CN118759100A - 2,3,4,6-四苄基-d-吡喃葡萄糖酸-1,5-内酯的定量分析方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种2,3,4,6‑四苄基‑D‑吡喃葡萄糖酸‑1,5‑内酯的定量分析方法，采用高效液相色谱法，以八烷基硅烷键合硅胶为固定相，以含有三乙胺和三氟乙酸的甲醇水溶液为流动相A、含有三乙胺和三氟乙酸的甲醇乙腈溶液为流动相B进行梯度洗脱，洗脱后采用面积归一化法对谱图进行积分，得到2,3,4,6‑四苄基‑D‑吡喃葡萄糖酸‑1,5‑内酯及杂质的定量结果；本发明分析结果准确，能够有效的检测出样品中2,3,4,6‑四苄基‑D‑吡喃葡萄糖酸‑1,5‑内酯的纯度以及杂质含量，检测误差可以控制在1.54％以内，甚至0.64％以内，最低可达0.07％。
Description
技术领域
本发明涉及化学分析技术领域，尤其涉及一种2,3,4,6-四苄基-D-吡喃葡萄糖酸-1,5-内酯的定量分析方法。
背景技术
2,3,4,6-四苄基-D-吡喃葡萄糖酸-1,5-内酯(式I)是浅黄色至酒红色液体，易溶于丁酮、甲苯等有机溶剂，不溶于水。它是较为常见的葡萄糖衍生物，广泛应用于药物及药物中间体、天然产物的合成。
2,3,4,6-四苄基-D-吡喃葡萄糖酸-1,5-内酯是合成伏格列波糖和钠糖共转运体(SGLT1和SGLT2)抑制剂的关键原料之一，用于治疗糖尿病。2,3,4,6-四苄基-D-吡喃葡萄糖酸-1,5-内酯可以用于合成葛根素吗啡的中间体，葛根素吗啡的使用可以减少吗啡的用量，降低吗啡的成瘾性和耐受性，作为吗啡的代用品进行疼痛的治疗。还可以用来制备米格列醇、甲酰基C-糖苷、治疗高胆固醇化合物、螺环原酸酯糖类等。
作为关键中间体的2,3,4,6-四苄基-D-吡喃葡萄糖酸-1,5-内酯，其制备及检测方法的研究成为研发及分析人员首要任务。目前有报道薄层色谱(TLC)、核磁共振(NMR)或质谱(MS)可以检测结构和纯度。但并没有相关文献涉及到2,3,4,6-四苄基-D-吡喃葡萄糖酸-1,5-内酯及其有关物质的定量分析方法。
四苄基葡萄糖是生产2,3,4,6-四苄基-D-吡喃葡萄糖酸-1,5-内酯的原料。公司登记在企业标准信息服务平台上的四苄基葡萄糖企业标准方法，采用液相色谱法检测含量，该法是采用甲醇作为溶剂，且流动相呈酸性。2,3,4,6-四苄基-D-吡喃葡萄糖酸-1,5-内酯采用该方法检测时，在酸性条件下会水解，易造成含量结果偏低。
因此，本领域亟需开发一种操作简单、结果准确的2,3,4,6-四苄基-D-吡喃葡萄糖酸-1,5-内酯的定量分析方法。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供了一种2,3,4,6-四苄基-D-吡喃葡萄糖酸-1,5-内酯的定量分析方法。该定量分析方法操作方便，分析结果准确，能够有效的检测出样品中2,3,4,6-四苄基-D-吡喃葡萄糖酸-1,5-内酯的纯度以及杂质含量。
本发明的技术方案如下：
一种2,3,4,6-四苄基-D-吡喃葡萄糖酸-1,5-内酯的定量分析方法，所述方法如下：
采用高效液相色谱法对2,3,4,6-四苄基-D-吡喃葡萄糖酸-1,5-内酯进行定量分析，以八烷基硅烷键合硅胶为固定相，以含有三乙胺和三氟乙酸的甲醇水溶液为流动相A、含有三乙胺和三氟乙酸的甲醇乙腈溶液为流动相B进行梯度洗脱，洗脱后采用面积归一化法对谱图进行积分，得到2,3,4,6-四苄基-D-吡喃葡萄糖酸-1,5-内酯及杂质的定量结果；
流动相A中，溶剂甲醇和水的体积比10～30：90～70，例如10：90、15：85、20：80、25：75、30：70等，优选20：80；
流动相B中，溶剂甲醇和乙腈的体积比10～30：90～70，例如10：90、15：85、20：80、25：75、30：70等，优选20：80；
流动相A中，三乙胺和三氟乙酸的体积分数均为0.03～0.07％，例如0.03％、0.04％、0.05％、0.06％、0.07％等，优选0.05％；
流动相B中，三乙胺和三氟乙酸的体积分数均为0.03～0.07％，例如0.03％、0.04％、0.05％、0.06％、0.07％等，优选0.05％；
梯度洗脱程序如下：基于流动相A和流动相B的总体积，以流动相A的体积分数计：0～18min：55～65％(例如56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％等)；
18～19min：0；19～25min：55～65％(例如56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、
63％、64％等)；
梯度洗脱程序中，以进样时刻记为0min，流动相A体积分数的调节具体例如，0.1min时流动相A的体积分数为55～65％，18min时调节为0，19min时调节为55～65％；
优选梯度洗脱程序如下：基于流动相A和流动相B的总体积，以流动相A的体积分数计：0～18min：60％；18min：0；19～25min：60％；在该洗脱梯度下，能够进一步提高2,3,4,6-四苄基-D-吡喃葡萄糖酸-1,5-内酯和杂质的分离程度，从而进一步提高定量分析结果的准确性；
流动相(流动相A和流动相B合计)的流速为0.6～1.0ml/min，例如：0.6ml/min、0.7ml/min、0.8ml/min、0.9ml/min、1.0ml/min等，优选0.8ml/min；
柱温为25～35℃，例如：26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃等，优选30℃；
检测波长为205～215nm，例如：206nm、207nm、208nm、209nm、210nm、211nm、212nm、213nm、214nm等，优选210nm；
进样体积为8～12μl，例如：8μl、9μl、10μl、11μl、12μl等，优选10μl。
特别优选的，本发明所述2,3,4,6-四苄基-D-吡喃葡萄糖酸-1,5-内酯的定量分析方法如下：
采用高效液相色谱法对2,3,4,6-四苄基-D-吡喃葡萄糖酸-1,5-内酯进行定量分析，以八烷基硅烷键合硅胶为固定相，以含有三乙胺和三氟乙酸的甲醇水溶液为流动相A、含有三乙胺和三氟乙酸的甲醇乙腈溶液作为流动相B进行梯度洗脱，洗脱后采用面积归一化法对谱图进行积分，得到2,3,4,6-四苄基-D-吡喃葡萄糖酸-1,5-内酯及杂质的定量结果；
流动相A中，溶剂甲醇和水的体积比20：80，三乙胺和三氟乙酸的体积分数均为0.05％；
流动相B中，溶剂甲醇和乙腈的体积比20：80，三乙胺和三氟乙酸的体积分数均为0.05％；
梯度洗脱程序如下：基于流动相A和流动相B的总体积，以流动相A的体积分数计：0～18min：60％；18min：0；19～25min：60％；
流动相的流速0.8ml/min，柱温30℃，检测波长210nm，进样体积10μl。
在本发明的优选方案中，选择特定的固定相和流动相，并且通过设置洗脱梯度、柱温、流速、检测波长和进样体积，进一步提升2,3,4,6-四苄基-D-吡喃葡萄糖酸-1,5-内酯和杂质的分离效果，从而进一步提升定量分析结果的准确性。
相较于现有技术，本发明具有如下有益效果：
本发明提供了一种采用高效液相色谱法对2,3,4,6-四苄基-D-吡喃葡萄糖酸-1,5-内酯进行定量分析的方法，以含有三乙胺和三氟乙酸的甲醇水溶液、含有三乙胺和三氟乙酸的甲醇乙腈溶液作为流动相对待测样品进行洗脱，洗脱后2,3,4,6-四苄基-D-吡喃葡萄糖酸-1,5-内酯和杂质的分离度高，采用面积归一化法对谱图进行积分，得到2,3,4,6-四苄基-D-吡喃葡萄糖酸-1,5-内酯及杂质的定量结果。
本发明分析结果准确，能够有效的检测出样品中2,3,4,6-四苄基-D-吡喃葡萄糖酸-1,5-内酯的纯度以及杂质含量，检测误差可以控制在1.54％以内，甚至0.64％以内，最低可达0.07％。
附图说明
图1：实施例1中通过高效液相色谱法检测得到的谱图。
图2：实施例2中通过高效液相色谱法检测得到的谱图。
具体实施方式
下面通过具体实施例进一步描述本发明，但本发明的保护范围并不仅限于此。
实施例1
本实施例提供一种采用高效液相色谱法对2,3,4,6-四苄基-D-吡喃葡萄糖酸-1,5-内酯进行定量分析的方法，具体如下：
(1)配制样品溶液：
称取25mg的2,3,4,6-四苄基-D-吡喃葡萄糖酸-1,5-内酯，加溶剂乙腈溶解定容至50ml，混匀。用0.45μm的滤膜过滤。
(2)检测仪器：安捷伦1260系列液相色谱仪。
(3)固定相：八烷基硅烷键合硅胶(Waters XTerra RP85μm，4.6×150mm)；流动相A：体积分数0.05％的三乙胺和三氟乙酸的甲醇水(体积比20：80)溶液，流动相B：体积分数0.05％的三乙胺和三氟乙酸的甲醇乙腈(体积比20：80)溶液。
(4)洗脱梯度如下表所示(表中时间为变更体积比的时间节点)：
| 流动相A和流动相B的体积比 | |
| 0min | 60:40 |
| 0.1min | 60:40 |
| 18min | 0:100 |
| 19min | 60:40 |
| 25min | 60:40 |
(5)洗脱参数设置：
流速0.8ml/min，柱温为30℃，检测波长为210nm，进样体积为10μl。
(6)数据分析：
上述测试结果如图1所示，图中峰面积最大的即为2,3,4,6-四苄基-D-吡喃葡萄糖酸-1,5-内酯的峰，从谱图上可以看出，2,3,4,6-四苄基-D-吡喃葡萄糖酸-1,5-内酯与杂质间的分离度较高，出峰位置适中，峰形好。
实施例2
与实施例1的区别在于，洗脱梯度如下表所示(表中时间为变更体积比的时间节点)：
| 流动相A和流动相B的体积比 | |
| 0min | 45:55 |
| 0.1min | 45:55 |
| 18min | 0:100 |
| 19min | 45:55 |
| 25min | 45:55 |
实施例2的测试结果如图2所示，图中峰面积最大的即为2,3,4,6-四苄基-D-吡喃葡萄糖酸-1,5-内酯的峰，峰形较好，但是与实施例1相比，2,3,4,6-四苄基-D-吡喃葡萄糖酸-1,5-内酯与杂质的分离程度相对较低，且出峰位置靠前。
实施例3
与实施例1的区别在于，洗脱梯度如下表所示(表中时间为变更体积比的时间节点)：
| 流动相A和流动相B的体积比 | |
| 0min | 65:35 |
| 0.1min | 65:35 |
| 18min | 5:95 |
| 19min | 65:35 |
| 25min | 65:35 |
实施例4
与实施例1的区别在于，洗脱梯度如下表所示(表中时间为变更体积比的时间节点)：
| 流动相A和流动相B的体积比 | |
| 0min | 55:45 |
| 0.1min | 55:45 |
| 18min | 0:100 |
| 19min | 55:45 |
| 25min | 55:45 |
实施例5
与实施例1的区别在于，流速0.6ml/min。
实施例6
与实施例1的区别在于，流速1.0ml/min。
实施例7
与实施例1的区别在于，流速0.4ml/min。
实施例8
与实施例1的区别在于，流速1.2ml/min。
实施例9
与实施例1的区别在于，柱温为25℃。
实施例10
与实施例1的区别在于，柱温为35℃。
实施例11
与实施例1的区别在于，柱温为23℃。
实施例12
与实施例1的区别在于，柱温为37℃。
实施例13
与实施例1的区别在于，检测波长为205nm。
实施例14
与实施例1的区别在于，检测波长为215nm。
实施例15
与实施例1的区别在于，检测波长为202nm。
实施例16
与实施例1的区别在于，检测波长为218nm。
实施例17
与实施例1的区别在于，进样体积为8μl。
实施例18
与实施例1的区别在于，进样体积为12μl。
实施例19
与实施例1的区别在于，进样体积为7μl。
实施例20
与实施例1的区别在于，进样体积为13μl。
实施例21
与实施例1的区别在于，流动相A中三乙胺和三氟乙酸的体积分数为0.03％、流动相B中三乙胺和三氟乙酸的体积分数为0.03％。
实施例22
与实施例1的区别在于，流动相A中三乙胺和三氟乙酸的体积分数为0.07％、流动相B中三乙胺和三氟乙酸的体积分数为0.07％。
实施例23
与实施例1的区别在于，流动相A中三乙胺和三氟乙酸的体积分数为0.02％、流动相B中三乙胺和三氟乙酸的体积分数为0.02％。
实施例24
与实施例1的区别在于，流动相A中三乙胺和三氟乙酸的体积分数为0.08％、流动相B中三乙胺和三氟乙酸的体积分数为0.08％。
实施例25
与实施例1的区别在于，流动相A中溶剂甲醇和水的体积比为15：85、流动相B中溶剂甲醇和乙腈的体积比为15：85。
实施例26
与实施例1的区别在于，流动相A中溶剂甲醇和水的体积比为25：75、流动相B中溶剂甲醇和乙腈的体积比为25：75。
实施例27
与实施例1的区别在于，流动相A中溶剂甲醇和水的体积比为10：90、流动相B中溶剂甲醇和乙腈的体积比为10：90。
实施例28
与实施例1的区别在于，流动相A中溶剂甲醇和水的体积比为30：70、流动相B中溶剂甲醇和乙腈的体积比为30：70。
对比例1
与实施例1的区别在于，流动相A、流动相B中取消加入三乙胺和三氟乙酸。
对比例2
与实施例1的区别在于，流动相A不变，流动相B将乙腈替换为甲醇。
数据分析：
采用面积归一法对上述实施例和对比例得到的谱图进行积分，计算得到被测样品中2,3,4,6-四苄基-D-吡喃葡萄糖酸-1,5-内酯的浓度，并计算与实际浓度的误差(％)，如下表所示：
由表可知，本发明提供的定量分析方法的准确度高，误差在1.54％以内，甚至0.64％以内，最低可达0.07％。
对比例1和对比例2与实施例1相比分别替换其中的流动相，其误差相较于实施例1升高，准确度降低，由此证明，本发明是通过采用特定的流动相对待测样品进行洗脱以实现有效的分离，得到准确的测试结果，改变两种流动相中的任何一种，均不能获得本发明的技术成果。
对比实施例1～4可知，在本发明的优选洗脱梯度范围内(实施例1、3和4)，测试的准确度更高，特别是实施例1的洗脱效果最佳。
对比实施例1、5～20可知，流速、柱温、检测波长和体积均会对最终测试结果的准确性造成影响，当上述四项均满足本发明的优选条件(流速0.6～1.0ml/min，柱温为25～35℃，检测波长为205～215nm，进样体积为8～12μl)时(实施例1、5、6、9、10、13、14、17、18)，各项参数与洗脱梯度相互配合，能够进一步提高准确性，将流速、柱温、检测波长和进样体积中的任一项参数调整至优选范围之外(实施例7、8、11、12、15、16、19、20)，均会使准确度有所降低。
对比实施例1、21～24可知，选用体积分数为0.03～0.07％的三乙胺和三氟乙酸的甲醇水溶液和体积分数为0.03～0.07％的三乙胺和三氟乙酸的甲醇乙腈溶液作为流动相(实施例1、21和22)，能够进一步提高检测结果的准确性，浓度过低(实施例23)或者过高(实施例24)均会使准确性有所降低。
对比实施例1、25～28可知，选用体积比为15～25：85～75的甲醇水溶液和体积比为15～25：85～75的甲醇乙腈溶液作为流动相溶剂(实施例1、25和26)，能够进一步提高检测结果的准确性，甲醇比例过低(实施例27)或者过高(实施例28)均会使准确性有所降低。
Claims (8)
1.一种2,3,4,6-四苄基-D-吡喃葡萄糖酸-1,5-内酯的定量分析方法，其特征在于，所述方法如下：
采用高效液相色谱法对2,3,4,6-四苄基-D-吡喃葡萄糖酸-1,5-内酯进行定量分析，以八烷基硅烷键合硅胶为固定相，以含有三乙胺和三氟乙酸的甲醇水溶液为流动相A、含有三乙胺和三氟乙酸的甲醇乙腈溶液为流动相B进行梯度洗脱，洗脱后采用面积归一化法对谱图进行积分，得到2,3,4,6-四苄基-D-吡喃葡萄糖酸-1,5-内酯及杂质的定量结果。
2.如权利要求1所述2,3,4,6-四苄基-D-吡喃葡萄糖酸-1,5-内酯的定量分析方法，其特征在于，流动相A中，溶剂甲醇和水的体积比10～30：90～70，三乙胺和三氟乙酸的体积分数均为0.03～0.07％；流动相B中，溶剂甲醇和乙腈的体积比10～30：90～70，三乙胺和三氟乙酸的体积分数均为0.03～0.07％。
3.如权利要求1所述2,3,4,6-四苄基-D-吡喃葡萄糖酸-1,5-内酯的定量分析方法，其特征在于，梯度洗脱程序如下：基于流动相A和流动相B的总体积，以流动相A的体积分数计：0～18min：55～65％；18～19min：0；19～25min：55～65％。
4.如权利要求1所述2,3,4,6-四苄基-D-吡喃葡萄糖酸-1,5-内酯的定量分析方法，其特征在于，流动相的流速为0.6～1.0ml/min。
5.如权利要求1所述2,3,4,6-四苄基-D-吡喃葡萄糖酸-1,5-内酯的定量分析方法，其特征在于，柱温为25～35℃。
6.如权利要求1所述2,3,4,6-四苄基-D-吡喃葡萄糖酸-1,5-内酯的定量分析方法，其特征在于，检测波长为205～215nm。
7.如权利要求1所述2,3,4,6-四苄基-D-吡喃葡萄糖酸-1,5-内酯的定量分析方法，其特征在于，进样体积为8～12μl。
8.如权利要求1所述2,3,4,6-四苄基-D-吡喃葡萄糖酸-1,5-内酯的定量分析方法，其特征在于，所述方法如下：
采用高效液相色谱法对2,3,4,6-四苄基-D-吡喃葡萄糖酸-1,5-内酯进行定量分析，以八烷基硅烷键合硅胶为固定相，以含有三乙胺和三氟乙酸的甲醇水溶液为流动相A、含有三乙胺和三氟乙酸的甲醇乙腈溶液作为流动相B进行梯度洗脱，洗脱后采用面积归一化法对谱图进行积分，得到2,3,4,6-四苄基-D-吡喃葡萄糖酸-1,5-内酯及杂质的定量结果；
流动相A中，溶剂甲醇和水的体积比20：80，三乙胺和三氟乙酸的体积分数均为0.05％；
流动相B中，溶剂甲醇和乙腈的体积比20：80，三乙胺和三氟乙酸的体积分数均为0.05％；
梯度洗脱程序如下：基于流动相A和流动相B的总体积，以流动相A的体积分数计：0～18min：60％；18min：0；19～25min：60％；
流动相的流速0.8ml/min，柱温30℃，检测波长210nm，进样体积10μl。
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