CN117286601B - 一种可食性骨胶原蛋白纤维自组装制备方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及食品生物材料技术领域，尤其涉及一种可食性骨胶原蛋白纤维自组装制备方法及应用。该制备方法包括如下步骤：(1)Ⅰ型骨胶原蛋白溶液制备；(2)羧甲基壳聚糖溶液制备；(3)Ⅰ型骨胶原蛋白‑羧甲基壳聚体系制备；(4)I型骨胶原蛋白纤维制备。该制备方法通过天然胶原蛋白和可食性的羧甲基壳聚糖进行特定分子交联，实现了胶原蛋白自组装分子行为调控，构建了胶原蛋白纳米纤维凝胶特殊网状结构，从而有效地调节自组装的可食性骨胶原蛋白纤维的性能。
Description
技术领域
本发明涉及食品生物材料技术领域，尤其涉及一种可食性骨胶原蛋白纤维自组装制备方法及应用。
背景技术
畜禽肉品加工产业每年会产生较大量畜禽骨副产物，但整体加工利用率不足总产量的10％。畜禽骨中胶原蛋白占有机基质的90％以上，是食品级天然胶原蛋白的重要来源，开发利用价值巨大。研究表明，纤维化可以赋予食品级蛋白质优异的功能特性。多种动物蛋白和植物蛋白已被证实在酸性条件和变性温度下转化为纳米纤维，这意味着原纤维化是食品级蛋白质的共同特性。胶原蛋白自组装行为是其最重要分子行为特征之一，它通过分子间疏水作用、氢键、离子键等相互作用形成微纤维，微纤维再进一步聚集成胶原纤维，为骨骼、跟腱、瓣膜、皮肤等组织提供强大的生物力学性能。在合适的条件下，胶原蛋白在体外也能自组装形成胶原纤维，这引起了科学工作者的极大关注。近年来，利用天然胶原自组装分子行为构筑的胶原纤维已广泛应用于食品科学，生物材料，医学美容等领域，也为畜禽骨副产物的高值化精深加工指明了新方向。
尽管胶原蛋白自组装后形成的胶原蛋白纤维，在机械性能，热稳定性都有所提升，拓宽了其功能和应用。例如改善凝胶和乳化性能。但由于胶原蛋白生产、储存和利用过程中总是面临高温的挑战，导致其三螺旋结构的破坏，严重影响了自组装性能并限制了其在食品领域的应用范围。鉴于多糖的存在能影响胶原蛋白自组装过程，并赋予食品级蛋白质优异的功能特性，行业内已进行了多糖和胶原蛋白结合指导自组装进行胶原蛋白改性的技术尝试，但尚存在物理交联效果差、引入了外源化学物质(如交联剂戊二醛、碳化二亚胺等)而不利于健康的问题。
为了改善天然胶原蛋白及其纤维热变性温度低、酶降解速率过快及机械性能较弱等缺点，本发明通过天然胶原蛋白和选定的多糖进行分子交联，实现胶原自组装分子行为调控，构建胶原蛋白纳米纤维凝胶特殊网状结构，从而有效地调节自组装产物性能。
发明内容
本发明提供了一种可食性骨胶原蛋白纤维自组装制备方法及应用，通过天然胶原蛋白(牛骨胶原蛋白)和多糖(可食性的羧甲基壳聚糖)的特定分子交联，实现了胶原蛋白自组装分子行为调控，构建了胶原蛋白纳米纤维凝胶特殊网状结构，从而有效地调节自组装的可食性骨胶原蛋白纤维的性能，解决了现有技术中存在的问题。
本发明所采用的技术方案之一是：
一种可食性骨胶原蛋白纤维自组装制备方法，包括如下操作步骤：
(1)Ⅰ型骨胶原蛋白溶液制备
①低温条件下，将冻干的Ⅰ型骨胶原蛋白搅拌溶解于一定浓度的乙酸溶液中，制备得2mg/mL的Ⅰ型骨胶原蛋白储备溶液；
②低温条件下，将步骤(1)制得的Ⅰ型骨胶原蛋白储备溶液透析，至胶原蛋白呈中性；
(2)羧甲基壳聚糖溶液制备
将羧甲基壳聚糖充分溶解于超纯水中，得到8mg/mL的羧甲基壳聚糖溶液；
(3)Ⅰ型骨胶原蛋白-羧甲基壳聚体系制备
将步骤(1)制得的Ⅰ型骨胶原蛋白溶液与步骤(3)的羧甲基壳聚糖溶液混合，孵育制备Ⅰ型骨胶原蛋白-羧甲基壳聚体系溶液；
(4)I型骨胶原蛋白纤维制备
将步骤(3)制得的I型骨胶原蛋白-羧甲基壳聚糖体系与模拟体液低温下混合，调节pH至中性，于26-32℃下孵育11-13小时，制得I型骨胶原蛋白纤维。
进一步地，步骤(1)中低温指3℃-5℃；步骤(1)的①中乙酸溶液的摩尔浓度为0.5mol/L；②中透析采用磷酸缓冲液，透析至胶原蛋白pH7.2±0.2。
进一步地，步骤(1)乙酸溶液使用0.5mol/L的浓度，可以在不破坏三螺旋结构完整性的前提下充分溶解Ⅰ型骨胶原蛋白。
进一步地，将Ⅰ型骨胶原蛋白溶液浓度设置为2mg/mL，实现了兼顾酸性溶液中的Ⅰ型骨胶原蛋白的结构完整性、溶解度和改性胶原蛋白的产率的目的。
进一步地，步骤(1)的②使用透析袋在磷酸缓冲液中对所述Ⅰ型骨胶原蛋白储备溶液进行透析直至中性，得到所述I型骨胶原蛋白溶液；所述磷酸缓冲液的浓度为200mM，pH7.4，所述透析袋的截留分子量为8000-14000Da。
进一步地，步骤(1)的①冻干的Ⅰ型胶原蛋白为天然Ⅰ型胶原蛋白，以牛腿棒骨为原料通过酸溶酶提法制备，保持了完整的三螺旋分子结构的胶原蛋白。
上述酸溶酶提法为提取胶原蛋白的常规方法，采用一定浓度的乙酸和胃蛋白酶结合使用的方法提取从牛骨中分离粗胶原蛋白，再经过盐析、离心、透析等方法进行纯化后冷冻干燥，制得本发明所使用的较高纯度的I型骨胶原蛋白。经过SDS-PAGE、FTIR、XRD等一系列理化性质表征手段表明制得的骨胶原蛋白属于Ⅰ型胶原蛋白。
进一步地，所述模拟体液(Simulated body fluids，SBF)为10×SBF，10×SBF成分组成为：NaCl(1370mM)、NaHCO3(42mM)、KCl(30mM)、K2HPO4·3H2O(10mM)、CaCl2(25mM)、Na2SO4(5mM)、MgCl2·6H2O(15mM)、Tris(300mM)。
进一步地，步骤(3)的Ⅰ型胶原蛋白-羧甲基壳聚体系溶液中，Ⅰ型胶原蛋白溶液与羧甲基壳聚糖溶液的质量比为1-9：1，混合后30℃下孵育12小时制得Ⅰ型骨胶原蛋白-羧甲基壳聚体系溶液。
进一步地，Ⅰ型骨胶原蛋白溶液与羧甲基壳聚糖溶液的质量比为9：1、8：2、7：3或5：5。
进一步地，步骤(4)低温指3℃-5℃，模拟体液的摩尔浓度0.1mol/L；牛骨I型胶原蛋白-羧甲基壳聚糖体系溶液与模拟体液调节pH至7.4后，于30℃孵育12h。
进一步地，步骤(4)中I型骨胶原蛋白-羧甲基壳聚糖体系溶液与模拟体液体积比为4:1；步骤(4)调节pH采用2M NaOH。
本发明所采用的技术方案之二是：
上述制备方法制得的可食性骨胶原蛋白纤维在食品、化妆品、生物医学、组织工程领域用胶原蛋白基生物材料及ECM类似物中的应用。
本发明的有益效果：
本发明可食性I型骨胶原蛋白纤维自组装制备方法，经济、安全地实现了制备骨胶原蛋白可食用改性纤维，并可控地改善骨胶原蛋白的热稳定性和自组装特性，且未显著影响骨胶原蛋白-羧甲基壳聚糖体系中牛骨胶原蛋白的三螺旋结构及生物相容性，拓展其应用范围。这有利于胶原蛋白基ECM材料的开发，同时也为畜禽骨副产物的高值化精深加工利用提供了新途径。
本发明制备中，I型骨胶原蛋白在与羧甲基壳聚糖的作用下发生了多层次的改性及结构变化，骨胶原蛋白单体与羧甲基壳聚糖随着羧甲基壳聚糖浓度的增加而形成了聚集程度更高的胶原蛋白聚集体，增加了胶原蛋白分子间和分子内氢键的数量；同时，I型胶原蛋白的三螺旋结构完整性得以保留，而自组装速率得以提高，增大了自组装形成的胶原蛋白纤维的直径，增强了骨胶原蛋白纤维的热稳定性。
附图说明
图1为本发明实施例1-实施例5提供的骨胶原蛋白-羧甲基壳聚糖体系的紫外吸收光谱图；
图2为本发明实施例1-实施例5提供的骨胶原蛋白-羧甲基壳聚糖体系的傅里叶变换红外光谱图；
图3为本发明实施例1-实施例5提供的I型骨胶原蛋白-羧甲基壳聚糖体系的荧光光谱图；
图4为本发明实施例1-实施例5提供的I型骨胶原蛋白-羧甲基壳聚糖体系的DSC曲线；
图5为本发明实施例1-实施例5提供的I型骨胶原蛋白-羧甲基壳聚糖体系的TGA曲线；
图6为由本发明实施例1-实施例5的I型骨胶原蛋白-羧甲基壳聚糖体系制得的I型骨胶原蛋白纤维的浊度曲线；
图7为由本发明实施例1-实施例5的I型骨胶原蛋白-羧甲基壳聚糖体系制得的I型骨胶原蛋白纤维形成度分析图；
图8为由本发明实施例1-实施例5的I型骨胶原蛋白-羧甲基壳聚糖体系制得的I型骨胶原蛋白纤维的SEM图像；
图9为由本发明实施例1-实施例5的I型骨胶原蛋白-羧甲基壳聚糖体系制得的I型骨胶原蛋白纤维的直径分布图；
图10为由本发明实施例1-实施例5的I型骨胶原蛋白-羧甲基壳聚糖体系制得的I型骨胶原蛋白纤维的TEM图像；
图11为由本发明实施例1-实施例5的I型骨胶原蛋白-羧甲基壳聚糖体系制得的I型骨胶原蛋白纤维的D-周期长度；
图12为本发明对纤维细胞存活率影响。
其中，图8中的图8A-图8E分别为对应实施例1-实施例5的体系进一步制得的I型骨胶原蛋白纤维的SEM图像；
图9中的图9A-图9E分别为对应实施例1至实施例5的体系进一步制得的I型骨胶原蛋白纤维的直径分布图；
图10中的图10A-图10E为对应实施例1至实施例5的体系进一步制得的I型骨胶原蛋白纤维的TEM图像。
具体实施方式
为能清楚说明本方案的技术特点，下面通过具体实施方式，结合附图，对本发明进行详细阐述。本发明的范围并不限于下述实施例。本领域的专业人员能够理解，在不背离本发明的精神和范围的前提下，可以对本发明进行各种变化和修饰。
下述实施例中所涉及的仪器、试剂、材料等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规仪器、试剂、材料等，可通过正规商业途径获得。下述实施例中所涉及的实验方法，检测方法等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规实验方法，检测方法等。
本发明提供了一种可食性骨胶原蛋白纤维自组装制备方法。该方法先对可食性I型骨胶原蛋白进行改性制备，然后基于改性得到的I型骨胶原蛋白溶液制备骨胶原蛋白-羧甲基壳聚糖体系，最后将骨胶原蛋白-羧甲基壳聚糖体系与模拟体液混合制备牛骨I型胶原蛋白纤维。
具体地，一种I型骨胶原蛋白的改性方法，包括以下步骤：
步骤(1)、制备I型骨胶原蛋白溶液
①将I型骨胶原蛋白在4℃下溶解于0.5mol/L的乙酸溶液中，制备得到酸性I型骨胶原蛋白溶液，浓度为2mg/mL；
②在4℃下使用透析袋在磷酸缓冲液中对上述酸性I型骨胶原蛋白溶液进行透析直至中性，得到I型胶原蛋白溶液；其中，所述磷酸缓冲液的浓度为200mM，pH 7.4，所述透析袋的截留分子量为8000-14000Da；
步骤(2)、制备羧甲基壳聚糖溶液
将羧甲基壳聚糖充分溶解于超纯水中，得到8mg/mL的羧甲基壳聚糖溶液；
步骤(3)、将上述I型骨胶原蛋白溶液和羧甲基壳聚糖溶液进行混合处理，对混合后的溶液进行培养，30℃下孵育12小时，得到I型骨胶原蛋白-羧甲基壳聚糖体系。
本发明I型骨胶原蛋白纤维的制备方法，采用将上述制得的I型骨胶原蛋白-羧甲基壳聚糖体系溶液与0.1mol/L的模拟体液(Simulated body fluid，SBF)按一定体积配比在4℃下混合，得到I型骨胶原蛋白混合溶液，调节pH至7.4，置于30℃下孵育12小时，以制备得到I型骨胶原蛋白纤维。
本发明制备得到的I型骨胶原蛋白纤维凝胶的直径更大，D周期长度更均匀，热稳定性更高。
以下通过具体的实施例，对本发明所提供的I型骨胶原蛋白-羧甲基壳聚糖体系、I型骨胶原蛋白纤维及其制备方法作进一步详细介绍。
实施例1
一种可食性骨胶原蛋白的改性方法，包括如下步骤：
(1)将骨胶原蛋白在4℃下使用搅拌器搅拌充分溶解于0.5mol/L的乙酸溶液中，制备得到2mg/mL浓度的I型骨胶原蛋白储备溶液；
(2)将I型骨胶原蛋白储备溶液装入截留分子量为8000-14000Da的透析袋(透析袋使用前进行预处理)，在4℃下的磷酸盐缓冲液(200mM，pH 7.4)中透析直至胶原蛋白呈中性，得I型骨胶原蛋白溶液；
(3)将羧甲基壳聚糖使用搅拌器搅拌充分溶解于超纯水中，得到8mg/mL的浓度；
(4)将200mL I型骨胶原蛋白溶液与0mL羧甲基壳聚糖溶液混合制备得到I型骨胶原蛋白-羧甲基壳聚糖体系溶液200mL，在30℃下培养12小时，然后将其中100mLI型骨胶原蛋白-羧甲基壳聚糖体系溶液冷冻干燥备用，另100mLI型骨胶原蛋白-羧甲基壳聚糖体系溶液用于制备牛骨I型胶原蛋白纤维。
本实施例制得到的I型骨胶原蛋白-羧甲基壳聚体系称为BBC。
实施例2
该实施例的制备操作同实施例1，所不同的是：步骤(4)中，I型骨胶原蛋白溶液体积为100mL，羧甲基壳聚糖溶液的体积为2.75mL，补充97.25mL超纯水。
本实施例超声处理得到的骨胶原蛋白-羧甲基壳聚体系被称为B9C1。
实施例3
该实施例的制备操作同实施例1，所不同的是：步骤(4)中，I型骨胶原蛋白溶液体积为100mL，羧甲基壳聚糖溶液的体积为6.25mL，补充93.75mL超纯水。
本实施例超声处理得到的I型骨胶原蛋白-羧甲基壳聚体系被称为B8C2。
实施例4
该实施例的制备操作同实施例1，所不同的是：步骤(4)中，I型骨胶原蛋白溶液体积为100mL，羧甲基壳聚糖溶液的体积为10.75mL，补充89.25mL超纯水。
本实施例超声处理的I型骨胶原蛋白-羧甲基壳聚体系被称为B7C3。
实施例5
该实施例的制备操作同实施例1，所不同的是：步骤(4)中，I型骨胶原蛋白溶液体积为100mL，羧甲基壳聚糖溶液的体积为25mL，补充75mL超纯水。
本实施例超声处理的I型骨胶原蛋白-羧甲基壳聚体系被称为B5C5。
将上述实施例1-实施例5改性制备的I型骨胶原蛋白-羧甲基壳聚糖体系溶液40mL与10mL的10×SBF在4℃下混合，用2M NaOH调节pH至7.4，置于30℃下孵育12小时，以制备得到相应的I型骨胶原蛋白纤维。
分别对实施例1-实施例5制备的改性I型骨胶原蛋白-羧甲基壳聚糖体系和由实施例1-实施例5的I型骨胶原蛋白-羧甲基壳聚糖体系与模拟体液混合制备的相应的I型骨胶原蛋白纤维进行定性分析。
一、紫外吸收光谱分析(UV-vis)
对制备的胶原蛋白-羧甲基壳聚糖体系样品溶液(超纯水稀释至牛骨胶原蛋白均达到0.5mg/mL的终浓度)进行紫外光谱扫描分析，溶液在37℃下以30nm/min的扫描速率在200～300nm内获得紫外吸收光谱。
参见图1，为实施例1-实施例5制得的Ⅰ型胶原蛋白-羧甲基壳聚糖体系的紫外吸收光谱(UV-vis)。
实施例1的BBC在225nm处显示紫外吸收峰，这是胶原蛋白三螺旋结构的特征紫外吸收峰。特征紫外吸收峰主要来源于胶原蛋白的肽键(尤其是脯氨酸和羟脯氨酸肽键-C＝O、－COOH、－CONH2基团的n-π*跃迁在220nm处产生紫外吸收峰)与侧链上含有苯环结构的芳香族氨基酸(芳香环结构在250～290nm波长范围内有较强的紫外吸收)，主要是苯丙氨酸(苯环结构的π-π*跃迁在258nm处显示紫外吸收峰)和酪氨酸(酪氨酸残基酚基的π-π*跃迁在280nm处显示紫外吸收峰)，因为I型胶原蛋白色氨酸(色氨酸残基吲哚环的π-π*跃迁在278nm处产生紫外吸收峰)含量极低。实施例2-实施例5中CMC的引入，对于BBC紫外吸收峰的位置没有影响，但与BBC相比，引入不同质量浓度CMC的BBC溶液都显示出更强的吸收峰。这可能是因为CMC的引入导致BBC-CMC复合物的肽键、共轭不饱和双键、氢键或与螺旋等构象相关的次级键增强，这些次级键一般在210～250nm的波长范围内产生紫外吸收峰，因而导致BBC-CMC复合物的紫外吸收峰强度增大。
二、傅里叶变换红外光谱分析(FT-IR)
由于天然的I型骨胶原蛋白的三螺旋结构具有光学活性，因此可以采用傅里叶红外变换光谱(FT-IR)分析胶原蛋白分子构象和三螺旋结构的变化。
对壳聚糖(CS)、羧甲基壳聚糖(CMC)以及本发明胶原蛋白-羧甲基壳聚糖体系样品进行红外光谱扫描分析，扫描范围为4000～500cm-1，分辨率为1cm-1。使用OMNIC v8.20软件(Thermo Nicolet，Madison，WI，USA)对FT-IR的二阶导数光谱进行分析，并使用PeakFitv4.12软件(Thermo Electron Co.，USA)对红外光谱进行高斯曲线拟合分析。FT-IR酰胺Ⅰ带(1700～1600cm-1)中特定波长范围内的积分峰面积对酰胺Ⅰ带总积分面积的比例可用来确定相应的牛骨Ⅰ型胶原蛋白的4种二级结构的含量：α-螺旋，1664～1645cm-1；β-折叠及其扩展结构，1637～1615cm-1和1700～1682cm-1；β-转角，1681～1664cm-1；无规则卷曲，1644～1637cm-1。
参见图2，为实施例1-实施例5制备得到的Ⅰ型胶原蛋白-羧甲基壳聚糖体系的傅里叶变换红外光谱FT-IR。胶原蛋白酰胺I带的曲线拟合分析情况见下表1。
表1胶原蛋白酰胺I带的曲线拟合分析情况
图2中，I型胶原蛋白-羧甲基壳聚糖体系的FT-IR红外光谱显示了胶原蛋白特征的酰胺A带(3440～3400cm-1)，酰胺B带(2980～2850cm-1)，酰胺I带(1700～1600cm-1)，酰胺II带(1600～1550cm-1)和酰胺III带(1360～1200cm-1)，表明本发明提取使用的I型胶原蛋白保持了完整的三螺旋结构。在引入CMC后，I型胶原蛋白的酰胺I、II和III带依然存在，只是强度和位置发生了变化，证实了牛骨I型胶原蛋白和羧甲基壳聚糖的结合。CMC位于1137cm-1的吸收峰表明其－CH2－COO-参与了I型胶原蛋白交联过程中分子间作用力的形成。CMC在1085cm-1处有一个明显的吸收峰，归因于主链的－C－O－C拉伸振动及C－N共价键作用。
由图2可知，各实施例的BBC、B9C1、B8C2、B7C3、B5C5到CMC位于1085cm-1处的吸收峰强度随着CMC含量的增加而逐渐增强，这与CMC的含量逐渐增大是对应的，表明I型胶原蛋白与羧甲基壳聚糖的共价结合能力和交联程度增大。另外，CMC引入后，观察到BBC(3323cm-1)、B9C1(3299cm-1)、B8C2(3315cm-1)、B7C3(3283cm-1)、B5C5(3273cm-1)酰胺A带的吸收峰有向低波数方向移动的趋势，表明胶原蛋白-羧甲基壳聚糖聚合物分子间/内氢键的作用力增强，更多的－COOH及－NH2基团参与形成氢键。CMC引入后的酰胺II带也存在红移，与N－H弯曲和C－N拉伸振动有关，进一步证实了氢键的增强。酰胺I带是与N－H基团偶联的C＝O基团的拉伸振动相关的二级结构的敏感标记，酰胺I带的曲线拟合分析可用来分析牛骨I型胶原蛋白4种二级结构的相对含量。
如上表1所示，引入CMC后，I型胶原蛋白的4种二级结构的含量未显示显著的差异。此外，若胶原蛋白FT-IR红外光谱的酰胺Ⅲ带和1450cm-1处的吸收峰值强度比(AⅢ/A1 450)为1.05-1.14，则表示胶原蛋白三螺旋结构保持良好。由表1可知，本发明I型胶原蛋白-羧甲基壳聚糖体系样品的AⅢ/A1450均在1.05-1.14的范围内，这表明CMC的结合并未影响I型胶原蛋白三螺旋结构的完整性。CMC的引入可经济高效的对I型胶原蛋白进行改性，进而显著影响I型胶原蛋白微观结构、热稳定性、自组装性质及其生物活性等。
三、荧光光谱分析
对制备的I型胶原蛋白-羧甲基壳聚糖体系样品溶液(超纯水稀释至牛骨胶原蛋白均达到0.5mg/mL的终浓度)进行荧光光谱分析。胶原蛋白分子中的酪氨酸具备内源荧光特性，酪氨酸残基通常参与氢键的形成，因此可利用荧光光谱对胶原蛋白分子进行内源性荧光检测以研究胶原蛋白分子的聚集行为。荧光分光光度计激发波长设置为280nm，波长扫描范围300～360nm，狭缝宽度设置为5nm，扫描速率为1200nm/min。
如图3所示，在激发波长为280nm的条件下，实施例1的BBC在305nm表现出荧光峰，由蛋白质荧光归属理论可知，303nm处的荧光峰归属于酪氨酸。实施例2-实施例5中CMC的引入，对于BBC荧光峰的位置没有影响，但与BBC相比，引入不同浓度CMC的BBC溶液都显示出更高的荧光峰，且CMC浓度越大，BBC-CMC复合物的荧光峰越高。这说明随着CMC浓度增大，BBC分子间间距逐渐减小，胶原蛋白纤维束聚集程度增大，使得酪氨酸相互接近以形成更多数量的氢键，从而导致荧光强度增大。因此，荧光光谱分析的结果表明，CMC的引入有助于BBC的自组装。酪氨酸(固有荧光团)仅存在于I型胶原蛋白分子的N-末端肽和C-末端肽区域，并负责启动胶原蛋白的自组装。因此推测CMC不影响I型骨胶原蛋白末端肽区域，而可能是I型骨胶原蛋白和CMC的相互作用限制了溶液中BBC单体的流动性，有助于在滞后期中形成更多的核，从而有助于随后胶原蛋白纤维的形成。
四、差示扫描量热法分析(DSC)
测定I型骨胶原蛋白-羧甲基壳聚糖体系样品的熔化温度(Tm)。精确称重5mg样品并密封到铝盒中，铝盒以5℃/min的升温速率从10℃加热到100℃以获得DSC曲线，空铝盒作为参考。
对实施例1-实施例5制备得到的牛骨Ⅰ型胶原蛋白-羧甲基壳聚糖体系进行DSC热变性曲线测定。胶原蛋白的天然三螺旋结构对其分子行为和生物功能至关重要。然而，胶原蛋白在高温下热不稳定并变性为明胶，这是胶原蛋白在储存和加工中的一个重大问题。CMC是一种两性聚电解质，UV和FT-IR光谱发现，CMC的引入未破坏BBC三螺旋结构的完整性。进一步的，DSC曲线显示了由加热诱导的典型热变性峰，对应的峰值温度和峰面积分别代表胶原蛋白由三螺旋结构转变为无规则卷曲结构的温度(熔融温度，Tm)和破坏伯氢键、酰胺键和保持胶原蛋白三螺旋的范德华力等所需的能量(焓变ΔH)。
如图4所示，BBC的熔融温度Tm为50.18℃，ΔH为2.89J/g。CMC引入后，Tm从51.69℃(B9C1)提高到57.28℃(B5C5)，ΔH从2.89J/g(BBC)提高到13.63J/g(B5C5)。胶原蛋白的热稳定性主要是由胶原蛋白三螺旋骨架中肽键之间的链间氢键相互作用维持的，而Tm值取决于胶原蛋白纤维形成过程的成核阶段，因此推测CMC的引入使得BBC-CMC之间的氢键、肽键、共轭不饱和双键结构或与螺旋等构象相关次级键的作用增强，这些作用力的增强稳定了胶原蛋白的三超螺旋结构，加速了自组装的成核阶段以增加胶原蛋白纤维形成度，补偿了热传递的影响，从而增强了胶原蛋白-羧甲基壳聚糖体系的热稳定性。同时，由于BBC-CMC之间更强的作用力导致更稳定的BBC三螺旋结构，解开BBC超结构所需的能量也在增加，因此导致了BBC-CMC体系更高的ΔH。
五、热重分析(TGA)
测定I型骨胶原蛋白-羧甲基壳聚糖体系样品的热重曲线(TGA)及微商热重曲线(DTG)。热重分析仪中精确称取少量样品，在氮气气氛中以10℃/min的升温速率获得骨胶原蛋白样品30～500℃范围内的TGA及DTG曲线。
对实施例1-实施例5制备得到的Ⅰ型骨胶原蛋白-羧甲基壳聚糖体系进行热重分析(TGA)。TGA是评估大分子热稳定性的一种简单可靠的方法，是决定材料在制造、储存和使用中稳定性的重要指标之一。实施例1的BBC及实施例2-实施例5的BBC-CMC复合物体系在大温度范围内的进一步热降解通过热重曲线(TGA)及微商热重曲线(DTG)来表征，参见图5，可以清晰的观察到，BBC及BBC-CMC复合物体系的热降解的三个阶段。
第一阶段的热降解发生在约120～220℃，这归因于BBC-CMC体系中游离水的去除以及蛋白质链之间氢键的破坏。引入CMC后，BBC-CMC体系第一阶段的热降解温度提升，这可能是由于CMC和水之间的高氢键作用可更好的防止自由水的蒸发。第二阶段热降解(220～280℃)的质量损失最明显，释放BBC-CMC体系体系结合水以及部分肽键热降解后的小分子产物，如肽和氨基酸。最后，第三阶段的热降解(280～500℃)对应于BBC-CMC体系体系粘附骨架降解，包括肽键的彻底降解和C－N，C－O的切割，高温通过脱氨基(肽键的破坏)和脱水(C－N和C－O键的破坏)将肽和氨基酸进一步分解为CO2、CO和NO。引入CMC后，发现BBC的热降解峰温度(312.29℃)并未随着CMC浓度的增加而呈现有规律的增加(B9C1，300.31℃；B8C2，316.58℃；B7C3，308.38℃；B5C5，318.67℃)，但BBC的残留物质量(22.71％)却随着CMC浓度的增加而呈现明显的增加(B9C1，30.75％；B8C2，38.49％；B7C3，40.66％；B5C5，42.96％)，这表明BBC-CMC体系在大温度范围内的热稳定性增强，有利于其在细胞培养肉等领域的应用。这可能是由于CMC和BBC之间形成更强的结合相互作用，包括共价键(肽键)、氢键、离子键、范德华力等。
六、浊度试验
通过浊度试验监测I型骨胶原蛋白纤维生成过程。
该试验是将I型骨胶原蛋白-羧甲基壳聚糖体系样品溶液(4mL)与1mL10×SBF(模拟体液，Simulated body fluids，SBF)在4℃下混合，并用2M NaOH将溶液调节至pH 7.4，以制备储备溶液。立即将储备溶液转移到石英比色皿(1cm)中30℃下孵育60min，紫外分光光度计在313nm处每35秒记录一次溶液的吸光度，得到I型骨胶原蛋白-羧甲基壳聚糖样品溶液的浊度曲线。10×SBF的成分为：NaCl(1370mM)、NaHCO3(42mM)、KCl(30mM)、K2HPO4·3H2O(10mM)、CaCl2(25mM)、Na2SO4(5mM)、MgCl2·6H2O(15mM)、Tris(300mM)。
对实施例1-实施例5制备得到的Ⅰ型骨胶原蛋白-羧甲基壳聚糖体系进行浊度曲线测定，参见图6。
在生理条件下或体内，I型胶原蛋白并不是以胶原蛋白单体的形式存在，而是以四分之一交错的方式并排聚集自组装成具有特征D周期结构的胶原蛋白纤维网络，从而自组装成微纤维、原纤维、原纤维束，并最终形成3D胶原蛋白纤维凝胶，从而赋予组织器官良好的韧性。胶原蛋白分子拥有胶原蛋白纤维形成所需的所有信息，这种胶原蛋白单体自发的聚集行为，不仅能改善其理化特性，也是决定其在食品、组织工程和生物医药等领域的应用最重要的性质之一。
图6中可以看出，在CMC存在和不存在的情况下，BBC的浊度曲线都呈现典型的S形。胶原蛋白的自组装动力学遵循成核依赖性聚合机制，通常包括三个不同的阶段：滞后期(成核阶段)、生长期(组装阶段)和平台期(平衡阶段)。胶原蛋白自组装成核发生在滞后期，胶原蛋白分子首先聚集形成二聚体，此时没有可检测的浊度变化。随着胶原蛋白分子的进一步聚集导致胶原微纤维、胶原蛋白纤维以及胶原蛋白纤维束的形成，生长期的浊度值急剧增加，而平台期胶原蛋白纤维的横向组装导致凝胶化，浊度达到恒定值。相较于BBC(0s～490s，490s；490s～840s，350s)，CMC的引入增加了平台期的最终平衡浊度。同时，B9C1(0s～315s，315s；315s～650s，335s)和B8C2(0s～455s，455s；455s～790s，335s)表现出更快的滞后期和生长期，而B7C3(0s～560s，560s；560s～945s，385s)、B5C5(0s～680s，680s；680s～1070s，390s)的浊度曲线则显示出逐渐延长的滞后期和生长期。在平台期，胶原原纤维进一步组装成超分子组织的凝胶，并伴有浊度值的平衡。这些结果表明，实施例2-实施例5CMC的引入，可强化胶原蛋白的自组装能力，且适度的引入CMC可加快胶原蛋白单体的自组装速率。本实验的结果与肝素对于胶原蛋白自组装的研究结果类似，发现低浓度的肝素促进胶原蛋白纤维形成，而高浓度的肝素抑制胶原蛋白纤维组装。因此推测，当CMC浓度较低时，由于适度的氢键和静电相互作用，可以促进BBC的聚集和自组装，但随着CMC的浓度升高，CMC与BBC分子之间形成的氢键和静电相互作用可以增强，BBC分子被大量的CMC包围，此时的静电排斥作用占据主导地位，BBC的构象稳定性可能会降低。可见，关于BBC和CMC之间相互作用的研究将有助于稳定BBC-CMC溶液体系。
七、胶原蛋白纤维形成度
胶原蛋白的纤维形成度被定义为自组装成胶原蛋白纤维的胶原分子的百分比。骨胶原蛋白储备溶液在30℃下孵育12h以形成胶原蛋白纤维，然后在18000g离心20min。通过Lowry蛋白质定量分析试剂盒测定上清液中的蛋白质含量，按照如下公式计算胶原蛋白纤维形成度：
注：C0为储备溶液中的初始蛋白质浓度(mg/mL)；C为储备溶液形成胶原蛋白纤维后上清液中的蛋白质浓度(mg/mL)。
对由实施例1-实施例5的Ⅰ型骨胶原蛋白-羧甲基壳聚糖体系继续制备得到的Ⅰ型骨胶原蛋白-羧甲基壳聚糖纤维的纤维形成度进行测定。图7为对应实施例1-实施例5制备得到的Ⅰ型骨胶原蛋白纤维形成度分析图。如图7所示，和浊度实验的结果一致，BBC纤维形成度随着CMC的引入而增加，并且CMC的浓度越高，BBC-CMC体系的纤维形成度也越大。这些结果进一步表明，CMC与BBC的结合作用并不影响其三螺旋结构的完整性，因而不会对BBC最终的纤维形成度产生负面影响。而CMC的引入可能影响了胶原蛋白的分子伸展，限制了溶液中BBC单体的流动性，增加了胶原蛋白单体碰撞和组装的概率，从而利于胶原蛋白纤维的形成。目前，三阶段的胶原蛋白纤维形成过程被普遍接受，但关于胶原蛋白自组装发生的机制尚不十分清楚，可能是由胶原蛋白单体非极性氨基酸残基之间的疏水相互作用驱动胶原蛋白单体上的识别位点之间形成氢键而启动的。
八、胶原蛋白纤维形态观察(SEM/TEM)
使用扫描电子显微镜(SEM)观察形成的I型骨胶原蛋白-羧甲基壳聚糖体系样品的纤维形态。
如前制备的I型骨胶原蛋白储备溶液，取50μL储备溶液在干净的载玻片中30℃下孵育过夜。处理后的样品用去离子水仔细冲洗数次，并用2.5％(v/v)戊二醛固定2h，然后用50％(v/v)乙醇脱水，并用冷冻干燥机冷冻干燥。在5kV的加速电压下通过SEM观察干燥的胶原蛋白纤维，并使用ImageJ软件分析100根胶原蛋白纤维的直径。
通过透射电子显微镜(TEM)进一步观察I型骨胶原蛋白-羧甲基壳聚糖体系样品的纤维形态。如前所述制备的I型骨胶原蛋白储备溶液在30℃下孵育12h形成胶原蛋白纤维，将一滴胶原蛋白纤维溶液装载在200目的铜格栅上，并用1％(w/v)磷钨酸染色，去离子水洗涤后风干。使用加速电压为200kV的TEM观察形成的胶原蛋白纤维的D周期性结构。
采用SEM观察实施例1-实施例5制备得到的Ⅰ型骨胶原蛋白-羧甲基壳聚糖纤维的形态，并对实施例1-实施例5制备得到的纤维直径分布进行分析。图8A-图8E为由实施例1-实施例5所制备的Ⅰ型胶原蛋白纤维的SEM图像，其中，图8A-图8E依次对应实施例1-实施例5的BBC，B9C1，B8C2，B7C3，B5C5制得的纤维。图9A-图9E为由实施例1-实施例5所制备的Ⅰ型骨胶原蛋白纤维的直径分布图，图9A-图9E依次对应实施例1-实施例5的BBC，B9C1，B8C2，B7C3，B5C5制得的纤维。
如图8A-图8E所示，通过SEM图像观察到，I型骨胶原蛋白纤维缠绕成具有多孔结构的致密纤细的纤维网络，这可能是由于冷冻干燥脱水导致的。由实施例1至实施例5的Ⅰ型骨胶原蛋白-羧甲基壳聚糖体系制备的I型骨胶原蛋白纤维的平均纤维直径为：BBC(85.65±16.68nm)、B9C1(172.51±13.36nm)、B8C2(206.81±32.26nm)、B7C3(232.52±20.43nm)、B5C5(220.33±26.55nm)，表明随着CMC引入浓度增大，BBC纤维直径显著变大。如图9A-图9E所示，随着CMC引入浓度的增大，自组装形成的胶原蛋白纤维的纤维直径分布(标准差)也呈增大趋势。SEM的结果表明，CMC引入后，胶原蛋白纤维的平均直径显著增大，并且胶原蛋白纤维的直径分布也更广泛。
采用TEM观察实施例1-实施例5的Ⅰ型骨胶原蛋白-羧甲基壳聚糖体系制备得到的Ⅰ型骨胶原蛋白-羧甲基壳聚糖纤维的D-周期性。图10A-图10E为Ⅰ型骨胶原蛋白纤维的TEM图像。其中，图10A-图10E依次对应实施例1-实施例5的BBC，B9C1，B8C2，B7C3，B5C5。图11为Ⅰ型骨胶原蛋白纤维的D-周期性结构长度。
从图10A-图10E发现，CMC引入前后的BBC均表现出了胶原蛋白特征性的D-周期性结构。D-周期结构形成的机制尚不清楚，如图11所示，随着CMC浓度的增加，BBC的D-周期平均宽度并未产生显著的差异(BBC，66.36±0.95nm；B9C1，68.61±1.59nm；B8C2，67.59±0.82nm；B7C3，70.25±1.05nm；B5C5，68.91±1.33nm)。因此，SEM/TEM的结果表明，在CMC的引入加速了BBC纤维的聚集，形成了聚集程度更高、直径更大的胶原蛋白纤维束，但不影响BBC的D-周期结构形成及其长度，这有利于细胞培养肉的模型胶原蛋白基ECM材料的开发。
九、牛骨胶原蛋白-羧甲基壳聚糖水凝胶的体外细胞相容性
将本发明I型骨胶原蛋白-羧甲基壳聚糖体系样品溶液(2.0mg/mL)在37℃、96孔板中孵育80min，得到水凝胶产物。然后将水凝胶冷冻干燥。使用75％乙醇对样品进行消毒。之后，将NIH/3T3胚胎成纤维细胞悬浮液(200μL/孔，104个细胞/mL，含10％ FBS和1％penicillin-streptomycin的DMEM培养基)接种在水凝胶样品上，并在37℃、5％ CO2、95％空气得培养箱中孵育5天。培养结束后，CCK-8法检测细胞活力。
参见图9，实施例2-5相比实施例1未添加I型骨胶原蛋白-羧甲基壳聚糖体系样品溶液制得的水凝胶产物，对经上述培养的细胞存活率，无显著影响，说明本发明制得的牛骨胶原蛋白-羧甲基壳聚糖水凝胶不会影响成纤维细胞存活率。
上述具体实施方式不能作为对本发明保护范围的限制，对于本技术领域的技术人员来说，对本发明实施方式所做出的任何替代改进或变换均落在本发明的保护范围内。
本发明未详述之处，均为本技术领域技术人员的公知技术。
Claims (7)
1.一种可食性骨胶原蛋白纤维自组装制备方法，其特征在于，包括如下操作步骤：
（1）Ⅰ型骨胶原蛋白溶液制备
①低温条件下，将冻干的Ⅰ型骨胶原蛋白搅拌溶解于一定浓度的乙酸溶液中，制备得2mg/mL的Ⅰ型骨胶原蛋白储备溶液；
②低温条件下，将步骤（1）制得的Ⅰ型骨胶原蛋白储备溶液透析，至胶原蛋白呈中性；
（2）羧甲基壳聚糖溶液制备
将羧甲基壳聚糖充分溶解于超纯水中，得到8 mg/mL的羧甲基壳聚糖溶液；
（3）Ⅰ型骨胶原蛋白-羧甲基壳聚糖体系制备
将步骤（1）制得的Ⅰ型骨胶原蛋白溶液与步骤（3）的羧甲基壳聚糖溶液混合，孵育制备Ⅰ型骨胶原蛋白-羧甲基壳聚糖体系溶液；
（4）I型骨胶原蛋白纤维制备
将步骤（3）制得的I型骨胶原蛋白-羧甲基壳聚糖体系与模拟体液低温下混合，调节pH至中性，于26-32℃下孵育11-13小时，制得I型骨胶原蛋白纤维。
2.根据权利要求1所述的可食性骨胶原蛋白纤维自组装制备方法，其特征在于，步骤（1）中低温指3℃-5℃；步骤（1）的①中乙酸溶液的摩尔浓度为0.5 mol/L；②中透析采用磷酸缓冲液，透析至胶原蛋白pH7.2±0.2。
3.根据权利要求1所述的可食性骨胶原蛋白纤维自组装制备方法，其特征在于，步骤（3）的Ⅰ型骨胶原蛋白-羧甲基壳聚糖体系溶液中，Ⅰ型骨胶原蛋白溶液与羧甲基壳聚糖溶液的质量比为1-9：1。
4.根据权利要求3所述的可食性骨胶原蛋白纤维自组装制备方法，其特征在于，Ⅰ型骨胶原蛋白溶液与羧甲基壳聚糖溶液的质量比为9：1、8：2、7：3或5：5。
5.根据权利要求1所述的可食性骨胶原蛋白纤维自组装制备方法，其特征在于，步骤（4）低温指3℃-5℃，模拟体液的摩尔浓度0.1 mol/L；I型骨胶原蛋白-羧甲基壳聚糖体系溶液与模拟体液调节pH至7.4后，于30℃孵育12h。
6.根据权利要求1所述的可食性骨胶原蛋白纤维自组装制备方法，其特征在于，步骤（4）中I型骨胶原蛋白-羧甲基壳聚糖体系溶液与模拟体液体积比为4:1；步骤（4）调节pH采用2M NaOH。
7.根据权利要求1-6任一所述的制备方法制得的可食性骨胶原蛋白纤维在食品、化妆品、生物医学、组织工程领域用胶原蛋白基生物材料及ECM类似物中的应用。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
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| PB01 | Publication | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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Denomination of invention: A method for self-assembly of edible bone collagen fibers and its application Granted publication date: 20240308 Pledgee: Weihai commercial bank Limited by Share Ltd. Dezhou branch Pledgor: DEZHOU COUNTY XIANGSHENG FOOD Co.,Ltd. Registration number: Y2024980025425 |