CN113817696B - 一种胺氧化酶asao、制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种胺氧化酶ASAO，所述胺氧化酶ASAO的氨基酸序列为SEQ ID NO.1。本发明的胺氧化酶ASAO对HFB1的降解率为100％；本发明胺氧化酶ASAO性质优良，该酶可以应用于农业、饲料和食品等工业，减少伏马毒素FB1对动物及人类健康的危害。

Description

一种胺氧化酶ASAO、制备方法和应用

技术领域

本发明属于农业生物技术领域，尤其是一种胺氧化酶ASAO、制备方法和应用。

背景技术

伏马毒素(Fumonisins，FB)是镰刀菌属等真菌在特定条件下产生的一种由不同的多氢醇和丙三羧酸组成的结构类似的次级代谢产物。粮食作物是人类生存的必需品。但是，一些真菌毒素特别容易污染粮食作物，并且在这些粮食作物加工成一些农产品的时候，也不能很好的被去除，而且会随着食物链进入人体，对人体造成一定的危害。伏马毒素主要存在于动物饲料原料中及其制品中，会导致某些家畜急性中毒，并且对大多数家禽存在潜在的致癌性，与此同时存在人类被传染的可能性,一些研究表明伏马毒素与人类食管癌的发病密切相关。基于诸多研究，同时由于伏马毒素具有分布广、危害大等特点，因此对伏马毒素的有效防控是必要的。

目前已知的伏马毒素降解方法主要有物理、化学以及生物降解。由于生物降解法相对于物理降解法以及化学降解法具有更多的优势，但是与之相关的研究依然相对较少且可有效用于商业用途的生物降解方法更为稀少。其中生物降解是利用从微生物中分离出与伏马毒素解毒酶相关基因进行克隆，利用基因工程技术进行构建基因工程菌，使其表达相关蛋白对毒素进行降解，具有较好的效果。

发明内容

本发明目的在于克服现有技术的不足之处，提供一种胺氧化酶ASAO、制备方法和应用，该胺氧化酶ASAO能够降解伏马毒素中的氨基以解除其毒性。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种胺氧化酶ASAO，所述胺氧化酶ASAO的氨基酸序列为SEQ ID NO.1。

如上所述的胺氧化酶ASAO的制备方法，步骤如下：

(1)采用分子生物学的手段将包含编码所述胺氧化酶ASAO的基因重组至载体继而转化宿主细胞，得到重组菌株；

(2)培养重组菌株，并诱导菌株表达胺氧化酶ASAO；

(3)分离并纯化胺氧化酶ASAO；

(4)通过蛋白免疫印记western blot验证蛋白表达正确。

而且，所述步骤(1)中宿主细胞为大肠细胞、酿酒酵母细胞、毕赤酵母细胞或多型逊酵母细胞。

如上所述的胺氧化酶ASAO在降解伏马毒素方面中的应用。

一种编码如上所述的胺氧化酶ASAO的胺氧化酶ASAO基因。

而且，所述基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.2。

包含如上所述的胺氧化酶ASAO基因的重组载体。

包含如上所述的胺氧化酶ASAO基因的重组载体pET28a(+)-ASAO。

包含如上所述的胺氧化酶ASAO基因的重组菌株。

而且，所述重组菌株为大肠杆菌。

本发明取得的优点和积极效果为：

1、本发明胺氧化酶ASAO可以降解催化水解伏马毒素FB1(HFB1)的氨基，消除水解伏马毒素的毒性。由于氨基是使得伏马毒素具有毒性作用的关键官能团之一，因此去除氨基是解除伏马毒素毒性的关键点。本发明的胺氧化酶ASAO具有降解水解伏马毒素HFB1的活性，可以应用于农业、饲料和食品等工业中，减少伏马毒素对动物及人类健康的危害。

附图说明

图1为本发明中胺氧化酶ASAO的SDS-PAGE纯化图；其中，M：蛋白marker；1：300mM咪唑洗脱的蛋白；

图2为本发明中胺氧化酶ASAO的western blot结果图，其中，M：蛋白marker；1:胺氧化酶ASAO；

图3为本发明中显示胺氧化酶ASAO的降解效果示意图，其中图A为标品水解伏马毒素的液相结果图，图B为胺氧化酶ASAO降解水解伏马毒素的液相结果；

具体实施方式

下面详细叙述本发明的实施例，需要说明的是，本实施例是叙述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。

本发明中所使用的原料，如无特殊说明，均为常规的市售产品；本发明中所使用的方法，如无特殊说明，均为本领域的常规方法。

一种胺氧化酶ASAO，所述胺氧化酶ASAO的氨基酸序列为SEQ ID NO.1。

如上所述的胺氧化酶ASAO的制备方法，步骤如下：

(1)采用分子生物学的手段将包含编码所述胺氧化酶ASAO的基因重组至载体继而转化宿主细胞，得到重组菌株；

(2)培养重组菌株，并诱导表达胺氧化酶ASAO；

(3)分离纯化胺氧化酶ASAO；

(4)通过蛋白免疫印迹western blot验证蛋白表达正确。

较优地，所述步骤⑴中宿主细胞为大肠细胞、啤酒酵母细胞或多型逊酵母细胞，优选为大肠杆菌BL21(DE3)。

如上所述的胺氧化酶ASAO在降解伏马毒素方面中的应用。

一种编码如上所述的胺氧化酶ASAO的胺氧化酶ASAO基因。

较优地，所述基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.2。

包含如上所述的胺氧化酶ASAO基因的重组载体。

包含如上所述的胺氧化酶ASAO基因的重组载体pET28a(+)-ASAO。

包含如上所述的胺氧化酶ASAO基因的重组菌株。

较优地，所述重组菌株为大肠杆菌。

具体地，所述胺氧化酶ASAO，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示：

SEQ ID NO.1：

MDAFDKAPRVYDVVVVGAGLSGLQAAHSICAAGFSVCVLEATNRVGGKTLSVRSCEKGINDLGAAWINDTNQSEMFKLHQRYSLDGEIQYTHGDDIIQSTDGLICKIPYGQTPLSTGLVEDLVRILREKSAPIDLHNPASSPAAKEVDNETFQDFCIRRTGCEDAVHIADSISAALLGVDSIEVSALYMLYYFKSGSGIDNLLSDEKNGGQYLRTRQGTQTISQKMAEELDPETLFLGTPVTSIDQSRPDGICLVQTLDNATFHCRRVIVSVPTTLYQSISFSPPLPQTKNSLSHDTVMGYYSKMIFVFNEPWWRNAGFTGIFDSADGPVSFTRDTSVPRDDQWSITCFIVGGRGRTWSKLSKADRHTQVWEQFCRYFGEFVEKIPEPANVLEMEWSKQPSFLGAPCPVMTPGTMTTVGTELATPFGRVHFVGTETSIVWRGYMEGAIRSGQRGAAEVLAALNGDLCSEA

其中，该酶基因编码470个氨基酸，没有信号肽，因此，成熟的胺氧化酶ASAO的理论分子量为51.55kDa。

本发明提供了编码上述胺氧化酶ASAO。该基因的基因组序列如SEQ ID NO.2所示：

SEQ ID NO.2：

ATGGATGCCTTCGATAAGGCTCCAAGGGTCTACGACGTTGTTGTTGTCGGTGCCGGATTGAGTGGTCTTCAAGCTGCTCACTCTATTTGTGCCGCCGGATTCTCTGTTTGCGTCCTTGAGGCCACCAATAGAGTCGGAGGAAAGACCCTTTCTGTTAGGTCTTGCGAGAAGGGTATCAACGATCTTGGTGCTGCTTGGATCAATGACACTAACCAGAGTGAGATGTTCAAATTGCATCAAAGATATAGTCTTGACGGAGAGATTCAGTACACTCACGGAGACGACATTATTCAGTCTACCGACGGACTTATCTGCAAGATCCCATATGGACAGACCCCTTTGTCTACCGGACTTGTCGAGGACTTGGTTAGAATCTTGAGGGAAAAGAGTGCCCCAATCGACCTTCACAACCCAGCTTCTAGTCCAGCTGCCAAAGAGGTTGATAACGAAACCTTCCAAGATTTCTGCATTAGAAGGACCGGTTGTGAGGATGCCGTTCACATCGCCGATTCTATCAGTGCTGCCCTTTTGGGTGTCGATAGTATCGAGGTCTCTGCCCTTTACATGTTGTATTACTTCAAATCTGGTTCTGGAATCGATAATTTGCTTAGTGACGAGAAAAACGGAGGACAGTATTTGAGGACTAGGCAAGGAACTCAAACCATCAGTCAGAAGATGGCCGAGGAGTTGGACCCAGAAACCCTTTTCTTGGGAACTCCAGTTACCAGTATCGATCAGAGTAGGCCAGATGGTATCTGCTTGGTTCAAACCTTGGACAACGCCACCTTCCATTGTAGAAGGGTTATCGTCAGTGTCCCAACCACCTTGTACCAATCTATCAGTTTCTCTCCTCCATTGCCTCAGACCAAGAACTCTTTGTCTCATGATACTGTTATGGGATATTATAGTAAAATGATCTTCGTTTTCAACGAGCCTTGGTGGAGGAATGCCGGTTTCACCGGAATCTTCGACTCTGCTGATGGACCAGTCAGTTTCACCAGAGACACCAGTGTCCCTAGGGATGACCAGTGGTCTATCACTTGTTTCATCGTTGGTGGTAGGGGTAGGACTTGGAGTAAATTGTCTAAAGCTGATAGACATACCCAAGTTTGGGAGCAGTTTTGTAGATACTTCGGTGAGTTCGTCGAGAAGATCCCAGAGCCAGCCAATGTCTTGGAGATGGAGTGGTCTAAGCAGCCTTCTTTCTTGGGTGCTCCATGCCCAGTTATGACTCCCGGAACTATGACCACCGTCGGAACTGAATTGGCTACCCCATTTGGTAGGGTCCACTTCGTTGGAACCGAGACCTCTATTGTCTGGAGGGGATACATGGAGGGTGCCATTAGGTCTGGACAAAGGGGTGCCGCTGAAGTCTTGGCCGCCTTGAACGGTGATTTGTGCTCTGAGGCC

本发明通过PCR的方法分离克隆了胺氧化酶ASAO，DNA全序列分析结果表明，胺氧化酶ASAO基因开放阅读框架序列(ORF)全长1410bp。

本发明还提供了包含上述胺氧化酶ASAO的重组载体，将优选重组载体命名为pET28a(+)-ASAO。将本发明的胺氧化酶ASAO基因插入到表达载体合适的限制性酶切位点之间，使其核苷酸序列可操作的与表达调控序列相连接。作为本发明的一个最优选的实施方案，优选为将本发明的解毒酶基因插入到质粒pET28a(+)上的EcoRI和NotI限制性酶切位点之间，使该核苷酸序列位于T7启动子的下游并受其调控，得到重组大肠表达质粒pET28a(+)-ASAO。更具体地，相关制备及检测如下：

试验材料和试剂：

1、菌株及载体：本发明得到一种新的胺氧化酶ASAO。大肠杆菌表达载体pET28a(+)及菌株BL21(DE3)为实验室保存。

2、酶类及其它生化试剂：内切酶购自TransGen Biotech公司，连接酶购自TransGen Biotech公司。Proteintech His标签抗体购自北京西美杰科科技公司，蛋白marker购自Thermo Scientific公司，色谱级甲醇购自Fisher Chemical公司，其它都为国产试剂(均可从普通生化试剂公司购买得到)。

3、培养基：

大肠杆菌LB培养基(10g/L蛋白胨、5g/L酵母提取物、10g/L氯化钠,pH 7.0)。

说明：以下未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。

一、胺氧化酶ASAO的克隆

利用人工化学合成的方法获得胺氧化酶ASAO的基因片段，并在5’端引入内切酶位点EcoRI、在3’端引入内切酶位点NotI。

二、重组胺氧化酶ASAO的制备

将表达载体pET28a(+)进行双酶切(EcoRI+NotI)，同时将编码胺氧化酶ASAO的基因双酶切(EcoRI+NotI)，将切出编码成熟胺氧化酶的基因片段与表达载体pET28a(+)通过T4 DNA连接酶进行连接，将获得含有胺氧化酶基因ASAO的重组质粒pET28a(+)-ASAO转化大肠杆菌BL21(DE3)，获得重组大肠杆菌菌株BL21/ASAO。

将重组菌株BL21/ASAO过夜活化后接种于100mL LB培养液中，37℃、220rpm振荡培养约2.5h后，加入0.2mM IPTG，置于25℃、220rpm进行诱导，约24h后测定胞内和胞外的胺氧化酶活力。在胞内检测到胺氧化酶的活性，经过镍柱纯化，分别收集了80mM、100mM、300mM的咪唑。SDS-PAGE结果表明，重组胺氧化酶得到了表达。在进一步通过蛋白免疫印迹westernblot进行验证蛋白表达正确。如图1所示，泳道1为纯化后的结果。图2为western blot验证的结果。

三、重组胺氧化酶的降解性质测定

高效液相色谱检测胺氧化酶的降解性，具体方法如下：

(1)HFB1标准储备液：配制成浓度为100μg/mL的标准液，-20℃保存。

(2)样品的制备：取纯化好的胺氧化酶酶液45μL，加入5μL的HFB1标准储备液，使HFB1的终浓度为10μg/mL，37℃水浴锅中放置10min，然后放入孵育器100℃失活酶10min。

(3)样品衍生化：将待测样品50μL，加入200μL乙腈水(V:V＝1:1)，250μL OPA衍生液，混匀30s，衍生2min内进样，过滤膜待测。通过与HFB1的标品的峰图对比，来确定胺氧化酶ASAO的酶活性。

尽管为说明目的公开了本发明的实施例，但是本领域的技术人员可以理解：在不脱离本发明及所附权利要求的精神和范围内，各种替换、变化和修改都是可能的，因此，本发明的范围不局限于实施例所公开的内容。

序列表

<110> 天津科技大学

<120> 一种胺氧化酶ASAO、制备方法和应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 470

<212> PRT

<213> 胺氧化酶ASAO的氨基酸序列(Unknown)

<400> 1

Met Asp Ala Phe Asp Lys Ala Pro Arg Val Tyr Asp Val Val Val Val

1 5 10 15

Gly Ala Gly Leu Ser Gly Leu Gln Ala Ala His Ser Ile Cys Ala Ala

20 25 30

Gly Phe Ser Val Cys Val Leu Glu Ala Thr Asn Arg Val Gly Gly Lys

35 40 45

Thr Leu Ser Val Arg Ser Cys Glu Lys Gly Ile Asn Asp Leu Gly Ala

50 55 60

Ala Trp Ile Asn Asp Thr Asn Gln Ser Glu Met Phe Lys Leu His Gln

65 70 75 80

Arg Tyr Ser Leu Asp Gly Glu Ile Gln Tyr Thr His Gly Asp Asp Ile

85 90 95

Ile Gln Ser Thr Asp Gly Leu Ile Cys Lys Ile Pro Tyr Gly Gln Thr

100 105 110

Pro Leu Ser Thr Gly Leu Val Glu Asp Leu Val Arg Ile Leu Arg Glu

115 120 125

Lys Ser Ala Pro Ile Asp Leu His Asn Pro Ala Ser Ser Pro Ala Ala

130 135 140

Lys Glu Val Asp Asn Glu Thr Phe Gln Asp Phe Cys Ile Arg Arg Thr

145 150 155 160

Gly Cys Glu Asp Ala Val His Ile Ala Asp Ser Ile Ser Ala Ala Leu

165 170 175

Leu Gly Val Asp Ser Ile Glu Val Ser Ala Leu Tyr Met Leu Tyr Tyr

180 185 190

Phe Lys Ser Gly Ser Gly Ile Asp Asn Leu Leu Ser Asp Glu Lys Asn

195 200 205

Gly Gly Gln Tyr Leu Arg Thr Arg Gln Gly Thr Gln Thr Ile Ser Gln

210 215 220

Lys Met Ala Glu Glu Leu Asp Pro Glu Thr Leu Phe Leu Gly Thr Pro

225 230 235 240

Val Thr Ser Ile Asp Gln Ser Arg Pro Asp Gly Ile Cys Leu Val Gln

245 250 255

Thr Leu Asp Asn Ala Thr Phe His Cys Arg Arg Val Ile Val Ser Val

260 265 270

Pro Thr Thr Leu Tyr Gln Ser Ile Ser Phe Ser Pro Pro Leu Pro Gln

275 280 285

Thr Lys Asn Ser Leu Ser His Asp Thr Val Met Gly Tyr Tyr Ser Lys

290 295 300

Met Ile Phe Val Phe Asn Glu Pro Trp Trp Arg Asn Ala Gly Phe Thr

305 310 315 320

Gly Ile Phe Asp Ser Ala Asp Gly Pro Val Ser Phe Thr Arg Asp Thr

325 330 335

Ser Val Pro Arg Asp Asp Gln Trp Ser Ile Thr Cys Phe Ile Val Gly

340 345 350

Gly Arg Gly Arg Thr Trp Ser Lys Leu Ser Lys Ala Asp Arg His Thr

355 360 365

Gln Val Trp Glu Gln Phe Cys Arg Tyr Phe Gly Glu Phe Val Glu Lys

370 375 380

Ile Pro Glu Pro Ala Asn Val Leu Glu Met Glu Trp Ser Lys Gln Pro

385 390 395 400

Ser Phe Leu Gly Ala Pro Cys Pro Val Met Thr Pro Gly Thr Met Thr

405 410 415

Thr Val Gly Thr Glu Leu Ala Thr Pro Phe Gly Arg Val His Phe Val

420 425 430

Gly Thr Glu Thr Ser Ile Val Trp Arg Gly Tyr Met Glu Gly Ala Ile

435 440 445

Arg Ser Gly Gln Arg Gly Ala Ala Glu Val Leu Ala Ala Leu Asn Gly

450 455 460

Asp Leu Cys Ser Glu Ala

465 470

<210> 2

<211> 1410

<212> DNA/RNA

<213> 胺氧化酶ASAO基因的核苷酸序列(Unknown)

<400> 2

atggatgcgt ttgataaagc gccgcgcgtg tatgatgtgg tggtggtggg cgcgggcctg 60

agcggcctgc aggcggcgca tagcatttgc gcggcgggct ttagcgtgtg cgtgctggaa 120

gcgaccaacc gcgtgggcgg caaaaccctg agcgtgcgca gctgcgaaaa aggcattaac 180

gatctgggcg cggcgtggat taacgatacc aaccagagcg aaatgtttaa actgcatcag 240

cgctatagcc tggatggcga aattcagtat acccatggcg atgatattat tcagagcacc 300

gatggcctga tttgcaaaat tccgtatggc cagaccccgc tgagcaccgg cctggtggaa 360

gatctggtgc gcattctgcg cgaaaaaagc gcgccgattg atctgcataa cccggcgagc 420

agcccggcgg cgaaagaagt ggataacgaa acctttcagg atttttgcat tcgccgcacc 480

ggctgcgaag atgcggtgca tattgcggat agcattagcg cggcgctgct gggcgtggat 540

agcattgaag tgagcgcgct gtatatgctg tattatttta aaagcggcag cggcattgat 600

aacctgctga gcgatgaaaa aaacggcggc cagtatctgc gcacccgcca gggcacccag 660

accattagcc agaaaatggc ggaagaactg gatccggaaa ccctgtttct gggcaccccg 720

gtgaccagca ttgatcagag ccgcccggat ggcatttgcc tggtgcagac cctggataac 780

gcgacctttc attgccgccg cgtgattgtg agcgtgccga ccaccctgta tcagagcatt 840

agctttagcc cgccgctgcc gcagaccaaa aacagcctga gccatgatac cgtgatgggc 900

tattatagca aaatgatttt tgtgtttaac gaaccgtggt ggcgcaacgc gggctttacc 960

ggcatttttg atagcgcgga tggcccggtg agctttaccc gcgataccag cgtgccgcgc 1020

gatgatcagt ggagcattac ctgctttatt gtgggcggcc gcggccgcac ctggagcaaa 1080

ctgagcaaag cggatcgcca tacccaggtg tgggaacagt tttgccgcta ttttggcgaa 1140

tttgtggaaa aaattccgga accggcgaac gtgctggaaa tggaatggag caaacagccg 1200

agctttctgg gcgcgccgtg cccggtgatg accccgggca ccatgaccac cgtgggcacc 1260

gaactggcga ccccgtttgg ccgcgtgcat tttgtgggca ccgaaaccag cattgtgtgg 1320

cgcggctata tggaaggcgc gattcgcagc ggccagcgcg gcgcggcgga agtgctggcg 1380

gcgctgaacg gcgatctgtg cagcgaagcg 1410

Claims (1)

1.胺氧化酶ASAO在不以治疗为目的的降解伏马毒素B1方面中的应用，所述胺氧化酶ASAO的氨基酸序列为SEQ ID NO.1。