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CN118742338A - 基于胶原样蛋白的海绵 - Google Patents

基于胶原样蛋白的海绵 Download PDF

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CN118742338A
CN118742338A CN202380023314.0A CN202380023314A CN118742338A CN 118742338 A CN118742338 A CN 118742338A CN 202380023314 A CN202380023314 A CN 202380023314A CN 118742338 A CN118742338 A CN 118742338A
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CN
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collagen
sponge
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cross
optionally
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M·扬纳施
S·韦伯
M·蒙特罗米拉贝特
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Evonik Operations GmbH
Original Assignee
Evonik Operations GmbH
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Abstract

本发明涉及制备基于胶原样蛋白的海绵的方法，其包括以下步骤：i)提供包含至少一种胶原样蛋白和任选存在的至少一种添加剂的水性溶液，所述水性溶液优选地具有6至8的pH值；ii)经由孵育用至少一种交联剂将所述至少一种胶原样蛋白交联，以获得水凝胶；iii)任选地，用缓冲液洗涤所述水凝胶；iv)执行冻干步骤以获得所述海绵；v)任选地加入至少一种添加剂；和vi)任选地，对获得的海绵灭菌，优选地经由等离子体、γ或UV处理对获得的海绵灭菌。此外，本发明涉及通过根据本发明的方法获得的海绵，和所述海绵的用途，其用于伤口密封、止血、伤口堵塞、愈合促进、骨再生、软骨修复、细胞培养、素食肉类或严格素食肉类的生产、对生物流体例如血液或伤口渗出物的吸收。

Description

基于胶原样蛋白的海绵
技术领域
本发明涉及制备基于胶原样蛋白的海绵的方法，其包括以下步骤：
i)提供包含至少一种胶原样蛋白和任选存在的至少一种添加剂的水性溶液；
ii)经由孵育用至少一种交联剂将所述至少一种胶原样蛋白交联，以获得水凝胶；
iii)任选地，用缓冲液洗涤所述水凝胶；
iv)执行冻干步骤以获得所述海绵；
v)任选地加入至少一种添加剂；和
vi)任选地对获得的海绵灭菌。
此外，本发明涉及通过根据本发明的方法获得的海绵，和所述海绵的用途，其用于伤口密封、止血、伤口堵塞、愈合促进、骨再生、软骨修复、细胞培养、素食肉类或严格素食肉类的生产、对生物流体例如血液或伤口渗出物的吸收。
背景技术
本发明的目的是提供衍生自动物的胶原海绵的替代物，该替代物可以用于医疗领域中，例如以用于伤口密封、止血、伤口堵塞、愈合促进、骨再生、软骨修复、细胞培养、或对生物流体例如血液或伤口渗出物的吸收。当被应用于医疗应用中时，替代海绵应至少具有类似的特性，并且另外避免衍生自动物胶原的海绵的挑战和问题，例如过敏或不耐受。
另外，动物胶原在水中表现出差的溶解性，并且在乙酸或盐酸中形成粘稠溶液。通过首先冷冻干燥所述粘稠溶液，然后交联经冷冻干燥的材料，实现了交联剂溶液与蛋白质网络的直接接触(固-液稳定化)。该程序比交联剂通过粘稠溶液的扩散更快。然而，因为经干燥的蛋白质部分地重新进入溶液，所以所述经冷冻干燥的材料的初始网络结构不能被有效地保存。最终，在交联经冷冻干燥的材料之后，交联产物再次处于湿润状态并需要进一步的冷冻干燥步骤。
在这点上，本发明的发明人发现了，根据本发明的基于胶原样蛋白的海绵不仅可以克服上述问题中的一个或多个，而且获得的海绵在与液体接触之后与基于衍生自动物的胶原的海绵相比还出人意料地显示出改善的形式稳定性。此外，根据本发明的海绵显示出改善的刚度、杨氏模量性质以及开孔孔隙率。此外，鉴于用于衍生自动物胶原的海绵的“常见”方法，本发明的方法通过需要更少的方法步骤而也得到了改善。
发明内容
因此，在第一方面，本发明涉及制备基于胶原样蛋白的海绵的方法，其包括以下步骤：
i)提供包含至少一种胶原样蛋白和任选存在的至少一种添加剂的水性溶液；
ii)经由孵育用至少一种交联剂将所述至少一种胶原样蛋白交联，以获得水凝胶；
iii)任选地，用缓冲液洗涤所述水凝胶；
iv)执行冻干步骤以获得所述海绵；
v)任选地加入至少一种添加剂；和
vi)任选地，对获得的海绵灭菌，优选地经由等离子体、γ或UV处理对获得的海绵灭菌。
在第二方面，本发明涉及通过根据本发明的方法获得的海绵。
最后，在第三方面，本发明涉及根据本发明的海绵的用途，其用于伤口密封、止血、伤口堵塞、愈合促进、骨再生、软骨修复、细胞培养、素食肉类或严格素食肉类的生产、对生物流体例如血液或伤口渗出物的吸收。
附图说明
图1对用不同交联技术和浓度制成的海绵表征了流体吸收率。在磷酸盐缓冲盐水中孵育24h之后，通过相对于干重的湿重测量值来计算流体吸收率。作为衍生自动物的胶原的参考，比较了由大鼠尾胶原(5mg/ml)制成的海绵和由重组胶原样蛋白(rCol；10mg/ml)制成的海绵。所有分析均以技术上的一式三份(n＝3)进行。
图2在磷酸盐缓冲盐水中浸没24h之前和之后，评估了海绵的直径。应用所获得的值以计算相对直径变化率。因此，对由胶原样蛋白(rCol；10、20和40mg/ml)制成的海绵和由大鼠尾胶原(5mg/ml)制成的海绵的溶胀或收缩的评估是可行的。对所有实验组均应用了技术上的一式三份(n＝3)。
图3通过对衍生自冷冻横截面的扫描电子显微镜图像的分析，测量了孔径。取决于海绵的结构和所得的测量尺寸的可行性，捕获了至少8至27个孔(n≥8)。
图4使用乙醇，通过液体置换法评估了由胶原样蛋白(rCol；10和40mg/ml)或由大鼠尾胶原(5mg/ml)制成的海绵的总孔隙率。所有实验组以技术上的一式三份(n＝3)来分析。
图5定量了开孔孔隙率以表征由胶原样蛋白(rCol；10和40mg/ml)制成的海绵或由大鼠尾胶原(5mg/ml)制成的海绵的表面结构。以技术上的一式三份(n＝3)进行了分析。
图6通过机械测试装置压缩了由胶原样蛋白(rCol；20mg/ml)制成的海绵和商业参考Lyostypt(B.Braun)。应用了记录的应力-应变相关性以导出杨氏模量。杨氏模量的平均值衍生自至少三个独立的压缩循环(n≥3)。
图7为了评估湿润条件下的杨氏模量，将由胶原样蛋白(rCol，20mg/ml)制成的相应海绵在磷酸盐缓冲盐水中孵育了24h。此后，压缩了所述海绵以从应力-应变相关性导出杨氏模量。由至少一式三份(n≥3)计算了平均值。
图8为了首次比较胶原来源与行为，评估了用棒状杆菌属的胶原样蛋白(20mg/ml)制成的海绵的流体吸收率。用由0.5ml的水凝胶制成的海绵进行了分析。所有计算均衍生自技术上的一式三份(n＝3)。
具体实施方式
以“x至y”的形式指示的数值范围也包括所述值。如果以这种形式指示了几个优选的数值范围，则不言而喻的是，还包括由各种端点的组合产生的所有范围。
如本文中使用的“一个(种)或多个(种)”涉及至少一个(种)，并包括1、2、3、4、5、6、7、8、9或更多个(种)所提及的物种。类似地，“至少一个(种)”意指一个(种)或多个(种)，即1、2、3、4、5、6、7、8、9或更多个(种)。如本文中使用的关于任何组分的“至少一种”是指化学上不同的分子的数量，即所提及物质(species)的不同类型的数量，但不是分子的总数。例如，“至少一种表面活性剂”意指使用至少一种类型的落入表面活性剂限定内的分子，但也可以存在两种或更多种不同类型的落入该限定内的表面活性剂，但并不意指仅存在一种类型的表面活性剂的一个或多个分子。
如果没有另外明确说明，则本文中给出的关于组合物或配制物的所有百分比涉及相对于相应组合物的总重量的wt.-％。
根据本发明的关于化合物的“基本上不含”意指该化合物只能以不影响该组合物特性的量存在，特别是相应化合物以基于该组合物的总重量计小于3wt.-％存在，优选地以小于1wt.-％存在，更优选地以小于0.01wt.-％存在，或根本不存在。
使用聚苯乙烯标准物，通过GPC可以确定重均分子量Mw和数均分子量Mn。
因此，在第一方面，本发明涉及制备基于胶原样蛋白的海绵的方法，其包括以下步骤或由以下步骤组成：
i)提供包含至少一种胶原样蛋白和任选存在的至少一种添加剂的水性溶液，所述水性溶液优选地具有6至8的pH值，优选地6.8至7.4的pH值；
ii)经由孵育用至少一种交联剂将所述至少一种胶原样蛋白交联，以获得水凝胶；
iii)任选地，用缓冲液洗涤所述水凝胶；
iv)执行冻干步骤以获得所述海绵；
v)任选地加入至少一种添加剂；和
vi)任选地，对获得的海绵灭菌，优选地经由等离子体、γ或UV处理对获得的海绵灭菌。
在第二方面，本发明涉及通过根据本发明的方法获得的海绵。
最后，在第三方面，本发明涉及根据本发明的海绵的用途，其用于伤口密封、止血、伤口堵塞、愈合促进、骨再生、软骨修复、细胞培养、素食肉类或严格素食肉类的生产、对生物流体例如血液或伤口渗出物的吸收。
通过研究以下详细描述和权利要求，本发明的这些和其他方面、实施方案、特征和优点对于本领域技术人员将变得明显。来自本发明的一个方面的任何特征可用于本发明的任何其他方面中。此外，将容易理解的是，本文中含有的实施例旨在描述和说明本发明，而不是限制本发明，并且特别地，本发明不限于这些实施例。
在所述方法中，使用至少一种胶原样蛋白。通常，所有胶原样蛋白均是合适的。
在本发明的一个优选的实施方案中，所述胶原样蛋白是来自酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)的胶原样蛋白，它优选地是来自酿脓链球菌的Scl2蛋白。
在若干体系包括大肠杆菌(Escherichia col)和酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)中，已经尝试了胶原样蛋白的表达。
在一个实施方案中，所述至少一种胶原样蛋白是细菌胶原样蛋白，所述细菌胶原样蛋白优选地是通过在毕赤酵母属(Pichia)、短芽孢杆菌属(Brevibacillus)、芽孢杆菌属(Bacillus)、埃希氏菌属(Escherichia)或棒状杆菌属(Corynebacterium)，优选地在巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、桥石短芽孢杆菌(Brevibacillus choshinensis)或谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)中的发酵而产生的。
在一个优选的实施方案中，所述胶原样蛋白可在棒状杆菌属中被表达，优选地在谷氨酸棒状杆菌中被表达。
一种特别合适的胶原样蛋白可衍生自以下多核苷酸。
编码与SEQ ID NO：1的氨基酸序列至少≥60％相同的氨基酸序列的多核苷酸，其中所述多核苷酸是编码胶原样蛋白的可复制的多核苷酸，并且其中所述氨基酸序列包含在SEQ ID NO：1的氨基酸序列的N末端处的至少38个氨基酸的缺失。
优选的是，所述氨基酸序列包含在SEQ ID NO：1的氨基酸序列的N末端处的38至74个氨基酸的缺失。这包括N末端V结构域(包含74个氨基酸)的完全缺失和至少38个氨基酸的V结构域的不同截短。
在一个优选的实施方案中，所述氨基酸序列与SEQ ID NO：1、SEQ IDNO：2、SEQ IDNO：3或SEQ ID NO：4的氨基酸序列至少≥60％相同。
在一个另外的构型中，所述氨基酸序列与SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3或SEQ IDNO：4的氨基酸序列至少≥65％、或≥70％、或≥75％、或≥80％、或≥85％相同。
在一个优选的构型中，所述多核苷酸编码与SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3或SEQ IDNO：4的氨基酸序列至少≥90％、≥92％、≥94％、≥96％、≥97％、≥98％、≥99％或100％相同的氨基酸序列，优选地≥97％，特别优选地≥98％，非常特别优选地≥99％，极其优选地100％相同的氨基酸序列。
在本发明的一个优选的实施方案中，所述多核苷酸是编码来自酿脓链球菌的胶原样蛋白的可复制的核苷酸序列。
包含此类序列并编码SEQ ID NO：1至4的多肽变体的多核苷酸和核酸分子也是合适的，所述多肽变体含有一个或多个插入或缺失。优选地，所述多肽含有最多5个、最多4个、最多3个或最多2个氨基酸的插入或缺失。
也可以使用多肽的混合物，所述多肽的混合物包含SEQ ID NO：1至4的多肽变体中的一种和SEQ ID NO：5至12的胶原样蛋白的截短变体中的一种或多种。
质粒和载体是合适的，所述质粒和载体包含根据本发明的核苷酸序列并且任选地在毕赤酵母属、棒状杆菌属、假单胞菌属(Pseudomonas)或埃希氏菌属的微生物中复制。在一个优选的构型中，包含根据本发明的核苷酸序列的载体适合用于在巴斯德毕赤酵母属的酵母中的复制。
包含根据本发明的多核苷酸、载体和多肽的毕赤酵母属、棒状杆菌属、假单胞菌属或埃希氏菌属的微生物也是合适的。优选的微生物是巴斯德毕赤酵母、桥石短芽孢杆菌或谷氨酸棒状杆菌。
包含根据本发明的任何核苷酸序列、根据本发明的任何多肽或任何载体的巴斯德毕赤酵母、大肠杆菌、恶臭假单胞菌(P.putida)或谷氨酸棒状杆菌(C.glutamicum)物种的微生物是合适的。
所述微生物可以是这样的微生物，在所述微生物中核苷酸序列以过表达形式存在。
根据本发明的过表达通常意指，相比于起始菌株(亲本菌株)或野生型菌株，如果这是起始菌株，核糖核酸、蛋白质(多肽)或酶的细胞内浓度或活性的增大。起始菌株(亲本菌株)意指这样的菌株，对该菌株进行了导致过表达的措施。
在过表达中，重组过表达的方法是优选的。这些包括使用体外提供的DNA分子产生微生物的所有方法。此类DNA分子包括，例如启动子、表达盒、基因、等位基因、编码区域等。这些通过转化、缀合(conjugation)法、转导法或类似方法被转换(convert)至需要的微生物中。
通过测量由基因转录的mRNA的量，通过确定多肽的量，和通过确定酶活性，可以确立表达或过表达的程度。
细菌胶原样蛋白可以在发酵方法中获得，所述发酵方法包括以下步骤：
a)在培养基中发酵根据本发明的微生物，
b)在所述培养基中积累细菌胶原样蛋白，其中获得发酵液。
待使用的培养基或发酵培养基必须适当地满足相应菌株的需求。在美国细菌学学会的手册“普通细菌学方法手册(Manual of Methods for General Bacteriology)”(Washington D.C，USA，1981)中包含各种微生物的培养基的描述。术语“培养基(culturemedium)”和术语“发酵培养基”或“培养基(medium)”是相互可互换的。
可以使用以下作为碳源：糖类和碳水化合物，例如葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麦芽糖、糖蜜、来自甜菜糖或甘蔗加工的含蔗糖溶液、淀粉、淀粉水解物和纤维素；油和脂肪，例如大豆油、向日葵油、花生油和椰子脂(coconut fat)；脂肪酸，例如棕榈酸、硬脂酸和亚油酸；醇，例如甘油、甲醇和乙醇；和有机酸，例如乙酸或乳酸。
可以使用以下作为氮源：有机氮化合物，例如蛋白胨、酵母提取物、肉提取物、麦芽提取物、玉米浆、豆粕和脲；或无机化合物，例如硫酸铵、氯化铵、磷酸铵、碳酸铵和硝酸铵。所述氮源可以单独使用，或可以作为混合物使用。
可以使用以下作为磷源：磷酸、磷酸二氢钾或磷酸氢二钾，或相应的含钠盐。
另外，培养基必须含有生长所必需的盐，例如以金属诸如钠、钾、镁、钙和铁的氯化物或硫酸盐的形式的盐，例如硫酸镁或硫酸铁。最后，除了上述物质之外，还可以使用必需的生长物质，例如氨基酸，诸如高丝氨酸，和维生素，诸如硫胺素、生物素或泛酸。
可以将所述起始材料以单一批次的形式加入至培养物中，或在培养期间以合适的方式供应。
以合适的方式使用碱性化合物例如氢氧化钠、氢氧化钾、氨或氨水，或酸性化合物例如磷酸或硫酸，以用于培养物的pH控制。通常将该pH调节至6.0至8.5，优选地6.5至8。为了泡沫进展(development)的控制，可以使用消泡剂，例如脂肪酸的聚乙二醇酯。为了维持质粒的稳定性，可以向培养基中加入合适的选择性作用物质，例如抗生素。发酵优选地在有氧条件下进行。为了维持所述有氧条件，将氧气或含氧气体混合物例如空气引入至所述培养物中。同样可以使用富含过氧化氢的液体。任选地，发酵在超大气压(superatmosphericpressure)下进行，例如在0.03至0.2MPa的超大气压下进行。培养的温度通常为20℃至45℃，优选地是25℃至40℃，特别优选地是30℃至37℃。在分批法或补料分批法的情况下，优选地继续培养直至已形成足够的量以用于获得需要的有机化学化合物的措施。该目标通常在10小时至160小时内达到。在连续法中，更长的培养时间是可能的。由于微生物的活性，因此发生精细化学品在该微生物的发酵培养基中和/或在该微生物的细胞中的富集(积累)。
合适的发酵培养基的实例可被找到，特别可在专利文献US 5,770,409、US 5,990,350、US 5,275,940、WO 2007/012078、US 5,827,698、WO 2009/043803、US 5,756,345或US7,138,266中找到；可以任选地根据所用菌株的要求进行适当的修改。
该方法的特征在于，它是选自分批法、补料分批法、重复补料分批法和连续法的方法。
该方法的特征另外可以在于，由含精细化学品的发酵液获得精细化学品、或液体、或固体的含精细化学品的产物。
基于用微生物的方法或发酵方法，在所述微生物中存在根据本发明的启动子变体，就选自浓度(每体积形成的化合物)、转化率(每消耗的碳源所形成的化合物)、体积生产率(每体积和时间形成的化合物)和生物质特定生产率(每细胞干质量或生物干质量和时间所形成的化合物，或每细胞蛋白和时间所形成的化合物)或其它方法参数、和它们的组合的参数中的一个或多个而言，根据本发明的方法或发酵方法的性能提高至少0.5％、至少1％、至少1.5％或至少2％。
由于发酵的措施，获得含有需要的胶原样蛋白的发酵液，优选地获得含有需要的胶原样蛋白和氨基酸或有机酸的发酵液。
然后，提供或生产或获得含有胶原样蛋白的以液体或固体形式的产物。
在一个优选的实施方案中，发酵液意指这样的发酵培养基或营养培养基，在所述发酵培养基或营养培养基中微生物在特定的温度下培养了特定的时间。发酵培养基、或发酵期间使用的培养基含有确保需要的胶原样蛋白的生产且通常确保生长和/或活力的所有物质或组分。
在发酵完成时，所得发酵液相应地含有：
a)由微生物细胞生长产生的微生物的生物质(细胞团(cell mass))，
b)在发酵的过程中形成的期望的胶原样蛋白，
c)在发酵的过程中可能形成的有机副产物，和
d)未被发酵消耗的所使用的发酵培养基的组分或起始材料的组分，例如维生素诸如生物素，或盐诸如硫酸镁。
除了相应的需要的化合物之外，有机副产物还包括由发酵中使用的微生物生成并可能分泌的物质。
将发酵液从培养器皿或发酵容器中取出，任选地收集，并用于提供含有胶原样蛋白的以液体或固体形式的产物。表述“获得含胶原样蛋白的产物”也用于此。在最简单的情况下，从发酵容器中取出的含胶原样蛋白的发酵液本身就是所获得的产物。
通过选自以下的一种或多种措施：
a)对水的部分去除(＞0％至＜80％)至完全去除(100％)或几乎完全去除(≥80％、≥90％、≥95％、≥96％、≥97％、≥98％、≥99％)，
b)对生物质的部分去除(＞0％至＜80％)至完全去除(100％)或几乎完全去除(≥80％、≥90％、≥95％、≥96％、≥97％、≥98％、≥99％)，其中在该去除之前任选地将该生物质灭活，
c)对在发酵的过程中形成的有机副产物的部分去除(＞0％至＜80％)至完全去除(100％)或几乎完全去除(≥80％、≥90％、≥95％、≥96％、≥97％、≥98％、≥99％、≥99.3％、≥99.7％)，和
d)对未被发酵消耗的所使用的发酵培养基的组分或起始材料的组分的部分去除(＞0％)至完全去除(100％)或几乎完全去除(≥80％、≥90％、≥95％、≥96％、≥97％、≥98％、≥99％、≥99.3％、≥99.7％)，
从发酵液中实现需要的胶原样蛋白的浓缩或纯化。以这种方式，分离出具有需要含量的所述化合物的产物。
对水的部分去除(＞0％至＜80％)至完全去除(100％)或几乎完全去除(≥80％至＜100％)(措施a))也称为干燥。
在该方法的一个变体中，通过对水、生物质、有机副产物和所使用发酵培养基中的未消耗组分的完全或几乎完全去除，成功地获得纯(≥80重量％、≥90重量％)或高纯度(≥95重量％、≥97重量％、≥99重量％)产物形式的需要的胶原样蛋白，优选地是细菌胶原样蛋白。对于根据a)、b)、c)或d)的措施，在现有技术中可获得多种技术说明。
在用于生产细菌胶原样蛋白的方法的情况下，优选这样的方法，其中获得不含有发酵液的任何组分的产物。这些产物特别用于人类医学中，用于制药工业中，且用于食品工业中。
在所述方法中，胶原样蛋白可以优选地以2.5至100mg/ml的浓度范围存在于所述水性溶液中。
在所述方法中，使用至少一种交联剂，其经由孵育与所述至少一种胶原样蛋白发生反应，以形成所述水凝胶。
通常，在胶原和胶原样蛋白的领域中使用的所有交联剂均是合适的。
在一个实施方案中，至少一种交联剂具有至少两个官能团，所述至少两个官能团能够与所述至少一种胶原样蛋白的官能团发生反应。
在一个实施方案中，至少一种交联剂优选地选自包含至少两个琥珀酰亚胺基的交联剂、4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基-吗啉氮鎓(morpholinium)氯化物(DMTMM)、戊二醛、转谷氨酰胺酶、二异氰酸酯、或1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)与N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的组合。在一个优选的实施方案中，所述至少一种交联剂选自包含至少两个琥珀酰亚胺基的交联剂、4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基-吗啉氮鎓氯化物(DMTMM)、转谷氨酰胺酶、二异氰酸酯、或1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)与N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的组合。
在一个优选的实施方案中，至少一种交联剂具有以下式(I)或式(II)中的一个：
其中：
R1是具有至多12个碳原子的线性或枝化的烷基，优选地具有至多8个碳原子，更优选地具有5个碳原子的线性或枝化的烷基；
Alk是-CH2-、-CH2-CH2-或-CH2-CH2-CH2-，优选地是-CH2-CH2-；
n是1至1350的整数，优选地是50至1000，更优选地125至660的整数；
R2是-CH2-、-C2H4-NH-(C＝O)-C3H6-、-C2H4-O-、-C2H4-O-(C＝O)-C3H6-、-C2H4-NH-(C＝O)-C2H4-或-C2H4-O-(C＝O)-C2H4-；
m是2至8的整数，优选地是4至8的整数，更优选地是4；
或
其中，
Alk是-CH2-、-CH2-CH2-或-CH2-CH2-CH2-，优选地是-CH2-CH2-；和
n是1至1350的整数，优选地是50至1000，更优选地125至660的整数。
在一个实施方案中，交联剂具有下式(III)：
其中，
R1是具有至多12个碳原子的线性或枝化的烷基，优选地具有至多8个碳原子，更优选地具有5个碳原子的线性或枝化的烷基，最优选地为：
Alk是-CH2-、-CH2-CH2-或-CH2-CH2-CH2-，优选地是-CH2-CH2-；
n是1至1350的整数，优选地是50至1000，更优选地125至660的整数；
m是2至8的整数，优选地是4至8的整数，最优选地是4。
在一个实施方案中，交联剂具有1,000至60,000克/摩尔的分子量，优选地具有2,000至40,000克/摩尔的分子量。
在一个实施方案中，在具有6至8的pH值，优选地具有6.8至7.4的pH值的水性溶液中提供至少一种交联剂。
在一个实施方案中，彼此发生反应的所述至少一种胶原样蛋白的官能团与所述至少一种交联剂的官能团是以1∶0.01至1∶5的比率存在的。
在根据本发明的方法中，可以任选地存在至少一种添加剂。所述至少一种添加剂可以存在于步骤i)和/或步骤v)中。如果在步骤i)和v)二者中均加入添加剂，则可以加入相同的添加剂或不同的添加剂。
在一个实施方案中，所述至少一种添加剂是生长因子，例如成纤维细胞生长因子、表皮生长因子、神经生长因子或结缔组织生长因子或重组人骨形态发生蛋白。
在一个实施方案中，所述至少一种添加剂选自凝血酶、纤维蛋白原、壳聚糖、硅酸前体、肝素、衍生自肝素的低聚糖类、透明质酸和糖胺聚糖。
在所述方法的一个实施方案中，孵育执行5分钟至48h，和/或在4至37℃执行。
在所述方法的一个实施方案中，缓冲液具有5.5至8.2的pH值，和/或选自2-[4-(2-羟乙基)哌嗪-1-基]乙烷-1-磺酸缓冲液、2-吗啉-4-基乙烷磺酸缓冲液和磷酸盐缓冲盐水。
在所述方法的一个实施方案中，冻干步骤在-40至-60℃执行；和/或在执行该冻干步骤之前，将获得的水凝胶冷却至-20至-80℃。
通过执行根据本发明的方法，获得海绵。
在一个实施方案中，基于海绵的总干重，海绵具有800％至3000％的吸水能力。
在一个实施方案中，海绵具有15至300μm的孔径。
在一个实施方案中，海绵具有75％至99％的总孔隙率，和20％至85％的开孔孔隙率。
在一个实施方案中，海绵在干燥形式下具有45至250kPa的杨氏模量。
在一个实施方案中，海绵在湿润形式下具有4至35kPa的杨氏模量。
如实施例部分中所述来确定海绵的上述特性。
本发明的海绵可用于伤口密封、止血、伤口堵塞、愈合促进、骨再生、软骨修复、细胞培养、素食肉类或严格素食肉类的生产、对生物流体例如血液或伤口渗出物的吸收。
蛋白序列
SEQ ID NO：1酿脓链霉菌胶原样蛋白(CLP)，全长蛋白
SEQ ID NO：2 酿脓链霉菌CLP，截短3
SEQ ID NO：3 酿脓链霉菌CLP，截短5
SEQ ID NO：4酿脓链霉菌CLP，无V结构域
实施例
在实施例中，胶原样蛋白根据以下方法来获得，并且也被称为“rCol”。
胶原样蛋白的生产
通过发酵，在不同宿主细胞中产生了细菌胶原样蛋白。
为了在巴斯德毕赤酵母中产生来自酿脓链霉菌(Streptomyces pyogenes)的Scl2，使用不同算法已经对编码胶原样蛋白的基因scl2的胶原结构域的序列进行了密码子优化，并将所述序列克隆在巴斯德毕赤酵母的分泌载体中，并遵循标准方案将所述序列转化在巴斯德毕赤酵母中，随后以补料分批模式应用标准表达方案，在细胞培养物的上清液中检测了对应于Scl2p的蛋白。(Damasceno,L.M.,Huang,CJ.&Batt,C.A.Proteinsecretion in Pichia pastoris and advances in protein production.ApplMicrobiol Biotechnol 93,31–39(2012))。
发酵后，上清液经由离心(12000g，室温下5分钟)与生物质分离。
在类似条件下使用大肠杆菌或谷氨酸棒状杆菌，可以产生蛋白。在酵母或谷氨酸棒状杆菌中生产的情况下，CL单链是由所述细胞分泌。在该方式中，不需要细胞裂解作为初始纯化步骤。在大肠杆菌中生产的情况下，细胞裂解是强制性的，以从所述细胞中取出产物。
也在桥石短芽孢杆菌中表达了全长胶原样蛋白、截短变体(截短3)和无V结构域变体(基于来自酿脓链霉菌的基因scl2)。因此，将相应的DNA序列克隆至用于桥石短芽孢杆菌的合适的分泌载体中。根据Mizukami等人2010(Curr Pharm Biotechnol 2010,13:151-258)，用新构建的质粒完成了桥石短芽孢杆菌的转化。
使用来自Eppendorf(Hamburg，德国)的平行生物反应器系统，在33℃和pH 7下的分批培养中，分析了桥石短芽孢杆菌菌株的产生不同胶原蛋白的能力。使用1L反应器进行了发酵。生产培养基(TM培养基，Biomed Res Int 2017,2017:5479762)含有10g/L的葡萄糖。发酵后，上清液通过离心已经与生物质分离，并被用于SDS PAGE分析。对于所有三种变体，均产生了胶原样蛋白。
也在谷氨酸棒状杆菌中表达了全长胶原样蛋白和无V结构域变体(基于来自酿脓链霉菌的基因scl2)。因此，将相应的DNA序列与位于上游的用于蛋白分泌的信号肽一起克隆至谷氨酸棒状杆菌的穿梭载体中(Biotechnology Techniques 1999,13:437-441)。通过如由Ruan等人(Biotechnology Letters2015,37:2445–2452)所述的电穿孔，用新构建的质粒转化了谷氨酸棒状杆菌菌株ATCC 13032。
使用来自Eppendorf(Hamburg，德国)的平行生物反应器系统，在30℃和pH 7下的补料分批培养中，分析了谷氨酸棒状杆菌菌株的产生不同胶原蛋白的能力。使用1L反应器进行了发酵。在分批阶段中，生产培养基含有20g/L的葡萄糖，并且以4g/L*h的葡萄糖进料运行了补料分批阶段。发酵后，上清液通过离心已经与生物质分离，并被用于HPLC分析。对于这两种变体，均产生了胶原蛋白。对于胶原样蛋白的截短变体，产物效价高于全长变体。
在细胞分离(经由离心)和细菌胶原样蛋白折叠(经由浓缩物的冷却)之后，用15v％的2-丙醇使用沉淀纯化了细菌胶原样蛋白。在Scl2蛋白的沉淀之后，执行了离心。将沉淀物(pellet)溶解在水中，在40℃展开了三螺旋Scl2蛋白，并将其过滤通过100kD膜。该步骤用于去除大尺寸杂质。然后，在连续的10kD过滤中浓缩了收集的渗透物。洗涤了渗余物以去除小尺寸杂质。
通过这种方式，实现了三螺旋Scl2蛋白纯度＞75w％。
在比较例中，使用衍生自动物的胶原，即大鼠尾胶原，其从Sigma Aldrich以产品编号C7661商业可获得，并且该胶原也称为“rtCol”。
实施例1：由用EDC/NHS交联的胶原样蛋白制成的海绵
通过用1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)将胶原样蛋白交联，随后冻干得到的水凝胶，制备了海绵。该技术是基于EDC与胶原的氨基酸的碳氢酸(carbon acid)侧链例如天冬氨酸和谷氨酸的反应，形成活性酯。偶联的EDC被NHS替代，提高交联效率，并减少非特异性副反应。得到的NHS酯又与胶原的赖氨酸侧链的伯胺反应。因此，若干胶原分子共价地连接以形成三维蛋白支架。
这里，10、20和40mg/ml的最终浓度的胶原样蛋白被交联，其中胶原的羧基侧链与交联剂的摩尔比为1∶1∶1。以等摩尔比交联了5mg/ml的浓度的大鼠尾胶原，以比较胶原样蛋白与衍生自动物的参考胶原。
对于初级凝胶化，需要以下试剂和溶液：
a.在超纯H2O中溶解的100mg/ml的胶原样蛋白
b.在0.1％的乙酸中溶解的6.3mg/ml的大鼠尾胶原(Sigma Aldrich，产品编号C7661)
c.1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC*HCl；Roth，产品编号2156.2)
对于1532.4mM储备溶液，在超纯H2O中制备294mg/ml
对于244.6mM储备溶液，在超纯H2O中溶解46.9mg/ml
d.N-羟基琥珀酰亚胺(NHS；Sigma Aldrich，产品编号130672)
对于1532.4mM溶液，在超纯H2O中溶解176mg/ml
对于244.6mM溶液，在超纯H2O中制备28.2mg/ml
c.对于0.1M洗涤溶液，将1.4g的磷酸氢二钠(Na2HPO4；Merck，产品编号#1.06586)溶解在100ml的超纯H2O中
d.ddH2O
详细地，在超纯水中制备了100mg/ml的胶原样蛋白储备溶液，并通过以450rpm的速度轨道式振荡将其均匀化过夜。在相同条件下，将大鼠尾胶原以6.3mg/ml的浓度溶解在0.1％的乙酸中。在进一步加工之前，通过在250×g0下离心至少5分钟，去除了存在的留在胶原储备溶液中的气泡。在使用当天，在超纯水中新鲜制备了EDC*HCl交联剂溶液和NHS交联剂溶液(应用的浓度被描述于表1至4中)，并通过涡旋将其均匀地溶解。用各自量的水稀释了胶原储备溶液，随后加入EDC*HCl储备溶液和NHS储备溶液(对于移液方案，参见表1至4)以最终获得凝胶化配制物。从该混合物中，将1ml的体积填充在24孔硅酮模具中，这导致每个海绵的填充高度为5mm。
表1：用于海绵的移液方案，所述海绵由具有10、20、40mg/ml的浓度的胶原样蛋白(rCol)制成且以1∶1∶1的胶原的羧基与EDC和NHS的摩尔比交联。
最终浓度 单位 储备溶液 稀释倍数 体积[μl]
rCol 10 mg/ml 100 10 100
EDC*HCl 15 mM 1532.4 100 10
NHS 15 mM 1532.4 100 10
H2O 不适用 不适用 不适用 不适用 880
最终浓度 单位 储备溶液 稀释倍数 体积[μl]
rCol 20 mg/ml 100 5 200
EDC*HCl 31 mM 1532.4 50 20
NHS 31 mM 1532.4 50 20
H2O 不适用 不适用 不适用 不适用 760
最终浓度 单位 储备溶液 稀释倍数 体积[μl]
rCol 40 mg/ml 100 2,5 400
EDC*HCl 61 mM 1532.4 25 40
NHS 61 mM 1532.4 25 40
H2O 不适用 不适用 不适用 不适用 520
表2：用于海绵的移液方案，所述海绵由具有5mg/ml的浓度的大鼠尾胶原(rtCol)制成且以1∶1∶1的胶原的羧基与EDC和NHS的摩尔比交联。
最终浓度 单位 储备溶液 稀释倍数 体积[μl]
rtCol 5 mg/ml 6,3 1.25 800
EDC*HCl 5 mM 244.6 50 20
NHS 5 mM 244.6 50 20
H2O 不适用 不适用 不适用 不适用 160
在约2小时之后，用石蜡封口膜(parafilm)覆盖了新形成的水凝胶，以防止变干。为了完全凝胶化，将该水凝胶在室温下储存过夜。随后，通过用0.1M的Na2HPO4洗涤1小时，将胶原的剩余活化基团失活。随后，用超纯水洗涤了所述水凝胶一小时三次和一次过夜洗涤，伴随着以200rpm的速度轨道式振荡。在洗涤之后，使用Christ LSC Plus真空干燥机冻干了所述水凝胶。应用了针对胶原样品限定的过程(详情参见表5)。首先，以-1℃/分钟的速度将所述水凝胶冷冻至-45℃。然后，在0.07毫巴的真空下，和在-30℃的起始温度，随后将所述温度升高至20℃，将冷冻的水凝胶干燥。
表5：应用于通过冻干水凝胶制成的海绵的干燥过程。
温度[℃] 压力[毫巴] 时间[h]
上样 15 - -
冷冻 15 - 0.5
-45 - 1.0
-45 - 2.0
主要干燥 -45 0.07 1.0
-30 0.07 1.0
-30 0.07 5.0
-25 0.07 5.0
-20 0.07 5.0
-15 0.07 5.0
-10 0.07 5.0
-5 0.07 5.0
0 0.07 2.0
5 0.07 2.0
最终干燥 20 0.001 1.0
20 0.001 1.0
实施例2：由用4-臂-PEG-SG交联的胶原样蛋白制成的海绵
通过用4-臂-PEG-SG交联胶原样蛋白，制造了胶原海绵。应用的交联剂是多臂PEG衍生物，所述多臂PEG衍生物具有季戊四醇核心和四个末端N-羟基琥珀酰亚胺基部分(N-Hydroxysuccimidyl moieties)(NHS)。在取代反应中，那些NHS基团被由伯胺与胶原的赖氨酸侧链形成的稳定的酰胺键替代。通过连接若干胶原分子，发生凝胶化。随后，将得到的水凝胶冻干以获得海绵。
为了比较不同的交联技术，如实施例1中所述，用胶原样蛋白(10、20和40mg/ml)以及用大鼠尾胶原(5mg/ml)，制备了海绵。在该实施例中，应用了1∶0.05的胶原的赖氨酸残基与4-臂-PEG-SG的摩尔比。此外，测试了具有不同核心尺寸单元的两种4-臂-PEG-SG衍生物，导致10kDa或40kDa的总质量。
除了实施例1中提及的胶原溶液之外，还需要以下试剂：
a.4-臂PEG琥珀酰亚胺基戊二酸酯(4-臂-PEG-SG)
10kDa衍生物(JenKem Technology USA，产品编号A7031-1/4ARM-SG-10K，M：10000克/摩尔)
对于9.6mM溶液，在超纯H2O中溶解96mg/ml
对于2.1mM溶液，在超纯H2O中制备21mg/ml
40kDa衍生物(JenKem Technology USA，产品编号A7017-1/4ARM-SG-40K，M：40000克/摩尔)
对于9.6mM溶液，在超纯H2O中溶解384mg/ml
对于2.1mM溶液，在超纯H2O中制备84mg/ml
b.pH 8.0的1M的HEPES缓冲液
将23.83g的HEPES溶解在80ml的超纯H2O中，用1M的NaOH调节至pH 8.0，并加入超纯H2O直至100ml
c.ddH2O
如实施例1中提及的，在超纯水中制备了具有100mg/ml的浓度的胶原样蛋白溶液，并将具有6.3mg/ml的浓度的大鼠尾胶原溶液溶解在0.1％的乙酸中。应用了pH 8.0的1M的HEPES溶液，以改善在碱性pH下的凝胶化效率。在超纯水中新鲜制备了4-臂-PEG-SG储备溶液。逐步将胶原溶液、pH 8.0的1M的HEPES缓冲液和水混合，随后加入交联剂溶液(对于移液方案的细节，参见表6的由胶原样蛋白制成的海绵和表7的参考胶原)。
表6：用于凝胶化溶液的移液方案，所述凝胶化溶液由具有10、20和40mg/ml的浓度的胶原样蛋白(rCol)制成并以1∶0.05的胶原的赖氨酸残基与4-臂-PEG-SG的摩尔比交联。
最终浓度 单位 储备溶液 稀释倍数 体积[μl]
rCol 10 mg/ml 100 10 100
PEG 0.5. mM 9.6 20 50
HEPES 100 mM 1000 10 100
H2O 不适用 不适用 不适用 不适用 750
最终浓度 单位 储备溶液 稀释倍数 体积[μl]
rCol 20 mg/ml 100 5 200
PEG 1 mM 9.6 10 100
HEPES 100 mM 1000 10 100
H2O 不适用 不适用 不适用 不适用 600
最终浓度 单位 储备溶液 稀释倍数 体积[μl]
rCol 40 mg/ml 100 2.5 400
PEG 2 mM 9.6 5 200
HEPES 100 mM 1000 10 100
H2O 不适用 不适用 不适用 不适用 300
表7：用于凝胶化溶液的移液方案，所述凝胶化溶液由具有5mg/ml的浓度的大鼠尾胶原(rtCol)制成，并以1∶0.05的赖氨酸残基与4-臂-PEG-SG的摩尔比交联。
最终浓度 单位 储备溶液 稀释倍数 体积[μl]
rtCol 5 mg/ml 6.25 1.25 800
PEG 0.1 mM 2.1 20 50
HEPES 100 mM 1000 10 100
H2O 不适用 不适用 不适用 不适用 50
在均匀混合之后，将1ml的体积的凝胶化配制物填充在24孔硅酮模具中。在几分钟内非常快速的凝胶化之后，用石蜡封口膜覆盖了所述水凝胶，并在室温下将其储存过夜。在第二天，用超纯水洗涤了所述水凝胶一小时三次，和过夜洗涤一次，伴随着以200rpm的速度轨道式振荡。在洗涤之后，用实施例1中描述的方法，冻干了所述水凝胶。
实施例3：由用DMTMM交联的胶原样蛋白制成的海绵
通过交联胶原样蛋白制造海绵的另外的技术是基于4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉氮鎓氯化物(DMTMM)。DMTMM活化胶原的碳氢酸侧链，例如天冬氨酸和谷氨酸，并形成活性酯。得到的高反应性酯能够被胶原的赖氨酸侧链的伯胺亲核攻击。该亲核取代释放4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-醇，并最终形成酰胺键。
如应用于其它交联技术那样，由10、20和40mg/ml的浓度的胶原样蛋白制备了海绵。一致地，用5mg/ml的浓度的大鼠尾胶原制造了海绵。这里，应用了1∶0.4的胶原的羧基与DMTMM的摩尔比。
对于该技术，需要以下特定试剂和溶液：
a.4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉氮鎓氯化物(DMTMM；TCIchemicals，产品编号D2919)
对于245.2mM的溶液，在超纯H2O中制备68mg/ml
对于97.9mM的溶液，在超纯H2O中溶解27mg/ml
b.ddH2O
如前所提及的(参见实施例1)，制备了具有100mg/ml的浓度的胶原样蛋白溶液和具有6.3mg/ml的浓度的大鼠尾胶原溶液。将DMTMM交联剂新鲜溶解在超纯水中。在加入DMTMM交联剂溶液之前，预混合了胶原储备溶液和水(详情参见表8和表9中的移液方案)。
表8：用于海绵的移液方案，所述海绵由具有10、20和40mg/ml的浓度的胶原样蛋白(rCol)制成，并以1∶0.4的胶原的羧基与DMTMM的摩尔比交联。
最终浓度 单位 储备溶液 稀释倍数 体积[μl]
rCol 10 mg/ml 100 10 100
DMTMM 6 mM 245.2 40 25
H2O 不适用 不适用 不适用 不适用 875
最终浓度 单位 储备溶液 稀释倍数 体积[μl]
rCol 20 mg/ml 100 5 200
DMTMM 12 mM 245.2 20 50
H2O 不适用 不适用 不适用 不适用 750
最终浓度 单位 储备溶液 稀释倍数 体积[μl]
rCol 40 mg/ml 100 2.5 400
DMTMM 25 mM 245.2 10 100
H2O 不适用 不适用 不适用 不适用 500
表9：用于海绵的移液方案，所述海绵由具有5mg/ml的浓度的大鼠尾胶原(rtCol)制成，并且以1∶0.4的胶原的羧基与DMTMM的摩尔比交联。
最终浓度 单位 储备溶液 稀释倍数 体积[μl]
rtCol 5 mg/ml 6.25 1.25 800
DMTMM 2 mM 97.9 50 20
H2O 不适用 不适用 不适用 不适用 180
在彻底混合所有组分之后，将1ml的体积的凝胶化溶液填充在24孔的硅酮模具中。在20分钟内开始凝胶化，此后，用石蜡封口膜覆盖了所述模具，并在室温下将其储存过夜。在第二天，用超纯水洗涤了所述水凝胶一小时三次和过夜洗涤一次，伴随着以200rpm的速度轨道式振荡。在洗涤之后，如实施例1中所述，冻干了所述水凝胶。
由胶原样蛋白制成的海绵的流体吸收、收缩和溶胀行为
根据冻干之后的海绵和浸没在磷酸盐缓冲盐水中之后的海绵的重量测量值，计算了流体吸收率。对于湿重评估，将所述海绵浸没在1ml的磷酸盐缓冲盐水中。在室温下孵育24h之后，去除了所述缓冲溶液和剩余的过量液体，并测量了湿重。流体吸收率相对于干重值来描述，如以下等式所总结：
流体吸收率[％]＝[重量24h-重量干]/重量干*100。
通过浸没在磷酸盐缓冲盐水中之前和之后的相对直径变化，确定了海绵的收缩和溶胀，如以下等式所示出：
直径变化[％]＝Δ直径浸没后-浸没前/直径浸没前*100。
由胶原样蛋白制成的海绵的孔径、总孔隙率和开孔孔隙率
在液氮中冷冻了由具有10、和40mg/ml的浓度的胶原样蛋白制成的海绵和由具有5mg/ml的浓度的大鼠尾胶原制成的海绵，并用刀片将其切割以产生脆性断裂横截面。用粘性垫将切片固定在SEM样品台(stub)上。用金-钯溅射了样品表面，由此提高电导率。用扫描电子显微镜(SEM，高真空，10kV，SE-模式)，以各种放大倍数捕获了二次电子图片。用图像分析软件测量了若干泡孔的孔径(n≥8)。
通过用乙醇(99％)的液体置换，评估了所述海绵的总孔隙率和开孔孔隙率。因此，评估了所述海绵的干重和将所述海绵浸没在乙醇中一小时之后的湿重。此外，称量了所施加的乙醇和在取出经浸泡的海绵之后剩余的乙醇。
根据单个测量值计算所述总孔隙率，如以下等式所述：
总孔隙率[％]＝乙醇加入-乙醇剩余/[海绵干燥+乙醇加入-乙醇剩余]*100。
通过海绵浸泡的乙醇与完全填充有乙醇的海绵的体积的假设重量的商，来评估开孔孔隙率。这里，通过测量的直径和高度，计算了几何体积(Vs)。通过几何体积与乙醇密度(ρe；0.789g/cm3)的乘积，导出了完全填充有乙醇的海绵的体积的重量。所述开孔孔隙率的计算总结如下：
开孔孔隙率[％]＝[海绵浸泡-海绵干燥]/ρe*Vs*100
由胶原样蛋白制成的海绵的机械表征
设计了测试设置，以用于在干燥状态的海绵和在磷酸盐缓冲盐水中孵育24h之后的海绵的压缩。对于机械表征，应用了来自Brookfield的CT3质构分析仪，其中最大载荷为4500g。该机械测试装置配备有探针(11.3mm直径，1cm2表面)，该探针等于或略小于测试样品的直径(约11至16mm直径)。以5g的触发点和0.5mm/s的测量速度，执行了所述压缩。在所述压缩过程期间，追踪了所施加的重量和相应实现的距离。记录的原始数据用于计算应力和应变，最后将这两个值绘制为彼此的函数。从该应力-应变图中，导出了作为线性弹性范围中的斜率的杨氏模量。对于干燥的海绵，在计算中包括了5％至20％的应变的线性弹性范围。对于湿润的海绵，应用了2％至10％的应变的线性弹性范围，以用于杨氏模量的计算。这里，比较了由20mg/ml的胶原样蛋白制成的示例性海绵与Lyostypt，商业可获得的来自B.Braun的海绵(产品编号1069128)。

Claims (10)

1.制备基于胶原样蛋白的海绵的方法，其包括以下步骤或由以下步骤组成：
i)提供包含至少一种胶原样蛋白和任选存在的至少一种添加剂的水性溶液；
ii)经由孵育用至少一种交联剂将所述至少一种胶原样蛋白交联，以获得水凝胶；
iii)任选地，用缓冲液洗涤所述水凝胶；
iv)执行冻干步骤以获得所述海绵；
v)任选地加入至少一种添加剂；和
vi)任选地对获得的海绵灭菌。
2.根据权利要求1所述的方法，其中彼此发生反应的所述至少一种胶原样蛋白的官能团与所述至少一种交联剂的官能团是以1∶0.01至1∶5的比率存在。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述至少一种胶原样蛋白是：
i)细菌胶原样蛋白；和/或
ii)以2.5至100mg/ml的浓度范围存在于所述水性溶液中。
4.根据前述权利要求中的任意一项所述的方法，其中，所述至少一种交联剂
i)具有至少两个官能团，所述至少两个官能团能够与所述至少一种胶原样蛋白的所述官能团发生反应；和/或
ii)选自包含至少两个琥珀酰亚胺基的交联剂、4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基-吗啉氮鎓氯化物(DMTMM)、戊二醛、转谷氨酰胺酶、二异氰酸酯、或1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)与N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的组合；和/或
iii)在具有6至8的pH值的水性溶液中提供；和/或
iv)具有1,000至60,000克/摩尔的分子量。
5.根据前述权利要求中的任意一项所述的方法，其中所述孵育被执行5分钟至48h和/或在4至37℃执行。
6.根据前述权利要求中的任意一项所述的方法，其中，所述缓冲液具有5.5至8.2的pH值，和/或选自2-[4-(2-羟乙基)哌嗪-1-基]乙烷-1-磺酸缓冲液、2-吗啉-4-基乙烷磺酸缓冲液、和磷酸盐缓冲盐水。
7.根据前述权利要求中的任意一项所述的方法，其中，所述冻干步骤在-40至-60℃执行；和/或
在执行所述冻干步骤之前，将获得的水凝胶冷却至-20至-80℃。
8.海绵，所述海绵是通过根据权利要求1至7中的任意一项所述的方法获得的。
9.根据权利要求8所述的海绵，所述海绵具有：
i)基于所述海绵的总干重，800％至3000％的吸水能力；和/或
ii)15至300μm的孔径；和/或
iii)75％至99％的总孔隙率的孔隙率，和20％至85％的开孔孔隙率；和/或
iv)以干燥形式的45至250kPa的杨氏模量；和/或
v)以湿润形式的4至35kPa的杨氏模量。
10.根据权利要求8或9所述的海绵的用途，其用于伤口密封、止血、伤口堵塞、愈合促进、骨再生、软骨修复、细胞培养、素食肉类或严格素食肉类的生产、对生物流体例如血液或伤口渗出物的吸收。
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