CN118773157A

CN118773157A - 一种Fhb7突变体及其应用

Info

Publication number: CN118773157A
Application number: CN202310352758.0A
Authority: CN
Inventors: 雷晓光; 杨军; 张静
Original assignee: Jiangsu Jicui Molecule Engineering Research Institute Co ltd
Current assignee: Jiangsu Jicui Molecule Engineering Research Institute Co ltd
Priority date: 2023-04-04
Filing date: 2023-04-04
Publication date: 2024-10-15

Abstract

本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及一种Fhb7突变体及其应用。本发明通过蛋白质工程的手段，改造长穗偃麦草来源的小麦赤霉病抗性蛋白Fhb7，获得热稳定性和活性显著提高的突变体。而且其具有广谱的底物适应性，能够高效地利用GSH作为底物，催化破坏单端孢霉烯族毒素中关键致毒基团，以降低毒素毒性。本发明提供的Fhb7突变体及其衍生物可作为基因元件或解毒剂，在饲料领域、生物医药领域以及农作物育种领域中发挥重要的脱毒作用，具有广阔的应用前景。

Description

一种Fhb7突变体及其应用

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及一种Fhb7突变体及其应用。

背景技术

小麦赤霉病(Fusarium head blight，FHB)是由镰刀菌所引起的一种小麦真菌性疾病，由于其具有巨大的破坏力，因此被认为是世界范围内小麦和大麦最具毁灭性的真菌病害之一。在2020年9月，中国农业农村部也将小麦赤霉病列入《一类农作物病虫害名录》。近年来，气候的变化为粮食和饲料安全带来了许多意想不到和更频繁的生物压力。在这个气候变化的时代下，全球持续出现的温暖和潮湿天气状况为霉菌的生长提供了更加有利的条件，从而加剧了FHB的爆发，FHB的发生会带来严峻的食品安全问题。感染赤霉病的小麦中存在着多种霉菌毒素，这些霉菌毒素对于人类和动物的健康而言是巨大的威胁。因此，控制FHB和真菌毒素解毒是当前气候变化时代解决粮食问题具有重要意义的研究领域。

脱氧雪腐镰刀菌烯醇，又名呕吐毒素(DON)，是一种来自镰刀菌属的环氧倍半萜类次级代谢产物，属于单端孢霉烯族毒素家族，该类家族化合物的特点就在于C12/C13位的环氧基团，该基团已经被证实是这类化合物的主要致毒基团。此外，有研究证实DON不仅是蛋白质合成的抑制剂，对人类和动物具有严重的细胞毒性、免疫毒性、遗传毒性，而且还是FHB的基本致病因子，能够促进镰刀菌进一步侵染农作物。除了感染FHB的农作物原料会带来DON污染以外，粮食在储藏、加工和运输过程中同样具有污染风险。由此可见，寻找DON的降解方法不仅对于保障粮食安全具有重要意义，同时在构建能够抵抗FHB的抗性农作物方面同样具有重要的参考价值。

与低效、营养损失和不安全的化学和物理降解策略相比，生物方法因其安全、高效和生态友好而受到越来越多的关注。近年来，越来越多的生物讲解呕吐毒素的方法被报道。其中主要分为两种不同的类型，一是通过某些微生物对于呕吐毒素具有一定的物理吸附作用，通过将DON吸附在微生物表面，从而实现解毒的目的。但是，这种物理吸附的方式效率低，并且存在着较大的安全问题。

二是通过微生物所产生的酶对DON进行酶学转化，将其转化成毒性更低或者无毒的产物以达到最终的解毒目的。由于酶学转化的专一性、温和性、高效性，使其比仅仅通过物理吸收来解毒的微生物具有更好的实际应用价值。目前为止，虽然已经分离出许多能够降解DON的微生物，但其中具体发挥功能的酶却报道较少。在已经报道的几种酶中，其对DON的酶学转化都集中在C3位羟基和C9＝C10这两个基团上，例如在C3-OH上进行乙酰化、糖基化、差向异构化和氧化。但是，作为DON中最致毒基团C12/C13环氧，在2020年以前尚未发现有酶能够针对这一关键基团对呕吐毒素进行解毒。因此发现能够开环氧的酶比针对3-OH和C9＝C10的酶具有更加深远的意义。由于环氧基团处在DON的C12/C13处，而在这个位置上缺少活泼的基团来增强其反应性，因此通过酶学方法转化该环氧基团来达到解毒效果较为困难。在2020年之前，仅发现了一种肠道厌氧细菌能够针对呕吐毒素的环氧基团进行生物转化。研究者从牛瘤胃液中分离出的Eubacterium sp.BBSH 797能够通过还原去环氧的方式将DON转化为毒性很低的DOM-1，并且这株菌已被作为工业饲料添加剂用于DON解毒。

直到2020年，针对DON的环氧基团的第一种酶Fhb7被成功克隆，它是由一个小麦赤霉病抗性基因Fhb7所编码的酶。Fhb7属于谷胱甘肽-S转移酶(GST)超家族，利用谷胱甘肽(GSH)作为解毒剂催化打开DON的环氧基团。虽然，作为意义最为深远的抗FHB基因，Fhb7已经开始被用于小麦育种领域。然而，Fhb7的热稳定性非常差，纯化出的蛋白在冰上孵育10分钟左右即开始沉淀并失去活性，Fhb7的活性和稳定性严重阻碍了其在体外的实际应用价值，从而极大地限制了其作为呕吐毒素解毒酶在工业上发挥作用。

微生物的酶法脱毒虽然在实际应用中具备强大的优势，但是由于其常需要在体内发挥作用，而肠道内的环境对于多数酶而言是不利的，很容易造成酶活力的丧失。相比之下，微生物作为添加剂加入到饲料中，通过微生物来进行毒素解毒这一思想或许能够取得更好的效果。近年来，也有不少具有呕吐毒素降解功能的微生物从环境中被分离出来，但是因为这些微生物本身的解毒效率、生物安全性等方面都极大地限制了它们作为解毒微生物在实际中的应用。合成生物学技术的兴起，给这一领域带来了新的曙光。利用目前已经发现的解毒基因作为元件，选择生物安全已经得到证实的微生物作为底盘细胞，构建具备霉菌毒素解毒功能的工程菌，这或许能够很大程度上解决工业中霉菌毒素污染严重的问题。然而，针对这一领域的研究非常有限，所以尚未有成功的工程菌被应用于饲料脱毒。

发明内容

本发明提供了一种Fhb7突变体以及该突变体在低成本、高效率地降解单端孢霉烯族毒素中的应用，解决了野生型小麦赤霉病抗性蛋白Fhb7热稳定性差且活性不高的缺陷。

本发明的第一目的是提供一种Fhb7突变体，其含有在SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列中发生至少一项以下氨基酸替换后的序列：

(1)第29位的氨基酸缬氨酸Val替换为脯氨酸Pro；

(2)第77位的氨基酸天冬酰胺Asn替换为酪氨酸Tyr；

(3)第95位的氨基酸亮氨酸Leu替换为苯丙氨酸Phe；

(4)第5位的氨基酸苏氨酸Thr替换为丝氨酸Ser，且第29位的氨基酸缬氨酸Val替换为脯氨酸Pro，且第52位的氨基酸甲硫氨酸Met替换为亮氨酸Leu，且第77位的氨基酸天冬酰胺Asn替换为酪氨酸Tyr，且第95位的氨基酸亮氨酸Leu替换为苯丙氨酸Phe，且第176位的氨基酸天冬氨酸Asp替换为谷氨酸Glu，且第208位的氨基酸亮氨酸Leu替换为苯丙氨酸Phe，且第262位的氨基酸半胱氨酸Cys替换为色氨酸Trp，且第265位的氨基酸甘氨酸Ala替换为甘氨酸Gly，且第269位的氨基酸谷氨酰胺Gln替换为精氨酸Arg。

本发明通过蛋白质工程技术对野生型小麦赤霉病抗性蛋白Fhb7进行改造，发现通过上述特定位置上的氨基酸替换能够使得Fhb7突变体相比野生型Fhb7具有更高的热稳定性和活性，能够使其作为解毒酶在工业中广泛应用。

本发明的野生型Fhb7来源于长穗偃麦草中。

作为本发明的一种优选的Fhb7突变体，具有：

(1)如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列；或

(2)与SEQ ID No.2同源性为70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、或99％，且具有同等活性的氨基酸序列。

本发明发现，在Fhb7突变体中，具有上述氨基酸序列或与其同源性较高且具有相同活性的氨基酸序列时，Fhb7突变体的热稳定性和活性更加优异。

在本发明中，与目标序列同源性较高的序列包括在目标序列的基础上进行氨基酸的取代、缺失、增加中的至少一种，但在满足上述同源性的同时也需要满足具有同等活性。

优选地，氨基酸的缺失是指30个氨基酸以内、更优选为10个氨基酸以内的缺失。

优选地，氨基酸的取代是指25个氨基酸以内、更优选为10个氨基酸以内的取代。

优选地，氨基酸的增加是指40个氨基酸以内、更优选为20个氨基酸以内的增加。

作为本发明的一种优选的Fhb7突变体，具有：

(1)如SEQ ID No.4所示的氨基酸序列；或

(2)与SEQ ID No.4同源性为70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、或99％，且具有同等活性的氨基酸序列。

本发明发现，在野生型蛋白Fhb7的氨基酸序列中将第29位氨基酸V突变成P，获得的Fhb7突变体具有比野生型更高的热稳定性和活性。

本发明的第二目的是提供编码上述任一Fhb7突变体的核酸。

作为本发明的一种优选的核酸，具有：

(1)如SEQ ID No.3所示的核苷酸序列；或

(2)SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列经过一个或多个核苷酸的替换、缺失或插入获得的具有相同功能蛋白的编码核苷酸序列；或

(3)在严格条件下可以与SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列进行杂交的核苷酸序列。

作为本发明的一种优选的核酸，具有：

(1)如SEQ ID No.5所示的核苷酸序列；或

(2)SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列经过一个或多个核苷酸的替换、缺失或插入获得的具有相同功能蛋白的编码核苷酸序列；或

(3)在严格条件下可以与SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列进行杂交的核苷酸序列。

本发明的第三目的是提供含有上述任一Fhb7突变体、或任一核酸的生物材料。

优选地，所述生物材料为表达盒、载体、宿主细胞或重组菌。

优选地，所述重组菌为重组大肠杆菌，更优选为重组k1系列大肠杆菌。

优选地，所述重组菌为重组酵母，更优选为重组毕赤酵母菌株。

优选地，本发明提供了含有上述任一Fhb7突变体、或任一核酸的工程化枯草芽孢杆菌。

本发明的第四目的是提供上述任一Fhb7突变体、或上述任一核酸、或上述任一生物材料在降解单端孢霉烯族毒素中的应用。

优选地，本发明提供上述任一Fhb7突变体、或上述任一核酸、或上述任一生物材料在降解含有单端孢霉烯族毒素的材料中的应用。

所述材料包括但不限于饲料、小麦及其制品、玉米及其制品、谷物及其制品。

使用本发明的上述任一Fhb7突变体、任一核酸、或任一生物材料作为生物催化剂，能够以谷胱甘肽(GSH)作为解毒剂，通过酶法打开单端孢霉烯族毒素的关键致毒基团C12/C13环氧基团，以实现单端孢霉烯族毒素的降解。图1为呕吐毒素降解机理图。

在降解单端孢霉烯族毒素时，优选地，单端孢霉烯族毒素的初始浓度为0.01～1mM，更优选为0.01～0.1mM。优选地，谷胱甘肽的初始浓度为1～10mM，更优选为0.2～2mM。优选地，反应条件为pH值4～10，温度10℃～50℃，更优选30℃。优选地，在搅拌下进行反应0.1～2h。

使用微生物作为宿主的情况下，只要可以稳定地保持在菌体内，作为载体可以使用市售的任一种质粒。使用大肠杆菌作为宿主的情况下，优选使用pET28a、pQlinkHx质粒。

在具体实施过程中，通过将获得的基因(DNA片段)连接于特定的启动子序列的下游，可在大肠杆菌中诱导表达产生大量目的蛋白。例如，pET28a具有可表达诱导的T7启动子，通过在培养的中途将异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)添加入培养基，可以使大肠杆菌表达出Fhb7蛋白或者其突变体。

转化体的培养通过通常的方法实施。即，若以芽孢杆菌属或大肠杆菌类的细菌时，培养基可以使用肉汤培养基、LB培养基(1％胰胨、0.5％酵母提取物、0.5％食盐)或MYT培养基(1.6％胰胨、酵母提取物、0.5％食盐)等，可以在该培养基中接种菌株后，在37℃下根据需要一边搅拌一边培养4-8小时，随后向其中加入0.1～1mM IPTG，在16～20℃下根据需要一边搅拌一边培养12～20小时，将得到的培养液离心分离，回收微生物菌体。

进一步，可以将上述微生物菌体通过机械破坏(采用旋转搅拌机、弗氏压碎器、匀浆器、研钵等)、冻结溶解、自我消化、干燥(采用冷冻干燥、风干等)、酶处理(采用溶菌酶等)、超声波处理、化学处理(采用酸、碱处理等)等公知的方法进行破碎，把得到的菌体的破碎物或者菌体的细胞壁或细胞膜的变性物等菌体处理物作为粗酶液进行单端孢霉烯族毒素的降解。

此外，也可以根据情况从上述菌体处理物中通过通常的酶纯化方法(盐析处理、等电点沉淀处理、有机溶剂沉淀处理、透析处理、各种层析法处理等)纯化具有单端孢霉烯族毒素降解活性的组分，制成部分纯化酶或纯化酶使用。

添加于反应体系中的酶只要具有所需的活性，可以是任意的形态，具体可以是微生物的菌体(包括转化体)、该菌体的处理物或由该处理物得到的酶等。

作为本发明的一种优选的实施方案，所述的单端孢霉烯族毒素为含有环氧基团的单端孢霉烯族毒素。

作为本发明的一种优选的实施方案，所述的单端孢霉烯族毒素为呕吐毒素、15-酰基化呕吐毒素、T-2毒素、NIV、DAS中的至少一种。

本发明的第五目的是提供上述任一Fhb7突变体、或上述任一核酸、或上述任一生物材料在以下至少一方面的应用：

(1)小麦赤霉病抗性农作物育种；

(2)构建可降解单端孢霉烯族毒素的微生物；

(3)用于临床及医药领域针对呕吐毒素及其类似物的解毒剂的制备；

(4)农作物中防治能够产生呕吐毒素及其类似物的微生物污染；

(5)开发粮食及饲料在贮藏和运输过程中能够产生呕吐毒素及其类似物的病原菌的抑菌剂；

(6)开发饲料添加剂。

优选地，应用(2)中所述微生物为工程菌；

所述工程菌包括但不限于芽孢杆菌属、酵母菌、乳杆菌属、链球菌属、以及其他被允许用于饲料工业或者医药行业的有益菌。

通过合成生物学原理可将本发明的上述任一Fhb7突变体、或任一核酸、或任一生物材料作为元件用于小麦赤霉病抗性农作物育种中或用于构建可降解单端孢霉烯族毒素的有益工程菌。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

本发明提供了一种Fhb7突变体，具有优异的热稳定性和活性。而且其具有广谱的底物适应性，能够高效地利用GSH作为底物，催化破坏单端孢霉烯族毒素中关键致毒基团，以降低毒素毒性。本发明提供的Fhb7突变体及其衍生物可作为基因元件或解毒剂，在饲料领域、生物医药领域以及农作物育种领域中发挥重要的脱毒作用，具有广阔的应用前景。

附图说明

图1为本发明Fhb7及其突变体降解呕吐毒素机理图。

图2是本发明Fhb7及其突变体的蛋白电泳图。

图3是本发明Fhb7及其突变体的活性测试结果图。

图4是本发明Fhb7及其突变体的蛋白熔解温度测试结果图。

图5是本发明Fhb7及其突变体热处理后残留活性测试结果图。

图6是本发明Fhb7及其突变体的温度耐受性测试结果图。

图7是本发明Fhb7及其突变体的半衰期测试结果图。

图8是呕吐毒素及其类似物的化学结构图。

图9是Fhb7及其突变体在枯草芽孢杆菌中相对表达量结果图。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例中的DNA的调制、采用限制性酶的剪切、采用T4 DNA连接酶的DNA连接以及大肠杆菌的转化方法全部按照《分子克隆实验室手册》第二版(“Molecular Cloning,aLaboratory Manual,Second Edition")(Maniatis Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,New York(1989))实施。此外，反应液中的呕吐毒素与谷胱甘肽加成物的定量通过UPLC法实施。分离使用Waters公司制的BEH-C18柱，洗脱液使用乙腈和水(含0.1％甲酸)梯度洗脱。不同pH值的缓冲液配置如下：

pH4-6 50mM柠檬酸/柠檬酸钠缓冲液

pH6.5-8.0 50mM Na₂HPO₄-NaH₂PO₄缓冲液

pH 7-8.5 50mM Tris-HCl缓冲液

pH 9-10 50mM碳酸钠/碳酸氢钠缓冲液

实施例中未注明具体技术或条件者，均为常规方法或者按照本领域的文献所描述的技术或条件进行，或者按照产品说明书进行。所用试剂和仪器等未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购买得到的常规产品。

实施例1Fhb7突变体的获得

本实施例提供了Fhb7突变体，具体步骤如下：

含有野生型Fhb7基因的pQlinkHx质粒的构建：野生型的Fhb7基因序列通过基因合成获得，如SEQ ID No.6所示。以合成的Fhb7基因作为模板，利用下列引物通过PCR的方式获取目的基因片段。引物序列SEQ ID No.7：pQlink-Fhb7-F:

GAAAACCTGTATTTTCAGGGATCCATGGCCACCTCAACCAGTAC引物序列SEQ ID No.8：pQlink-Fhb7-R:

AGCTCGACTCTAGAGGATCCTTATTTCACTTCGGCATATTTATCC

AGTGC

PCR反应体系：

PCR循环(50ul体系)

线性载体pQlinkHx的获得：以商业获得的pQlinkHx空质粒作为模板，利用下列引物通过PCR的方式获得pQlinkHx的线性化载体。

引物序列SEQ ID No.9：pQlink-linear-F:

GCGGCCGCCTAGGACCCAGCTTTCTTGTACAAAG

引物序列SEQ ID No.10：pQlink-linear-R:

GGATCCCTGAAAATACAGGTTTTC

PCR反应体系：

PCR循环(50ul体系)

各基因片段扩增后，对PCR产物进行1％的琼脂糖凝胶电泳并纯化各DNA片段。利用同源重组的方法将目的基因片段和线性化载体连接起来。

连接方法如下：

用Vazyme同源重组酶构建pQlinkHx-Fhb7质粒，5μl连接体系包括：0.5μl酶，1μl 5×CE buffer，2μl线性化载体pQlinkHx，1.5μl胶回收的目的基因片段。

将连接反应液全部转化大肠杆菌MC1061菌，从得到的氨苄青霉素抗性转化体分离质粒pQlinkHx-Fhb7。

质粒pQlinkHx-Fhb7为承载Fhb7基因的DNA片段的质粒。该基因的碱基序列的结果是SEQ ID NO.6中所示的DNA碱基序列。该DNA碱基序列翻译成氨基酸序列的结果是SEQ IDNO.1中所示的氨基酸序列。

Fhb7突变体基因片段的构建：以合成的Fhb7基因作为模板，利用下列引物通过PCR的方式获取包含目的突变的基因片段。

引物序列：

SEQ ID No.11：Fhb7-F:ATGGCCACCTCAACCAGTAC

SEQ ID No.12：Fhb7-R:TTATTTCACTTCGGC

SEQ ID No.13：Fhb7-T5S-F:CTCATCAAGTACCTCTACCCC

SEQ ID No.14：Fhb7-V29P-F:GTGCACCTAATCCGTGGAAATC SEQ ID No.15：Fhb7-M52L-F:CCTGGGTTAAACTGCCGGATATTTC SEQ ID No.16：Fhb7-N77Y-F:GGTAGCGATTTTTATACCTTAC

SEQ ID No.17：Fhb7-L95F-F:CTTTTGATATTGCCGCCTATTTACAGC SEQ ID No.18：Fhb7-D176E-F:CAACCGCAGAAGTGACCAAAG SEQ ID No.19：Fhb7-L208F-F:GAGCTTTCGTAATATGTTAGGCG SEQ ID No.20：Fhb7-L208F-R:CGCCTAACATATTACGAAAGCTC SEQID No.21：Fhb7-C262W-R:

GTAACTGACCAAAAATGGCGCCATGCCATGCAC SEQ ID No.22：Fhb7-A265G-R:

CTGACCAAAAATTCCGCCATGACATG

SEQ ID No.23：Fhb7-Q269R-R:

GTAAACGACCAAAAATGGCGCCATGACATGCAC

SEQ ID No.24：Fhb7-C262W-A265G-Q269R-R:

GTAAACGACCAAAAATTGCGCCATGCCATGCAC其中，T5S、V29P、M52L、N77Y、L95F、D176E突变体的反向引物都使用Fhb7-R。

PCR反应体系：

PCR循环(50ul体系)

各基因片段扩增后，对PCR产物进行1％的琼脂糖凝胶电泳并纯化各DNA片段。

包含Fhb7突变体基因的pQlinkHx质粒的构建：以上述胶回收的DNA片段作为大引物，质粒pQlinkHx-Fhb7作为模板，通过PCR的方式环形扩增质粒。

PCR反应体系：

PCR循环(25ul体系)

PCR的产物中加入1ul内切酶DpnI，在37℃消化3-4小时后，取出5ul转化进大肠杆菌MC1061中。筛选出具有氨苄青霉素抗性的转化子，测序验证结果显示突变体T5S、V29P、M52L、N77Y、L95F、D176E、L208F、C262W、A265G、Q269R、M10均构建成功，其对应的氨基酸序列分别如SEQ ID No.25，No.4，No.26，No.27，No.28，No.29，No.30，No.31，No.32，No.33，No.2所示，对应的核苷酸序列如SEQ ID No.34，No.5，No.35，No.36，No.37，No.38，No.39，No.40，No.41，No.42，No.3所示。

实施例2Fhb7及其突变体的表达纯化和活性测试

将含有pQlinkHx-Fhb7和实施例1制备的Fhb7突变体的大肠杆菌MC1061菌株接种到液体LB培养基培养，之后取20mL转接到1L含有100μg/mL的氨苄青霉素的LB培养基中，37℃，220rpm摇动培养直至菌液OD为0.8～1.0，18℃冷却1h后，加入终浓度为0.5mM的IPTG诱导18-20h。培养结束后，通过离心分离(5000Xg，20分钟)回收菌体，用25ml裂解缓冲液(20mMNaH₂PO₄-Na₂HPO₄，0.2mM NaCl，pH 8.0)重悬菌体。进行超声波处理，破碎菌体(500W，30％的功率超声5s,停5s，共破碎20分钟)。再通过离心分离(15000rpm,1h)，除去菌体残渣，收集上清并用0.22μm的滤膜过滤为粗酶液。重力镍柱用裂解缓冲液平衡5个柱体积后，将粗酶液缓慢加入到重力镍柱中，使其逐渐流过镍柱。用洗杂缓冲液(20mM NaH₂PO₄-Na₂HPO₄，0.2mMNaCl，50mM咪唑，pH 8.0)冲洗杂蛋白，之后用洗脱缓冲液(20mM NaH₂PO₄-Na₂HPO₄，0.2mMNaCl，300mM咪唑，pH 8.0)洗脱目的蛋白。Fhb7及其突变体在大肠杆菌中的表达量高达20-60mg/L。洗脱下来的目的蛋白使用10kDa超滤管浓缩至体积为1-2ml。分子筛柱子SuperdexS200用平衡缓冲液(20mM NaH₂PO₄-Na₂HPO₄，0.2mM NaCl，pH 8.0)平衡1-2个柱体积后，上述浓缩好的蛋白样品通过Akta仪器过分子筛纯化，收集目标蛋白组分后，进一步用10kDa超滤管浓缩至蛋白浓度为0.5-1.5mg/ml。取10ul纯化后的蛋白液加入3ul 5×蛋白上样缓冲液100℃加热5min，进行10％的聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，考马斯亮蓝染色。蛋白条带大小约为31kDa。结果见图2。

测定Fhb7及其突变体的活性：酶促反应体系为100ul，包括10ug Fhb7或其突变体蛋白，1mM谷胱甘肽，50uM呕吐毒素。30℃条件下反应10分钟。检测方法：反应结束后立即往体系中加入100ul冰浴的无水甲醇淬灭。0.22um滤膜过滤后，用以下液相方法进行UPLC-MS检测:0-0.5min:0％乙腈，100％水(含0.1％甲酸)；0.5-1min:乙腈浓度梯度升高到2％，水相浓度梯度降低到98％；1-2.5min：乙腈浓度梯度升高到5％，水相浓度梯度降低到95％；2.5-4.5min:乙腈浓度梯度升高到40％，水相浓度梯度降低到60％；4.5-6.5min:乙腈浓度梯度升高到90％，水相浓度梯度降低到10％；6.5-8min:乙腈浓度梯度升高到100％，水相浓度梯度降低到0％。

结果表明，野生型Fhb7和除M52L以外的突变体都保持了70％-140％的相对活性，而突变体M52L的活性相比于野生型显著下降。突变体V29P和M10具有比野生型更高的活性。如图3所示。

实施例3Fhb7及其突变体蛋白熔解温度Tm值的测定采用实施例2中获得的Fhb7及其突变体蛋白进行Tm值的测定。

测定体系(25ul)的配制：取10ul实施例2中纯化出的蛋白，加入15ul缓冲液(20mMNaH₂PO₄-Na₂HPO₄，0.2mM NaCl，pH 8.0)稀释后再加入0.2ul 500x SYPRO orange荧光染料，用移液枪吹吸混匀后加入到96孔板中。

测试方法：将96孔板放入qPCR仪器中，以每分钟上升1℃的加热速率将温度从15℃加热到65℃，每隔1分钟检测一次体系的荧光变化。最后通过SYPRO荧光染料产生的荧光来监测蛋白质的Tm值。结果表明，Fhb7的Tm值为30℃；突变体T5S、M52L、N77Y、D176E、L208F、C262W、A265G、Q269R的Tm值在30-33℃之间；突变体L95F的Tm值为35℃，比野生型Fhb7提高了5℃；突变体V29P的Tm值为42℃，比野生型提高了12℃；突变体M10的Tm值为45℃，比野生型提高了15℃。如图4所示。

实施例4Fhb7的稳定性评价

热稳定性研究：100ul反应体系包括：6ug实施例2中所获得的Fhb7蛋白，1mM谷胱甘肽，100uM呕吐毒素。将反应温度分别替换为10℃，15℃，20℃，25℃，30℃，35℃，40℃，45℃，50℃。每个样品设置三个平行，以生成的呕吐毒素和谷胱甘肽加合物来评价酶活，转化率最高的温度即为该酶的最适温度。结果表明该酶的最适反应温度为30℃。

酸碱稳定性研究：反应体系如上，反应缓冲液分别替换为pH 4-10,间隔为0.5。每个样品设置三个平行，生成的呕吐毒素和谷胱甘肽加合物来评价酶活，转化率最高的pH即为该酶的最适pH。结果表明该酶的最适反应pH为8.0。

实施例5Fhb7及其突变体热处理后残留活性的评价

采用实施例2获得的Fhb7及其突变体蛋白。

蛋白热处理：取5ug蛋白加入到100ul缓冲液(20mM NaH₂PO₄-Na₂HPO₄，0.2mM NaCl，pH 8.0)中，随后将该体系放在35℃条件下加热5min。加热后立即将体系置于冰上使温度降下来。作为对照，同时配制相同的体系，一直置于冰上而不做加热处理。

酶残留活性测试：往上述热处理后的体系中加入1ul 0.1M谷胱甘肽水溶液和1ul10mM呕吐毒素的DMSO溶液。置于30℃条件下反应6分钟。反应结束后，立即加入100ul冰浴的无水甲醇淬灭反应。使用0.22um滤膜过滤后使用UPLC-MS分析样品中产生的呕吐毒素和谷胱甘肽加合物的量。以经过热处理样品产生产物的量相对未经过热处理的样品中产物的量作为该蛋白热处理后的残留活性。

结果表明，野生型Fhb7在经过热处理后，残留活性为原来的38％；突变体T5S、M52L、D176E、L208F、C262W、A265G和Q269R的残留活性在20％-36％之间；突变体N77Y和L95F的残留活性在70％-80％之间；突变体V29P和M10均保持了100％的残留活性，显著高于野生型Fhb7。如图5所示。

实施例6Fhb7及其突变体V29P和M10温度耐受性评价

采用实施例2获得的Fhb7、V29P和M10蛋白。

蛋白热处理：取5ug蛋白加入到100ul缓冲液(20mM NaH₂PO₄-Na₂HPO₄，0.2mM NaCl，pH 8.0)中，随后将热处理温度分别替换成0℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃和50℃，处理时间为5min。加热后立即将体系置于冰上使温度降下来。

酶残留活性测试：采用实施例5中酶残留活性测试方法进行。以经过不同温度热处理样品产生产物的量相对在0℃处理的样品中产物的量作为该蛋白在不同温度热处理后的残留活性。

结果表明，Fhb7蛋白在25℃-35℃热处理5分钟后依然保留了38％以上的残留活性，30℃热处理后，活性开始显著下降，当热处理温度高于40℃后，蛋白完全丧失了催化活性；突变体V29P在25℃-40℃热处理5分钟后依然保留了23％以上的残留活性，25℃-35℃热处理后几乎没有活性的丧失，当热处理温度高于40℃时活性显著下降，当热处理温度高于45℃时丧失了活性；突变体M10具有更加优良的热耐受性，在50℃热处理后依然保持了40％以上的残留活性，热处理温度为40℃时也依然保持了80％以上的活性。如图6所示。

实施例7Fhb7突变体V29P和M10的最适反应温度测试

100ul反应体系包括：6ug实施例2中所获得的V29P和M10蛋白，1mM谷胱甘肽，100uM呕吐毒素。将反应温度分别替换为10℃，15℃，20℃，25℃，30℃，35℃，40℃，45℃，50℃。每个样品设置三个平行，以生成的呕吐毒素和谷胱甘肽加合物来评价酶活，转化率最高的温度即为该酶的最适温度。结果表明V29P的最适反应温度为30℃-35℃。M10的最适反应温度为35℃-40℃。

实施例8Fhb7及其突变体V29P和M10的半衰期t_1/2的测定采用实施例2中所获得的Fhb7及突变体V29P和M10蛋白。

蛋白热处理：取5ug Fhb7或V29P或M10蛋白加入到100ul缓冲液(20mM NaH₂PO₄-Na₂HPO₄，0.2mM NaCl，pH 8.0)中。含有蛋白的缓冲液放于30℃水浴中热处理不同的时间(对于Fhb7，分别处理1min，2min，5min，10min，15min，20min，25min，30min；对于V29P，分别处理1min，5min，10min，20min，40min，60min，90min，120min；对于M10，分别处理1min，30min，1h，2h，4h，8h，12h，24h，36h，48h，72h)。热处理后立即置于冰上预冷。

热处理后的酶残留活性测定：按照实施例6中的酶残留活性检测方法。根据不同处理时间下酶的残留活性计算得到这三种不同蛋白的半衰期t_1/2(即在30℃下加热处理不同时间，使酶活性降低至原来的50％所需要的时间)。

结果表明，Fhb7在30℃下的半衰期为5.8min；V29P在30℃下的半衰期为31.9min，是野生型的6.5倍；M10在30℃下的半衰期为1546.9min，是野生型的266.7倍。如图7所示。

实施例9Fhb7及其突变体V29P和M10对呕吐毒素及其类似物的活性测试

采用实施例2中所获得的Fhb7及其突变体V29P和M10蛋白。

测试所用到的呕吐毒素及其类似物结构如图8所示：呕吐毒素(DON)、15-酰基化呕吐毒素(15-ADON)、Nivalenol(NIV)、diacetoxyscirpenol(DAS)和T-2毒素(T-2)。上述化合物均配制成浓度为10mM的DMSO储液。

酶活性测试：酶促反应体系为100ul，包括10ug Fhb7或V29P或M10蛋白，1mM谷胱甘肽，100uM呕吐毒素或者其类似物。30℃条件下反应10分钟。检测方法：反应结束后立即往体系中加入100ul冰浴的无水甲醇淬灭。0.22um滤膜过滤后，用实施例2中所述的UPLC-MS方法进行检测。

结果表明，对于DON、15-ADON和NIVEA三种底物，所有上述三种蛋白均具有较高的活性，转化率为70％-100％；对于DAS和T-2两种底物，上述三种蛋白的催化活性减弱，转化率为20％-40％。

实施例10Fhb7及其突变体作为基因元件在枯草芽孢杆菌中的表达

Fhb7以及V29P和M10基因片段的获得：参考实施例1中的PCR反应体系和程序，采用下列引物扩增Fhb7、V29P以及M10的目的基因片段。

引物序列：

SEQ ID No.43：Fhb7-His-F:

AGGAGCGATTTACATATGGAAAACCTGTATTTTCAGGGATC CATGGCCACCTC

SEQ ID No.44：Fhb7-His-R:

GCTCGACTCTAGAGGATCCTTATTTCACTTCGGC

线性载体pMA5的获得：参考实施例1中的PCR反应体系和程序，采用下列引物扩增pMA5的线性载体。

引物序列：SEQ ID No.45：pMA5-linear-F:

GGATCCTCTAGAGTCGAGCTC

SEQ ID No.46：pMA5-linear-R:

CATATGTAAATCGCTCCTTTTTAGG

表达载体的构建：参考实施例1中构建质粒pQlinkHx-Fhb7的方法和体系，构建质粒pMA5-Fhb7、pMA5-Fhb7-V29P和pMA5-Fhb7-M10。

所用的表达菌株：枯草芽孢杆菌Bacillus subtills WB600。

蛋白在枯草芽孢杆菌的表达：将上述获得的质粒转化进枯草芽孢杆菌WB600中，筛选具有卡那霉素抗性的单克隆用于蛋白表达。将含有表达质粒的菌株接种到3ml含有50ug/ml卡那霉素的液体LB培养基中，37℃，220转/分钟培养约10-12小时，取出1ml培养好的菌液接种到新鲜的100ml含50ug/ml卡那霉素的LB培养基中，37℃，220转/分钟培养18-20小时。

蛋白表达水平检测：将上述培养物在4000转/分钟条件下离心10分钟，收集地层沉淀物，加入10ml缓冲液(20mM NaH₂PO₄-Na₂HPO₄，0.2mM NaCl，pH 8.0)重悬沉淀物。取40ul重悬后的沉淀物置于1.5ml离心管中，向其中加入10ul 5x蛋白上样缓冲液。混匀后，在100℃条件下加热10分钟，加热产物进行蛋白western-blot检测。

如图9所示，结果表明，Fhb7以及其突变体V29P和M10均能够成功在枯草芽孢杆菌WB600中表达，突变体V29P的表达量与Fhb7相当，但是突变体M10的表达量显著高于野生型蛋白Fhb7，大约是Fhb7野生型表达量的2倍。

实施例11Fhb7及其突变体在枯草芽孢杆菌中对呕吐毒素降解效果评价

采用上述实施例10中所获得的菌液。

菌体对呕吐毒素降解效果测试：取200ul上述实施例10中的菌液，向其中加入终浓度为5mM的谷胱甘肽，1mM呕吐毒素，置于37℃条件下边混匀边反应，一共反应72小时。反应结束后，往其中加入400ul无水甲醇淬灭，过0.22um滤膜后按照实施例2中的UPLC-MS方法检测呕吐毒素残留量，计算转化率。

结果表明，利用表达了Fhb7或者其突变体的枯草芽孢杆菌能够实现对呕吐毒素高效地降解。并且稳定性高的突变体相比于野生型具有更好的降解效果。Fhb7、V29P和M10的呕吐毒素降解率分别为51％，56％和72％。

最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

Claims

1.一种Fhb7突变体，其特征在于，其含有在SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列中发生至少一项以下氨基酸替换后的序列：

(1)第29位的氨基酸缬氨酸Val替换为脯氨酸Pro；

(2)第77位的氨基酸天冬酰胺Asn替换为酪氨酸Tyr；

(3)第95位的氨基酸亮氨酸Leu替换为苯丙氨酸Phe；

2.根据权利要求1所述的Fhb7突变体，其特征在于，具有：

(1)如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列；或

3.根据权利要求1所述的Fhb7突变体，其特征在于，具有：

(1)如SEQ ID No.4所示的氨基酸序列；或

4.编码权利要求1～3中任一项所述的Fhb7突变体的核酸。

5.根据权利要求4所述的核酸，其特征在于，具有：

(1)如SEQ ID No.3所示的核苷酸序列；或

6.根据权利要求4所述的核酸，其特征在于，具有：

(1)如SEQ ID No.5所示的核苷酸序列；或

7.含有权利要求1～3中任一项所述的Fhb7突变体、或权利要求4～6中任一项所述的核酸的生物材料。

8.权利要求1～3中任一项所述的Fhb7突变体、或权利要求4～6中任一项所述的核酸、或权利要求7所述的生物材料在降解单端孢霉烯族毒素中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述的单端孢霉烯族毒素为含有环氧基团的单端孢霉烯族毒素。

10.权利要求1～3中任一项所述的Fhb7突变体、或权利要求4～6中任一项所述的核酸、或权利要求7所述的生物材料在以下至少一方面的应用：

(1)小麦赤霉病抗性农作物育种；

(2)构建可降解单端孢霉烯族毒素的微生物；

(6)开发饲料添加剂。