或3mpk的单剂量皮下施用缀合GalNAc的LPA asiRNA。给药后每周采集一次血液样品。通过测量经治疗的小鼠的血清apo(a)蛋白来确定LPA表达抑制。为进行归一化，将给药前样品的值取平均值并设定为100％，并将数据作为与给药前相比的相对值进行分析。

结果如图16a和表19所示，OLX706A-062-12显示第7天LPA表达抑制为72％，第14天抑制为74％，第21天抑制为72％。OLX706A-033-4显示第7天LPA表达抑制为74％，第14天抑制为61％，第21天抑制为54％。OLX706A-092-4显示第7天LPA表达抑制为76％，第14天抑制为77％，第21天抑制为76％。

如图16b和表20所示，OLX706A-062-12显示第7天LPA表达抑制为62％，第14天抑制为58％，第21天抑制为57％。OLX706A-033-4显示第7天LPA表达抑制为41％，第14天抑制为28％，第21天抑制为24％。

[表19]

[表20]

实例6.非人灵长类动物GalNAc-asiLPA研究以评估血清中的Lp(a)降低

将食蟹猴(cynomolgus monkey/Macaca fascicularis)分组，使其平均体重(约2-4kg)在对照组与实验组之间相当。每个队列含有两只动物。在研究第1天，以3mpk的单剂量皮下施用缀合GalNAc的LPA asiRNA。在研究第-6天和第1天采集血液样品，并在给药后每周采集一次。在指示的时间点，通过使用Lp(a)ELISA(Mercodia公司，10-1106-01)测量经治疗的NHP的Lp(a)血清浓度来确定LPA表达抑制。将给药前样品的值取平均值并设定为100％，并将数据作为与给药前相比的相对值进行分析。

OLX706A-033-4显示第29天LPA表达抑制为89％，第43天抑制为80％，第64天抑制为53％。OLX706A-062-12显示第29天LPA表达抑制为84％，第43天抑制为66％，第64天抑制为43％。实验数据在下表21和图17中示出。

[表21]

至此，已详细描述了本披露内容的特定部分，但对于本领域普通技术人员来说显而易见的是，这些特定描述仅是优选的实施例，并且本披露的范围不限于此。因此，意图在于本披露的实质范围由所附权利要求书及其等同物限定。

根据一方面的RNAi剂可通过结合并降解LPA mRNA来抑制LPA蛋白的表达，同时减轻副作用，如非特异性免疫应答和脱靶效应。还进行了一项研究，以评估本公开的RNAi剂在ICR小鼠中单剂量皮下给药后经过8天观察期的毒性，未发现显著的毒性迹象。

此外，根据一方面的RNAi剂被有效地递送至肝细胞并且可用作心血管疾病的靶向治疗剂。

应理解，本文描述的实施例应仅被认为是描述性的，而不是出于限制的目的。典型地每个实施例内的特征或方面的描述应被认为可用于其他实施例中的其他相似特征或方面。虽然已经参考附图描述了一个或多个实施例，但本领域普通技术人员将理解，在不脱离由以下权利要求限定的本披露的精神和范围的情况下，可在其中进行形式和细节的各种改变。

Claims

1.一种RNAi剂，其包含：与LPA(脂蛋白(a))mRNA序列具有序列互补性且长度为19nt至21nt的反义链；以及与该反义链具有序列互补性且长度为15nt至17nt的有义链，其中该反义链的5'端和该有义链的3'端形成平端。

2.如权利要求1所述的RNAi剂，其中该有义链具有选自表1、表2、表3、表4、表5、表6、表7、表8和表9中列出的有义链序列的序列。

3.如权利要求1所述的RNAi剂，其中该有义链是选自以下的任一种：SEQ ID NO:11、SEQID NO:13、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:51、SEQID NO:53、SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:71、SEQ ID NO:77、SEQID NO:79、SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:87、SEQ ID NO:103、SEQ ID NO:123、SEQ ID NO:125、SEQ ID NO:127、SEQ ID NO:183、SEQ ID NO:215、SEQ ID NO:339、SEQ IDNO:341、SEQ ID NO:373、SEQ ID NO:375、SEQ ID NO:471、SEQ ID NO:477、SEQ ID NO:495、SEQ ID NO:701、SEQ ID NO:709、SEQ ID NO:711、SEQ ID NO:713、SEQ ID NO:715、SEQ IDNO:735、SEQ ID NO:737、SEQ ID NO:739、SEQ ID NO:743和SEQ ID NO:775。

4.如权利要求1所述的RNAi剂，其中该有义链是选自以下的任一种：SEQ ID NO:11、SEQID NO:13、SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:71、SEQ ID NO:85、SEQID NO:123、SEQ ID NO:127、SEQ ID NO:183、SEQ ID NO:215、SEQ ID NO:339、SEQ ID NO:341、SEQ ID NO:373、和SEQ ID NO:737；并且优选地，该有义链是选自以下的任一种：SEQID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:123和SEQ ID NO:183。

5.如权利要求1所述的RNAi剂，其中该反义链具有选自表1、表2、表3、表4、表5、表6、表7、表8和表9中列出的反义链序列的序列。

6.如权利要求1所述的RNAi剂，其中该反义链是选自以下的任一种：SEQ ID NO:12、SEQID NO:14、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:52、SEQID NO:54、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:78、SEQID NO:80、SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:86、SEQ ID NO:88、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:124、SEQ ID NO:126、SEQ ID NO:128、SEQ ID NO:184、SEQ ID NO:216、SEQ ID NO:340、SEQ IDNO:342、SEQ ID NO:374、SEQ ID NO:376、SEQ ID NO:472、SEQ ID NO:478、SEQ ID NO:496、SEQ ID NO:702、SEQ ID NO:710、SEQ ID NO:712、SEQ ID NO:714、SEQ ID NO:716、SEQ IDNO:736、SEQ ID NO:738、SEQ ID NO:740、SEQ ID NO:744和SEQ ID NO:776。

7.如权利要求1所述的RNAi剂，其中该反义链是选自以下的任一种：SEQ ID NO:12、SEQID NO:14、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:86、SEQID NO:124、SEQ ID NO:128、SEQ ID NO:184、SEQ ID NO:216、SEQ ID NO:340、SEQ ID NO:342、SEQ ID NO:374、和SEQ ID NO:738；并且优选地，该反义链是选自以下的任一种：SEQID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:124和SEQ ID NO:184；更优选地，所述RNAi剂具有如SEQ ID NO:65所示的有义链以及如SEQ ID NO:66所示的反义链；所述RNAi剂具有如SEQ ID NO:123所示的有义链以及如SEQ ID NO:124所示的反义链；或者所述RNAi剂具有如SEQ ID NO:183所示的有义链以及如SEQ ID NO:184所示的反义链。

8.如权利要求1所述的RNAi剂，其中该有义链的3'端与N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)衍生物结合。

9.如权利要求1所述的RNAi剂，其中该有义链或该反义链包含至少一种化学修饰。

10.如权利要求9所述的RNAi剂，其中该有义链包含选自以下的至少一种化学修饰：

用硫代磷酸酯、硼烷磷酸酯或膦酸甲酯修饰与5'端相邻的2至4个核苷酸键；

用-CH₃(甲基)、-OCH₃(-O-甲基)、-NH₂、-F、-O-2-甲氧基乙基-O-丙基、-O-2-甲基甲硫基乙基、-O-3-氨基丙基或-O-3-二甲基氨基丙基取代至少一种核苷酸的糖结构2'碳位处的-OH基团；以及

3'端与N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)衍生物或细胞穿透肽结合。

11.如权利要求9所述的RNAi剂，其中该反义链包含选自以下的至少一种化学修饰：

用硫代磷酸酯、硼烷磷酸酯或膦酸甲酯修饰与3'端或5'端相邻的2至7个核苷酸键；和

用-H、-CH₃(甲基)、-OCH₃(-O-甲基)、-NH₂、-F、-O-2-甲氧基乙基-O-丙基、-O-2-甲基甲硫基乙基、-O-3-氨基丙基或-O-3-二甲基氨基丙基取代至少一种核苷酸的糖结构2'碳位处的-OH基团；以及用E-乙烯基膦酸酯取代5'端的-OH基团。

12.如权利要求9所述的RNAi剂，其包含选自以下的至少一种修饰：

将与有义链或反义链中的3'端或5'端相邻的2至7个核苷酸键修饰为硫代磷酸酯；

将有义链或反义链中至少一种核苷酸的糖结构2'碳位处的-OH基团修饰为-H、-OCH₃(-O-甲基)或-F；

该有义链的3'端与N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)衍生物结合；以及

用E-乙烯基膦酸酯取代反义链的5'端的-OH基团。

13.如权利要求1-12中任一项所述的RNAi剂，其中在该反义链中，从5’至3’，2、14、16位被2’-氟修饰，5和7位是脱氧核苷，并且其余位置被2’-OMe修饰，该3’端有六个硫代磷酸酯键，该5’端有一个5’(E)-乙烯基膦酸酯核苷酸；在该有义链中，从5’至3’，2、4、5、6位被2’-氟修饰，任选地该3'端有一个与N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)衍生物连接的核苷酸。

14.如权利要求13所述的RNAi剂，其中在该有义链中，从5’至3’：2、4、5、6、14和16位被2’-氟修饰，并且其余位置被2’-OMe修饰；或2、4、5、6和12位被2’-氟修饰，并且其余位置被2’-OMe修饰。

15.如权利要求9所述的RNAi剂，其中该有义链具有选自表15中列出的有义链序列的序列。

16.如权利要求9所述的RNAi剂，其中该反义链具有选自表15中列出的反义链序列的序列，优选地，所述RNAi剂选自表15中GalNAc-asiRNA缀合物。

17.一种药物组合物，该药物组合物包含如权利要求1至16中任一项所述的RNAi剂作为活性成分及药学上可接受的载体。

18.如权利要求1至16中任一项所述的RNAi剂或权利要求17所述的药物组合物在制造用于预防或治疗心血管疾病的药物产品的用途。

19.如权利要求18所述的用途，其中该心血管疾病选自：伯格氏病、外周动脉疾病、冠状动脉疾病、代谢综合征、急性冠脉综合征、主动脉瓣狭窄、心肌梗死、主动脉瓣反流、主动脉夹层、视网膜动脉阻塞、脑血管疾病、肠系膜缺血、肠系膜上动脉阻塞、肾动脉狭窄、稳定/不稳定型心绞痛、急性冠脉综合征、杂合子或纯合子家族性高胆固醇血症、高β脂蛋白血症、脑血管动脉粥样硬化和静脉栓塞形成。