CN118667716B - 鼠李糖乳杆菌lxw-1和/或其代谢物在制备预防和/或治疗溃疡性结肠炎的产品中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种鼠李糖乳杆菌LXW‑1和/或其代谢物在制备预防和/或治疗溃疡性结肠炎的产品中的应用。本发明通过筛选获得了一株鼠李糖乳杆菌LXW‑1，所述的鼠李糖乳杆菌LXW‑1于2024年05月20日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为：中国.武汉.武汉大学，保藏编号为：CCTCC NO：M 20241017，分类命名为：鼠李糖乳杆菌LXW‑1Lactobacillus rhamnosus LXW‑1。本发明的研究结果表明，鼠李糖乳杆菌LXW‑1代谢物在≥1.0mg/mL时显著抑制炎性因子IL‑1β和IL‑6。动物实验证实，该代谢物减轻DSS诱导的溃疡性结肠炎，改善肠道病变，降低炎性因子水平，增强肠道细胞连接，展现良好预防与治疗潜力。
Description
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种鼠李糖乳杆菌LXW-1和/或其代谢物在制备预防和/或治疗溃疡性结肠炎产品中的应用，尤其是在药品、饲料中的应用。
背景技术
溃疡性结肠炎是病因尚未完全明确的、以直肠和结肠的浅表性、非特异性病变为主的肠道疾病，常伴有腹部疼痛、发热、呕吐、腹泻、直肠便血、贫血和体重下降等临床症状。目前，临床上对溃疡性结肠炎大多是采用西药加以控制，但是西药治疗具有一定副作用且价格相对较高。
近年来，随着人们对溃疡性结肠炎的深入研究，发现溪黄草、苦豆子等植物所含有的天然活性成分对溃疡性结肠炎均表现出一定的抑制活性，成为预防或者治疗溃疡性结肠炎的研究热点。
“是药三分毒”，比如，溪黄草虽然具有一定的清热解毒功效，但长时间服用溪黄草，会产生一定的副作用，且目前溪黄草引起的严重不良症状尚未可知，并且若服用溪黄草不当也会加重肝脏的负担，加重病情，可见，天然植物提取物中所含有的活性成分种类复杂，长期使用的过程中，是否会对机体的其他正常细胞产生一定的损害或者抑制作用，并且这些问题在短时间内并不会暴露出来，换句话说，将中药提取物应用于溃疡性结肠炎存在较大的安全隐患。
因此，更深入地研究溃疡性结肠炎的发病机制，以此为依据提供一种安全性更高、效果更好的产品，对于未来在解决溃疡性结肠炎的困扰方面意义重大。
发明内容
为了解决上述的技术问题，本发明提供了一种鼠李糖乳杆菌LXW-1和/或其代谢物在制备预防和/或治疗溃疡性结肠炎产品中的应用。
第一方面，本发明提供的一种鼠李糖乳杆菌LXW-1，2024年05月20日保藏于中国典型培养物保藏中心（地址：中国武汉武汉大学），保藏编号为：CCTCC NO：M 20241017，分类命名为：鼠李糖乳杆菌LXW-1 Lactobacillus rhamnosus LXW-1。
第二方面，本发明提供一种含有第一方面所述的鼠李糖乳杆菌LXW-1和/或其代谢物的产品。
第三方面，本发明提供一种第一方面所述的鼠李糖乳杆菌LXW-1和/或其代谢物在制备预防和/或治疗溃疡性结肠炎的产品中的应用。
上述鼠李糖乳杆菌LXW-1和/或其代谢物代谢物在上述产品（包括但不限于药品、饲料）的应用中，是作为预防和/或治疗溃疡性结肠炎的产品的活性成分来使用的；当然上述产品还可以包含其它功能的活性成分。
优选地，上述的药品、饲料中鼠李糖乳杆菌LXW-1的代谢物的含量为0.25~2.0 mg/mL时效果较理想，优选的为1.0 mg/mL。药品、饲料中还可以包括赋形剂，赋形剂选自黏合剂、填充剂、崩解剂、润滑剂、防腐剂、抗氧化剂、矫味剂、芳香剂、乳化剂、着色剂、增溶剂中的至少一种。
优选地，鼠李糖乳杆菌LXW-1的代谢物的制备方法如下：
S1.在MRS培养基中对鼠李糖乳杆菌LXW-1培养12~48 h，获得培养代谢物；
S2.采用离心装置对S1中获得的培养代谢物进行离心，分别回收培养液上清液和生物质沉淀部分；
S3.向S2中回收获得的生物质沉淀部分中添加0.1~0.2 M的碱溶液，并搅拌20~30min，采用离心装置离心处理后，收集细胞裂解上清液；
S4.将S2中获得的培养液上清液以及S3中获得的细胞裂解上清液合并，加入柠檬酸和干物质，即制得鼠李糖乳杆菌LXW-1的代谢物。
优选地，干物质选自麦芽糊精、环糊精中的一种或两种；柠檬酸与干物质的重量比为1：10-20，柠檬酸和干物质的重量之和占合并后液体重量的5-10%。
优选地，鼠李糖乳杆菌LXW-1的代谢物是通过改善溃疡性结肠炎受试者（如小鼠）的炎性因子水平、紧密连接蛋白的水平、肠道菌群的丰度和多样性中的至少一个方面来起作用的。
更优选地，鼠李糖乳杆菌LXW-1的代谢物通过改善HT-29、Caco-2、COLO320DM、DLD-1、LS513中至少一株细胞中的炎性因子和紧密连接蛋白的水平来起作用的。
优选地，炎症因子选自IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10、TGF-β、TNF-α中的至少一种。
优选地，紧密连接蛋白选自Occludin、Claudins、JAM-1、JAM-4、ZO-1中的至少一种。
本发明的有益效果在于：
本发明提供一种能应用于溃疡性结肠炎方面的鼠李糖乳杆菌LXW-1和/或其代谢物，本发明中的实验显示，上述的鼠李糖乳杆菌LXW-1发酵所获得的代谢物在一定程度上能够缓解溃疡性结肠炎，且微生物发酵所需底物成本低，原料易获得，发酵后所获得的代谢物特异性强。更具体来说，本发明优选实施例具有如下优点：
（1）通过构建LPS诱导的炎症细胞模型，研究鼠李糖乳杆菌LXW-1的代谢物对细胞炎性的抑制作用实验，结果显示，当鼠李糖乳杆菌LXW-1的代谢物浓度达到1.0 mg/mL以上时，细胞上清液中的炎性因子IL-1β和IL-6的浓度逐渐降低，具有明显的抑炎作用；
（2）通过蛋白质印迹法检测紧密连接蛋白的表达量，证明鼠李糖乳杆菌LXW-1的代谢物对肌动蛋白β-actin、细胞连接蛋白Occludin和ZO-1的表达均有明显促进作用，可以提升组织细胞的紧密连接水平；也进一步证明了鼠李糖乳杆菌LXW-1的代谢物具有抑制炎性因子的作用；
（3）建立肠炎小鼠模型，对小鼠灌胃给与本发明中的鼠李糖乳杆菌LXW-1的代谢物，实验结果表明，本发明中的鼠李糖乳杆菌LXW-1的代谢物能够减轻DSS诱导的小鼠溃疡性结肠炎；组织染色结果显示，本发明中的0.2 g/kg和0.4 g/kg给药组（鼠李糖乳杆菌LXW-1的代谢物）对小鼠的溃疡性结肠炎有显著性改善作用。
附图说明
图1为本发明实施例1中筛选获得的鼠李糖乳杆菌LXW-1的菌落显微镜形态图；
图2为本发明实施例2中鼠李糖乳杆菌LXW-1的代谢物不同添加浓度下对人克隆结肠腺癌细胞Caco-2生长的影响情况；
图3为本发明实施例3中细胞上清液中的炎性因子IL-1β随鼠李糖乳杆菌LXW-1的代谢物样品浓度的变化情况；
图4为本发明实施例3中细胞上清液中的炎性因子IL-6随鼠李糖乳杆菌LXW-1的代谢物样品浓度的变化情况；
图5为本发明实施例3中IL-1β mRNA在不同的鼠李糖乳杆菌LXW-1的代谢物样品浓度与作用时间下的显著性分析；
图6为本发明实施例3中IL-6 mRNA在不同的鼠李糖乳杆菌LXW-1的代谢物样品浓度与作用时间下的显著性分析；
图7为本发明实施例4中Western Blot法对肌动蛋白β-actin、细胞连接蛋白Occludin和ZO-1的染色情况；
图8为本发明实施例4中鼠李糖乳杆菌LXW-1的代谢物对相关蛋白的表达情况；
图9为本发明实施例5中采用体重对肠炎小鼠模型进行确认的情况；
图10为本发明实施例5中采用DSS诱导法建立肠炎小鼠模型20天小鼠体重的变化情况；
图11为本发明实施例5中不同处理条件下，肠炎小鼠病情指数（DAI）随时间的变化情况；
图12为本发明实施例5中不同的处理条件下，肠炎模型DSS组肠道组织长度情况；
图13为本发明实施例5中不同的处理条件下，肠炎模型DSS组肠道组织长度的对比差异情况；
图14为本发明实施例5中不同处理条件下肠炎模型小鼠的结肠组织病例切片图；
图15为本发明实施例5中不同处理条件下肠炎模型小鼠的组织学评分图；
图16为本发明实施例5中小鼠肠道组织炎性因子IL-1β水平测定结果图；
图17为本发明实施例5中小鼠肠道组织炎性因子IL-6水平测定结果图；
图18A-18D为本发明实施例5中通过ELISA和RT-PCR检测，鼠李糖乳杆菌LXW-1的代谢物在降低炎性因子水平上的作用效果图。
具体实施方式
所使用的实验材料和试剂，若无特别说明，均为常规可从商业途径所获得的耗材和试剂。
实施例1 菌种的筛选
本发明选取的乳酸菌，经16S rDNA序列比对鉴定为鼠李糖乳杆菌，编号记为LXW-1，2024年05月20日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO：M 20241017，分类命名为：鼠李糖乳杆菌LXW-1 Lactobacillus rhamnosus LXW-1，其菌落和显微镜形态如图1所示。
对上述鼠李糖乳杆菌LXW-1的代谢物按照如下步骤培养：
S1.在MRS培养基中对鼠李糖乳杆菌LXW-1于42℃下静置培养48h，获得培养代谢物；其中MRS培养基成分为：蛋白胨10 g/L，牛肉膏粉5 g/L，酵母膏粉4 g/L，葡萄糖2 g/L，吐温-80 1.08 g/L，无水磷酸氢二钾2 g/L，无水乙酸钠5 g/L，无水柠檬酸三铵/无水柠檬酸氢二铵2 g/L，无水硫酸镁0.2 g/L，一水合硫酸锰0.05 g/L，半胱氨酸0.5 g/L，乳糖20g/L；
S2.取S1中获得的培养代谢物，于10000 rpm的转速下离心10 min，获得培养液上清液和生物质沉淀部分；
S3.向S2生物质沉淀部分中添加0.15 M的氢氧化钠溶液，搅拌30 min，于10000rpm的转速下离心10 min，收集细胞裂解上清液；
S4.将S2中培养液上清液和S3中的细胞裂解上清液合并，加入柠檬酸和麦芽糊精，获得鼠李糖乳杆菌LXW-1的代谢物；其中柠檬酸和麦芽糊精重量比约为1：15，柠檬酸和麦芽糊精的重量之和占合并后液体重量的7%。
实施例2 毒性试验
采用MTT法测定实施例1中获得的鼠李糖乳杆菌LXW-1的代谢物对人克隆结肠腺癌细胞Caco-2细胞存活率的影响情况。
在Caco-2细胞中添加不同浓度的鼠李糖乳杆菌LXW-1代谢物，观察添加不同浓度(0.25mg/mL、0.5mg/mL、1.0mg/mL、2.0mg/mL)下Caco-2细胞的存活情况；在Caco-2细胞中添加鼠李糖乳杆菌LXW-1代谢物，观察添加不同时长（24h、48h）下Caco-2细胞的存活情况。
结果如图2所示，图2中白色、黑色条形柱分别代表添加时长24h、48h的实验结果；“+”代表添加，“-”代表无添加，比如最左侧白色条形柱表示无任何添加的空白参照，自左往右第二~五条白色条形柱分别表示添加0.25 mg/mL、0.5 mg/mL、1.0 mg/mL、2.0 mg/mL的鼠李糖乳杆菌LXW-1代谢物后的细胞存活率结果；黑色条形柱代表了基于24h数据对48h实验过程的预期或类推。附图中的“给药”均是指给鼠李糖乳杆菌LXW-1代谢物。
图2的结果显示：随着鼠李糖乳杆菌LXW-1代谢物添加浓度的增加（从0到0.25 mg/mL、0.5 mg/mL、1 mg/mL、2.0mg/mL），结肠腺癌细胞Caco-2的存活率并无明显的降低，说明上述代谢物在一定浓度范围内对细胞的存活没有显著的抑制性，鼠李糖乳杆菌LXW-1的代谢物对细胞无明显毒性，这对于评估鼠李糖乳杆菌LXW-1的代谢物作为潜在的生物治疗剂或保健品的安全性具有重要意义。
实施例3 鼠李糖乳杆菌LXW-1代谢物的抑炎作用
首先，构建LPS诱导的炎症细胞模型，然后开展鼠李糖乳杆菌LXW-1代谢物对细胞炎性的抑制作用分析实验。
在细胞中均添加LPS 2.5 mg/mL（空白对照组除外，即图3中左图最左侧的白色柱子和图3右图最左侧的黑色柱子），然后依次在不同的实验组中分别添加不同浓度的鼠李糖乳杆菌LXW-1代谢物（0.25 mg/mL、0.5 mg/mL、1.0 mg/mL、2.0 mg/mL），用“+”表示有添加，“-”表示无添加；观察细胞上清液中的炎性因子IL-1β、IL-6在12h、24h后的变化情况。
结果分别如图3、图4所示，其中“#”代表空白对照组与建模组之间有显著性差异，建模成功；“*”代表与对照组相比，是否有统计学上的显著性差异，若是有“*”，则代表有显著性差异，若“*”越多，则代表显著性差异越大。附图中的其它图片中关于“+”“-” “*” “#”均参照以上解释。给药组是指是添加本发明中的鼠李糖乳杆菌LXW-1代谢物。
从图3、图4中可以看出：鼠李糖乳杆菌LXW-1代谢物的添加浓度和添加时长对细胞上清液中的炎性因子IL-1β、IL-6含量都有影响。对于添加浓度，具体分析如下：
随着鼠李糖乳杆菌LXW-1代谢物添加浓度的升高（从0.25 mg/mL到0.5 mg/mL、1.0mg/mL、2.0 mg/mL），细胞上清液中的炎性因子IL-1β和IL-6的浓度逐渐降低，低浓度的代谢物样品虽然也能够降低炎性因子的浓度，但效果并不明显，当其浓度在1.0 mg/mL、2.0 mg/mL时才会有明显的抑炎作用，根据以下的趋势，当浓度达到1.0 mg/mL时，代谢物样品具有显著的抑炎效果，当浓度进一步再增加时，预计其效果也同样显著，但是1.0 mg/mL、2.0mg/mL已经能达到显著的抑炎效果，再进一步增加浓度已经意义不大，因此未进行更大浓度的实验。
从附图4中可以看出，添加鼠李糖乳杆菌LXW-1的代谢物12h后的组别，其炎性因子IL-6的浓度要低于24h的组别。
为了进一步分析鼠李糖乳杆菌LXW-1代谢物在不同时间段内的抑炎能力，分别开展了不同时间点抑炎能力分析，选择了3 h、6 h、9 h、12 h这四个时间点进行测定，实验测定结果如图5~6所示。
图5~6的结果显示：给药后3 h内，0.25mg/mL、0. 5 mg/mL、1mg/mL、2 mg/mL的组别中，无论是IL-1β和IL-6，其浓度随着给药浓度的增加而降；
给药后3 h、6 h、9 h、12 h这几个时间段，随着时间的增加，给药组0.25mg/mL、0.5 mg/mL、1mg/mL、2 mg/mL的组别中，IL-1β和IL-6的浓度随着时间的增加不断的下降，在12h时，相比于3 h、6 h、9 h这三个时间段，IL-1β浓度是相对较低的；而对于IL-6来说，1mg/mL、2 mg/mL这两个高浓度的给药组中，在6h时其浓度就相对较低，9h和12h浓度变化并不明显。这说明，随着时间的延长，代谢物的抑炎性依然较好，抑炎效果并未表现出特别明显的衰退。
实施例4 蛋白质印迹法检测紧密连接蛋白的表达量
采用蛋白质印迹法（Western Blot）检测鼠李糖乳杆菌LXW-1代谢物对于肌动蛋白β-actin（42 kDa）、细胞连接蛋白Occludin（59 kDa）和ZO-1（250 kDa）的改善情况，其中，鼠李糖LXW-1代谢物的浓度分别设置为1.0 mg/mL、2.0 mg/mL。
测定的实验结果如图7~8所示，其中图7为Western Blot法对肌动蛋白β-actin、细胞连接蛋白Occludin和ZO-1的染色情况，条带的颜色越浅，代表细胞间连接紧密度越低；反之则代表细胞连接更为紧密；
图8为鼠李糖乳杆菌LXW-1代谢物对相关蛋白的表达情况。从图8中可以看出，高浓度的给药组对于细胞连接蛋白Occludin和ZO-1的表达有明显的促进作用，可以提升组织细胞的紧密连接水平，即可以对炎性因子进行有效的抑制。
实施例5 体内动物模型实验
5.1肠炎小鼠模型的建立
采用自由饮用葡聚糖硫酸钠（DSS）的方式诱导小鼠结肠炎，诱导产生的炎症性肠病（IBD）。
由于IBD模型首先引起以及最明显的特征就是造成便血和体重下降，而便血主观性太强，所以采取测量体重的方式来进行客观判断，如图9所示，其中字母“C”“D”“M”“A”分别代表“空白”“建模组”“给药”“处死”。
将小鼠随机分为空白对照组（健康小鼠，NOR），建模组（葡聚糖硫酸钠组，DSS组），以及4个浓度的鼠李糖乳杆菌LXW-1代谢物给药组（0.05 mg/kg、0.1 mg/kg、0.2 mg/kg、0.4mg/kg），每组小鼠10只。
小鼠第0-6天为适应性培养阶段，不进行任何干预，各组条件处理方式均为空白（记为C, Control）；第7-11天为溃疡性结肠炎诱导阶段，采用2.8wt%的DSS饮用水喂养6天诱发溃疡性结肠炎，并于第12-29天恢复阶段开始对4个浓度的鼠李糖乳杆菌LXW-1代谢物给药组（0.05 mg/kg、0.1 mg/kg、0.2 mg/kg、0.4 mg/kg）（分别记为MLF-1,2,3,4组）进行灌胃给药（处理方式记为M，即给药MLF），建模组（DSS组）则继续不干预处理（记为C,Control），第20天开始小鼠进行处死、解剖，测定各项指标。在造模及治疗期间，各组小鼠均自由饮水饮食。
在溃疡性结肠炎诱导和恢复阶段，每天检测各组小鼠的生存状态，记录体重；在第6天及第15天收集小鼠粪便，观察粪便粘稠度和粪便中出血情况。通过体重下降率、粪便粘稠度和粪便中出血情况进行疾病活动指数(DA1)评分，小鼠的DAI的具体评分标准见表1。
表1 肠炎小鼠的疾病指数（DAI）评分标准表
在16天后处死小鼠，收集小鼠的血液、结肠组织和肠系膜淋巴结，将血液分别在2800r和10000r离心5 min和10 min，收集血清样品用于酶联免疫(Elisa)测定；将结肠组织拍照，测量结肠长度，用灭菌后的磷酸盐缓冲液（PBS）轻轻冲洗肠腔，清除肠溶物，取部分结肠组织固定于4wt%的多聚甲醛溶液，用于结肠组织染色及免疫组化分析，余下部分于-80℃保存待用。
将肠系膜淋巴结MINs，研磨，制备单细胞悬浮液，用于流式细胞染色及分析。
5.2组织染色
使用4%的多聚甲醛固定结肠组织，然后包埋于石蜡中，采用H&E法染色。用NikonEclipseTs2R+FL显微镜观察组织染色切片，并对切片结果进行组织学评分，评分标准如表2所示。
组织病理学评分＝炎性渗润评分+粘膜损伤评分+上皮细胞评分
表2 小鼠结肠组织病理学评分标准
注：“-”代表无法计算
5.3炎症因子水平的测定
采用Elisa试剂盒(NOVUSBiologicals,USA)测定血清中炎症因子IL-1β、IL-6的水平。
5.4实验结果分析
（1）鼠李糖乳杆菌LXW-1代谢物能够减轻DSS诱导的小鼠溃疡性结肠炎
从图10中可以看出，采用DSS诱导法建立肠炎小鼠模型，20天体重观察发现除空白对照组（NOR）之外，其他实验组小鼠体重均呈先下降后升高的趋势，符合预期。
图11中的小鼠病情指数DAI显示，除空白对照组之外，各组小鼠均呈现肠炎症状，且添加鼠李糖乳杆菌LXW-1代谢物的各浓度组病情指数较建模组（DSS组）均有明显下降。
结肠病理观察结果如图12~13所示，结果显示，肠炎建模组DSS组肠道组织长度较空白对照组（NOR组）明显变短，而鼠李糖乳杆菌LXW-1代谢物给药组均有明显恢复。
（2）组织染色结果
结肠组织病例切片结果见图14，可以看出，DSS组肠道组织发生明显病变，炎性浸润现象显著，0.2 g/kg和0.4 g/kg给药组有显著性改善。
按照表2中的结肠组织评分标准对不同处理条件下的肠炎模型小鼠的组织学进行评分，结果如图15所示。
结合图14~15可以看出，0.2 g/kg和0.4 g/kg给药组对小鼠的溃疡性结肠炎有显著性改善。
（3）小鼠血清中炎症因子水平
小鼠肠道组织炎性因子水平测定结果如图16~17所示。
图中结果显示，各不同浓度的鼠李糖乳杆菌LXW-1代谢物给药组的炎性因子IL-1β和IL-6较阳性对照组DSS组均有明显降低，证明其有明显的抑炎作用。
如图18A-18D所示，通过ELISA和RT-PCR检测，鼠李糖乳杆菌LXW-1代谢物样品在降低炎性因子水平上具有显著性作用，且呈现浓度性梯度。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (3)
1.一种鼠李糖乳杆菌LXW-1的代谢物在制备治疗溃疡性结肠炎的产品中的应用，其特征在于，所述鼠李糖乳杆菌LXW-1于2024年05月20日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国.武汉.武汉大学，保藏编号为：CCTCC NO：M 20241017，分类命名为：鼠李糖乳杆菌LXW-1Lactobacillus rhamnosus LXW-1；
所述的鼠李糖乳杆菌LXW-1的代谢物由如下步骤制得：
步骤S1.在MRS培养基中对鼠李糖乳杆菌LXW-1培养12~48h，获得培养代谢物；
步骤S2.对步骤S1中获得的培养代谢物离心，分别回收培养液上清液和生物质沉淀部分；
步骤S3.在步骤S2中回收获得的生物质沉淀部分中添加0.1~0.2M的碱溶液，搅拌20~30min，离心，收集细胞裂解上清液；
步骤S4.将步骤S2中的培养液上清液和步骤S3中的细胞裂解上清液合并，加入柠檬酸和干物质，获得鼠李糖乳杆菌LXW-1的代谢物；
所述的干物质选自麦芽糊精、环糊精中的至少一种；柠檬酸与干物质的重量比为1：10-20，柠檬酸和干物质的重量之和占合并后液体重量的5-10%。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述鼠李糖乳杆菌LXW-1的代谢物在所述产品中的含量为0.25~2.0mg/mL。
3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的鼠李糖乳杆菌LXW-1的代谢物通过改善溃疡性结肠炎受试者的炎性因子水平、紧密连接蛋白的水平中的至少一个方面来起作用。
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