CN118620086B - 一种治疗糖尿病的融合蛋白及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及融合蛋白领域，尤其是涉及一种用于治疗糖尿病的融合蛋白及其应用。本发明提供的含Exendin‑4的融合蛋白是由Exendin‑4‑C1、特定突变的Exendin‑4‑C2与特定突变的人免疫球蛋白IgG1的Fc片段突变体融合而成。该融合蛋白具有更高的Exendin‑4生物学活性以及用于I型、II型糖尿病以及肥胖症的治疗效果，同时具有更强的葡萄糖耐受活性，更长的半衰期，且采用本发明提供的含Exendin‑4的融合蛋白冻干粉制剂直接肺部给药，其降血糖效果明显优于E4F4融合蛋白。

Description

一种治疗糖尿病的融合蛋白及其应用

技术领域

本发明涉及融合蛋白领域，尤其是涉及一种用于治疗糖尿病的融合蛋白及其应用。

背景技术

糖尿病是多病因参与的慢性疾病，涉及遗传、代谢、营养和生活习惯等。其发病具有家族聚集性，遗传是糖尿病的重要发病因素，同时遗传外因素受饮食结构、生活习惯、体力活动和体重控制。

Exendin-4是一种短肠促胰岛素多肽，属于胰高血糖素样肽-1(GLP-1)受体长效激动剂。近年来，研究发现Exendin-4可以通过多种途径作用于胰岛β细胞，起到治疗糖尿病的作用。一方面，Exendin-4可以通过与胰岛β细胞上的GLP-1受体特异性结合调节胰岛素分泌；另一方面，Exendin-4还可以促进胰岛β细胞的增殖、调控细胞自噬及抑制细胞凋亡，保护胰岛功能。Exendin-4可在血糖较高时刺激胰岛素分泌，从而降低血糖；在血糖较低时则无此作用，故不会引起低血糖。Exendin-4可显著降低T2DM患者空腹及餐后血糖、HbA1c，显著降低体重和改善脂代谢，动物研究表明exendin-4增加β-细胞数量，对Ⅱ型糖尿病有较好的疗效。

随着生物技术的飞速发展，延长药物在体内的半衰期并阻止其被快速清除已成为近年来的研究热点。已建立的提高药物半衰期的技术包括化学修饰、微囊化、糖基化、抗蛋白酶突变体、蛋白质融合等，许多长效蛋白药物已经研制成功并且应用于临床治疗。同时，目前已上市的Fc融合蛋白往往采用一个目的蛋白与IgG的Fc片段融合，这样会降低目的蛋白的体外活性，尤其是自身分子量较小的多肽。特别是exendin-4与Fc融合蛋白领域，包含exendin-4的融合蛋白稳定性差、生物活性低、治疗效果不明显、安全性不足，进而不能满足市场需要。

发明内容

本发明要解决的技术问题是现有的含Exendin-4多肽的融合蛋白的糖尿病以及肥胖症效果不明显、葡萄糖耐受较差、半衰期短的问题。

本发明解决技术问题的方案是提供一种新的含Exendin-4多肽的融合蛋白，其特征在于所述融合蛋白的结构为：从氮端起依次含有Exendin-4-C1、第一连接肽、Exendin-4-C2、第二连接肽、IgM的Fc段突变体。即本发明含Exendin-4多肽的融合蛋白的结构从氮端起为Ex4-C1-第一连接肽-Ex4-C2-第二连接肽-IgG1-Fc的Fc段突变体。

其中，人IgG1的Fc段突变体的氨基酸序列如SEQ ID No.5所示；

进一步，Exendin-4-C1的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示；

Ex4-C1：HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS(SEQ ID NO:2)；

进一步，Exendin-4-C2的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示；

Ex4-C2：HGEGTATSDLSKQMEREAVRLFIEWLKNGGPSTGAPPPS(SEQ ID NO:3)；

上述融合蛋白为Exendin-4-C1、Exendin-4-C2与人IgG1Fc突变体重组而成，融合蛋白之间的连接肽需要具有足够的长度和较好的柔性，以保证连接的2个分子能正确折叠，保证其生物学活性。一般采用5-25个氨基酸的柔性肽段。

连接肽的氨基酸序列可如SEQ ID No.6所示；

Linker：GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:6)；

进一步的，上述的融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.9所示。

Ex4C1-Linker-Ex4C2-Linker-IgG1-Fc-Mutant：HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPSGGGGSGGGGSGGGGSHGEGTATSDLSKQMEREAVRLFIEWLKNGGPSTGAPPPSGGGGSGGGGSGGGGSPTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPDVKFNWYVNGAEVHRAQTKPRETQYNSTYRVVSVLTVTHQDWLNGKEYTCSVSNKALPAPIQKTISKDKGQPREPQKYTLPPSREELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIVVEWESSGQPENTYKTTPPVLDSDGSYFLYSKLTVDGSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSVSPGK(SEQ ID NO:9)

更进一步的，上述融合蛋白还在氮端包含有信号肽；

ssmIg：MGWSCIILFLVATATGVHS(SEQ ID NO:7)；

更进一步的，上述融合蛋白的核苷酸序列如SEQ ID No.10或其简并序列所示；

本发明还提供含有如SEQ ID No.10所述核苷酸序列的基因载体；

本发明还提供含有上述基因载体的宿主细胞；

此外，本发明还提供了一种治疗糖尿病或肥胖症的药物，该药物是以上述的融合蛋白为主要活性成分制备而成，进一步所述的融合蛋白为冻干粉制剂；

本发明还提供了上述药物在制备治疗糖尿病或者肥胖症的药物中的应用，优选地，上述的糖尿病为1型糖尿病或2型糖尿病。

本发明与现有技术相比，具有如下的优点和有益效果：

本发明提供的含Exendin-4的融合蛋白是由Exendin-4-C1、Exendin-4-C2与特定突变的人免疫球蛋白IgG1的Fc片段突变体融合而成。该融合蛋白具有更高的Exendin-4生物学活性以及用于I型、II型糖尿病以及肥胖症的治疗效果，同时具有更强的葡萄糖耐受活性以及更长的半衰期，即使采用肺部给药融合蛋白的冻干粉制剂，本发明提供的含Exendin-4的融合蛋白的短时间降血糖效果明显优于现有技术水平。

附图说明

图1pcDNA3.1-ssmIg-Ex4C1-Linker-Ex4C2-Linker-IgG1-Fc-Mutant基因片段凝胶电泳结果

图2Ex4C1-Linker-Ex4C2-Linker-IgG1-Fc-Mutant融合蛋白的G-25凝胶过滤柱的洗脱图、SDS-PAGE以及Western Blot结果

图3NS组、Ex4C1-Ex4C2-F1组、E4F4组、Control组小鼠体重及其摄食量的变化

图4基于不同时间点测定的血糖值绘制血糖浓度-时间曲线所示的小鼠葡萄糖耐量

图5Ex4C1-Linker-Ex4C2-Linker-IgG1-Fc-Mutant融合蛋白在体内的半衰期

具体实施方式

本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

实施例1ssmIg-Ex4C1-Linker-Ex4C2-Linker-IgG1-Fc-Mutant融合蛋白表达基因合成及载体构建

融合蛋白序列设计，将突变人IgG1-Fc片段融合于Ex4-C1和Ex4-C2的C-端。同时，为了实现融合蛋白的分泌表达，在N-端加上小鼠信号肽序列，得到最终的融合蛋白为：ssmIg-Ex4C1-Linker-Ex4C2-Linker-IgG1-Fc-Mutant。

Exendin-4母肽：HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS(SEQ ID NO:1)；

Ex4-C1：HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS(SEQ ID NO:2)；

其中Ex4-C1的氨基酸序列与Exendin-4母肽完全相同；

Ex4-C2：HGEGTATSDLSKQMEREAVRLFIEWLKNGGPSTGAPPPS(SEQ ID NO:3)；

IgG1-Fc：PTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPDVKFNWYVNGAEVHHAQTKPRETQYNSTYRVVSVLTVTHQDWLNGKEYTCKVSNKALPAPIQKTISKDKGQPREPQVYTLPPSREELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIVVEWESSGQPENTYKTTPPVLDSDGSYFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSVSPGK(SEQ ID NO:4)；

IgG1-Fc-Mutant：PTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPDVKFNWYVNGAEVHRAQTKPRETQYNSTYRVVSVLTVTHQDWLNGKEYTCSVSNKALPAPIQKTISKDKGQPREPQKYTLPPSREELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIVVEWESSGQPENTYKTTPPVLDSDGSYFLYSKLTVDGSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSVSPGK(SEQ ID NO:5)；

Linker：GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:6)；

ssmIg：MGWSCIILFLVATATGVHS(SEQ ID NO:7)；

ssmIg-Ex4C1-Linker-Ex4C2-Linker-IgG1-Fc-Mutant：MGWSCIILFLVATATGVHSHGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPSGGGGSGGGGSGGGGSHGEGTATSDLSKQMEREAVRLFIEWLKNGGPSTGAPPPSGGGGSGGGGSGGGGSPTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPDVKFNWYVNGAEVHRAQTKPRETQYNSTYRVVSVLTVTHQDWLNGKEYTCSVSNKALPAPIQKTISKDKGQPREPQKYTLPPSREELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIVVEWESSGQPENTYKTTPPVLDSDGSYFLYSKLTVDGSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSVSPGK(SEQ ID NO:8)；

Ex4C1-Linker-Ex4C2-Linker-IgG1-Fc-Mutant：HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPSGGGGSGGGGSGGGGSHGEGTATSDLSKQMEREAVRLFIEWLKNGGPSTGAPPPSGGGGSGGGGSGGGGSPTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPDVKFNWYVNGAEVHRAQTKPRETQYNSTYRVVSVLTVTHQDWLNGKEYTCSVSNKALPAPIQKTISKDKGQPREPQKYTLPPSREELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIVVEWESSGQPENTYKTTPPVLDSDGSYFLYSKLTVDGSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSVSPGK(SEQ ID NO:9)

ssmIg-Ex4C1-Linker-Ex4C2-Linker-IgG1-Fc-Mutant融合蛋白对应的编码核苷酸序列如下所示：

atgggctggagctgcattattctgtttctggtggcgaccgcgaccggcgtgcatagccatggcgaaggcacctttaccagcgatctgagcaaacagatggaagaagaagcggtgcgcctgtttattgaatggctgaaaaacggcggcccgagcagcggcgcgccgccgccgagcggcggcggcggcagcggcggcggcggcagcggcggcggcggcagccatggcgaaggcaccgcgaccagcgatctgagcaaacagatggaacgcgaagcggtgcgcctgtttattgaatggctgaaaaacggcggcccgagcaccggcgcgccgccgccgagcggcggcggcggcagcggcggcggcggcagcggcggcggcggcagcccgacctgcccgccgtgcccggcgccggaactgctgggcggcccgagcgtgtttctgtttccgccgaaaccgaaagataccctgatgattagccgcaccccggaagtgacctgcgtggtggtggatgtgagccaggaagatccggatgtgaaatttaactggtatgtgaacggcgcggaagtgcatcgcgcgcagaccaaaccgcgcgaaacccagtataacagcacctatcgcgtggtgagcgtgctgaccgtgacccatcaggattggctgaacggcaaagaatatacctgcagcgtgagcaacaaagcgctgccggcgccgattcagaaaaccattagcaaagataaaggccagccgcgcgaaccgcagaaatataccctgccgccgagccgcgaagaactgaccaaaaaccaggtgagcctgacctgcctggtgaaaggcttttatccgagcgatattgtggtggaatgggaaagcagcggccagccggaaaacacctataaaaccaccccgccggtgctggatagcgatggcagctattttctgtatagcaaactgaccgtggatggcagccgctggcagcagggcaacgtgtttagctgcagcgtgatgcatgaagcgctgcataaccattatacccagaaaagcctgagcgtgagcccgggcaaa(SEQID NO:10)；

采用全基因合成的方法得到含小鼠信号肽的ssmIg-Ex4C1-Linker-Ex4C2-Linker-IgG1-Fc-Mutant融合蛋白的DNA片段(SEQ ID No.10)，将合成的片段直接插入表达载体pcDNA3.1得到重组表达质粒pcDNA3.1-ssmIg-Ex4C1-Linker-Ex4C2-Linker-IgG1-Fc-Mutant；PCR扩增质粒产物经2％琼脂糖凝胶电泳分析，可见6480bp左右的pcDNA3.1-ssmIg-Ex4C1-Linker-Ex4C2-Linker-IgG1-Fc-Mutant基因片段，大小与预期一致；经过NotI和EcoRI双酶切，可见约5427bp载体片段和约1053bp目的基因片段(图1)，其中Lane1：pcDNA3.1-ssmIg-Ex4C1-Linker-Ex4C2-Linker-IgG1-Fc-Mutant；Lane2：pcDNA3.1-ssmIg-Ex4C1-Linker-Ex4C2-Linker-IgG1-Fc-Mutant经过NotI和EcoRI双酶切；Lane1和Lane2的结果大小分别与理论值相一致，将重组质粒送至上海生工生物进行测序，测序结果与ssmIg-Ex4C1-Linker-Ex4C2-Linker-IgG1-Fc-Mutant融合蛋白基因序列完全符合，表明重组表达质粒pcDNA3.1-ssmIg-Ex4C1-Linker-Ex4C2-Linker-IgG1-Fc-Mutant构建成功。

实施例2Ex4C1-Linker-Ex4C2-Linker-IgG1-Fc-Mutant融合蛋白的表达和纯化

在37℃、8％CO₂饱和湿度及附加摇床速度为10⁹r·min^-1的恒温培养箱条件下，CHO-S悬浮细胞在ExpiCHO Expression Medium培养基中培养和传代。待细胞生长密度达7×10¹⁰L^-1时，将转染细胞稀释为6×10¹⁰L^-1，在ExpiFectamine^TM CHO Reagent的介导下，取25ug重组质粒pcDNA3.1-ssmIg-Ex4C1-Linker-Ex4C2-Linker-IgG1-Fc-Mutant转入CHO-S悬浮细胞中，转染20h后分别添加150ul ExpiCHOTM Enhancer和6mL ExpiCHOTM Feed，继续培养。

培养过程中，每3天换培养液一次直至细胞克隆形成。分离单克隆细胞并扩展成稳定的细胞系并将这些细胞系在24孔板上生长的组织培养的上清液用SDS-PAGE或Elisa检测融合蛋白。选择能大量分泌融合蛋白，且传代稳定的细胞用作以后的特性分析。取传代稳定的CHO工程细胞株接种于25cm2T形瓶中，每瓶含5mL细胞悬液，振荡培养4-5天后扩增至三角瓶中，培养7-10天，分离含有融合蛋白的细胞培养液分别经Protein A亲和层析介质、Sepharose SP XL层析柱、Butyl Sepharose FF层析柱，以及DEAE Sepharose FF层析柱纯化，然后用G-25凝胶过滤柱置换至制剂缓冲液中，Ex4C1-Linker-Ex4C2-Linker-IgG1-Fc-Mutant融合蛋白的G-25凝胶过滤柱的洗脱图、SDS-PAGE以及Western Blot结果(图2)；

图2结果显示，过滤柱的洗脱图显示Ex4C1-Linker-Ex4C2-Linker-IgG1-Fc-Mutant融合蛋白杂质较少，目的蛋白主要集中在峰(1)；SDS-PAGE显示泳道(1)融合蛋白分子量结果大小均与理论值相35kDa一致；Western Blot显示融合蛋白分泌表达在CHO工程细胞株培养基中，且能被抗IgG1-Fc抗体以及抗Exendin-4抗体特异性识别，上述结果表明成功表达和纯化出了Ex4C1-Linker-Ex4C2-Linker-IgG1-Fc-Mutant融合蛋白。

实施例3Ex4C1-Linker-Ex4C2-Linker-IgG1-Fc-Mutant融合蛋白对肥胖小鼠糖尿病模型的体重和摄食量治疗效果

建立小鼠饮食诱导的肥胖模型(DIO)研究Ex4C1-Linker-Ex4C2-Linker-IgG1-Fc-Mutant融合蛋白体内的对小鼠糖尿病模型的治疗效果，实验方法：选择体重为40～50g的C57/B6雄性小鼠，随机分成4组：

生理盐水组(NS组)：用高脂饲料喂养10周形成肥胖；

实施例2制备的Ex4C1-Linker-Ex4C2-Linker-IgG1-Fc-Mutant融合蛋白实验组(Ex4C1-Ex4C2-F1组)：用高脂饲料喂养10周形成肥胖；

按照CN106146667B专利文献记载的方法制备的E4F4融合蛋白对照组(E4F4组)：用高脂饲料喂养10周形成肥胖；

正常组(Control组)：同期不饲喂高脂饲料；

采用如下方式进行给药：

生理盐水组(NS组)：皮下给药，按照一周给生理盐水一次320μg·kg-1；

Ex4C1-Linker-Ex4C2-Linker-IgG1-Fc-Mutant融合蛋白实验组(Ex4C1-Ex4C2-F1组)：皮下给药，按照一周给药一次320μg·kg-1；

按照CN106146667B专利文献记载的方法制备的E4F4融合蛋白对照组(E4F4组)：皮下给药，按照一周给药一次320μg·kg-1；每天称四组的体重和摄食量(图3)。

图3结果显示：E4F4融合蛋白组以及Ex4C1-Ex4C2-F1融合蛋白组采用一周给药1次均能够明显抑制小鼠体重的增长；并且Ex4C1-Ex4C2-F1组的抑制体重增长的效果远优于E4F4组；每天对小鼠摄食量进行称量，与NS组相比，Ex4C1-Ex4C2-F1融合蛋白组对小鼠摄食量有一定的抑制作用，且摄食量的抑制效果远优于E4F4融合蛋白组。

实施例4Ex4C1-Linker-Ex4C2-Linker-IgG1-Fc-Mutant融合蛋白的葡萄糖耐量活性实验

取正常C57BL/6小鼠18只，按体质量随机分成3组，每组6只，逐只编号，分别按照以下方式给药：

给按照CN106146667B专利文献记载的方法制备的E4F4融合蛋白组(E4F4组)：剂量320μg·kg-1；

按照实施例2制备的Ex4C1-Linker-Ex4C2-Linker-IgG1-Fc-Mutant融合蛋白组(Ex4C1-Ex4C2-F1组)：剂量320μg·kg-1；

空白对照组(Control组)：10mmol·L-1磷酸盐缓冲液，pH7.4；

在给药后12h分别腹腔注射40％葡萄糖0.2mL，注射前及注射后0、15、30、60、90、100、120min尾静脉采血，用血糖仪测定血糖值，评价给药后小鼠葡萄糖耐量情况。根据不同时间点测定的血糖值绘制血糖浓度-时间曲线如图4所示。

图4结果显示，与空白对照和索马鲁肽相比，E4F4融合蛋白组和Ex4C1-Ex4C2-F1融合蛋白组在给药后12h注射葡萄糖15min及30min时仍有明显降血糖作用，Ex4C1-Ex4C2-F1融合蛋白组相比较E4F4融合蛋白组可以维持更低血糖浓度，同时低血糖浓度维持时间更长，即Ex4C1-Ex4C2-F1融合蛋白组的葡萄糖耐量活性远优于E4F4融合蛋白组。

实施例5Ex4C1-Linker-Ex4C2-Linker-IgG1-Fc-Mutant融合蛋白的体内半衰期检测

选择8周龄的SD雄性大鼠4只，给按照实施例2制备的Ex4C1-Linker-Ex4C2-Linker-IgG1-Fc-Mutant融合蛋白组注射Ex4C1-Linker-Ex4C2-Linker-IgG1-Fc-Mutant融合蛋白200μg/kg；检测49天内Exendin-4含量的变化，在不同的时间点0、1、2、4、6、14、21、28、35、42、49天取血，采用Exendin-4检测试剂盒检测血清中Exendin-4的含量。Ex4C1-Linker-Ex4C2-Linker-IgG1-Fc-Mutant融合蛋白组的血清在Exendin-4含量一直可持续检测到49天(如如图5所示)，经计算Ex4C1-Linker-Ex4C2-Linker-IgG1-Fc-Mutant融合蛋白在体内的半衰期t1/2为10天左右。

以上所述实施例仅表达了本申请的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本申请的保护范围。因此，本申请专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.一种用于治疗糖尿病的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白的结构为：从氮端起依次为如SEQ ID NO：2所示的Exendin-4-C1多肽、第一连接肽、如SEQ ID NO：3所示的Exendin-4-C2多肽、第二连接肽、如SEQ ID NO：5所示的IgG1的Fc段突变体；任选地，所述第一连接肽和第二连接肽可以相同。

2.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述氮端还含有信号肽。

3.根据权利要求2所述的融合蛋白，其特征在于，所述信号肽为如SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列。

4.根据权利要求1-3任一所述的融合蛋白，其特征在于，所述第一连接肽和第二连接肽为如SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列。

5.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白为如SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列。

6.编码权利要求2-5任一项所述的融合蛋白的核酸，其特征在于，所述核酸序列为SEQID No.10或其简并序列。

7.含有权利要求6所述核酸的基因载体。

8.含有权利要求7所述基因载体的宿主细胞。

9.治疗2型糖尿病或饮食诱导的肥胖症的药物组合物，其特征在于，含有权利要求1或5所述的融合蛋白的冻干粉剂及药学上可接受的辅料。

10.如权利要求1-5任一所述的融合蛋白以及权利要求9所述的药物组合物在制备治疗饮食诱导的肥胖症的药物中的用途。