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CN118599826A - 酚-氯仿法结合柱离心法经DNase I消化的RNA提取纯化方法及提取纯化试剂盒 - Google Patents

酚-氯仿法结合柱离心法经DNase I消化的RNA提取纯化方法及提取纯化试剂盒 Download PDF

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CN118599826A
CN118599826A CN202410751400.XA CN202410751400A CN118599826A CN 118599826 A CN118599826 A CN 118599826A CN 202410751400 A CN202410751400 A CN 202410751400A CN 118599826 A CN118599826 A CN 118599826A
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CN
China
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rna
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CN202410751400.XA
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时宗芬
刘怀泽
王晨琛
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Shanghai Ruijikang Biopharmaceutical Co ltd
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Shanghai Ruijikang Biopharmaceutical Co ltd
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Publication date
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
    • C12N15/1006—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by means of a solid support carrier, e.g. particles, polymers
    • C12N15/101—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by means of a solid support carrier, e.g. particles, polymers by chromatography, e.g. electrophoresis, ion-exchange, reverse phase

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Abstract

提供了一种酚‑氯仿法结合柱离心法经DNase I消化的RNA提取纯化方法及提取纯化试剂盒，通过本发明的提取纯化方法，得到的RNA样品无ssDNA残留。

Description

酚-氯仿法结合柱离心法经DNase I消化的RNA提取纯化方法 及提取纯化试剂盒
技术领域
本发明总体上涉及核酸提取纯化领域。具体地，本发明涉及酚-氯仿法结合柱离心法经DNase I消化的RNA提取纯化方法及提取纯化试剂盒。
背景技术
从细胞中提取核酸是基因治疗和生物医学研究的基础，如何从细胞中快速分离高质量核酸尤其重要。常规的核酸提取方法包括酚-氯仿法（目前最常用的RNA提取方法，为Chomc zynski和Sacchi于1987年发表的一步法RNA抽提方法“Single-step method of RNAisolation”。参考文献：P. Chomczynski & N. Sacchi, Analytical Biochemistry, 1987April Page 156-159, Single-step method of RNA isolation by acid guanidiniumthiocyanate-phenol-chloroform extraction。本公开以下简称“酚-氯仿法”）、柱离心法和磁珠法等。其中，酚-氯仿法成本低，但操作过程较为繁琐，且该方法所用到的氯仿为易挥发的有毒物质，容易造成环境污染，危害操作人员的身体健康。柱离心法提取过程依赖于离心机。磁珠法中核酸提取所用的磁珠为超顺磁性氧化硅纳米磁珠，该磁珠能在微观界面上与核酸分子特异性地识别和高效结合，通过磁力架吸附磁珠即可从血液、动物组织、细胞、微生物等样本中将核酸分离出来，缺点是成本较高。
在实际的实验过程中，酚-氯仿法因其低成本的优势成为最普遍的RNA提取方法。该方法的第一步就是用QIAzol裂解液或TRIzol裂解液将细胞等生物样品裂解，此时可以立即提取，或者置于-80℃冻存。所以最常见的保存待提取样品的方式为-80℃冻存的生物样品的QIAzol裂解液或TRIzol裂解液。如果因为样品的特殊性或者某些高灵敏度实验的特殊要求导致酚-氯仿法提取的RNA纯度不达标时，则需要使用纯度更高的提取方法，比如柱离心法。而此时往往样品已经经过QIAzol裂解液或TRIzol裂解液处理并保存于-80℃的条件下了，所以开发酚-氯仿法与柱离心法的结合方法就十分重要。但发明人发现在使用结合方法提取RNA时，实验结果依然不尽人意，原因是提取出来的RNA中存在其他杂质影响实验结果，但是现有技术并未报道关相关原因和解决办法。
发明内容
一方面，本公开提供酚-氯仿法结合柱离心法经DNase I消化的RNA提取纯化方法，包括如下步骤：
（1）将QIAzol裂解液或TRIzol裂解液加入培养细胞；
（2）使用吸附柱提取得到RNA样品；
（3）先使用DNase I消化RNA样品，然后将消化后的样品使用吸附柱提取得到RNA终样品，即可。
在一些实施方式中，所述步骤（2）具体为：先将步骤（1）得到的样品转移到gDNAEraser Spin Column中，离心得到滤液，然后将滤液转移到RNA Spin Column中，离心后弃滤液、洗脱得到RNA样品。
在一些实施方式中，所述步骤（3）具体为：先使用DNase I消化RNA样品，然后将消化后的样品转移到RNA Spin Column中，离心洗脱得到RNA终样品，即可。
在一些实施方式中， 酚-氯仿法结合柱离心法经DNase I消化的RNA提取纯化方法，包括如下步骤：
（1）将QIAzol裂解液或TRIzol裂解液加入培养细胞：向培养细胞中加入QIAzol裂解液或TRIzol裂解液，将含细胞的裂解液转移到离心管中，-80℃冻存；
（2）使用吸附柱提取得到RNA样品： 将离心管中裂解液转移到gDNA Eraser SpinColumn中，离心得滤液，在滤液中加入异丙醇，混匀并转移到RNA Spin Column中，离心后弃滤液，将Buffer RWA加入至RNA Spin Column中，离心后弃滤液，再将Buffer RWB加入至RNASpin Column中，离心后弃滤液，将RNA Spin Column重新安放于Collection Tube上，离心，将RNA Spin Column安放于RNase Free Collection Tube上，在RNA Spin Column膜中央处加入RNase Free dH2O，静置、离心洗脱得RNA样品；
（3）使用DNase I消化RNA样品：先使用DNase I消化RNA样品并离心，然后加乙醇，混匀后转移到RNA Spin Column中，离心，将Buffer RWA加入至RNA Spin Column中，离心后弃滤液，将Buffer RWB加入至RNA Spin Column中，离心后弃滤液，将RNA Spin Column重新安放于Collection Tube上，离心，将RNA Spin Column安放RNase Free Collection Tube上，在RNA Spin Column膜中央处加入RNase Free dH2O，静置、离心洗脱RNA，即可。
另一方面，本公开提供了一种酚-氯仿法结合柱离心法经DNase I消化的RNA提取纯化试剂盒，包括：QIAzol裂解液或TRIzol裂解液；提取RNA的吸附柱；DNase I。
在一些实施方式中，所述提取RNA的吸附柱包括gDNA Eraser Spin Column和RNASpin Column。
在一些实施方式中，所述试剂盒包括说明书，所述说明书记载使用方法：
（1）将QIAzol裂解液或TRIzol裂解液加入培养细胞：向培养细胞中加入QIAzol裂解液或TRIzol裂解液，将含细胞的裂解液转移到离心管中，-80℃冻存；
（2）使用吸附柱提取得到RNA样品： 将离心管中裂解液转移到gDNA Eraser SpinColumn中，离心得滤液，在滤液中加入异丙醇，混匀并转移到RNA Spin Column中，离心后弃滤液，将Buffer RWA加入至RNA Spin Column中，离心后弃滤液，再将Buffer RWB加入至RNASpin Column中，离心后弃滤液，将RNA Spin Column重新安放于Collection Tube上，离心，将RNA Spin Column安放于RNase Free Collection Tube上，在RNA Spin Column膜中央处加入RNase Free dH2O，静置、离心洗脱得RNA样品；
（3）使用DNase I消化RNA样品：先使用DNase I消化RNA样品并离心，然后加乙醇，混匀后转移到RNA Spin Column中，离心，将Buffer RWA加入至RNA Spin Column中，离心后弃滤液，将Buffer RWB加入至RNA Spin Column中，离心后弃滤液，将RNA Spin Column重新安放于Collection Tube上，离心，将RNA Spin Column安放RNase Free Collection Tube上，在RNA Spin Column膜中央处加入RNase Free dH2O，静置、离心洗脱RNA，即可。
本发明的优点：
发明人在实验中会遇到需要利用酚-氯仿法结合柱离心法提取RNA的情形，但是发现利用酚-氯仿法结合柱离心法得到的RNA样品纯度不高，但现有技术并无准确报道相关原因（有文献记载可能是双链DNA残留并给了解决办法，发明人按照该文献方法调整后发现得到的RNA样品仍然有杂质残留），致使发明人的后续实验结果总是不尽人意，发明人总结经验，首次发现该方法提取得到的RNA样品中有ssDNA残留，而ssDNA残留对检测结果会影响很大，如AAV作为基因治疗载体，遗传物质是ssDNA，如果在提取RNA样品过程中没有有效去除ssDNA，提取得到的RNA样品中包括ssDNA，这会很大程度上影响基因治疗产品的检测结果，而本发明首次发现利用该方法得到的RNA样品中包含ssDNA残留，并优化该方法的步骤和参数，利用本发明的方法得到的RNA样品纯度高，无ssDNA残留，使得基因治疗产品的检测结果真实可信。
本发明摒弃了酚-氯仿法中的氯仿分相操作，无需考虑不同实验人员对水相吸取量的差异，对RNA提取友好，对环境和提取者的身体健康友好。
附图说明
以下附图形成本说明书的一部分，并且被包括在内以进一步展示本公开的某些方面。通过参考这些附图中的一个或多个，结合本文中所呈现的具体实施方式的详细说明，可以更好地理解本公开。
图1显示两组RNA样品的ssDNA残留量（copies/μg）。“原始RNA”为不经过DNase I消化的样品；“酶切RNA”为利用实施例1方法回收提取得到的RNA样品。2E14表示实验组：原代大鼠背根神经节细胞被总量为2×1014 VG的病毒感染10天后经由QIAzol裂解液处理；1.6E13表示实验组：原代大鼠背根神经节细胞被总量为1.6×1013 VG的病毒感染10天后经由QIAzol裂解液处理。表格中a、b、c、d、e代表同一实验组中的5个不同复孔。
具体实施方式
在更详细地描述本公开之前，应理解的是，本公开不限于所描述的具体实施方式，并且因此当然可以变化。还应当理解，本文所使用的术语仅仅是出于描述具体实施方式的目的，并且不旨在是限制性的，因为本公开的范围将仅由所附权利要求限定。
除非另外定义，否则本文所使用的所有技术术语和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常所理解的含义相同的含义。虽然与本文所描述的那些方法和材料类似或等同的任何方法和材料也可以用于本公开的实践或测试中，但是现在描述优选的方法和材料。
本说明书中所引用的所有出版物和专利通过引用并入本文，就像每个单独的出版物或专利被具体且单独地指示为通过引用并入并且通过引用并入本文，以便结合所引用的出版物来公开和描述所述方法和/或材料。对任何出版物的引用是针对其在提交日之前的公开内容，并且不应被解释为承认本公开因先前的公开而无权先于此类出版物。此外，所提供的公开日期可能与实际的公开日期不同，实际的公开日期可能需要单独确认。
如对于本领域技术人员将显而易见的是，在阅读本公开时，本文描述和展示的单独实施方式中的每一个均具有离散的组成部分和特征，所述组成部分和特征可以在不偏离本公开的范围或精神的情况下易于与其它若干实施方式中的任何实施方式的特征分离或组合。任何所叙述的方法都可以按所叙述的事件顺序或逻辑上可能的任何其它顺序进行。
定义
应理解，前面的一般性描述和以下的详细描述都只是示例性和说明性的，并不是对要求保护的本发明的限制。在本申请中，除非另外特别说明，否则单数的使用包括复数。在本公开中，除非明确指示仅指代替代方案或替代方案是相互排斥的，否则术语“或”用于意指“和/或”。此外，术语 “包括”等其它形式的使用不是限制性的。
如本文所使用的，“细胞”可以是原核的或真核的。原核细胞包括例如细菌。真核细胞包括例如真菌、植物细胞和动物细胞。优选地，本文所描述的细胞是动物细胞。动物细胞的类型（例如，哺乳动物细胞或人细胞）包括例如来自神经系统或器官的细胞。细胞可以是正常的、健康的细胞；或患病或不健康的细胞（例如，癌细胞）。哺乳动物细胞可以是啮齿动物细胞，例如小鼠、大鼠、仓鼠细胞。哺乳动物细胞可以是兔形目细胞，例如兔细胞。哺乳动物细胞也可以是灵长类动物细胞，例如，人细胞。
如本文所使用的，术语“核酸”是指呈单链或双链形式的脱氧核糖核酸（DNA）或核糖核酸（RNA）和其聚合物。
提供以下实施例以更好地说明要求保护的发明，并且不应以任何方式解释为限制本发明的范围。下面描述的所有具体组合物、材料和方法全部或部分地落入本发明的范围内。这些具体组合物、材料和方法并不旨在限制本发明，而是仅说明落入本发明的范围内的具体实施方式。本领域的技术人员可以开发出等效的组合物、材料和方法，而无需行使发明能力且不脱离本发明的范围。应理解，可以在本文所述的程序中进行许多变化，同时仍保持在本发明的范围内。本发明的发明人的意图是此类变化都包括在本发明的范围内。
实施例1
此实施例展示提取纯化RNA的方法及结果：
一、技术方案：
1.预先配置试剂：
Buffer RL裂解液：向9.8 mL Buffer RL（室温保存）中加入200 μL 50×DTT（-20℃保存）溶液，混匀后备用。配制的Buffer RL裂解液可在4℃冰箱保存一月。
Buffer RWB在首次使用前，请添加70 mL的无水乙醇，混合均匀。
Buffer WB在首次使用前，请添加56 ml的无水乙醇，混合均匀。
RNase Free dH2O使用前进行65℃预热。
DNA/RNA Remover核酸气溶胶污染清除剂喷洒操作台面，作用半小时，建立无核酸区域。
2 贴壁细胞收集
2.1 操作步骤
2.1.1 吸弃培养液，使用1×DPBS轻柔地清洗一次。
2.1.2 向培养细胞中加入1 mL QIAzol Lysis Reagent，室温孵育2 min，使裂解液均匀分布于细胞表面并裂解细胞。
2.1.3 将含细胞的裂解液完全转移至1.5 mL离心管中。
2.1.4 -80℃冻存，待提取RNA。
3. RNA提取
3.1 样品来源：QIAzol Lysis Reagent。
3.2 室温静置，直至冰块融化。
3.3 将黄色gDNA Eraser Spin Column安放到2 ml的Collection Tube上。
3.4 将QIAzol裂解液分批完全转移到gDNA Eraser Spin Column中，13000×g，室温离心30 s。
3.5 保留2 ml Tube中的滤液进行RNA提取。
3.6 在滤液中加入0.7倍体积的异丙醇，混匀。
3.7 立即将混合液全部转移到RNA Spin Column中，13000×g，室温离心30 s，弃滤液。
3.9 将500 μL的Buffer RWA加入至RNA Spin Column中，13000×g，室温离心30s，弃滤液。
3.10 重复操作步骤3.9。
3.11 将600 μL的Buffer RWB加入至RNA Spin Column中，13000×g离心30 s，弃滤液。
3.12 重复操作步骤3.11。
3.13 将RNA Spin Column重新安放于2 mL Collection Tube上，13000×g，室温离心2 min。
3.14 将RNA Spin Column安放于1.5 mL的RNase Free Collection Tube上，在RNA Spin Column膜中央处加入50 μL 65℃预热的RNase Free dH2O，室温静置5 min。
3.15 13000×g，室温离心2 min洗脱RNA。
3.16 将洗脱液吸出重新加回至RNA Spin Column中，室温静置5 min，13000×g，室温离心2 min洗脱RNA。
3.17 将获得的RNA样品进行DNase I消化，消化体系如下表1：
表1 消化体系
试剂 体积（µL）
RNA X
DNase I buffer(10X) 10
DNase I 1
dH2O 补至100 µL
3.18 上下颠倒混匀后，快速离心，37℃孵育15 min。
3.19 重新回收RNA，步骤如下：
3.20 向步骤3.18混合液中加入等体积70%乙醇，混匀后转移到RNA Spin Column中，13000×g，室温离心1 min。
3.21 将500 μL的Buffer RWA加入至RNA Spin Column中，13000×g，室温离心30s，弃滤液。
3.22 将600 μL的Buffer RWB加入至RNA Spin Column中，13000×g离心30 s，弃滤液。
3.23 重复操作步骤3.22。
3.24 将RNA Spin Column重新安放于2 mL Collection Tube上，13000×g，室温离心2 min。
3.25 将RNA Spin Column安放于1.5 mL的RNase Free Collection Tube上，在RNA Spin Column膜中央处加入50 μL 65℃预热的RNase Free dH2O，室温静置5 min。
3.26 13000×g，室温离心2 min洗脱RNA。
3.27 将洗脱液吸出重新加回至RNA Spin Column中，室温静置5 min，13000×g，室温离心2 min洗脱RNA。
3.28 RNA样品分装后-80℃保存。
试剂耗材和仪器设备见下表2-3。
表2 试剂耗材
名称 货号 批号 品牌
QIAzol Lysis Reagent 79306 N/A QIAGEN
Axygen® 1.5 mL MaxyClear Snaplock微量离心管* MCT-150-C N/A Axygen
柱式法通用型RNA提取试剂盒 9767 N/A TaKaRa
引物 N/A N/A 通用生物
Axygen® 1.5 mL Snaplock微量离心管，琥珀色* MCT-150-X N/A Axygen
UltraPure™ 无 DNase/RNase 蒸馏水* 10977015 N/A Invitrogen™
100 μL低吸附滤芯吸头盒装灭菌* GTL04-100 N/A 金淇源
10 μL加长低吸附滤芯吸头盒装灭菌* GTL04-11 N/A 金淇源
10 μL低吸附滤芯吸头盒装灭菌* GTL04-10 N/A 金淇源
200 μL低吸附滤芯吸头盒装灭菌* GTL04-200 N/A 金淇源
1000 μL低吸附滤芯吸头盒装灭菌* GTL04-1000 N/A 金淇源
数字PCR耗材套件 RW007096A N/A 苏州思纳福医疗科技有限公司
4×dPCR Probe Mix （Cy5.5） RT020096A N/A 苏州思纳福医疗科技有限公司
DNA/RNA Remover核酸气溶胶污染清除剂* 19702ES76 N/A 翌圣生物
DNase I (RNase-free) M0303S N/A NEB
*可用等效替代。
表3 仪器设备
名称 型号 品牌
Sniper DQ24 Digital PCR System DQ24 苏州思纳福医疗科技有限公司
离心机* 5425按键式 EPPENDORF
*可用等效替代。
二、实验结果见图1：
“原始RNA”为不经过DNase I消化的样品；“酶切RNA”为利用本实施例方法回收提取得到的RNA样品。我们使用ddPCR技术检测上述RNA样品中的DNA残留，检测试剂为4×dPCRProbe Mix体系（无反转录过程），检测结果显示，经方法改良后，获得了无ssDNA残留的RNA样品，利于后续的核酸定量检测。
虽然本发明已经参照具体实施方式（其中一些是优选实施方式）具体地示出和描述，但所属领域的技术人员应理解，在不脱离如本文所公开的本发明的精神和范围的情况下，可以在其中进行形式和细节上的各种改变。

Claims (7)

1.一种RNA提取纯化方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）将QIAzol裂解液或TRIzol裂解液加入培养细胞；
（2）使用吸附柱提取得到RNA样品；
（3）先使用DNase I消化RNA样品，然后将消化后的样品使用吸附柱提取得到RNA终样品，即可。
2.根据权利要求1所述的RNA提取纯化方法，其特征在于，步骤（2）具体为：先将步骤（1）得到的样品转移到gDNA Eraser Spin Column中，离心得到滤液，然后将滤液转移到RNASpin Column中，然后离心后弃滤液、洗脱得到RNA样品。
3.根据权利要求1所述的RNA提取纯化方法，其特征在于，步骤（3）具体为：先使用DNaseI消化RNA样品，然后将消化后的样品转移到RNA Spin Column中，离心洗脱得到RNA终样品，即可。
4.根据权利要求1所述的提取纯化方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）将QIAzol裂解液或TRIzol裂解液加入培养细胞：向培养细胞中加入QIAzol裂解液或TRIzol裂解液，将含细胞的裂解液转移到离心管中，-80℃冻存；
（2）使用吸附柱提取得到RNA样品： 将离心管中裂解液转移到gDNA Eraser SpinColumn中，离心得滤液，在滤液中加入异丙醇，混匀并转移到RNA Spin Column中，离心后弃滤液，将Buffer RWA加入至RNA Spin Column中，离心后弃滤液，再将Buffer RWB加入至RNASpin Column中，离心后弃滤液，将RNA Spin Column重新安放于Collection Tube上，离心，将RNA Spin Column安放于RNase Free Collection Tube上，在RNA Spin Column膜中央处加入RNase Free dH2O，静置、离心洗脱得RNA样品；
（3）使用DNase I消化RNA样品：先使用DNase I消化RNA样品并离心，然后加乙醇，混匀后转移到RNA Spin Column中，离心，将Buffer RWA加入至RNA Spin Column中，离心后弃滤液，将Buffer RWB加入至RNA Spin Column中，离心后弃滤液，将RNA Spin Column重新安放于Collection Tube上，离心，将RNA Spin Column安放RNase Free Collection Tube上，在RNA Spin Column膜中央处加入RNase Free dH2O，静置、离心洗脱RNA，即可。
5.一种提取纯化RNA的试剂盒，其特征在于，包括：QIAzol裂解液或TRIzol裂解液；提取RNA的吸附柱；DNase I。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述提取RNA的吸附柱包括gDNA EraserSpin Column和RNA Spin Column。
7.根据权利要求5-6任一所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括说明书，所述说明书记载使用方法：
（1）将QIAzol裂解液或TRIzol裂解液加入培养细胞：向培养细胞中加入QIAzol裂解液或TRIzol裂解液，将含细胞的裂解液转移到离心管中，-80℃冻存；
（2）使用吸附柱提取得到RNA样品： 将离心管中裂解液转移到gDNA Eraser SpinColumn中，离心得滤液，在滤液中加入异丙醇，混匀并转移到RNA Spin Column中，离心后弃滤液，将Buffer RWA加入至RNA Spin Column中，离心后弃滤液，再将Buffer RWB加入至RNASpin Column中，离心后弃滤液，将RNA Spin Column重新安放于Collection Tube上，离心，将RNA Spin Column安放于RNase Free Collection Tube上，在RNA Spin Column膜中央处加入RNase Free dH2O，静置、离心洗脱得RNA样品；
（3）使用DNase I消化RNA样品：先使用DNase I消化RNA样品并离心，然后加乙醇，混匀后转移到RNA Spin Column中，离心，将Buffer RWA加入至RNA Spin Column中，离心后弃滤液，将Buffer RWB加入至RNA Spin Column中，离心后弃滤液，将RNA Spin Column重新安放于Collection Tube上，离心，将RNA Spin Column安放RNase Free Collection Tube上，在RNA Spin Column膜中央处加入RNase Free dH2O，静置、离心洗脱RNA，即可。
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