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CN118754987B - 一种紧密连接蛋白抗体h04及其应用 - Google Patents

一种紧密连接蛋白抗体h04及其应用 Download PDF

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CN118754987B CN202411152856.0A CN202411152856A CN118754987B CN 118754987 B CN118754987 B CN 118754987B CN 202411152856 A CN202411152856 A CN 202411152856A CN 118754987 B CN118754987 B CN 118754987B
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Abstract

本发明提供了一种紧密连接蛋白抗体H04及其应用，所述抗体H04为单域抗体，所述单域抗体的重链可变区包括CDR1、CDR2和CDR3；所述CDR1的氨基酸序列包括SEQ ID NO.1；所述CDR2的氨基酸序列包括SEQ ID NO.2；所述CDR3的氨基酸序列包括SEQ ID NO.3。本发明获得的紧密连接蛋白抗体H04对CLDN6的亲和力更高，对CLDN9的亲和力更低，即对CLDN6的特异性更高，同时其介导的ADCC和CAR‑T的肿瘤杀伤效果更好，以其为基础构建的嵌合抗原受体分子可更好地介导免疫细胞杀伤肿瘤。

Description

一种紧密连接蛋白抗体H04及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种紧密连接蛋白抗体H04及其应用。
背景技术
紧密连接蛋白6(Claudin 6，CLDN6)是一种四次跨膜的细胞间黏附蛋白，参与形成表皮和内皮细胞周围的紧密连接。CLDN6在胎儿时期的胃、胰腺、肺、肾脏等组织器官均有高表达，而在成年机体中的相应组织器官中却几乎不表达。然而，研究发现，在多种实体瘤中都能检测到CLDN6表达的异常上调，包括乳腺癌、子宫内膜癌、卵巢癌、睾丸癌、肺癌、胃癌、胆管癌、结直肠癌、食管癌、头颈癌等。另外，CLDN6也具有促进肿瘤发生发展的功能，与相关癌症的较差预后相关。例如，CLDN6可以通过GSTP1和AF-6/ERKs通路提升乳腺癌对化疗药物的耐受性，通过AKT/mTOR通路提升肝癌和子宫内膜癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力，通过ZO-2/YAP1提高肝癌细胞对化疗药物的耐受性，通过YAP1/SNAIL通路提高胃癌细胞的转移和侵袭能力等等。
CLDN6已被认为是针对多种实体瘤的极具应用潜力的治疗靶点。针对CLDN6的治疗性单克隆抗体、抗体偶联药物(antibody-durg conjugate，ADC)、双特异性抗体(Bispecific antibody，BsAb)和嵌合抗原受体T(chimeric antigen receptor T，CAR-T)细胞等都已被开发，部分药物已进行至临床研究。
CN106519035A公开了使用结合CLDN6的抗体治疗和/或预防与表达CLDN6之细胞相关的肿瘤疾病，特别是癌症和癌症转移。其证明抗体与肿瘤细胞表面上的CLDN6的结合足以抑制肿瘤的生长并足以延长肿瘤患者的存活和寿命。另外，抗体与CLDN6的结合有效地抑制CLDN6阳性生殖细胞肿瘤(例如畸胎癌或胚胎癌，特别是睾丸的生殖细胞肿瘤)的生长。
CN101918450A公开了一种与细胞膜上表达的CLDN6结合的抗体。该发明的抗体识别在细胞膜上以天然形存在的人CLDN6，对高度表达人CLDN6的癌细胞株显示出由ADCC及/或CDC活性产生的细胞毒性。另外，该发明的抗体通过与毒素结合对人CLDN6高度表达癌细胞株显示出细胞生长抑制作用。
上述的现有技术都基于靶向CLDN6的抗体所开发。然而，CLDN6与CLDN9的胞外域结构相似性极高(两者的第一胞外结构域都包含53aa，但仅在1个氨基酸位点上有差异；第二胞外结构域都包含22aa，但仅在2个氨基酸位点上有差异)，导致上述抗体不能兼具对CLND6的高亲和力和高特异性。对CLDN6具有高亲和力的抗体，往往也能显著结合CLDN9；能有效区分CLDN6和CLDN9的抗体，往往对CLDN6的亲和力较弱。因此，相关药物的治疗效果仍有提升空间。另外，现有技术中的CLDN6抗体均为鼠源/人源化抗体。在应用于抗体类药物时，其较大的分子量不利于提高药物对实体瘤病灶的渗透率；在应用于细胞类药物时，通常以单链抗体(scFv)的形式进行表达，其较长的编码序列不利于表达载体的构建和改造，也可能由于临近scFv分子的VH和VL交叉配对，使细胞药物发生非特异性激活。因此，兼具高亲和力和高特异性，且分子量小的CLDN6抗体具有极高的临床应用价值，对相关肿瘤治疗药物的药效和安全性提升具有关键意义。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种紧密连接蛋白抗体H04及其应用。本发明为解决现有CLDN6抗体亲和力和特异性不能兼具的问题，筛选获得了比现有CLDN6抗体亲和力更高、特异性更好、分子量更小的CLDN6抗体。同时其介导的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(antibody dependent cell-mediated cytotoxicity，ADCC)作用更好，以其为基础构建的CAR分子可更好地介导免疫细胞杀伤肿瘤。本发明的抗体能够提高相关抗体和细胞药物有效性，在肿瘤治疗药物的开发中具有重要的应用价值。
为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供紧密连接蛋白抗体H04，所述抗体H04为单域抗体，所述单域抗体的重链可变区包括CDR1、CDR2和CDR3；
所述CDR1的氨基酸序列包括SEQ ID NO.1所示；
所述CDR2的氨基酸序列包括SEQ ID NO.2所示；
所述CDR3的氨基酸序列包括SEQ ID NO.3所示。
优选地，所述单域抗体的重链可变区序列包括SEQ ID NO.4所示。
第二方面，本发明提供一种重链抗体，所述重链抗体包括第一方面所述的重链可变区序列和人免疫球蛋白(immunoglobulin，Ig)可结晶段(fragment crystallizable，Fc)Ig Fc的全长或部分氨基酸序列。
优选地，所述Ig Fc包括IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的Fc段的全长或部分序列，或其组合。
优选地，所述IgG1 Fc氨基酸序列包括SEQ ID NO.5所示。
优选地，所述重链抗体的氨基酸序列包括SEQ ID NO.6所示。
本发明使用过表达CLDN6的HEK293T细胞免疫羊驼。通过ELISA和流式细胞术确定羊驼血清中CLDN6特异性抗体的效价后，分离羊驼外周血单个核细胞(peripheral bloodmononuclear cell，PBMC)，提取RNA并反转录获得cDNA。用羊驼单域抗体特异性引物，扩增VHH序列，并克隆至噬菌体表达质粒中，构建噬菌体展示文库。使用过表达CLDN9的CHO-S细胞与噬菌体展示文库孵育，剔除与CLDN9细胞结合的抗体克隆。然后用含有CLDN6的病毒样颗粒(virus-like particle，VLP)对噬菌体展示文库进行3-4轮富集淘选。从富集产物中挑取单克隆，通过ELISA检测候选抗体与CLDN6-VLP的特异性结合情况。阳性抗体表达纯化后，分别检测其与过表达CLDN6或CLDN9的CHO-S细胞的亲和力。选择与CLDN6亲和力强且与CLDN9亲和力弱的抗体克隆，与NK细胞、CLDN6阳性的Huh-7肝癌细胞共培养，检测各克隆的抗体依赖性的细胞介导的细胞毒作用(antibody-dependent cell-mediatedcytotoxicity，ADCC)。同时，将CLDN6单域抗体序列克隆至CAR表达载体中，构建以CLDN6单域抗体为抗原结合域的CAR-T细胞，检测其对CLDN6阳性的OVCAR3细胞在体内外的杀伤能力。结果显示，与现有技术相比，本发明获得的CLDN6单域抗体对CLDN6的亲和力更高，对CLDN9的亲和力更低，即对CLDN6的特异性更高，同时其介导的ADCC和CAR-T的肿瘤杀伤效果更好。
第三方面，本发明提供一种核酸分子，所述核酸分子编码第一方面所述的紧密连接蛋白抗体H04或第二方面所述的重链抗体。
第四方面，本发明提供一种表达载体，所述表达载体含有第三方面所述的核酸分子；并且所述表达载体在转染/转导/转化宿主细胞后，使得宿主细胞表达第一方面所述的紧密连接蛋白抗体H04或第二方面所述的重链抗体。
第五方面，本发明提供一种宿主细胞，所述宿主细胞中含有至少一个拷贝的第四方面所述的表达载体，或至少一个拷贝第三方面所述的核酸分子。
第六方面，本发明提供一种用于检测紧密连接蛋白的组合物，所述组合物包括第一方面所述的紧密连接蛋白抗体H04或第二方面所述的重链抗体。
第七方面，本发明提供一种抗紧密连接蛋白嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体识别紧密连接蛋白，所述嵌合抗原受体由以下结构依次串联组成：信号肽、第一方面所述的紧密连接蛋白抗体H04、铰链区、跨膜结构域、胞内共刺激结构域和人CD3胞内信号转导结构域。
优选地，所述信号肽选自以下蛋白的信号肽：CD8、GM-CSF、CD4、CD28、CD137、IgG、IgE、TCRα、TCRβ，或其组合。
优选地，所述信号肽的氨基酸序列包括SEQ ID NO.8所示。
优选地，所述铰链区选自以下蛋白的铰链区：CD8、CD28、CD137、IgG1、IgG4、TCRα、TCRβ，或其组合。
优选地，所述铰链区的氨基酸序列包括SEQ ID NO.9所示。
优选地，所述跨膜结构域选自以下蛋白的跨膜结构域：CD28、CD3ε、CD3ζ、CD3γ、CD3δ、TCRα、TCRβ、CD40、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154、CD278、CD152、CD279、CD233、CD314，或其组合。
优选地，所述跨膜结构域的氨基酸序列包括SEQ ID NO.10所示。
优选地，所述胞内共刺激结构域选自以下蛋白的共刺激结构域：CD3ε、CD3γ、CD3δ、OX40、CD2、CD7、CD27、CD28、CD30、CD40、CD70、CD134、4-1BB(又称CD137)、PD1、Dap10、CDS、ICAM-1、LFA-1/CD11a/CD18、ICOS(又称CD278)、NKG2D、GITR、OX40L，或其组合。
优选地，所述胞内共刺激结构域的氨基酸序列包括SEQ ID NO.11所示。
优选地，所述人CD3胞内信号转导结构域选自以下蛋白：CD3ζ、CD3ε、CD3γ、CD3δ，或其组合。
优选地，所述人CD3胞内信号转导结构域的氨基酸序列包括SEQ ID NO.12所示。
优选地，所述抗紧密连接蛋白嵌合抗原受体的氨基酸序列包括SEQ ID NO.7所示。
第八方面，本发明提供一种核酸分子，所述核酸分子编码第七方面所述的抗紧密连接蛋白嵌合抗原受体。
第九方面，本发明提供一种表达载体，所述表达载体含有第八方面所述的核酸分子；并且所述表达载体在转染/转导/转化宿主细胞后，使得宿主细胞表达第七方面所述的抗紧密连接蛋白嵌合抗原受体。
第十方面，本发明提供一种表达抗紧密连接蛋白嵌合抗原受体的细胞，所述细胞由宿主细胞转染/转导/转化第九方面所述的表达载体或第八方面所述的核酸分子后得到，并且表达第七方面所述的抗紧密连接蛋白嵌合抗原受体。
优选地，所述宿主细胞包括T细胞。
第十一方面，本发明提供一种药物组合物，所述药物组合物包括第十方面所述的表达抗紧密连接蛋白嵌合抗原受体的细胞。
第十二方面，本发明提供第一方面所述的紧密连接蛋白抗体H04、第二方面所述的重链抗体、第三方面所述的核酸分子、第四方面所述的表达载体、第五方面所述的宿主细胞、第六方面所述的用于检测紧密连接蛋白的组合物、第七方面所述的抗紧密连接蛋白嵌合抗原受体、第八方面所述的核酸分子、第九方面所述的表达载体、第十方面所述的表达抗紧密连接蛋白嵌合抗原受体的细胞或第十一方面所述的药物组合物中任意一种或至少两种的组合在制备治疗或检测肿瘤的药物中的应用。
相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
本发明的单域抗体对CLDN6的亲和力更高，对CLDN9的亲和力更低，且分子量更小。以其为基础开发的抗体类药物有效性更好、组织穿透力更强、体内稳定性更好、药效更优；以其为基础开发的工程化免疫细胞外源基因表达水平更高、有效性更好，药效更优、改造难度更低；以其为基础开发的检测试剂灵敏性更高、假阳性更低。
附图说明
图1是72#羊驼血清效价检测结果。
图2是110#羊驼血清效价检测结果。
图3是羊驼抗体VHH区的扩增结果；其中，A为首轮PCR扩增重链抗体片段；B为第二轮PCR扩增VHH区片段。
图4是流式细胞术检测重组单域抗体的特异性结果。
图5是流式细胞术检测重组单域抗体的EC50的结果。
图6是流式细胞术检测重组单域抗体的EC50的结果；其中，A为用CHO-S-CLDN6细胞检测的浓度-效应曲线；B为用CHO-S-CLDN9细胞检测的浓度-效应曲线。
图7是IHC和流式细胞术检测重组单域抗体对卵巢癌细胞的结合结果。
图8是流式细胞术检测肝癌细胞中CLDN6表达的结果。
图9是IncuCyte实时定量活细胞成像分析重组单域抗体介导ADCC功能。
图10是靶向CLDN6的CAR分子结构及其在T细胞中的表达；其中，A为CAR分子结构；B为流式细胞术检测BVHCN6-008在T细胞中的表达。
图11是IncuCyte实时定量活细胞成像分析靶向CLDN6的CAR-T细胞的杀伤功能和特异性结果。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。
以下实验材料的来源如下所示：
HEK293T：ATCC，CRL-3216。CHO-S细胞：Gibco，R80007。FITC标记的Rabbit anti-Llama IgG(H+L)抗体：Invitrogen，A16155。anti M13-HRP抗体：SinoBiological，11973-MM05T-H。PE标记的anti-human IgG抗体：Biolegend，410708。AF647标记的Anti-human IgG抗体：Jackson ImmunoResearch，109-606-170。阳性对照抗体A-4：Santa Cruz，sc-393671。抗VHH抗体：GenScript，A02017。AF647标记的抗人CLDN6抗体：Novus，FAB3656R。CLDN6-VLP：CUSABIO，CSB-MP005508HU(A4)。
本发明中涉及的序列及其编号如下所示：
89A VL氨基酸序列：SEQ ID NO.13。
89A VH氨基酸序列：SEQ ID NO.14。
72-2-C01氨基酸序列：SEQ ID NO.15。
72-2-E02氨基酸序列：SEQ ID NO.16。
110-1-H04氨基酸序列：SEQ ID NO.4。
110-1-H04的CDR1氨基酸序列：SEQ ID NO.1：SGSISSIAL。
110-1-H04的CDR2氨基酸序列：SEQ ID NO.2：SITWVGST。
110-1-H04的CDR3氨基酸序列：SEQ ID NO.3：NAPGSSG。
人IgG1 Fc氨基酸序列：SEQ ID NO.5。
所述重链抗体的氨基酸序列：SEQ ID NO.6。
所述抗紧密连接蛋白嵌合抗原受体的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示。
人CD8信号肽氨基酸序列：SEQ ID NO.8所示。
人IgG4 hinge氨基酸序列：SEQ ID NO.9。
人CD8跨膜结构域氨基酸序列：SEQ ID NO.10。
人4-1BB胞内域氨基酸序列：SEQ ID NO.11。
人CD3ζ胞内域氨基酸序列：SEQ ID NO.12。
实施例1：羊驼免疫和抗体效价测定
(1)CLDN6和CLDN9过表达细胞的构建
根据人类CLDN6(UniProt Accession：P56747)的氨基酸序列信息，构建慢病毒表达载体，感染HEK293T和CHO-S细胞，获得过表达CLDN6的细胞系293T-CLDN6和CHO-S-CLDN6，分别用于羊驼免疫、血清效价检测和抗体亲和力验证。
根据人类CLDN9(UniProt Accession：O95484)的氨基酸序列信息，构建慢病毒表达载体，感染CHO-S细胞，获得过表达CLDN9的细胞系CHO-S-CLDN9细胞，用于抗体淘选及亲和力验证。
(2)羊驼免疫和血清效价检测
采用上述构建的293T-CLDN6细胞对2只羊驼(72#和110#)进行免疫，每三周免疫一次，共免疫5次。每次免疫前采集5mL外周血，将收集有血液样本的离心管置于离心机中，800g离心10min后，将上清转移至一个新的无菌离心管中，收集免疫血清。使用PBS梯度稀释血清，在96孔板中每孔加入100μL梯度稀释的血清(对照孔以PBS代替)、2×105个CHO-S-CLDN6细胞或CHO-S细胞株。室温孵育1h后，800g离心3min，弃上清，并使用PBS洗涤3次。每孔加入100μL FITC标记的Rabbit anti-Llama IgG(H+L)抗体(1:1000稀释)。室温孵育1h后，800g离心3min，弃上清，并使用PBS洗涤3次，使用流式细胞仪检测。
结果如图1、图2、表1、表2、表3和表4所示。其中，表1为72#羊驼第三次免疫后的血清的流式检测结果(以MFI表示)；表2为72#羊驼第四次免疫后的血清的流式检测结果(以MFI表示)；表3为110#羊驼第三次免疫后的血清的流式检测结果(以MFI表示)；表4为110#羊驼第四次免疫后的血清的流式检测结果(以MFI表示)。
两头羊驼免疫前的血清与CHO-S细胞和CHO-S-CLDN6细胞孵育后在流式细胞仪中检测到的平均荧光强度(mean fluorescence intensity，MFI)相近，免疫前两头羊驼与两种细胞的结合能力相当，说明其中含有的CLDN6特异性抗体含量极低。相反，第三次和第四次免疫后的血清与CHO-S-CLDN6细胞的结合能力显著高于CHO-S细胞，说明经过多免疫后两头羊驼血清中CLDN6特异性抗体的含量显著提升，免疫成功，可用于噬菌体表面展示文库的构建。
表1
表2
表3
表4
实施例2：单域抗体噬菌体表面展示文库的构建
(1)VHH抗体片段克隆
确认两头羊驼血清中含有CLDN6特异性抗体后，采集100mL外周血，使用淋巴细胞分离液分离PBMC，提取RNA。用PrimeScriptTMII 1st Strand cDNA Synthesis Kit进行反转录，获得cDNA。以PBMC cDNA为模板，用特异性引物(上游引物结合在VHH抗体ORF的信号肽，下游引物结合在CH2区)PCR扩增羊驼重链抗体序列。使用1％的琼脂糖进行电泳分析PCR产物，回收分离分子量大小为750bp左右的目的片段(图3中A)。再以首轮PCR产物为模板，用特异性引物(上游引物结合在抗体FR1区，5’端含SfiI酶切位点GGCCCAGCCGGCC，SEQ IDNO.17；下游引物结合在抗体Hinge和FR4区，5’端含SfiI酶切位点GGCCACGAAGGCC，SEQ IDNO.18)扩增重链抗体VHH片段。使用1％的琼脂糖进行电泳分析PCR产物，回收分离分子量大小为400bp左右的目的片段(图3中B)。将目的片段保存于-80℃冻存(保存液含1/10体积3M醋酸钠，1μg/μL糖原，80％无水乙醇)。
(2)文库载体的电转化以及文库容量和多样性检测
用SfiI内切酶将噬菌体表面展示载体pComf和上述获得的VHH片段文库进行单酶切消化。用T4连接酶将线性化的pComf载体和VHH片段文库于16℃连接过夜。连接产物保存于-80℃冻存(保存液含1/10体积3M醋酸钠，1μg/μL糖原，80％无水乙醇)。将300μL上述连接产物与大肠杆菌SS320感受态细胞的混合物加入预冷电转杯中，通过电穿孔的方式将连接产物转化入大肠杆菌中(2500V，5ms)后，加入20mL SOC培养基重悬菌体，37℃摇床复苏培养1h。取菌液15mL用于后续噬菌体生产富集，其余5mL电转产物加入等体积的50％甘油，均匀混合后保存在-80℃。另外取菌液20μL用2YT培养基梯度稀释后均匀涂布在含有氨苄青霉素的LB平板上，37℃培养过夜，计算每个连接反应能够产生的克隆数，获得单域抗体噬菌表面展示体文库的容量。结果显示，从72#羊驼PBMC获得的单域抗体噬菌体表面展示文库的库容为1.33×109，从110#羊驼PBMC获得的单域抗体噬菌体表面展示文库的库容为1.18×109。挑取平板上的20个单克隆，以M13R引物进行Sanger测序，结果显示噬菌体文库序列差异大，无重复序列，多样性好。
(3)噬菌体表面展示文库的富集
取上述电转化并复苏培养后的15mL菌液，用2YT稀释调整至OD600为0.25左右，加入终浓度为100μg/mL的氨苄青霉素置于恒温摇床中，37℃摇床225rpm培养。当OD600为0.6时，加入M13KO7辅助噬菌体(加入的M13KO7辅助噬菌体体积＝10×菌液体积×OD600×5×108/M13KO7滴度)，摇匀后37℃静置30min，再于37℃摇床225rpm培养1h。辅助噬菌体完成目的菌株的侵染后，6000rpm离心10min后弃去上清，用2YT-AK培养基重悬，25℃摇床200rpm过夜培养。之后将菌液10000rpm离心15min，将含有噬菌体颗粒的上清转至新的离心管(管内加入1/5菌液体积的PEG/NaCl)，混匀后放置4℃。静置2h后，在4℃下10000rpm离心30min，收集噬菌体沉淀，用原体积1/50的PBS重悬。将重悬的噬菌体转移至1.5mL EP管中，在4℃下12000g离心5min去除不溶杂质。再将上清转移至新的1.5mL EP管，每管加入250μL的PEG/NaCl，混匀后4℃静置10min后，在4℃下12000g离心10min，弃上清。加入1mL PBS重悬后，在4℃下12000g离心5min，将上清转移至新的1.5mL EP管后，获得单域抗体噬菌体表面展示原始文库。
取10μL沉淀进行10倍梯度稀释，分别加入200μL的OD600为0.5的ER2738大肠杆菌，混匀后放于37℃水浴锅，静置10min，后涂布于LB平板。37℃过夜培养后，计数噬菌斑获得噬菌体表面展示文库的滴度。
实施例3：目的抗体库淘选
(1)第一轮淘选及产物扩增
用3％ MPBS封闭1.5mL离心管，4℃过夜后。使用CBS溶液稀释CLDN6-VLP抗原至50μg/mL，加入96孔固相板中，4℃包被过夜。取1×107CHO-S-CLDN9细胞，PBS洗涤3次，3％ PBSA重悬，于360°低速旋转混旋仪上，37℃封闭1h。同时，取150μL单域抗体噬菌体表面展示原始文库的沉淀产物，加入350μL 1％ PBSA于360°低速旋转混旋仪上，4℃封闭1h作为预混液。将封闭后的CHO-S-CLDN9细胞500g离心10min，去上清，并投入噬菌体预混液，于360°低速旋转混旋仪上4℃孵育1h，以去除与CLDN9非特异结合的噬菌体克隆。弃去96孔板中CLDN6-VLP蛋白，并加入200μL 3％ MPBS缓冲液室温静置。封闭1h后，3％ MPBS缓冲液。将CHO-S-CLDN9细胞于500g离心10min，取上清并分别加入CLDN6-VLP蛋白孔中，室温振荡孵育1h。弃去CLDN6-VLP蛋白孔中噬菌体上清，使用0.05％ PBST洗涤6次，PBS洗涤4次。每孔加入100μLpH2.2的Gly-HCl洗脱液，37℃振荡孵育8min，对特异性结合的噬菌体重复洗脱2次，获得的洗脱产物于预先封闭的离心管(封闭后PBS洗涤2次)4℃保存。
取20mL 2YT培养基，加入终浓度100μg/mL四环素和20μL大肠杆菌ER2738于37℃，225rpm培养箱中培养至OD600为0.5。向ER2738菌液中投入上述洗脱的噬菌体产物，混匀后37℃静置孵育30min，在加入20mL的2YT培养基，继续37℃下225rpm培养30min。当菌液OD600再次为0.5时，加入M13KO7辅助噬菌体(M13KO7的加入体积＝10×菌液体积×OD600×5×108/M13KO7滴度)，摇匀后37℃静置30min。向菌液中加入终浓度100μg/mL氨苄青霉素，于37℃下225rpm培养45min后，8000rpm离心20min，弃去上清并收集菌体。用40mL 2YT-AK培养基重悬，于30℃下210rpm过夜培养。将侵染、扩增过夜的噬菌体悬液转移至50mL离心管中，8000rpm，于4℃下离心30min后，将上清分装于40mL离心管。每管加入10mL PEG/NaCl，混匀后放置冰上，静置1h沉淀噬菌体后，8000rpm，4℃离心30min。弃去上清并用1mL无菌PBS重悬噬菌体，于12000g下4℃离心5min，去除不溶杂质。将1mL噬菌体悬液转移至新的1.5mL离心管中，加入250μL PEG/NaCl，混匀后4℃静置10min沉淀噬菌体。于12000g下4℃离心10min后，弃上清。用1mL PBS重悬噬菌体，于12000g下4℃离心5min，去除不溶杂质，此为第一轮淘选扩增获得的噬菌体产物。
(2)第二至第四轮淘选及产物扩增
使用CBS溶液稀释CLDN6-VLP抗原至10μg/mL，加入96孔固相板中，4℃包被过夜。用第一轮淘选扩增的噬菌体产物，以上述相同步骤进行第二至第四轮淘选，以获得特异性结合CLDN6的噬菌体文库。结果如表5和表6所示，72#羊驼单域抗体噬菌体表面展示文库第四轮和第一轮的富集指数没有显著差异，110#羊驼单域抗体噬菌体表面展示文库第四轮的富集指数比第一轮下降约27倍，说明110#羊驼单域抗体噬菌体表面展示文库可能含有更多CLDN6特异性的单域抗体克隆。表5为72#羊驼单域抗体噬菌体表面展示文库的淘选和富集结果；表6为110#羊驼单域抗体噬菌体表面展示文库的淘选和富集结果。
表5
表6
(3)单克隆噬菌体的ELISA检测和测序
用上述多轮淘选后的单域抗体噬菌体表面展示文库侵染ER2738大肠杆菌，混匀后放于37℃水浴锅，静置10min，后涂布于LB平板，37℃过夜。将2YT-A培养基以每孔200μL加入96孔深孔板，挑取平板上的单克隆，于37℃下225rpm培养过夜。将2YT-A培养基以每孔150μL加入96孔深孔板，每孔加入20μL上述过夜培养的菌液，37℃，225rpm培养至OD600约为0.5。加入M13KO7辅助噬菌体，混匀后37℃静置15min(M13KO7体积＝10×菌液体积×OD600×5×108/M13KO7滴度)后，于37℃下225rpm培养45min。3900rpm离心10min，弃去上清后，每孔用500μL 2YT-AK培养基重悬，于30℃下220rpm过夜培养。3900rpm离心10min，获得的上清即为单克隆噬菌体颗粒。
在扩增噬菌体单克隆的同时，用pH9.6的CBS包被CLDN6-VLP抗原蛋白至ELISA板(2μg/mL，100μL/孔)。4℃过夜包被后，弃去抗原，用PBST洗涤三次后，每孔加入250μL3％MPBS，4℃封闭过夜。将封闭液弃去后，每孔加入200μL 0.05％PBST洗涤4次后，加入50μL的0.1％的PBST，再一一对应加入50μL上述单克隆噬菌体上清。4℃孵育1h后，用0.05％ PBST洗涤5次。用0.05％ PBST稀释anti M13-HRP抗体(1:5000)后，每孔加入100μL，4℃孵育45min。用0.05％ PBST洗5次后，加入100μL TMB常温显色10min，再加入50μL 0.2M盐酸终止，与酶标板上读取OD450。计算样品/阴性对照的数值，选取比值显著大于阳性血清对照组的克隆进行测序，获得抗体72-2-C01、72-2-E02和110-1-H04。
实施例4：重组单域抗体的表达及与靶蛋白结合的检测
PCR扩增候选VHH的序列，并克隆至真核表达载体pcDNA3.4中，使其C端与人IgG1Fc片段融合表达。将获得的表达质粒瞬时转染至HEK293细胞后，收获的细胞培养上清中含有各重组单域抗体。以相同方式，表达获得作为阳性对照的CLDN6特异性抗体89A。
检测各重组单域抗体的结合特异性。用含有各重组单域抗体的培养上清分别与3×105个CHO-S、CHO-S-CLDN6或CHO-S-CLDN9细胞室温孵育1小时。800g室温离心5min后，弃去上清，并用PBS洗涤细胞3次。加入100μL PE标记的anti-human IgG抗体(1:500稀释)，室温避光孵育45min。800g室温离心5min后，弃去上清，并用PBS洗涤细胞3次。使用500μL PBS重悬细胞，进行流式分析。
结果如图4所示，阴性对照组的表达上清对CHO-S-CLDN6或CHO-S-CLDN9都没有显著结合；阳性对照抗体89A对CHO-S-CLDN6和CHO-S-CLDN9都有显著结合，但对CHO-S-CLDN9细胞的结合水平稍弱于CHO-S-CLDN6细胞。与阳性对照相似，72-2-C01和72-2-E02重组单域抗体对CHO-S-CLDN9细胞的结合水平稍弱于CHO-S-CLDN6细胞，说明这些抗体都能结合CLDN6，但特异性较差。相反，110-1-H04几乎不与CHO-S-CLDN9细胞结合，而与CHO-S-CLDN6细胞强结合，说明其对CLDN6的特异性高于其他抗体。
实施例5：重组抗体的纯化和半数效应浓度(EC50)测定
为测定110-1-H04抗体的EC50，将相关表达质粒瞬时转染至293F细胞，摇瓶振荡培养，以进行抗体的表达和纯化。由于目的重组抗体含有人IgG片段，可用Protein A磁珠进行亲和纯化。按顺序用30mL PBS缓冲液、0.1M氢氧化钠、PBS缓冲液分别洗涤Protein A磁珠两次。根据样品的需求量向293F细胞摇瓶中投入相应体积Protein A磁珠(按20mg IgG/mLProtein A磁珠计算)。在振荡培养箱中120rpm室温下孵育1～4h或4℃过夜。用磁选架收集Protein A磁珠并转移至50mL离心管。用30mL PBS缓冲液和去离子水各洗涤两次后，用1mL洗脱缓冲液重悬。室温下孵育5min后，用磁分离架收集磁珠，将含有目的抗体的上清液转移到15mL离心管中。对Protein A磁珠重复洗脱两次后，合并洗脱液，并加入中和缓冲液调节溶液pH。洗脱的样品用至少样品100倍体积的PBS进行透析，先在18～25℃透析2h，换液1次后再于2～8℃透析14～16h。最后测定蛋白浓度并用0.22μm无菌滤膜过滤样品并分装，-80℃冰箱保存待用。
梯度稀释目的抗体，分别与3×105个CHO-S-CLDN6和CHO-S-CLDN9室温孵育1h。800g室温离心5min，弃去含有抗体的上清后，用PBS洗涤细胞3次。加入100μL PE标记的Anti-human IgG抗体(1:500稀释)，充分混匀后，室温避光孵育45min。800g室温离心5min，去掉含有抗体的上清后，用PBS洗涤细胞3次后，用500μL PBS重悬细胞，进行流式分析。
结果如图5、图6和表7所示，表7为流式细胞术检测重组单域抗体的EC50结果。阳性对照抗体89A(表中PC)对CHO-S-CLDN6的EC50值为1.26μg/mL，110-1-H04对CHO-S-CLDN6的EC50值为5.907μg/mL；阳性对照抗体89A对CHO-S-CLDN9的EC50值为14.49μg/mL，110-1-H04对CHO-S-CLDN9的EC50值为16.19μg/mL，说明110-1-H04对CLDN9的亲和力弱于阳性对照抗体。
表7
实施例6：肿瘤细胞的CLDN6表达检测
(1)卵巢癌细胞的表达检测
阳性对照抗体A-4是结合CLDN6胞内域的抗体，而不结合CLDN9，可以有效区分CLDN6和CLDN9。用A-4抗体通过免疫组织化学技术(immunohistochemistry，IHC)检测卵巢癌细胞(分别为过表达萤火虫荧光素酶和红色荧光蛋白的OVCAR-3、SK-OV-3和CAOV-3细胞)中CLDN6的表达情况。结果如图7所示，只有OVCAR-3-Luc-mCherry细胞为CLDN6阳性，SK-OV-3-Luc-mCherry和CAOV-3-Luc-mCherry细胞为CLDN6阴性。用110-1-H04抗体分别对上述三个细胞室温孵育1h。800g室温离心5min，弃去含有抗体的上清后，用PBS洗涤细胞3次。加入100μL AF647标记的Anti-human IgG抗体，充分混匀后，室温避光孵育45min。800g室温离心5min，弃去含有抗体的上清后，用PBS洗涤细胞3次后，用200μL PBS重悬细胞，进行流式细胞分析。如图7所示，110-1-H04抗体与OVCAR-3-Luc-mCherry细胞中CLDN6靶点显著结合而不与CLDN6靶点阴性的SK-OV-3-Luc-mCherry和CAOV-3-Luc-mCherry细胞结合，说明110-1-H04抗体对肿瘤细胞中的CLDN6也有较好的亲和力和特异性。
(2)肝癌细胞的表达检测
用AF647标记的抗人CLDN6抗体与过表达萤火虫荧光素酶和红色荧光蛋白的肝癌细胞HuH-7-Luc-mCherry孵育1h。800g离心5min，弃去含有抗体的上清后，用PBS洗涤细胞3次。用200μL PBS重悬细胞，进行流式细胞分析。如图8所示，HuH-7-Luc-mCherry细胞中CLDN6显著表达，说明该肝癌细胞可用于后续功能评价实验。
实施例7：ADCC功能检测
选用HuH7-Luc-Mcherry细胞进行目的抗体ADCC功能的检测。用OptiVitro NK细胞扩增培养基清洗靶细胞三次后，以1×104/孔的密度将靶细胞接种于96孔板中过夜培养。按4:1的效靶比加入NK细胞，同时加入终浓度为5μg/mL的CLDN6阳性对照抗体89A或目的抗体110-1-H04。
用实时定量活细胞成像和分析平台IncuCyte检测。通过IncuCyte SX5软件计算各组别中靶细胞的荧光信号变化情况，信号值越低表明该组别中细胞数量越少，NK细胞杀伤效果越好。结果如图9所示，与未加入抗体的NK细胞组相比，110-1-H04抗体和阳性对照抗体均可显著提高NK细胞对肿瘤细胞的杀伤效果，且110-1-H04抗体组的杀伤增强幅度均大于阳性对照抗体组。
实施例8：基于目的抗体的CAR-T细胞的构建
(1)CAR分子的设计
本实施例中涉及的慢病毒载体的目的基因结构如图10中A所示。
BVHCN6-008由以下结构依次串联组成：人CD8信号肽(简称SP)、紧密连接蛋白抗体H04[110-1-H04，简称VHH(110-1-H04)]、人IgG4铰链区(简称IgG4 hinge)、人CD8跨膜结构域(简称CD8 TM)、人4-1BB胞内共刺激结构域(简称4-1BB ICD)、人CD3ζ胞内信号转导结构域(简称CD3ζICD)。
(2)慢病毒制备
全基因合成上述CAR分子表达序列，再通过分子克隆的方式连接到慢病毒载体pCDH-EF1α-MCS质粒中，使之在人EF-1α启动子和Kozak序列的调控下表达。用转染试剂Lipofectamine 3000，按相关说明书将上述各慢病毒载体表达质粒分别与慢病毒包装质粒pRSV-Rev、pMDLg/pRRE和pMD2.G共转染293T细胞。转染后48h收集病毒上清液，于4℃下3000rpm离心10～15min，再经0.45μm孔径的滤膜过滤，最后于4℃下25000rpm超速离心2～3h。获得的病毒浓缩液置于-80℃保存，命名为BVHCN6-008。最后，以Jurkat细胞为材料，对上述慢病毒进行活性滴度检测。
(3)CAR-T细胞制备
将健康供者的PBMC复苏于AIM V培养基中，加入25ng/mL抗CD3抗体、25ng/mL抗CD28抗体和300IU/mL重组hIL-2，置于细胞培养箱中培养24h(培养温度为37℃，二氧化碳浓度为5％)。清洗获得的T细胞，以MOI＝5TU/mL的用量加入慢病毒进行转导，同时补充25ng/mL抗CD3抗体、25ng/mL抗CD28抗体和300IU/mL重组hIL-2，置于细胞培养箱中培养(培养温度为37℃，二氧化碳浓度为5％)。24h后，将细胞密度调整至(1.5～2)×106/mL，并补充300IU/mL的hIL-2。转导后第4天，清洗细胞以去除上清中残留的慢病毒粒子，并继续置于细胞培养箱中培养5天(培养温度为37℃，二氧化碳浓度为5％)，期间保持细胞密度为(1～2)×106/mL。转导后第10天收取细胞，冻存于液氮中备用。获得的CAR-T细胞沿用相应CAR分子的命名，未用慢病毒转导的T细胞命名为Ctrl T。
(4)CAR分子的表达检测
用PBS清洗待检测的BVHCN6-008 CAR-T细胞两次，并用FACS缓冲液(含0.1％叠氮化钠和0.4％ BSA的PBS)重悬。按照抗体说明书将FITC标记的抗VHH抗体与CAR-T细胞孵育1h。随后离心去除上清，并用FACS缓冲液清洗两次，重悬。以Ctrl T细胞为阴性对照，用流式细胞仪检测BVHCN6-008细胞的CAR分子表达率。结果如图10中B所示，BVHCN6-008 CAR的表达率为61.6％。
实施例9：CAR-T细胞体内外功能研究
BVHCN6-008细胞体外杀伤实验
用培养基以1×105个/mL的密度重悬OVCAR-3-Luc-mCherry细胞，以每孔100μL的体积接种于96孔板中。置于IncuCyte SX5活细胞成像分析系统培养过夜后，按效靶比为4.5:1加入CAR-T细胞进行共培养，实时记录CAR-T细胞对肿瘤细胞的杀伤效果。共培养结束后，通过IncuCyte SX5软件计算各组别中靶细胞的mCherry荧光信号变化情况，信号值越低表明该组别中细胞数量越少，CAR-T细胞杀伤效果越好。结果如图11所示，对于CLDN6阳性的OVCAR-3-Luc-mCherry细胞，BVHCN6-008组(最后一个时间点的相对荧光面积为0.336±0.11)的杀伤效果相比于Ctrl T组(最后一个时间点的相对荧光面积为1.13±0.02)大幅提升(P<0.05)。此结果说明，以110-1-H04抗体为基础构建的CAR-T细胞对CLDN6阳性的肿瘤细胞具有很强的杀伤功能。
综上，本发明的紧密连接蛋白抗体H04对CLDN6的亲和力更高，对CLDN9的亲和力更低，即对CLDN6的特异性更高，同时其介导的抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用更好，以其为基础构建的嵌合抗原受体分子可更好地介导免疫细胞杀伤肿瘤。
申请人声明，以上所述仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，所属技术领域的技术人员应该明了，任何属于本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims (27)

1.一种紧密连接蛋白抗体H04，其特征在于，所述抗体H04为单域抗体，所述单域抗体的重链可变区序列如SEQ ID NO.4所示；
所述单域抗体的重链可变区包括CDR1、CDR2和CDR3；
所述CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；
所述CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；
所述CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
2.一种重链抗体，其特征在于，所述重链抗体包括权利要求1所述的重链可变区序列和人免疫球蛋白可结晶段Ig Fc的全长或部分氨基酸序列。
3.根据权利要求2所述的重链抗体，其特征在于，所述Ig Fc包括IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的Fc段的全长或部分序列，或其组合。
4.根据权利要求3所述的重链抗体，其特征在于，所述IgG1 Fc氨基酸序列包括SEQ IDNO.5所示。
5.根据权利要求4所述的重链抗体，其特征在于，所述重链抗体的氨基酸序列包括SEQID NO.6所示。
6.一种核酸分子，其特征在于，所述核酸分子编码权利要求1所述的紧密连接蛋白抗体H04或权利要求2-5中任一项所述的重链抗体。
7.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体含有权利要求6所述的核酸分子；并且所述表达载体在转染/转导/转化宿主细胞后，使得宿主细胞表达权利要求1所述的紧密连接蛋白抗体H04或权利要求2-5中任一项所述的重链抗体。
8.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞中含有至少一个拷贝的权利要求7所述的表达载体，或至少一个拷贝权利要求6所述的核酸分子。
9.一种用于检测紧密连接蛋白的组合物，其特征在于，所述组合物包括权利要求1所述的紧密连接蛋白抗体H04或权利要求2-5中任一项所述的重链抗体。
10.一种抗紧密连接蛋白嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体识别紧密连接蛋白，所述嵌合抗原受体由以下结构依次串联组成：信号肽、权利要求1所述的紧密连接蛋白抗体H04、铰链区、跨膜结构域、胞内共刺激结构域和人CD3胞内信号转导结构域。
11.根据权利要求10所述的抗紧密连接蛋白嵌合抗原受体，其特征在于，所述信号肽选自以下蛋白的信号肽：CD8、GM-CSF、CD4、CD28、CD137、IgG、IgE、TCRα、TCRβ，或其组合。
12.根据权利要求11所述的抗紧密连接蛋白嵌合抗原受体，其特征在于，所述信号肽的氨基酸序列包括SEQ ID NO.8所示。
13.根据权利要求10所述的抗紧密连接蛋白嵌合抗原受体，其特征在于，所述铰链区选自以下蛋白的铰链区：CD8、CD28、CD137、IgG1、IgG4、TCRα、TCRβ，或其组合。
14.根据权利要求13所述的抗紧密连接蛋白嵌合抗原受体，其特征在于，所述铰链区的氨基酸序列包括SEQ ID NO.9所示。
15.根据权利要求10所述的抗紧密连接蛋白嵌合抗原受体，其特征在于，所述跨膜结构域选自以下蛋白的跨膜结构域：CD28、CD3ε、CD3ζ、CD3γ、CD3δ、TCRα、TCRβ、CD40、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154、CD278、CD152、CD279、CD233、CD314，或其组合。
16.根据权利要求15所述的抗紧密连接蛋白嵌合抗原受体，其特征在于，所述跨膜结构域的氨基酸序列包括SEQ ID NO.10所示。
17.根据权利要求10所述的抗紧密连接蛋白嵌合抗原受体，其特征在于，所述胞内共刺激结构域选自以下蛋白的共刺激结构域：CD3ε、CD3γ、CD3δ、OX40、CD2、CD7、CD27、CD28、CD30、CD40、CD70、CD134、4-1BB、PD1、Dap10、CDS、ICAM-1、LFA-1/CD11a/CD18、ICOS、NKG2D、GITR、OX40L，或其组合。
18.根据权利要求17所述的抗紧密连接蛋白嵌合抗原受体，其特征在于，所述胞内共刺激结构域的氨基酸序列包括SEQ ID NO.11所示。
19.根据权利要求10所述的抗紧密连接蛋白嵌合抗原受体，其特征在于，所述人CD3胞内信号转导结构域选自以下蛋白：CD3ζ、CD3ε、CD3γ、CD3δ，或其组合。
20.根据权利要求19所述的抗紧密连接蛋白嵌合抗原受体，其特征在于，所述人CD3胞内信号转导结构域的氨基酸序列包括SEQ ID NO.12所示。
21.根据权利要求10所述的抗紧密连接蛋白嵌合抗原受体，其特征在于，所述抗紧密连接蛋白嵌合抗原受体的氨基酸序列包括SEQ ID NO.7所示。
22.一种核酸分子，其特征在于，所述核酸分子编码权利要求10-21中任一项所述的抗紧密连接蛋白嵌合抗原受体。
23.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体含有权利要求22所述的核酸分子；并且所述表达载体在转染/转导/转化宿主细胞后，使得宿主细胞表达权利要求10-21中任一项所述的抗紧密连接蛋白嵌合抗原受体。
24.一种表达抗紧密连接蛋白嵌合抗原受体的细胞，其特征在于，所述细胞由宿主细胞转染/转导/转化权利要求23所述的表达载体或权利要求22所述的核酸分子后得到，并且表达权利要求10-21中任一项所述的抗紧密连接蛋白嵌合抗原受体。
25.根据权利要求24所述的表达抗紧密连接蛋白嵌合抗原受体的细胞，其特征在于，所述宿主细胞包括T细胞。
26.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括权利要求24或25所述的表达抗紧密连接蛋白嵌合抗原受体的细胞。
27.权利要求1所述的紧密连接蛋白抗体H04、权利要求2-5中任一项所述的重链抗体、权利要求6所述的核酸分子、权利要求7所述的表达载体、权利要求8所述的宿主细胞、权利要求9所述的用于检测紧密连接蛋白的组合物、权利要求10-21中任一项所述的抗紧密连接蛋白嵌合抗原受体、权利要求22所述的核酸分子、权利要求23所述的表达载体、权利要求24或25所述的表达抗紧密连接蛋白嵌合抗原受体的细胞或权利要求26所述的药物组合物中任意一种或至少两种的组合在制备治疗肿瘤的药物中的应用，其特征在于，所述肿瘤为肝癌或卵巢癌。
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